PL89658B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania enzymu kariogenazy, powodujacego zmniejszanie próchnicotwórczego nalotu nazebnego.Wiadomo, ze nalot nazebny u ludzi odgrywa wazna role w rozwoju próchnicy, kamienia i chorób tkanki okolozebowej, stanowiac wazny problem zdrowotny i ze nalezy mu zapobiegac przez wlasciwa higiene jamy ustnej.Nalot nazebny przylega do zebów i tkanki dziaslowej a przeciwdziala sie przynajmniej czesciowo jego integralnosci przez dzialania polisacharydów i protein. Jeden z tych polisacharydów, glukan, znany jest jako dekstran powstajacy przy hydrolizie enzymatycznej dekstranazy. W zgloszeniu patentowym Woodruffa w Sta¬ nach Zjednoczonych Ameryki Nr 10.983 zaproponowano dodawanie dekstranazy do srodków sluzacych do utrzymywania higieny jamy ustnej. Podobnie, w publikacjach Molle w J.Soc.Calif.Dent.Assn., 35, 391 (1967) i Shavera i in. w J.Periodontology, 41, 33 (1970) zaproponowano stosowanie w srodkach do utrzymywania^higie¬ ny jamy ustnej protez, powodujacych zdyspergowanie nalotu nazebnego. Stwierdzono nieoczekiwanie, ze osad nazebny zawiera inny osobny glukan w ilosci niemal takiej jak dekstran, odporny na dzialanie hydrolizujace dekstranazy, któremu nadano nazwe kariogenan.Odkryto równiez nieopisane wczesniej enzymy, zdolne do enzymatycznej degradacji kariogenanowego skladnika nalotu nazebnego. Enzym ten nazwano kariogenanaza.Sposób wedlug wynalazku polega na wytwarzaniu powyzszego enzymu kariogenazy. Polega on na tym, ze hoduje sie mikroorganizm Bacillus sp NRRL nr 5300 w srodowisku odzywczym, zawierajacym kariogenan jako jedyne zródlo weglowodanów do momentu zuzycia calego kariogenanu. Nastepnie z brzeczki oddziela sie nie¬ rozpuszczalne substancje, a klarowny przesacz zateza sie okolo dziesieciokrotnie, po czym dodaje sie do niego aceton w temperaturze okolo -60°C w takiej ilosci, aby uzyskac stezenie koncowe okolo 60%. Wytracony tak osad rozpuszcza sie w buforze fosforanowym o wartosci pH okolo 7 i oddziela substancje nierozpuszczalne, po czym nasyca sie roztwór siarczanem amonu i wytracony osad poddaje sie dializie.2 < 89658 Ze wzgledu na zdolnosc kariogenanazy do degradacji kariogenanu, który stanowiJedeJi ze srodków wiaza¬ cych nalot nazebny, znajduje ona zastosowanie jako skladnik srodków stosowanych do utrzymywania higieny jamy ustnej, takich jak pasty do zebów, plyny do plukania ust, masci do wcieraniaJako skladnik gum do zucia, cukierków d<* ssania, tabletek do zucia, pokarmu, napojów lub strumieni wody wtryskiwanych z duza predkoscia, zarówno jako pojedynczy skladnik jak i pozyteczny dodatek w polaczeniu z innymi enzymami, takimi jak dek- stranazy, które powoduja dyspersje nalotu nazebnego oraz dzialajac podobnie jak proteazy.Srodki do utrzymywania higieny jamy ustnej powinny miec taki sklad, aby podczas jednorazowego uzycia poddac jame ustna dzialaniu 10 20000 jednostek kariogenanazy, przy czym pozadane jest stosowanie ich kilka razy dziennie.Gdy kariogenanaze stosuje