DE2265327A1 - Mundpraeparate zur bekaempfung von zahnbelag - Google Patents

Description

Dr.-Ing. Walter Abitz Dr. Dieter F. Morf Dipl.-Phys. M. Gritschneder 8 München 86, Pienzenauerstr. 23

19. April 1977 14 380 A

MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag

7 09830/0801

Merck & Co., Inc. 1*1 380 A

Beschreibung

Zähnbelag haftet an den Zähnen und dem Zahnfleischgewebe an und behält seinen Zusammenhalt mindestens teilweise infolge der Wirkung von Polysacchariden und Proteinen. Eines dieser Polysaccharide, ein Glucan, ist bereits als Dextran erkannt worden, das sich durch Dextranasen hydrolysieren lässt. Die Verwendung von Zahnbelag dispergierenden Proteasen für die Mundhygiene ist von Molle in "Journ. So. Calif. Dent. Assn.", Band 35 (1967), Seite 391, und von Shaver und Mitarbeitern in "Journ. Periodontology", Band (1970), Seite 33, empfohlen worden. Zahnbelag enthält in etwa ebenso grossen Mengen wie Dextran noch ein anderes Glucan, das gegen die hydrolytische Wirkung von Dextranase widerstandsfähig ist, und für das die Bezeichnung Cariogenan geprägt worden ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mundpräparat zur Verfügung zu stellen, das Dextran, Cariogenan und gegebenenfalls Proteine des Zahnbelags enzymatisch abbaut.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch angegebene Mundpräparat gelöst.

Die Mundpräparate sollen so zusammengesetzt sein, dass durch eine einzige Mundbehandlung etwa 100-200 000 Dextranaseeinheiten, etwa 10 bis 20 000 Cariogenanaseeinheiten und gegebenenfalls etwa 0,M-200 Azocaseineinheiten von Zahnbelag dispergierender Protease auf den Mund zur Einwirkung gelangen.

380 α τ

Das in dem erfindungsgemässen Mittel enthaltene, Cariogenan abbauende Enzym wird erhalten, indem man

(a) ein halbfestes Nährmedium, das Cariogenan als Kohlehydratquelle suspendiert enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt, bis ein gewisses Klarwerden des suspendierten Cariogenans beobachtet wird,

(b) von diesen Stellen des Nährmediums einen Cariogenan abbauenden Mikroorganismus isoliert,

(c) diesen isolierten Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(d) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt und

(e) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert.

Als Mikroorganismus verwendet man insbesondere einen Mikroorganismus aus der Gruppe NRRL Nr. 5305, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5307, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5308, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309, Bacillus sp. NRRL Nr. B-53OO, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5302, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 und Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310.

Als Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag kommen beispielsweise in Frage Zahnpasten, Mundwässer, Salben, Kaugummi, Tabletten, zerkaubare Tabletten, Nahrungsmittel, Getränke oder auch Formulierungen, bei denen das Enzym mit Hilfe von starken Wasserstrahlen in der Mundhöhle versprüht wird.

- 2 709830/0801

380 A c»

Der Begriff der Azocaseineinheiten wird in Journ. Biol. Chem. 171, Seite 501 (IW) erläutert. Er dient als Einheit für die Bestimmung der Proteaseaktivität.

Cariogenan kann zusammen mit Dextran in vitro durch Streptococcus mutans SL-I (NRRL No. B-5304) erzeugt werden, wenn dieser in einem Medium gezüchtet wird, das Saccharose als Kohlehydratquelle enthält, und es entsteht auch, wenn eine zellfreie Fermentationsflüssigkeit von Streptococcus mutans, die extrazelluläre Enzyme enthält, mit einer Saccharoselösung inkubiert wird.

Das Cariogenan wird von dem begleitenden Dextran durch Inkubieren mit Dextranase getrennt. Das Cariogenan wird von Proteinen nach herkömmlichen Verfahren befreit.

