DE2620307A1

DE2620307A1 - Verfahren zum herstellen von enzymen

Info

Publication number: DE2620307A1
Application number: DE19762620307
Authority: DE
Inventors: Yrjoe Maelkki; Pertti Markkanen; Raimo Mattson; Leo Rouhainen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1975-05-08
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1976-12-02
Also published as: NL7604873A; JPS521088A; CH631484A5; DK202976A; FR2310407A1; FR2310407B1; FI51599B; US4062730A; DK140560C; DK140560B; FI51599C

Description

1) Yrjö Mälkki, Helsinki/Finnland

2) Pertti Markkanen, Vantaa/Finnland

3) Raimo Mattsson, Helsinki/Finnland

VERFAHREN ZUM HERSTELLEN VON ENZYMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft, ein Verfahren zum Herstellen von Proteine und Peptide hydrolytisch zu Aminosäuren abbauenden Enzymen, worin die Enzyme in einer Bakterienkultur entstehen, sowie die nach dem Verfahren hergestellten Enzyme.

Gegenwärtig erzeugt man Proteine und Peptide abbauende Enzyme durch Isolieren derselben aus tierischen Verdauungskanalen, Verdauungsdrüsen, aus sonstigen tierischen Geweben, aus Pflanzengeweben sowie in letzten Jahren auch durch Züchten diese Enzyme erzeugender Bakterien, Schimmelpilze, Hefen und Strahlenpilze.

Zum grössten Teil sind jedoch die zuvor bekannten, Proteine und Peptide abbauenden Enzyme Endopeptidasen gewesen, d.h. sie bauen die Proteinmoleküle ab, indem sie die Peptidbindungen in den Mole- '· külen abbrechen. Die Exopeptidasen, d.h. die nahe an den Enden der Moleküle liegende Peptidbindungen hydroIysierende, im technischen Massstab isolierbare und produzierbare Enzyme, waren gering an der Zahl. Weiterhin sind die Enzyme in den meisten Fällen in ihrer Wirkung höchst spezifisch, d.h. sie brechen ganz genau bestimmte Bindungen ab oder erzeugen entsprechendermassen gewisse Verbindungen, womit die Auswahl der Enzyme für den praktischen Bedarf in der Technik, in der Lebenmittelfertigung, in Medizin und Forschung unzulänglich war. Ferner ist die Aktivität der zuvor bekannten Enzyme in der Proteinhydrolyse unbefriedigend; beispielsweise ist die Protease von Streptomyces griseus, die als das am effektivsten Proteine hydrolysierende Mikrobenenzym gilt, nur*imstande etwa 55 %

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. Jl

von den Aminosäurerückständen nach Kasein zu Aminosäuren freizusetzen. ..

Die vorliegende Erfindung hat den Zweck, die oben angeführten Nachteile zu beseitigen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet/ dass zur Herteilung von Enzymen der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens' Mc 864/VTTE 8.7 und/oder der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Mc 865/VTTE 1.9 verwendet wird.

Die Bakterienstämme, die zur Art Pseudomonas fluorescens gehören, werden in der Universität Helsinki, Abteilung der Mikrobiologie unter .Nummer 864 und 865, und in dem StaatlichenForschungscentrum unter Nummer VTTE 8.7 und VTTE 1.9 entsprechend, Finnland,.bewahrt.

Die neuen Bakterienstämme gemäss der Erfindung werden in der Tabelle 2 charakterisiert. Die Bakterien werden in einer Kulturlösung oder auf einem Kultursubstrat (z.B. Festen) in gewöhnlicher Weise gezüchtet.

Die Reiningung der Enzyme und/oder ihr Abtrennen für den Gebrauch von der Kulturlösung bzw. dem Substrat kann unter Anwendung üblicher Verfahren, wie z.B. Zentrifugieren, Ausfällen, Filtrieren, Adsorbieren, Chromatographie usw., erfolgen. Ferner kann man zusammen mit den Enzymen an sich bekannte Aktivatoren, Inhibitoren, Puffersubstanzen u.dgl. Stoffe je nach Anwendungszweck und Bedarf einsetzen.

