SU810082A3 - Способ получени оптически активных АМиНОКиСлОТ - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ DL-АМИНОКИСЛОТ

остающимис  клеtKaiVfn цп  чего в проойрку с 10 лад фосфатного буферного раствора 0,07 М, р11 8 с 20 мкмоль/мл5-(0,д-фенилгидантоииа прибавл ют i мл бактериальной суспензии ( вес около 50 мг/1гуш) После 30 мин выдержки в термостате при 30 С провод т реакцию с п-диметиламинбеизальдегидом дл  ко.шчественггого определени  образовавшегос  карбамз-шьного производного.

Используют штаммы Pseudomonas sp. 942 или 945, а также р д других этого рода, полученные из Центрального .бюро грибковых культур, где им присвоены символы СВ 14575 и 14675 соответственно. Бактериальные штаммы (табл.1) хорошо растут на всех обыодых лабораторных средах, способны нотребл ть гидантоии в качестве единственного источника азота. Рост наблюдаетс  при 5 - 40°С, оптима71ьные пределы 26--30°С.

Штаммы классифицированы по генетическому принципу. Их характеристика представлена втабл. 2.

Гидролиз гидантоинов происходит не только в присутствии микроорганизмов ivw незатронутых их клеток, но также и в экстрактах этих микроорганизмов, которые могут быть культивированы, например, в  шг.ской питательной среде дл  получе1ш  гидролазы в клетках и DL-гидантоины могут быть 1юс.л этого прибавлены к культуре. Энзиматическа  ферментативна  реакци  может быть .также проведена в отсутствии гак наэглвасмых поко щихс  клеток. В этом случае бактериальные клетки выдел ют нз культуральной среды, П1зо.мывают и сус.пендируют в забуференной среде, к .которой прибавлен раделшческий гидантоин. Могут быть использованы также препараты, содержащие гидролазы , такие как экстракты или коицентратЬ, сьгрые или очищенные препараты гидролазы, полученные из клеток микроорга шзг,тов (табл. 1). Можно, использовать также иммобилизованные ферменты.

и р и м е-р 1. К 100 мл бульонной културы в среде штамма Pseudomonas sp. 942 в колбе объемом 500 ivm прибавл -ют, на 24 ч выдерижи в термостате (перемешивание вращением) при 30° С 100 iv-m фосфатного буферного раствора (0,14 М) с рН 8,5, который содержал, 30 мкмоль/мл 5(D,L)-фe нилгидантоина. После 5 ч выдержки в термостате в тех же услови х определ ют образовавшийс  М-карбомилфён1шглицин. Из 530 м 5-(D 1.)-фенилгидантоина получают 525 мг М-карСамилфенилглйцина, что соответствует примерно 90%-ному выходу.

П р и м е р 2. К бульонной культуре, котора  приготовлена с описанным, выше составом , прибавл ют 1 г/л 5-(0,1)-метилп данТОНН . рН устанавл.йвают на уровне 7,2 добавлением Waj СОз и среду распредел ют по 50 мл в колбы объемом 250 мл. После 30 мин стерилизации при 110° С содержимое колб инокулир тот культурой Pseudomonas sp. 942 с пластинки, котора  содержит ту же среду вместе с 2% агар-агара (Difco) и выдерЖ1гвают в термостате 20 ч при температуре 30° С и перемешивании вращением (220 об/ми С помощью предварительно приготовленной культуры (оптическа  плотность при 550 нм 0,400; степень разбавлени  1:10) инокулируют 5 мл в колбах объемом 500 мл, которые содержат 100 мл той же среды и выдерживают в термостате при 30°С и перемешивании 18 ч (последн   фаза экспоненциального роста ) , riocjje, этого клетки собирают путе.м центрифугировани  и промывают 3 порци ми забуферешюго физиологического раствора, сус17е .1 /тиру1от в буферном растворе соли-фосфата , 0,074 М, рН 8.5 (поко а иес  клетки). Дн  проведени  ферментативного (энзимагического ) гидролиза в колбах объемом 250 м выдерживают в термостате при 30° С и перемешивании 64 Mjt бактерий (сухой вес) и 20 мк.моль/мл 5-(0,1)-фенилгидантоина (3,52 мг/мл). Через различные промежутки времени про.дукт гидролиза, т.е. D-карба: .; ; ;ш;лглицин, определ ют калориметри ..еским методом при длине волны 438 им.