Die Struktur des Cariogenans wurde nach herkömmlichen Verfahren bestimmt, nämlich durch saure Teilhydrolyse und anschliessende qualitative und quantiative Analyse der dabei entstehenden Oligosaccharidfraktionen sowie durch Untersuchungen mit Hilfe der Oxydation mit Perjodat und der Reduktion mit Borhydrid. So wurde die Struktur des Cariogenans als diejenige eines unverzweigten Glucans bestimmt, welches ot-(l—>3)- und Ot-(I—>2)-Bindungen in einem Verhältnis von etwa 3:1 aufweist.

709830/0801

H 380 A t>

Mikroorganismen, die imstande sind, Gariogenan enzymatisch zu hydrolysieren, werden aus in der Luft vorkommenden Bakterien isoliert, indem man Agarplatten, die ein geeignetes Nährmedium mit Cariogenan als Kohlehydratquelle enthalten, der Luft aussetzt und die so entstehenden Kulturen bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich "bei 28 "bis 37° G, für Zeiträume bis zu etwa 10 Tagen inkubiert. Von den sich als aktiv erweisenden Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt.

Das extrazelluläre Enzym Cariogenanase wird in isolierbarer Menge hergestellt, indem man eine Kultur eines Cariogenanase erzeugenden Mikroorganismus bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich von 28 bis 37° C, in einem Nähnnedium in Schüttelkolben inkubiert, bis eine zufriedenstellende Konzentration an Cariogenanaseaktivität erreicht ist, was gewöhnlich etwa 72 bis 96 Stunden dauert. Im allgemeinen benötigen die Mikroorganismen kein Cariogenan als Kohlehydratquelle in dem Nährmedium für die Erzeugung von Cariogenanase. Einer der verwendeten Mikroorganismen, nämlich Bacillus sp. MB-2665 (NRRL No. B-53OO), benötigte jedoch Cariogenan als Nährstoff. Nach herkömmlichen Mutationsmethoden lässt sich jedoch eine konstitutive Mutante erzeugen, die kein Cariogenan im Nährmedium benötigt.

Das Enzym wird aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert, indem man den Zellenabfall und andere unlösliche Stoffe abzentrifugiert oder abfiltriert, das Zentrifugat im Vakuum auf die etwa 5- bis 15-fache, vorzugsweise etwa die 10-fache Konzentration, einengt und das Protein nach herkömmlichen Verfahren, z.B. mit einem organischen Lösungsmittel, durch Komplexbildung mit Metallen oder durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, ausfällt. Vorzugsweise wird die Ausfällung mehrmals wiederholt, der Niederschlag zwischen den einzelnen Ausfällungen in einer Pufferlösung gelöst und die Lö-

_ k _
709830/0801

sung filtriert oder zentrifugiert. Die letzte Ausfällung in wässriger Lösung wird dann dialysiert und entweder als kalte Lösung oder in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

Es wurde gefunden, dass das so erzeugte Enzym für eine odr(l—>3)-Glucosidbindung mit einer vizinalen o6-(l—>2)-Glucosidbindung spezifisch ist. Es hat einen isoelektrischen Einstellpunkt von 5,1. Es weist einen weiten optimalen pH-Bereich mit einer maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich Cariogenanase deutlich von den bisher bekannten Polysaccharasen.

Aus HeIv. Odont. Acta, Band 14 (1970), Seiten 89-108 ist ein Ferment bekannt, welches Mutanase genannt wird und ein Ofc-Glucan angreift, das Mutan genannt wird. Mutan ist zwar ebenso wie Cariogenan ein unlösliches od-Glucan, jedoch sind Cariogenan und Mutan unterschiedliche Produkte; denn Cariogenan weist 1,3- und 1,2-Bindungen auf, Mutan dagegen 1,3- und 1,6-Bindungen. Ebenso sind das in der Literaturstelle genannte Enzym Mutanase und das Enzym Cariogenanase unterschiedliche Enzyme; denn Cariogenanase greift 1,6-Bindungen nicht an, dagegen greift Mutanase solche Bindungen an. Auch die Abbauprodukte der beiden Enzyme sind unterschiedlich. Das Hauptprodukt der Hydrolyse mit Cariogenanase sind Oligoglucane mit etwa 6 Glucose-Einheiten. Dagegen liefert Mutanase Glucose als das hauptsächliche Hydrolyse-Produkt. Der isoelektrische Punkt von Cariogenanase liegt bei 5»1* derjenige von Mutanase bei 4,17.