Es ist festgestellt worden, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Enzyme effektiv imstande sind, die meisten in Proteinen vorkommenden Peptidbindungen zu hydrolysieren, indem z.B. das Kasein der Milch oder das Coprizipitat der Eiweisstoffe in der Milch durch die jetzt hergestellten Enzyme so hydrolysiert wird, dass von den Aminosäureresten der Proteine 60 bis 90 %

lediglich durch Einwirkung der von einem einzigen Bakterienstamm herstammenden Enzyme zu Aminosäuren freigesetzt wurden. Zugleich ist der Abbau der Aminosäuren sehr gering; es fand somit keine Bildung von Schwefelwasserstoff statt. Auch die Entstehung von Ammoniak und Aminen ist gering; beispielweise hielt sich die Gesamtmenge von Histamin, Tryptamin und Tyramin in den Grenzen von 6 bis 60 mg je 100 g Trockensubstanz.

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Tabelle 1

Biotyp

Gram-Färbung Sporenbildung Beweglichkeit Flagella Aurobizität

Heterotrophie

Wachstum bei 273 K Wachstum bei 303 K Wachstum bei 308 K Schwefelwasserstoffbildung .

Nitratreduktion

Phenylalanindeaminase

Hämolyse Oxidase Arginindehydrolase

Gelatineverflüssigung Bildung von Levan

Bildung von fluoresz. Pigment Als Kohlenstoffquelle

- Saccharose

- Trehalose

- Maltose

- Mannose

- Mannit

- Xylose

- Glycerin

- Acetat

- Arginin

- p-Hydroxybenzoesäure

Pseudomonas fluo- Pseudomonas fluorescens Mc 865/ rescens Mc 864/ VTTE 1.9 VTTE 8.7

t +

1-2 polar 1-2 polar

absolut, NO" absolut, NO₃ keine Alternative keine Alternative

verwendet allein verwendet

H	M
η	η
η	η

verwendet nicht verwendet nicht verwendet

verwendet allein

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Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Enzyme können auch mit Vorteil dazu eingesetzt werden, bitteren Geschmack hervorrufende Peptide in Lebensmitteln zu zersetzen, z.B. die in einigen Käsetypen von Mikrobenlaben oder Bakterien herbeigeführten bitteren Peptide. Ferner können die erfindungsgemässen Enzyme in analytischen und Strukturuntersuchungen der Proteine infolge ihres

' ■ überragenden Hydrolysiervermögens verwendet werden. Ferner kann man die Enzyme dazu heranziehen, die der Hydrolyse entsprechende umgekehrte Reaktion, die Plasteinbildung, zu katalysieren.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren von den Bakterienstämmen erzeugten Endopeptidasen sind zelläussere oder extrazelluläre Enzyme, und die Exopeptidasen sind grösstenteils zellinnere oder intrazelluläre Enzyme. Letztgenannte wurden in der späteren Phase der Züchtu; 3 abgesondert, als die Zellen begannen, der Autolyse zu unterliegen .Es wurde festgestellt, dass man die sich abscheidende Exopeptidaseaktivität günstig steigern konnte, indem man zur Kulturlösung oder alternativ zum festen Kultursubstrat anionaktive oder nichtionisierbare Tenside zugab oder auch Tenside in den der . Züchtung nachfolgenden Behandlungsphasen, wie in der Zellenzertrümmerung, im Waschen und in den Abtrennphasen, benutzte. Bei der Verwendung von Tensiden wurde überraschenderweise wahrgenommen, dass intrazelluläre Enzyme in die Kulturlösung bzw. in das feste Substrat übergehen, während das Wachstum der Kultur weiter fortgeht. Die in das Nährsubstrat,übergetretene Exopeptidaseaktivität ist hierbei höher als in einer ohne Tensidzusatz erfolgten Züchtung die zusammengerechnete Exopeptidaseaktivität der Zellen und des Substrats. Die Hinzugabe von Tensid erhöht somit offenbar die Gesamtmenge der während der Züchtung entstehenden zelleninneren Peptidasen. Der Einfluss des Tensidzusatzes auf die L-Leu-L-Thyr-Dipeptidaseaktivität bei der Temperatur 301 K ist in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Tensid · Konz. (%) Zeit (h) Aktivität

