SU465796A3 - Способ получени фермента, разрушающего кариогенан - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, РАЗРУШАЮЩЕГО КАРИОГЕНАН

1 ;

Изобретение относитс  к производству ферментных препаратов.

Предложен способ получени  фермента, разрушающего кариогенан, ранее в патентной литературе не описанный, который заключаетс  в том, что активный микроорганизм, изолированный путем выращивани  на полутвердой среде с кариогенаном, инкубируют в среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, и из фильтрата культуральной ЖИДКОСТИ выдел ют и очищают целевой продукт известными приемами.

Предложенный фермент способен разрушать кариогенан,  вл ющийс  одним из прикрепл ющих средств зубного п тна. Фермент  вл етс  полезной составной частью дл  средств ухода за полостью рта, таких как зубные пасты, эликсиры дл  полоскани  полости рта, различные мази дл  втирани , а также дл  жевательных резинок, лепешек, пастилок, пищевых продуктов, напитков. Кроме того, фермент может содержатьс  в воде, используемой в виде струи, выход щей с большой скоростью, ИЛИ в качестве растворител  энзиматической составной части, или в виде полезной добавки совместно с другими ферментами, такими как декстраназа и/или лротеазы, уничтожающими п тна на зубе.

Средства дл  ухода за полостью рта должны составл тьс  таким образом, чтобы однократна  доза дл  обработки полости рта содержала 10-20 тыс. единиц фермента; желательно в течение дн  производить от одной до нескольких обработок указанной дозой. В случае применени  в сочетании с декстраназой или протеазой, рассеивающими п тна на зубах, или совместно с ними обеИМИ , средства дл  ухода за полостью рта должны составл тьс  таким образом, чтобы доза дл  однократной обработки полости рта содержала - 100-200 тыс. единиц декстраназы , 0,4-200 азоказеиновых единиц протеазы , обеспечивающей рассеивание зубных п тен, И 10-20 тыс. единиц фермента.

Микробные организмы, способные энзиматически гидролизовать кариогенан, отдел ютс  от аэробных бактерий путем выдерживани  пластинок агара, содержащих надлежащую питательную среду, включающую кариогенан в качестве источника углеводорода, и инкубировани  образовавщихс  в итоге культур при подход щей температуре, обычно выбираемой в интервале 28-37°С в течение, примерно, до 10 суток. Организмы, которые были определены как активные, подвергаютс  субкультивированию на аналогичных нластинках агара дл  изолировани .

Фермент выдел ют из питательного бульона путем осветлени  его, отделени  клеточных остатков и других нерастворимых материалов посредством центрифугировани  или фильтровани  с последующим концентрированием центрифугата в вакууме и получением остатка , который в 5-50 раз меньше первоначального объема, предпочтительно в 10 раз. Затем осаждают протеин с помощью стандартных процедур - растворение в органическом растворителе, образование комплексного соединени  с металлом, насыщение такой солью, как сульфат аммони  или подобной ей. Предпочтительны многократные осаждени  с промежуточными растворени ми осадка в буферном растворе и последующими осветлени ми полученных растворов посредством фильтровани  или центрифугировани . В заключение итоговый продукт осаждени  подвергают диализу в водном растворе и сохран ют или в охлажденном растворе или в лиофилизированной форме.

Полученный таким образом фермент отличаетс  специфическим действием в отношении а () глюкозидной св зи с соседней а () глюкозидной св зью. Данный фермент имеет изоэлектрофокусирующую точку равную 5,1 и оптимум в широком интервале значений водородного показател  рН при наличии пиковой активности при значении рН 6,0. Эти характеристики  вно отличают предложенный фермент от любого другого вида распознанной полисахаразы.

Пример 1. Определение фермента. Отбор микробных организмов, вырабатывающих ферменты, гидролизующие дар-иогенан, осуществл ют на агаровых пластинках, приготовленных совместно с определенной средой, содержащей кариогенан в качестве источника углевода. Агарова  среда имеет следующий состав: 100 мг триптиказы, 1,5 г агара, 200 г кариогенана, 0,1 мл солевого раствора, имеющего такой же состав, как дл  стрептококковой среды, в 100 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН среды 7,0. Среду автоклавируют 15 мин. Около 10 мл среды, содержащей хорошо суспендированный кариогенан, выливают в чашку Петри. После экспозиции по отношению к аэробным микроорганизмам чащки выдерживают при температуре 28°С 10 суток.