Da die hergestellte Cariogenanase besonders,gut bei einem pH-Wert von 6,0 wirkt, während Mutanase am besten bei einem pH-Wert von 4,5 wirkt und der durchschnittliche pH-Wert der Mundhöhle etwa 6,5 beträgt, liegt der pH-Wert, bei

709830 /θB0 1

380 A

welchem Cariogenanase am besten ihre Wirkung entfaltet, näher dem pH-Wert der Mundhöhle als der optimale pH-Wert für die Wirkung von Mutanase.

Nachstehend werden verschiedene Verfahren zum Isolieren und Kennzeichnen von in vivo und in vitro hergestelltem Cariogenan beschrieben und Beispiele für die Herstellung und Kennzeichnung der Cariogenanasen gegeben.

Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag

Frischer Zahnbelag wird Personen entnommen, die während eines zur Ausbildung des Zahnbelages dienenden Zeitraums von 4 bis 6 Tagen keinerlei Mundhygiene angewandt haben. Zum Abschaben und Sammeln des Zahnbelages von allen erreichbaren Zahnoberflächen wird ein kleiner Spatel verwendet. Der feuchte Zahnbelag, der gewöhnlich die Grosse einer Erbse hat, wird in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wird 20 Minuten in ein siedendes Wasserbad eingesetzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Die unlöslichen Stoffe werden abzentrifugiert, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet. Gewöhnlich erhält man von einer Person auf diese Weise 6 bis 15 mg Zahnbelag (Trockengewicht).

709830/0801

Das Cariogenan wird aus dem Zahnbelag folgendermassen isoliert:

10 g Polysaccharide werden bei Raumtemperatur 30 Minuten unter ständigem Rühren mit 1 1- 0,5-molarer Natronlauge extrahiert. Das Unlösliche wird abzentrifugiert und verworfen. Die etwas undurchsichtige überstehende Flüssigkeit wird mit 2-norinaler Essigsäure auf einen pH-¥ert von 5,1 gebracht, wobei sich ein schweres Gel bildet. Man verzeichnet das Volumen der sehr zähflüssigen Suspension und setzt je ml 200 Einheiten Dextranase zu. Die Suspension wird bei 37° G inkubiert, bis die anthron-positiven Zucker, löslich gemacht durch die Dextranase, eine maximale Konzentration erreicht haben. Dies erfordert gewöhnlich 6 bis 8 Stunden. Das Dextranase-Aufschlussprodukt, das weniger zähflüssig geworden ist, wird zentrifugiert, um das nicht aufgeschlossene Material zu sammeln. Das pillenförmige Material wird zweimal mit 10 Raumteilen destilliertem Wasser gewaschen. Dann wird es in 5 Raumteilen 0,5-normaler Natronlauge löslich gemacht und durch 15 Minuten langes Behandeln mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 9 Raumteilen Chloroform und 1 Raumteil Butanol in einem Mischer bei niedriger Umlaufgeschwindigkeit von Proteinen befreit. Die Chloroform-Protein-Komplexverbindung wird durch Phasentrennung in der Zentrifuge entfernt. Die kläre wässrige Schicht wird durch Abhebern gewonnen und die Verfahrensstufe der Entproteinisierung wiederholt, bis die Chloroform-Pro tein-Komplexver bindung als dünne Haut erscheint, die die Grenzfläche zwischen den Phasen teilweise bedeckt. Die klare und fast'farblose wässrige Phase wird u&ernacht gegen laufendes entmineralisiertes Wasser dialysiert. Beim Verschwinden der alkalischen Reaktion setzt sich Cariogenan als weisses, durchscheinendes Gel ab, das aus flachen, hellen Teilchen besteht. Das Gel wird durch Gefriertrocknung in ein lockeres, helles Pulver übergeführt, dessen Menge etwa 25 Gewichtsprozent des rohen Ausgangspolysaccharids beträgt.