sie lacznie z dekstranazami lub proteazami powodujacymi dyspersje nalotu nazebnego lub obydwoma tymi enzymami lacznie, zawierajace srodki do utrzymywania higieny jamy ustnej powinny miec taki sklad, aby podczas jednorazowego uzycia poddac jame ustna dzialaniu 100-200.000 jedno¬ stek dekstanazy, 0,4-200 jednostek azokazeinowych proteazy powodujacej dyspersje nalotu nazebnego i, jak wspomniano wyzej, 10-20.000 jednostek kariogenanazy.Ludzki osad nazebny wyodrebniono od pewnej liczby osobników przez fizyczne skrobanie zebów i stwier¬ dzono, ze zawiera on, w przeliczeniu na sucha mase, 0,6-2,3% pplisacharydu odpornego na dzialanie dekstrana- Ten sam polisacharyd wraz z dekstranem, otrzymano in vitro, hodujac Streptococcus mutans SL-l /NRRL NoB-5304/ na pozywce, zawierajacej ajko zródlo weglowodanów cukier trzcinowy, jak równiez inkubujac pozbawiona komórek bulionowa hodowle Streptococcus mutans, zawierajaca pozakomórkowe enzymy, z roz¬ tworem cukru trzcinowego.W kazdytp przypadku kariogenan oddzielano od towarzyszacego dekstranu przez inkubacje z de(kstranaza.Nastepnie znanymi sposobami oczyszczano kariogenan na drodze deproteinizacji.Struktura kariogenanu okreslano w standardowy sposób, polegajacy na czesciowej hydrolizie kwasem z na¬ stepna jakosciowa i ilosciowa analiza otrzymanych frakcji oligosacharydowych i przez badanie utleniania metana- djodanem i redukcji borowodorem. Okreslona w ten sposób struktura przedstawia nierozgaleziony glukan posia¬ dajacy wiazania a—/l -3/ i a ¦-¦/! —2/ w stosunku3:1. , Praktyczna realizacja sposobu wedlug wynalazku polega na tym, ze wytworzona kariogenaze wyodrebnia sie z brzeczki, usuwajac z niej pozostalosci kpmórkowe i inne substancje nierozpuszczalne przez odwirowanie lub filtracje i 5:15-krotne, a korzystnie 10-krotne zatezenie odwirowanej brzeczki pod zmniejszonym cisnieniem oraz wytracanie protein w znany spoób rozpuszczalnikiem organicznym, utworzenie kompleksu z metalem i przez nasycenie sola taka jak siarczan amonu itp. Korzystnie jest stosowac wielokrotne wytracanie z posrednim roz¬ puszczaniem osadu w roztworze buforowym i klarowaniem otrzymanego roztworu na drodze filtracji lub odwiro¬ wywania.Nastepnie koncowy osad w roztworze wodnym poddaje sie dializie i przechowuje jako zimny roztwór lub w postaci zliofitizowanej.Otrzymany w ten sposób enzym charakteryzuje sie specyficznym dzialaniem na wiazania al 1-3/ glikozy- dowe bliskie wiazaniu a/1-2/ glikozydowemu. Ma on punkt izoelektrycznego ogniskowania 5,1 i szeroki zakres optymalnych wartosci pH ze szczytowa aktywnoscia przy pH 6. Tacharakterystyka jasno odróznia kariogenana¬ ze od znanych polisacharoz.Ponizej podano szczególy róznych metod, stosowanych do wyodrebniania i charakteryzowania kariogena¬ nu in vivó i in vitró oraz przyklady otrzymywania i charakteryzowania nowego enzymu wydzielonego sposobem wedlug wynalazku, kariogenanazy. Wydzielanie kariogenanu z nalotu nazebnego ludzi prowadzono nastepujaco: swiezy nalot nazebny