bei höchster bis zum An- Einh. je ml Aktivität stieg der 27 h

Aktivität

Ohne Tensid · . 0.04...0.07

OhneTensid 60984 9/0876 °'¹³

< 5-	χί24	2620307	0.23
0.2		2.7	0.15
0.2		0.18
0.2	34	0.11 .
0.2	34		4.0
0.1
0.2		0.11	1.1
0.2	-< 24	0..15	3.0
0.2	-<24		4.3
0.2	< 24	2.6
0.1	-<24
0.5	-C24
0.5

Nichtionisierbare
Triton X-100
Triton X-305
Triton X-405
Tween 20
Tween 80
Cholesterin
Brij-35

Anionische
Na-Laurylsulphat
Na-Dodecylbenz osulphonat
Dioctylnatriumsulphosuccinat 0.1
Na-Tauro eholat
Na-Dehydroxycholat

Kationische
Cetylpyridiniumchlorid 0.025 24 . 0.82

Kombinationen

Na-Laurylsulphat + Cholestrin 0.1 24 0.42

Na-Laurylsulphat + Triton 0.15 24 2.5

Alkylmethylbenz ylammonium-

chlorid + Alkylmethyläthyl-

benzylammoniumchlorid 0.004 · 0.004 24 0.53

Na-Laurylsulphat + Dodecanol 0.1+0.5 24 1.3

Na-Laurylsulphat + Stearyl-

alkohol " 0.1 +0.5 0.10

Teepol GD 53 0.5 24 0.50

Triton X-100 = Polyäthylenglykol-Mono-^a- (1,1,3,3-Tetramethylbutyl}'-Phenyl7-Ä"ther, etwa 10 M Äthylenoxyd enthaltend

Triton X-305 = Polyäth-ylen-Mono-^p-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)-Phenyl7-Äther

Triton X-305 = enthält etwa 40 M. Äthylenoxyd Tween 20 = Polyoxyäthylensorbitanmonolaurät Tween 80 = Polyoxyäthylensorbitanmonooleat Brij-35 = Polyoxyäthylen-23-Lauryläther

Teepol GD 53 = Alkylbenzen-Sulphonat, Alkoholäthoxysuiphonat, und Alkoholäthoxylat.

Bei den mittels des Verfahrens aus dem Bakterienstamm Pseudomonas·

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•Mc 864/VTTE 8.7 hergestellten extrazellulären Endopeptidasen wurde ein Molekulargev«^Ticht von etwa 28.000 und bet ·. den. 3xopeotidasen vbn 71 000 und 62 000 festgestellt. Als intrazelluläre Enzyme wurden Exopeptidasefraktionen festgestellt mit Molekulargewichten von 71 000 und 33 000; vcn der letztgenannten Fraktion wurden Spuren auch in den extrazellulären Präparaten festgestellt.

Es wurde festgestellt, dass die Endopeptidasefraktion bei den pH-Werten 6 bis 11 aktiv war, wo die Fraktion zwei deutliche Optimalstellen 7,8 und 10,5 aufwies. Diese Enzyme werden durch Cystein aktiviert und durch chelatisierende Verbindungen sowie durch Phenylmethylsulphonylchlorid inaktiviert. Die Exopeptidasefraktion hat mehrere Maxima bei pH-Werten zwischen 5.25 und 10.0 je nach dem Substrat. EDTA verhindert effektiv die Aktivität bei den pH-Werten 7.0 und 10.0 und in geringerem Mass bei den Werten 6.0, 8.0 und 9.0. Die Aktivität bei 9.0 nimmt zu, wenn man das Enzym in Phosphat-Pufferlösung stehen lässt, der Magnesiumsalze zugesetzt worden sind. p-Chloromercuribenzoat tilgt die Dipeptidaseaktivät fast gänzlich im gesamten genannten pH-Intervall. Phenylmethylsulphonylfluorid hat keine herabsetzende Wirkung auf die Exopeptidaseaktivität.