- 7 709830/0801

Herstellung von Cariogenan in vitro mit Hilfe von Streptococcus mutans

Das Ausgangsmaterial für die Isolierung von Cariogenan wird in einem Medium der folgenden Zusammensetzung erzeugt: 5 g Hefeextrakt, 11 g Aufschlussprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 60 g Saccharose, 1 g Na₂CO,, 0,5 ml Salzlösung (800 mg MgSO₁₁^H₃O, 40 mg PeCl,.6H₃O und 18 mg MnCIp je 100 ml entmineralisierten Wassers), gelöst in 1 1 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,3). Das Medium wird mit Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. Β-53ΟΌ beimpft und das unlösliche Material gewonnen, wenn der pH-Wert auf 5,2 abgesunken ist. Nach dem Zentrifugieren wird das Material zweimal mit 20 Raumteilen entmineralisierten Wassers gewaschen und gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird aus den gefriergetrockneten, in vitro hergestellten, unlöslichen rohen Polysacchariden nach dem gleichen Verfahren isoliert, das oben für die Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag beschrieben wurde.

Herstellung von Cariogenan in vitro mit Hilfe von zellenfreier Streptococcus mutans-Fermentationsflüssigkeit

Polysaccharide werden durch Zusatz von 5 ml einer bei einem pH-Wert von 5»2 gewonnenen, zellenfreien Streptococcus mutans SL-1-Fermentationsflüssigkeit zu 25 ml einer Lösung von 6 Gewichtsteilen Saccharose in 100 Raumteilen einer' 0,10-molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), Filtrieren des Gemisches durch ein Filter mit einer Porengrösse von 0,45 μ und 7-tägiges Inkubieren bei 37° C erzeugt. Die Polysaccharide werden abzentrifugiert, zweimal mit 12 ml· destilliertem Wasser gewaschen, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird nach der oben beschriebenen Methode isoliert.

709830/0801
- 8 _

Bestimmung der Struktur des Cariogenans (a) Ultrarotspektroskopie

Das Ultrarotspektrum des Cariogenans in Nujol zeigt ein Maximum bei 840 cm , was der α-Konfiguration der Glucosidbindungen entspricht. Ein vollkommenes Fehlen einer Absorption bei 890 ei
sind.

890 cm zeigt am, dass keine ß-Glucosidbindungen vorhanden

(b) Säurehydrolyse

Das Cariogenan wird 48 Stunden in 2-normaler Schwefelsäure (in einer Konzentration von 10 mg/ml) hydrolysiert. Durch Feutralisieren mit BaGO, und Zentrifugieren erhält man eine klare Lösung. Die Papier- und die Dünnschichtchromatographie der Lösung ergibt, dass das einzige vorhandene Monosaccharid Glucose ist.

Die Dünnschichtchromatographie wird an Kieselsäuregel G-Platten in zwei Systemen durchgeführt:

System I: 4 Eaumteile n-Butanol, 5 Raumteile Aceton und

1 Eaumteil Wasser;
System II: 9 Eaumteile n-Butanol, 6 Eaumteile Essigsäure, 1 Eaumteil Wasser und 3 Eaumteile Äthyläther.

Die entwickelten Platten lässt man im Luftstrom trocknen. Der Eest von Butanol und Essigsäure wird entfernt, indem man die Platten 30 Minuten in den Vakuumexsikkator einbringt. Die Zucker werden festgestellt, indem man die entwickelte Platte entweder mit einer 5-prozentigen Silbernitratlösung besprüht und 1Q Minuten auf 110° C erhitzt oder mit Naphthol-Eesorcin-Eeagens besprüht und 15 Minuten auf 100° 0 erhitzt. Zur Bestimmung der Molekülgrösse der durch die Einwirkung von Gariogenanase auf Cariogenan entstehenden Hydrolyseprodukte werden als Bezugs-Markierungssubstanzen ein Produkt des Aufschlusses von linearem Dextran mit Dextranase sowie Dextrose und Eaffinose verwendet.

709830⁹/Ö"801

Die Papierchromatographie der Produkte der enzymatisehen Hydrolyse und der Säurehydrolyse wird auf Filterpapierblättern von etwa 20 χ 55 cm nach der absteigenden Methode durchgeführt. Die Chromatogramme werden 2 1/2 Tage mit einem System aus 6 Raumteilen n-Butanol, 4 Raumteilen Pyridin und 3 Raumteilen Wasser entwickelt. Die Zucker werden durch Anfärben mit Silbernitrat in Aceton sichtbar gemacht (vgl. W.E. Trevelyan und Mitarbeiter, "Nature", Band 166 (1960), Seite 444).