pobierano od dawców, którzy zaprzestali wszelkich zabiegów higienicznych jamy ustnej na okres 4-6 dni, potrzebny do utworzenia sie nalotu nazebnego. Do zbierania i laczenia nalotu nazebnego ze wszystkich dostepnych powierzchni zebów stosowano mala szpachelke. Wilgotny nalot, zazwyczaj wielkosci ziarnka grochu, przeprowadzano w stan zawiesiny w 10 mililitrach wody destylowanej i umieszczano zawiesine na wrzacej lazni wodnej na okres 20 minut w celu dezaktywacji enzymów. Substancje nierozpuszczalne groma¬ dzono przez odwirowanie, przeprowadzano ponownie w stan zawiesiny w 2 mililitrach wody destylowanej i wy- mrazano. Zazwyczaj od jednego dawcy otrzymywano 6 -15 mg suchej masy nalotu.Kariogenan izolowano z nalotu nazebnego w nastepujacy sposób. Polisacharydy (10 g) ekstrahowano w temperaturze pokojowej za pomoca 1 litra 0,3 molarnego roztworu NaOH w ciagu 30 minut przy nieustannym mieszaniu. Substancje nierozpuszczalne usuwano przez odwirowanie i odrzucano. Lekko nieprzezroczysty plyn unoszacy sie na powierzchni doprowadzano do pM 5,1 przez dodanie 2N kwasu ocotowego z utworzeniem89658 3 ciezkiego zelu. Notowano objetosc bardzo lepkiej zawiesiny i dodawano do niej dekstrana/e w ilosci 200 jedno- stek na mililitr. Zawiesine inkubowano w temperaturze 37°C az do osiagniecia maksymalnego poziomu dodat¬ nich antranocukrów, rozpuszczonych dzieki dzialaniu dekstranazy, co wymaga zwykle 6-8 godzin.Roztwór przetrawiony dzialaniem dekstranazy, który staje sie mniej lepki, odwirowuje sie w celu zgroma¬ dzenia nieprzetrawionych przez enzym substancji. Pigulki substancji przemywa sie dwukrotnie 10-cioma objeto¬ sciami wody, rozpuszcza w 5 objetosciach 0,5 N NaOH i deproteinizuje równa objetoscia mieszaniny chloro¬ form/butanol wstosunku objetosciowym 9:1 w ciagu 15 minut w mieszalniku przy malej predkosci. Kompleks proteinowochloroformowy usuwa sie przez rozdzielenie faz w wirówce. Przezroczysta warstwe wodna odzyskuje sie przez syfonowanie. Operacje deptoteinizacji powtarza sie dotad, dopóki pojawia sie kompleks cldoroformo- wo-protelnowy w postaci cienkiej blonki czesciowo pokrywajacej powierzchnie miedzyfazowe. Przezroczysta i prawie bezbarwna faze wodna dializuje sie w ciagu nocy biezaca woda, pozbawiona jonów.Po utracie odczynu alkalicznego, kariogenan osadza sie jako bialy, przezroczysty zel, skladajacy sie z plas¬ kich, blyszczacych czastek. Zel wymraza sie do otrzymania klaczkowatego, polyskujacego proszku, stanowiace¬ go okolo 25% surowego wyjsciowego polisacharydu.Wytwarzanie kariogenanu przez Streptococcus mutans in vitro. Material wyjsciowy do wyodrebniania kariogenanu stanowi pozywka o nastepujacym skladzie: 5 g ekstraktu drozdzowego, lig tryptykazy, 60 g sacha¬ rozy, Ig Na2C03, 0,5 g roztworu soli (800 mg MgSG4 • 7H20, 40mg FeCl3 ¦• 6H20, 18mg NuGli w 100 mililitrach wody pozbawionej jonów) rozpuszcza w 1 litrze 0,1 molarnego roztworu buforu fosforanowego opH7,3. Pozywke szczepi sie szczepem Streptococcus mutans SL-1 /NRRL No