Факт получени  фермента, обладающего гидролитическим действием, легко распознаетс  по просветлению подложки суспендированного в агаре кариогенана вокруг культуры . Активными оказались различные микроорганизмы , суд  по степени просветлени  основной массы, содержащей суспендированный в агаре кариогенан. Их субкультивируют на аналогичных пластинках агара с целью выделени .

Найдено, что к числу активных микроорганизмов относ тс : неиндентифицированные

грибки (MF--4490) NRLL № 5305; Streptococcus sp. (MA-4226, 4227, 4228 и 4229), NRLL № 5306, 5307, 5308 и 5309 соответственно; Bacillus sp. (МВ-2793, 2796 и 2665), NRLL № В-5301, В-5302, В-5303 и В-5300 соответственно; и Corynebacterium sp. (MB- 2795), NRLLA o В-5310.

Культура Bacillus sp. MB-2665, NRLL № В-5300 была выбрана в качестве организма дл  по снени  рассматриваемого изобретени , хот  можно было применить любую из числа различных других.

Пример 2. Получение фермента. Производ т в двзхлитровых колбах, не имеющих отражательных перегородок, содержащих 400 мл среды следующего состава: 800 мг питательного бульона, 800 мг дрожжевого экстракта , 800 мг триптиказы, 0,20 мл солевого

раствора, 8 г кариогенана, в 400 мл 0,1 М фосфатного буфера; рН 7,0. После автоклавировани  (15 мин при 121°С) среду инокулируют 1 мл культуры после 48-часового посева , введенной в 50 мл (колба дл  встр хиванн  объемом 250 мл) декстрозной среды, содержащей, мг: арадамин (автолизованные дрожжи, поставл емые фирмой «Уэст Продактс Инкорпорейшн) 10000; декстроза 10000; KHsPOi 180; Na2HPO4 190; MgSO47П20 50, растворенных в 1 л дистиллиронной воды. Культуру (MB-2665) получают при температуре 37°С в аппарате дл  встр хивани  (200 об/мин) с амплитудой раскачивани  0,05 М. Культуру собирают после

просветлени  суспендированного кариогенана , обычно.в пределах 72-96 час.

Пример 3. Выделение фермента. Вульон осветл ют от клеточной массы и других остаточных нерастворившихс  веществ посредством центрифугировани  при температуре 2°С в течение 20 мин при 16000 об/мин. Прозрачный всплывший слой концентрируют в вакууме (от 400 до 40 мл) и к полученному

концентрату добавл ют ацетон порци ми по 2-3 мл при перемешивании на лед ной бане до получени  окончательной концентрации 60% (объем/объем). Выделившийс  осадок центрифугируют 10 мин при -20°С, суспендируют в 200 мл охлажденного на льду фосфатного буфера концентрацией 0,05 М при рН 7,0; полученную суспензию перемешивают 1 час, затем осветл ют от нерастворимых веществ центрифугированием при 13000 об/мин

в течение 20 мин и при 2°С. Прозрачный светло-желтый всплывший слой довод т до насыщени  сернокислым аммонием. Осадок собирают центрифугированием при 13 000 об/мин в течение 20 мин при 2°С. Осадок раствор ют

в 40-60 мл охлажденной льдом дистиллированной воды и диализуют 24 час. Прозрачный раствор высушивают вымораживанием. Полученный материал (выход 150-200 мг) оценивают как имеющий активность 400-

500 ед./мг по ферменту. 5 6

Предмет изобретени риогенаном, инкубируют в среде, содержащей

Способ получени  фермента, разрушающе- ли, и из фильтрата культуральной жидкости го кариогенан, отличающийс  тем, что выдел ют и очищают целевой продукт известактивный микроорганизм, изолированный ну- 5 ными приемами, тем выращивани  на полутвердой среде с ка465796

источники углерода, азота и минеральные со