(c) Saure Teilhydrolyse

300 mg Cariogenan werden 15 Minuten bei Raumtemperatur in 3 ml 66-prozentiger Schwefelsäure der Säurehydrolyse unterworfen. Das Hydrolysat wird mit Ba(OH)2 neutralisiert und mit destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt. Nach dem Entfernen des Bariumsulfats wird das überschüssige Bariumhydroxid als Bariumcarbonat ausgefällt, indem man kleine Stücke festes Kohlendioxid zugibt. Das Bariumcarbonat wird dann abzentrifugiert. Die klare Lösung wird auf die 10-fache Konzentration eingeengt.

Die Papier- und die Dünnschichtchromatographie des Konzentrats ergeben die Anwesenheit von Nigerotriose (O-cc-D-Glucopyranosyl-(1->3)-0-a-D-glucopyranosyl-(1->3 )-0-a-D-glucopyranose), Nigeröse (O-cc-D-Glucopyranosyl)-(1-^3)-0-a-D-glucopyranose), Kojibiose (0-a-D-Glucopyranosyl-(1->2)-0-oc-D-glucopyranose) und Glucose.

Es ist kein Anzeichen von Isomaltose oder Isomaltotriose (Oligosacchariden mit 1-^6-Bindung) festzustellen.

(d) Oxydation mit Per.jodat

Untersuchungen mit Hilfe der Perjodatoxydation werden nach einem abgeänderten Smith·sehen Abbau durchgeführt, wie er von

_ 10 _

709830/0801

Misaki und Mitarbeitern in "Agr. Biol. Chem.", Band 32 (1968), Seite 432, für Untersuchungen von Dextran beschrieben ist.

Der Gesamtglucosegehalt des Cariogenans, bestimmt durch den Anthrontest, beträgt 5,54 μΜοΙ Anhydroglucose je mg PoIysaccharid. Bs werden 1,53 μΜοΙ Perjodat je mg (5,54 μΜοΙ Anhydroglucose) verbraucht. Bei der Vervollständigung der PerjodatOxydation werden nur 0,05 μΜοΙ Ameisensäure je mg Trokkengewicht in Freiheit gesetzt.

(e) Reduktion mit Borhydrid

Eine Suspension von Cariogenan wird einem teilweisen Smith'sctaen Abbau unterworfen. Der dabei entstehende Polyaldehyd liefert bei der Reduktion mit Natriumborhydrid keinen löslichen PoIyalkohol.

Die Analyse des Polyalkohole auf Gesamtdextrose nach dem Anthrontest ergibt 3,8 μΜοΙ Glucose je mg Polyalkohol.

Bei der Hydrolyse des Polyalkohole wird kein Erythrit in Freiheit gesetzt, jedoch bildet sich Glycerin.

(f) Schlussfolgerung

Aus den obigen Versuchen ergibt sich, dass Cariogenan ein lineares Glucan aus oc-(1—■>3)-Bindungen mit dazwischenliegenden a-(1—>2)-Bindungen in einem Verhältnis von etwa 3:1 ist.

Die Auswahl von Mikroorganismen, die Enzyme erzeugen, welche Cariogenan hydrolysieren, wird auf Agarplatten durchgeführt, die mit einem bestimmten Medium hergestellt werden, welches Cariogenan als Kohlehydratquelle enthält. Das Agarmedium ist