Примерз. Готов т среду следующего состава;

Двузамещенный фосфат натри  WajHPO, г/л7,5

Двузамещенный фосфат кали  КН2РО4, г/л. 2,72

Сульфат аммони .

(N144)2804, г/л5,0

Сульфат магни 

MgSO4, г/л0,2

Сульфат дву.чвалентного марганца MnS04, г/мл0,45 FeS04 -71-120, г/мл5,5 Глюкоза, г/л .10,0 Экстракт дрожжей, г/л 0,2 5-(0,Ь)-Мет И1Гидантоин. г/л . 1,0

Среду разливают по 50 мл в колбы объемом 250 мл и по 100 мл в колбы объемом 500 .мл, стерилизуют 30 мин при 110°С. Содержимое .колб ипокулируют срезом с пластш{ , на которых находитс  культура щтамма Pseudomonas sp. 942 и выдерживают в термостате , 24 ч при 30° С. Из этой культуры (оп-п .ческа  плотность при длине волны 550 нм 0,245; степень разбавлени  1:10) инокулируют 5 мл в колбы объемом 500 . После выдержки 19 ч в термостате при 30° С получают поко щиес  клетки.

Ферментативный гидролиз провод т при в реакционной среде, содержащей 64 мл буфера, 280 мг бактерий (из расчета на сухой вес) и 20 мкмоль/мл 5-{0,и)-фешшгидантоина . Через 5,10 и 15 мин определ ют количество образовавшегос  карбамильного производного , которые составл ют 1,15; 2,05 и 3,00 соответственно.

П р и м е р 4. Бактериальные клетки готов т из штамма Pseudomonas sp. 942 аналогично примеру 2. Суспензии клеток 42 мг/мл (из расчета на вес сухих бактерий) в буферном растворе соли-фосфата 0.1 М, рН 8, подвергают механическому разрушению в гомогенизаторе Мант-Гаулин под давлением850 кг/см и телшературе ниже 24° С. Экстрак отдел ют центрифугированием. К 950 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,7), содерхсашего 2,12 г 5-{0,1)-фенилгидантоина приШтамм

Явл ют 50 мл экстракта, содержащего 8500 ед. фермента, выдерживают 1 ч при 30° С. Получают 1,7 D-карбамнльного производного (80% от теории).

П р и м е р 5. Аналогично примеру 4, к 993 мл субстрата прибавл ют 7 мл экстракта , который предварительно подвергают семикратной чистке. Через 1 ч при 30° С образовываетс  1,7 г О-карбамильного производного (примерно 80% от теории).

П р и м е р 6. Аналогично примеру 2, получают после .30 мин вьшержки при 30° С со игтаммом Pseudomonas sp. 945 и 352 мг 5-(О,Ь)-феш1лп1дантоина 220 мг карбамилфенилглицина (примерно 57% от теории).

Предлагаемый способ обеспечивает получение D-амннокислот в промышленном масштабе , снижение затрат на их производство, а также увеличение выхода продукта с повьшюнной оптической чистотой.

Таблица I

N-карбамилфеинлглицкн, % от теоретического выхода

Pseudomonas sp.

Pseudomones fluorescens

Pseudomonas sp. Pseudomonas ATCC

Pseudomonas oleovorans CL

41

50

17

Pseudomonas desmoiyticum NCIB

8859

Pseudomonas

11250

f luoroscens ATCC Pseudomonas putida ATCC 12633

Подвижность Пспожение спор , Набухание спорангий

Форма спор

Максимальна  темпераTjpa роста, °С

Минимальна  температура роста, °С

Гидролиз крахмала

Желатины

Казеина

Индол

Отношение к нитратам и нитритам- (

Уреаэа

Рост в хлориде натри  2%-ном

3%-ном 5%-ном Каталаза Анаэробиоз

Щелочна  реакци  в У-Р бульоне

8100828

, Продолжение табл. 1

25

25 14

Таблица 2

Предконцевое

4

Эллипсоидна  50-55 30

+ f

+

+

+ +

9810082JO

Claims (1)

1. Формула изобретени тивный гидролиз гидантоиновых производных

   Ооособ получени  оптически активных DL-monas sp. 942 или 945.

   аминокислот путем ферментативного гидроли-.Источники информации,

   за пшантоиновых производных, отличаю-j прин тые во внимание при экспертизе

   щ и и с   тем, что, с целью повышени  выхода1. Патент Японии N 4S-863S, к л. С 12 D 13/16,

   и удешевлени  целевого продукта, фермента-опублик. 1970.

   аминокислот осуществл ют штаммами Pseudo-