B-5304/i zbiera substancje nierozpuszczalne gdy wartosc pH spadnie do okolo 5,2. Po odwirowaniu substancje przemywa sie dwukrotnie 20 objetosciami wody pozbawionej jonów i wymraza.Kariogenan wyodrebnia sie z surowego, nierozpuszczalnego, wymrozonego polisacharydu in vitro w ten sam sposób, jak opisano poprzednio w odniesieniu do wyodrebniania kariogenanu z ludzkiego nalotu nazebnego.Wytwarzanie kariogenanu z bezkomórkowego bulionu Streptococcus mutans in vitro.Polisacharydy otrzymuje sie, dodajac 5 mili!itrów bezkomórkowego bulionu Streptococcus mutans SL-1, zebranego przy pH 5,2, do 25 mililitrów 6% roztworu sacharozy (w 0,10 molarnym buforze fosforanowym o pH 7.0), przesaczenie mieszaniny przez filtr o rozmiarach porów 0,45 mikronu i inkubacje w ciagu 7 dni. Polisacha¬ rydy gromadzi sie przez odwirowanie, przemywa dwukrotnie 12 mililitrami wody destylowanej, przeprowadza w stan zawiesiny w 2 mililitrach wody destylowanej i wymraza.Kariogenan wyodrebnia sie sposobem, opisanym poprzednio. Okreslanie struktury kariogenanu. a. Spektroskopia w podczerwieni. Widmo w podczerwieni w Nujolu wykazuje maksimum pny 840 cm*1 wskazujac a-konfiguracje wiazan glikozydowych. Calkowity brak absorpcji przy 890 cm"1 wskazujena torik wiazan 0-glikozydowych. b. Hydroliza kwasem. Kariogenan poddaje sie hydrolizie 2N H2SO4 (10 mg/ml) w ciagu 48 godzin. Pó neutralizacji BaC03 i odwirowaniu otrzymuje sie klarowny roztwór. Chromatografia bibulowa i cienkowarstwo¬ wa roztworu wykazuje, ze jedynym monosacharydem, obecnym w roztworze jest glukoz Chromatografie cienkowarstwowa prowadzi sie na plytkach z silikazelu G, (Analtch, Inc) w dwóch ukla¬ dach. Uklad I: n-butanol-.aceton:woda wstosunku 4:5:1. IJklad II: n-butanol :kwas octowy:wodaster etylowy wstosunku 9:6:1:3. Plytki z rozwinietym chromatogramem suszono w strumieniu powietrza. Pozostaly butanol i kwas octowy usuwano, umieszczajac plytki weksykatorze pod zmniejszonym cisnieniem na okres 30 minut.Cukry lokalizowano, natryskujac plytki z rozwinietym chromatogramem 5% roztworem azotanu Srebra (ogrze* wanie 110°C w ciagu 10 minut) lub odczynnikiem naftolowo-rezorcynowym z ogrzaniem w temperaturze 100°C wciagu 15 minut. Jako wskazników do okreslenia wymiarów czasteczek produktów hydrolizy powstalych pod dzialaniem kariogenanazy na kariogenan stosowano przetrawiony przez dekstranaze liniowy dekstran-100 (Sig¬ ma) jak równiez dekstroze i rafinoze.Chromatografie bibulowa produktów hydrolizy enzymatycznej i kwasowej prowadzono na arkuszach bibu» ly Whatman No 1 o wymiarach 20x55 cm metoda zastepujaca. Chromatogram rozwijano w ciagu 2,5 dnia w ukladzie: n-butanolpirydyna woda w stosunku 6:4:3. Cukry lokalizowano przez wybarwienle roztworem azo* tanu srebra w acetonie metoda W.E.Traveylanai in. opisana w Nature, 166,444, (1960). c. Czesciowa hydroliza kwasem. Kariogenan poddawano hydrolizie kwasem, dzialajac na 300 mh karioge¬ nanu 3 mililitrami 66% kwasu siarkowego w ciagu 15 minut w temperaturze pokojowej. Hydrolizat