_ 11 _
709830/0801

14 380 A

folgendermassen zusammengesetzt: 100 mg Aufschlussprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 1,5 g Agar, 200 mg Cariogenan, 0,1 ml Salzlösung, wie oben für das Streptococcenmedium beschrieben, in 100 ml 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Das Medium wird 15 Minuten im Autoklaven behandelt. Sobald das Cariogenan suspendiert ist, giesst man das Medium in Petrischalen (100 mm χ 20 mm) in Mengen von 10 ml je Schale. Nach der Einwirkung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen werden die Schalen 10 Tage bei 28 ⁰C aufbewahrt. Die Erzeugung eines hydrolytischen Enzyms lässt sich leicht daran feststellen, dass der Hintergrund von in Agar suspendiertem Cariogenan um die Kultur herum klar wird. Mehrere Mikroorganismen erweisen sich als aktiv, wobei die Aktivität an dem Ausmass des Klarwerdens des Hintergrundes des in Agar suspendierten Cariogenans bestimmt wird. Von diesen Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt. Hierbei fand man: einen nicht identifizierten Fungus (MF-4490) NRRL Nr. 5305; Streptomyces sp. (MA-4226, 4227, 4228 und 4229) NRRL Nr. 5306, 5307, 5308 bzw. 5309; Bacillus sp. (MB-2793, 2794, 2796 und 2665), NRRL Nr. B-5301, B-5302, B-5303 bzw. B-53OO und ein Corynebacterium sp. (MB-2795), NRRL Nr. B-5310. Die Kultur von Bacillus sp. MB-2665 (= NRRL Nr. B-53OO) wird als Mikroorganismus zur Erläuterung ausgewählt; man hätte jedoch ebensogut auch mit einem der anderen Mikroorganismen arbeiten können.

Bacillus sp. MB-2665 (= NRRL B-53OO) wird in Zweitkultur auf cariogenanhaltigen Agarplatten, die, wie oben beschrieben, hergestellt worden sind, zwecks Isolierung und Herstellung von L-Rohren für die Lagerung gezüchtet.

_ 12 _

709830/0801

14 380 A

Herstellung5 Reinigung und Aktivität von Cariogenanase Herstellung

Die Herstellung von Cariogenanase mit der Kultur NRRL B-53OO erfolgt in 2-Liter-Kolben ohne Umlenkorgane, die je 400 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten: 800 mg Nährflüssigkeit, 800 mg Hefeextrakt, 800 mg Aufschlussprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 0,20 ml Salzlösung (wie oben beschrieben), 8 g Cariogenan in 400 ml 0,1-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Nach 15 Minuten langer Behandlung im Autoklaven bei 121 ⁰C wird das Medium mit 1 ml einer 48 Stunden alten Saatkulturbeimpft, die in 50 ml (in 250 ml-Schüttelkolben) Dextrosemedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet worden ist: 10 g Hefeautolysat, 10 g Dextrose, l80 mg KH₃PO₁₁, I90 mg.Na₂HPO₂,, 50 mg MgSO₁,.7H₃ gelöst in 1 1 destilliertem Wasser. Die Erzeugungskultur wird bei 37 ⁰C in einer Schüttelmaschine bei 200 U/min mit einem Hub von 5 cm inkubiert. Die Kultur wird geerntet, wenn das suspendierte Cariogenan klar geworden ist, was gewöhnlich 72 bis 96 Stunden dauert.

Reinigung

Die Fermentationsflüssigkeit wird durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2 ⁰C mit einer Zentrifugalkraft von 16 000.g von Zellen und anderen unlöslichen Rückständen befreit. Die klare überstehende Flüssigkeit wird im Vakuum von 400 ml auf 40 ml eingeengt, und zu dem Konzentrat setzt man im Eisbad unter Rühren Aceton von -60 ⁰C in Anteilen von 2 bis 3 ml zu, bis die Konzentration 60 Volumprozent beträgt. Der Niederschlag wird 10 Minuten bei -20 ⁰C mit einer Zentrifugalkraft von 1500.g abzentrifugiert und sofort in 200 ml eiskalter 0,05-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert.. Die Suspension wird 60 Minuten gerührt und dann durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2 ⁰C und 13 000.g von unlöslichen

14 380 A

Stoffen befreit. Die klare, blaesgelbe überstehende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der Niederschlag wird 20 Minuten bei 2 ⁰C mit einer Zentrifugalkraft von 13 000.g abzentrifugiert und in ¹IO bis 60 ml eiskaltem destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert. Die klare Lösung wird gefriergetrocknet. Das so erhaltene Material (Ausbeute 150 bis 200 mg) ergibt bei der Analyse eine Cariogenanaseaktivität von 400 bis 550 Einheiten je mg.