Die Erfindung wird im folgenden eingehend mit Hilfe von Ausführungsbeispielen beschrieben.

Beispiel 1 * . .

Der zur Gattung Pseudomonas gehörige Bakterienstamm Mc 864/VTTE 8.7 wurde in einem Nährsubstrat gezüchtet, das Glukose 0.5 %, Hefeextrakt 0.5 %, fettfr.eie Trockenmilch 1 % und Kaliumdihydrogenphosphat 0.1 % enthielt und dessen pH auf 7.0 ein justiert wurde, bei 23°C als Rüttelkultur. In das Nährsubstrat schied sich von Beginn der Züchtung an Endopeptidaseaktivität aus, deren Spiegel sein Maximum nach 38,5-stündiger Züchtung erreichte und hierbei 0.54 Einh. je ml (Mikromol freigesetztesTyrosin je Minute bei 30⁰C) betrug, auf Grund der kaseinhydrolysierenden Wirkung bestimmt. Der Maximalwert der Exopeptidaseaktivität wurde nach 14-stündiger Züchtung erreicht, mit 0.047 Einh. je ml (Mikromol freigesetztes Leucin je Minute bei 30 C) mit Pepton als Substrat.

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Beispiel 2

Peptidasen wurden in einem Substrat produziert, das 3 % Schlempenpulver, 0,5 % Caseinhydrolysat und 0,01 % Magnesiumsulfat (als MgSO₄ . 7H₂O) enthielt. Der pH-Wert des Substrats wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt'. Das Inokulum aus Zellen von Pseudomonas Fluorescens Stamm VTTE 8,7 wurde vorher in Schüttelkolben gezüchtet. Ein Biotec Labor-Fermentor , 2,5 Liter, wurde für die Enzymproduktion verwendet; die Züchtungsbedingungen waren folgende: Temperatur 28 C, Rührgeschwindigkeit 620 UpM, und Belüftung 1 Liter pro Liter Substrat und Minute. In einer anderen Kultur waren die Bedingungen ähnlich, es wurde jedoch Laurylsulfat (Natriumdodecylsulfat) langsam während der 16.-20. Stunde der Züchtung bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % zugegeben. Die Ergebnisse in Fig. 1 und 2 zeigen, daß die Ausbeutender gesamteri"Bftlzyme durch Zugabe von Laurylsulfat verbessert wurden und daß die Organismen nach einer Adaptionsperiode weiter wuchsen und Enzyme produzierten.

Fig. 1 und 2 geben die Enzymaüsbeuten und die Leu-Tyr-Aktivität bzw. Leu-Gly-Aktivität der Enzyme wieder, die in einer Bakterienkultur mit dem Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens, VTTE 8.7 gemäß Beispiel 2 mit bzw. ohne Laurylsulfatzugabe produziert wurden.

Beispiel 3 -

Bei Verwendung der nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Enzymmischung zum Hydrolysieren von Kasein konnte proteinabbauende Aktivität im PH-Bereich 5.0 bis 11.0 festgestellt werden, mit den Maxima der Aktivität bei pH 7.8 und 10.5. Beim Verwenden der von dem gleichen Enzymgemisch mittels GeTfiltrierens abgeschiedenen Dipeptidasefraktion zum Abbauen von Dipeptiden konnten deutliche pH-Optima bei pH 5.25, 6.3, 6.8, 8.0, 9.0 und 10.0 beobachtet werden.