neutralizowa¬ no Ba/CH/2 i rozcienczano woda destylowana do objetosci 100 mililitrów. Po usunieciu BaS04 nadmiar Ba/OH/2 usuwano jako BaC03, dodajac drgbne kawalki suchego lodu. BaC03 usuwano przez odwirowanie.Klarowny roztwór 10-krotnie zageszczano.4 89658 Chromatografia bibulowa i cienkowarstwowa koncentratu ujawnia obecnosc nigcrotriozy /O-a-D-glukopiranozylo-/1-3/-0-a-D-g1ukopiranozylo-/l-3/-0-a-D-glukopiranozy/, nigerozy /O-a-D-glukopiranozylo/-1 -3-/-0-a-D-glukopiranozy/, kojiblozy /0-a-D-gJukopiranozylo/-l-27-0«a-D-glukopiranozy/ i glukozy.Nie ma dowodu na obecnosc izomaltozy lub izpmaltotriozy (oligosacharydy o wiazaniach 1-6). d. Utlenianie nadjodanem. Badanie utleniania nadjodanem prowadzono metoda zmodyfikowanej degradacji Smrilia, opi$ana przez Misaki i ki. w publikacji Agr.BioKChem. 32, 432 (1968), stosowana do badan dekstranu.Calkowita zawartosc kariogenanu, okreslona w próbie antronowej, wynosi 5,54 mikromoli anhydroglukozy na miligram polisacharydu. Zuzywa ona 1,53 mikromola nadjodanu na miligram (5,54 mikromoli anhydrogluko¬ zy). W chwili zakonczenia utleniania nadjodanem, uwalnia sie tylko 0,05 mikromola kwasu mrówkowego na miligram substancji suchej. e. Redukcja borowodorem. Zawiesine kariogenanu poddaje sie czesciowej degradacji Smitha. Powstale polialdehydy zredukowane borowodorkiem sodu nie tworza rozpuszczalnego polialkoholu. Analiza polialkoholu na calkowita zawartosc dekstrozy w próbie antronowej wykazuje 3,8 mikromoli glukozy na miligram polialkoho- lu. , Hydroliza polialkoholu nie ujawnia obecnosci erytrytolu, a powoduje powstanie gliceryny. f. Wniosek. Na podstawie powyzszych dowodów okreslono, ze kariogenan jest liniowym glukanem zawiera¬ jacym wiazania a-/l-3/ przedzielone wiazaniami a-/l-2/ w stosunku 3:1.Nastepujace przyklady I i II ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie kariogenanazy. Wytwarzanie kariogenanazy prowadzi sie w kolbie o pojem¬ nosci 21 zawierajacej pozywke o nastepujacym skladzie: 800 mg bulionu odzywczego, 800 mg ekstraktu droz¬ dzowego, 800 mg tryptykazy, 0,20 mililitrów roztworu soli (o skladzie opisanym wyzej), 8 g kariogenanu (nie istotne dla wszystkich hodowli), w 400 mililitrach 0,1 molarnego buforu fosforanowego o pH 7,0. Po wyjalowie¬ niu w autoklawie w ciagu 15 minut w temperaturze 121°C pozywke szczepi sie 1 mililitrem 48-godzinnej hodo¬ wli posiewowej w 50 mililitrach (kolba do wstrzasania o pojemnosci 250 mililitrów) pozywki dekstrozowej o na¬ stepujacym skladzie: 10 g Aradaminy (autolizowane drozdze produkcji Yeast Products, Inc.), 10 g dekstrozy, 180 mg KHaOP4, 190 mg MgS04 • 7H20, 50 mg MgS04 • 7H20, rozpuszczone w 1 litrze wody destylowanej.Hodowle produkcyjna MB-2665, szczepu NRRL nr 5300 inkubuje sie w temperaturze 37°C na wstrzafarce o skoku*3,08 mm przy szybkosci 200 obrotów/minute. Kulture zbiera sie, gdy pozywka staje sie przezroczysta skutek zuzycia zawieszonego kariogenanu, zazwyczaj po 72-96 godzinach.Wyodrebnianie kariogenanazy. Brzeczke