Einheitsaktivität von Cariogenanase

Die Einheitsaktivität von Cariogenanase wird auf die Beobachtung gegründet, dass für die Abhängigkeit der prozentualen Aufklärung einer Suspension von Cariogenan von dem Logarithmus der Zeit eine geradlinige Beziehung existiert. Wenn überschüssiges Substrat vorhanden ist, gibt die Steigung der geradlinigen Kurve die Aktivität des Enzyms an. Wenn man Verdünnungsreihen mit einem gegebenen Enzympräparat ansetzt, ist es möglich, eine Standardkurve zu zeichnen, indem man die Steigung in Abhängigkeit von einer willkürlich gewählten linearen Skala der Einheitsaktivität in ein Diagramm einträgt. Das Standardanalysensystem enthielt 3,25 mg suspendiertes Cariogenan (1,0 mg je ml in 0,05-molarer Phosphatpufferlösung; pH 6,0) und 0,50 ml Enzym, verdünnt auf eine solche Aktivität, dass die Steigung im Verlaufe einer 5-stündigen Inkubations-

709830/0801

Periode 4 "bis 22 betrug. Bei höheren Enzyrakonzentrationen erreicht die Steigung eine Grenze. Die Inkubationen werden bei 37° C in mit Stopfen verschlossenen Küvetten in einem rotierenden Inkubator durchgeführt, wobei man die optische Dichte bei 620 ΐημ nach 0, 1,3 und 5 Stunden abliest. In einem nicht-linearen Analysensystem entspricht z.B. eine Steigung von 5 einem Wert von 6 Einheiten/ml, eine Steigung von 10 einem Wert von 16 Einheiten/ml und eine Steigung von 20 einem Wert von 62 Einheiten/ml.

Günstigster pff-Wert für die Cariogenanaseaktivität

Das pH-Optimum für Cariogenanase wird unter den üblichen Analysenbedingungen bestimmt, indem man die prozentuale Dispergierung von in geeigneter Weise gepufferten Cariogenansuspensionen (Q,1-molarer Sorensen-Puffer) in einem pH-Bereich von 4,9 bis 8,0 verzeichnet. Die prozentuale Dispergierung wird in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Zeit (in Minuten) in ein Diagramm eingetragen, und die Steigungen der so erhaltenen geradlinigen Kurven werden bestimmt.

	pH-Optimum von Cariogenanase	30 Min.	des Substrats	Steigung
&	Prozentuale Dispergierung	11,0	240 Mn.
	15 Min.	14,0	35,0	28,3
■ 4,9	5,0	18,0	42,0	33,0
5,5	8,0	16,0	45,0	36,0
6,0	12,2	15,0	43,0.	34,0
6,5	10,0	13,0	40,0	33,5
7,0	9,0	31,9	23,1
8,0	7,2

Cariogenanase hat einen weiten Bereich von optimalen pH-Werten mit einer maximalen Aktivität in der Nähe von pH 6,0.

- 15-

709830/0801

l4 380 A

Bindungsspezifität von Cariogenanase

Die Bindungsspezifität des Enzyms wird durch Analyse der Hydrolyseprodukte bestimmt. Die mittlere Länge der Zuckermoleküle wird berechnet, indem man das Verhältnis der Gesamtdextrose vor der Reduktion zu der Gesamtdextrose nach der Reduktion mit Natriumborhydrid bestimmt. Die durch die Wirkung des Enzyms entstehende Glucose wird mit Glucoseoxidase bestimmt. So wird die mittlere Länge der Oligosaccharidmoleküle zu 6,42 Glucoseeinheiten ermittelt. Diese Bruchstücke müssen je nach der Spezifität des Enzyms entweder eine Anreicherung oder eine Verarmung an°<L-(l—5> 2)-Bindungen erfahren haben. Es wird bestimmt, dass die Perjodatempfindlichkeit der inneren Struktur (4,42 Glucoseeinheiten) von etwa 25 auf 45 % zunimmt. Aus dieser Peststellung lässt sich herleiten, dass die oL-il—>2)-Bindung intakt bleibt, und dass dieo6-(l—>3)-Bindung von dem Enzym angegriffen wird. Ferner wird festgestellt, dass ungefähr ebenso viele Q^(I—>3)-Bindungen hydrolysiert werden, wie das Glucanmolekül insgesamt cL-(i—=>2)-Bindungen enthält. Daher wird angenommen, dass die o6-(l—^>2)-Bindung für die Spezifität des Enzyms auf dem Wege über das Erkennen der Angriff ssteile an eine oe-(l—>3)-Bindung eine Rolle spielt, da die Disaccharide Kojibiose und Nigerose Produkte der Säurehydrolyse sind, Nigerotriose ein Endprodukt der enzymatischen Hydrolyse ist und Nigerose sowie Nigeran keine Substrate für Cariogenanase darstellen.