Beispiel 4

Beim Verwenden des aus den nach Beispiel 1 oder 2 getriebenen Züchtungen mit Ammoniumsulfat ausgefällten Enzymgemisches zum Hydroly-. siaren des Copräzipitats der Milchproteine bei pH 4.0 und bei 35 C

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hatten sich nach Erreichen des Gleichgewichtszustandes aus 10Og Protein 73.6 g freie Aminosäuren ergeben.Von den verschiedenen in den Proteinen enthaltenen Aminosäuren waren hierbei jeweils die folgenden Anteile frei vorhanden: °

Asparaginsäure und deren Amid	100 %	Methionin	77
Threonin	82 %	Icoleucin	91
Serin	67 %	Leucin	82
Prolin	59 %	Thyrosin	63
Glutaminsäure und deren Amid	61 %	Phenylalanin	84
Glycin	59 %	Lysin	89
Alanin	97 %	Histidin	100
Valin	93 %	Tryptophan	90
Cystein/Cystin	34 %	Arginin	100
Beispiel 5
Pseudomonas fluorescens, Stamm	VTTE 1.9	wurde in einem	Subs

0,1 %■ Glucose, 03 % Hefeextrat, 0,3 % Trypton und 0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat enthielt, und dessen pH-Wert auf 6,8 einjustiert wurde, bei 25 C 6 Tage lang als Oberflächenkultur in Roux-Kolben gezüchtet. Der Stamm produzierte proteolytische Enzyme mit pH-Optima bei 3,0 und 6,2. Die Enzyme wurden von dem Substrat durch Fällen mit 63 g

₄J₂SO₄ pro 100-ml Substrat abgetrennt, über Nacht bei 4°C stehengelassen, zentrifugiert und der Niederschlag dialysiert. Die proteolytische Aktivität wurde bestimmt durch Zugabe von 1 ml der Enzymlösung zu 5 ml einer 3%igen Lösung von Milchprotein-Copräzipitat, eingestellt auf pH 6,0 und indem die .Probe bei 50°C 10 Minuten inkubiert wurde, die Proteine durch Zugabe von 10 ml einer 0,3 M Trichloressigsäurelösung gefällt und filtriert" wurden, und die optische Dichte bei 280 nm und 10 mm Lichtweg bestimmt wurde. Die Zunahme der optischen Dichte gegenüber der Blindprobe, multipliziert mit 4,545, ergab die Einheiten der Enzymaktivität. Die Aktivität der Enzyme im Kulturmedium betrug 15,6 Einheiten/ml, die Ausbeute nach Fällung und Dialyse v/ar 53 %. Die Aktivität des gefriergetrockneten Dialysats betrug 14,6 Einheiten/mg. Wenn Milchprotein-Copräzipitat mit dieser Präparation hydrolysiert wurde, wurden nach Erreichen des Gleich-

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gewichtes 90,2 g freie Aminosäuren aus 10Og Protein freigesetzt. Beispiel 6

Beim Erhitzen des gemäß Beispiel 2 hergestellten Enzymgemisches in 1/15-molarem und 0.4 M Magnesiumsulfat enthaltendem Natriumphosphatpuffer bei pH 7.0 und bei 60 C blieb die L-Leucyl-L-Tyrosin abbauende Aktivität des Enzyms folgendermassen erhalten: nach 10 Minuten waren von der Aktivität 97 % übrig, nach 30 Minuten 88 % und nach 60 Minuten 33 %.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Herstellen von Proteine und Peptide hydrolytisch zu Aminosäuren-abbauenden Enzymen, worin die Enzyme in einer Bakterienkultur entstehen,dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Enzyme der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Mc 864/VTTE 8.7 und/oder der Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens Mc 865/VTTE 1.9 verwendet wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hergestellten Enzyme intrazelluläre Exopeptidasen enthalten, und dass die Enzyme in Kulturlösung oder auf einem Kultursubstrat hergestellt werden, zu der anion ".aktives oder nichtionisierbares Tensid zugesetzt wird.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Laurylsulphat der Bakterienkultur zugesetzt wird.

4. Verfahren gemäss irgenfeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH auf 7.0 - 11.0 einjustiert wird.

5. Verfahren zum' Herstellen von Enzymen gemäss der Beschreibung oder der Beispiele.

6. Neue Enzyme, hergestellt gemäss der Ansprüche 1-5.

7. Neue Enzyme gemäss der Beschreibung oder der Beispiele.

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