klaruje sie przez odwirowanie w ciagu 20 minut w temperaturze 2°C przy przyspieszeniu 16 000 g komórek i innych nierozpuszczalnych pozostalosci. Klarowna ciecz zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem (od objetosci 400 mililitrów do objetosci 40 mililitrów) i do koncentratu, umieszczonego w kapieli z lodu dodaje sie w temperaturze -60°C, przy ciaglym mieszaniu, aceton, porcjami po 2-3 mililitrów do koncowego stezenia 60% objetosciowych. Wytracona substancje gromadzi sie pijez odwirowa¬ nie wciagu 10 minut w temperaturze -20°C przy przyspieszeniu 1500 g. ftad natychmiast przeprowadza sie wstan zawiesiny w 200 mililitrach ochlodzonego lodem 0,3 molarnego buforu fosforanowego o pH 7,0. Powsta¬ la zawiesine miesza sie wciagu 60 minut, a nastepnie klaruje przez odwirowanie substancji nierozpuszczalnych w temperaturze 2°C w ciagu 20 minut przy przyspieszeniu 13 000 g. Klarowny jasnozólty roztwór nasyca sie nastepni* /NH4/2S04. Cfcad gromadzi sie przez odwirowanie w ciagu 20 minut w temperaturze 2°C przy przy¬ spieszeniu 13000 g, rozpuszcza sie w 40-60 mililitrach wody destylowanej ochlodzonej lodem i podaje dializie w ciagu 24 godzin. Klarowny roztwór wymraza sie. Powstala substancja (wydajnosc 150-200 ihg) odznacza sie aktywnoscia kariogenanazy wynoszaca 400-50 jednostek/mg.Otrzymana kariogenaze poddano nastepujacym badaniom majacym na celu oznaczenie jest wlasciwosci i dzialania.Izoelektroogniskowanie kariogenanazy. Ctenaczanie izoelektroogniskowania prowadzi sie na kolumnie ele- ktroogniskujacej o pojemnosci 110 mililitrów, opisanej przez Charieta iin., Applied Microbiol. 20, 421 (1970).Znaleziony punkt izoelektroogniskujacy 5,1.Jednostkowa aktywnosc kariogenanazy. Okreslenie jednostkowej aktywnosci kariogenanazy oparto na spo¬ strzezeniu, ze istnieje prostoliniowa zaleznosc pomiedzy procentowa klarownoscia zawiesiny kariogenazu, a loga- rytmem czasu. Przy nadmiarze substratu nachylenia prostej odzwierciedla aktywnosc enzymu.• Badajac dany preparat enzymatyczny w szeregu rozcieiTczen mozna bylo wykreslic standartowa krzywa, sporzadzajac wykres nachylenia wzgledem'dowolnej liniowej skali jednostkowej aktywnosci. Standardowy uklad próbny zawiera 3,25 mg zawieszonego kariogenanu (1,0 mg) mililitr w 0,05 molarnym buforze fosforanowym89658 5 o pH 6,0/ i 0,50 mililitra enzymu, rozcienczonego do takiego poziomu aktywnosci, ze daje nachylenie krzywej 4-22 po 5-ciogodzinnym okresie inkubacji. Przy wyzszym poziomie zawartosci enzymu nachylenie staje sie ograniczone. Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 37°C w zamknietych kuwetach umieszczonych na inkuba¬ torze rotacyjnym. Odczytu gestosci optycznej dokonuje sie przy 620/im po 0,1, 3 i 5 godzinach. W nieliniowym ukladzie testowym, np. nachylenie 5 równe jest 6 jednostkom/mililitr, nachylenie 10 równe jest 16 jedno- stkom/mililitr a nachylenie 20 równe jest 62 jednostkom/mililitr.Optymalne pH aktywnosci kariogenanazy. Optymalne pH dla kariogenanazy