_ 16 _

709830/0801

Beispiel 1 Zahnpaste oder Zahnpulver '

Bekannte Präparate dieser Art, die sich in Lehrbüchern oder im Handel finden, werden durch 5-10 000 Einheiten Cariogenanase und 50-100 000 Einheiten Dextranase je g des Präparats ergänzt. Sie können dann in der normalen Weise auf einer Zahnbürste verwendet werden, wobei für jede Behandlung etwa 2 g Zahnpaste geeignet sind.

Beispiel 2 Einreibsalbe

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden mit etwa 10-20 000 Einheiten Cariogenanase und 100-200 000 Einheiten Dextranase je g Präparat ergänzt. Das Präparat kann mit den Fingern auf die Zähne aufgetragen werden.

Beispiel 3 Mundwasser

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden durch Cariogenanasekonzentrationen von etwa 1,0-2000 Einheiten und 10-20 000 Einheiten Dextranase je ml des Präparats ergänzt. Dieses Mundwasser kann in der Üblichen Weise im Mund umhergespült werden, wobei man im Mittel 20 bis 40 ml verwendet.

- 17 -

709830/0801

14 380 A *0

Beispiel

Kaugummi

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 2,5-5000 Einheiten Cariogenanase,25-50 000 Einheiten Dextranase und 0,1-50 Azocaseineinheiten Protease je g Präparat ergänzt, da ein gewöhnlicher Kaugummistab etwa 4 g wiegt. Ein solcher Kaugummistab kann z.B. in der üblichen Weise gekaut werden. In ähnlicher Weise kann eine zerkaubare Tablette verwendet werden.

Beispiel 5 Tablette

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 10-20 000 Einheiten Cariogenanase und 100-200 000 Einheiten Dextranase je Tablette ergänzt. Die Tablette wird in der üblichen Weise langsam durch Lutschen im Munde in Lösung gebracht. Dies ist die besonders bevorzugte Form des Präparats, weil sie normalerweise die längste Kontaktzeit zwischen dem aktiven Enzym und dem Zahnbelag herbeiführt.

Beispiel 6

Getränke

Das Enzym kann zu Trinkwasser oder Milch zugesetzt werden, ist jedoch von besonderem Wert in saccharosehaltigen Getränken, wie Cola, Orangensaft und ähnlichen mit Geschmacks-

- 18 709830/0801

380 A

stoffen versetzten Getränken, die Saccharose und/oder künstliche Süssstoffe enthalten. Zu einem herkömmlichen Colagetränk wird das Enzym z.B. in Konzentrationen von etwa bis 2000 Cariogenanaseeinheiten und 10-20 000 Einheiten Dextranase je ml zugesetzt. Hierbei erfolgt die Behandlung des Gaumens und der Zähne beim Trinken.

Beispiel 7 Was serstrahl-Zahnreiniger

Zu dem Wasser einer herkömmlichen Vorrichtung zum Reinigen der Zähne mit Hilfe eines starken Wasserstrahls wird Cariogenanase in Mengen von 10-20 000 Einheiten und 100-200 000 Einheiten Dextranase je ml Lösung zugesetzt.

Ende der Beschreibung.

- 19 -

709830/0801

Claims (1)

1. Merck & Co., Inc. 14 380 A

   Patentanspru c h

   Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Cariogenanase und Dextranase, gegebenenfalls in Kombination mit einer Zahnbelag dispergierenden Protease.

   709830/0801