okreslano w zwyklych warun¬ kach testowych, notujac procentowa dyspersje zawiesiny kariogenanu, odpowiednio buforowana (0,1 molarny bufor Sprensena) w przedziale pH 4,9—8,0.Sporzadzano wykres procentowy dyspersji wzgledem logarytmu czasu (w minutach) i okreslono nachylenie otrzymanych prostych.Optymalne pH kariogenanazy | PH 4,9 ,5 6,0 6,5 7,0 8,0 Procentowa dyspersja substratu min. ,0 8,0 12,2 ,0 9,0 7,2 min. 11,0 14,0 18,0 16,0 ,0 13,0 240 min. ,0 42,0 45,0 43,0 40,0 •ai.9 Nachylenie 28,3 1 33,0 36,0 34,0 33,5 23,1 Kariogenanaza ma szeroki zakres optymalnych pH za szczytowa aktywnoscia w poblizu pH 6,0.Specyficznosc dzialania kariogenanazy na wiazania. Specyficznosc dzialania enzymu na wiazania okreslano na podstawie analizy produktów hydrolizy. Przecietna dlugosc cukru oceniano, otrzymujac stosunek dekstrozy przed i po redukcji przy pomocy NaBFLp Glukoze powstajaca dzieki dzialaniu enzymu okreslano przy pomocy gjlukozooksydazy (Glucostat Worthington). I tak przecietna dlugosc oligosacharydu okreslono jako 6,42 jedno¬ stek glukozowych. Te fragmenty moglyby swiadczyc zarówno o przyroscie jak i o ubywaniu wiazan a-/l -? 2/, zaleznie od specyficznosci enzymu. Stwierdzono, ze podatnosc nadjodanowa wewnetrznej struktury czasteczek (4,42 jednostki glukozy) wzrasta z okolo 25 do 45%. Wnioskuje sie stad, ze wiazanie a-/l -* 2/ pozostaje nienaruszone i ze enzym atakuje wiazanie a-/l -* 3/. Dodatkowo stwierdzono, ze enzym hydrolizuje niemal tyle wiazan a-/l -* 3/, ile wynosi zawartosc wiazan a-/\ -* 2/ w glukanie. Sadzi sie, ze wiazania a-/l -+2/ Odgrywaja role w specyficznosci dzialania enzymu, poprzez rozpoznawanie miejsca ataku na wiazanie a-/1 -? 3/, poniewaz dwusacharydy, kojibioza i nigeroza sa produktami hydrolizy kwasem, a nigerotrioza jest koncowym produktem hydrolizy enzymatycznej i zarówno nigeroza jak i nigeran nie sa substratem dla kariogenanazy.W przykladach II—IX przedstawiono rózne mozliwe preparaty sporzadzone w oparciu o uzyskana sposo¬ bem wedlug wynalazku kariogenaze. Przyklady II—IX nie ilustruja wynalazku, a jedynie stanowia dodatkowa informacje o mozliwosciach stosowania kariogenazy w praktyce.Przyklad II. Pasta lub proszek do zebów. Preparaty o przyjetych skladach, które mozna znalezc w podrecznikach lub znajdujace sie w sprzedazy uzupelnia sie dodatkiem 5-10.000 jednostek enzymu karioge¬ nanazy na gram preparatu. Mozna je stosowac w normalny sposób przy pomocy szczoteczki do zebów, uzywajac do kazdego zabiegu okolo 2 g pasty.Przyklad III. Masc do wcierania lub plyn do przemywania. Preparaty o przyjetych skladach, które mozna znalezc w podrecznikach lub znajdujace sie w-sprzedazy uzupelnia sie dodatkiem 10-20.000 jednostek enzymu kariogenanazy na gram przepustu. Mozna go stosowac do zebóów i dziasel przy pomocy palców.Przyklad IV. Plyn do plukania ust. Preparaty o przyjetych skladach, które mozna znalezc W podre¬ cznikach lub znajdujace sie w sprzedazy uzupelnia sie kariogenanaza w ilosci 1,0-2000 jednostek/mililitr prepa¬ ratu. Preparatem takim plucze sie usta w zwykly sposób, uzywajac przecietnie 20-40 mililitrów preparatu.Przyklad V. Guma do zucia. Preparaty o przyjetych skladach, które mozna znalezc w podreczni¬ kach lub znajdujace sie w sprzedazy uzupelnia sie dodatkiem 2,5-5000 jednostek enzymu kraiogenanazy na gntm preparatu, przy zwyklym ciezarze batonika gumy do zucia wynoszacym 4 g. Batonik gumy do zucia mozna zuc np. w zwykly sposób. Podobnie mozna stosowac tabletki do zucia.Przyklad VI. Cukierek. Cukierki o przyjetym skladzie, które mozna znalezc w podrecznikach lub znajdujace sie na rynku uzupelnia sie dodatkietn 10-20.000 jednostek kariogenanazy na cukierek. Cukierek mozna rozpuszczac powoli w ustach w zwykly sposób. Najkorzystniejsze sa cukierki, których sklad zapewnia przy nonnalnym uzyciu najdluzszy czas zetkniecia aktywnego enzymu z nalotem nazebnym.6 89 658 P* z y k l a d VII. Pozywienie. Poniewaz zwykle spozywa sie znaczne ilosci pozywienia, dodaje sie do niego np. do sniadaniowej kawy zbozowej i chleba 1 -2000 jednostek kariogenanazy na gram. Innym szczególnie wartosciowym przykladem jest dodawanie enzymu do pokarmów, zawierajacych znaczne ilosci cukru, takich jak zwykle slodycze 1 lody. Zucie w zwykly sposób powoduje nakladanie enzymu na zebach 1 dziaslach.Przyklad VIII. Napoje. Enzym dodaje sie do wody pitnej lub mleka ale szczególnie korzystne jest dodawanie go do napojów takich jak cola, oranzada i podobnych smacznych napojów zawierajacych cukier i/lub sztuczne srodki slodzace. Enzym dodaje sie w ilosci l -2000 jednostek kariogenanazy na mililitr konwencjonal¬ nej coli. Powoduje to w czasie picia nakladanie enzymu na dziaslach i zebach.Przyklad IX. Czyszczenie zebów wtryskiwanym strumieniem wody. Do wody, stosowanej w kon¬ wencjonalnym aparacie, wtryskujacym na zeby strumien wody o duzej predkosci w celu ich oczyszczenia dodaje sie kariogenanaze w ilosci J 0-20 000 jednostek na mililitr roztworu. Sklady innych preparatów zawierajacych kariogenanaze, jak równiez dekstranaze lub proteaze lub obydwa te enzymy lacznie podano w tablicy I.Tablica I • Preparat Pasta lub proszek do zebów 1 Masc do wcierania 1 lub plyn do przemywania Plyn do plukania ust Gunia do zucia Pozywienie 1 Napój • Wtryskiwane strumienie wody do czyszczenia zebów Cukierek Kariogenanaza 10000* 10000 10000 20000 JP000 20000 1 2000 1 2000 1 *2000 2,5 5000 2,5- 5000 2,5 5000 l 2000 1 2000 1 2000 1 2000 1 2000 1 - 2000 20000 20000 - 20000 - 20000 " jedn. /cukierek -20000 jedn./cukierck - 20000 jedn./cukierek Dekstranaza 100 - 200000 100-200000 100-200000 100 - 200000 100 - 50000 100 - 50000 100 - 50000 100 - 50000 - 50000 - 50000 - 50000 - 50000 - 50000 - 50000 100 - 200000 100 200000 Proteaza 0,2 - 100 0,2-100 | 0,2 - 100 0,2 - 100 0,2-100 0,2-100 | 0,2-100 0,2-100 | 0,2-100 0,2-^100 | 0,2-100 0,2-100 | 0,2-100 0,2-100 | 0,2-100 0,2 - 100 * Jednostek na mililitr cieczy lub na gram substancji stalej, jesli nie wskazano inaczej.L Druk-WOSJ „WspólnaSwuwa" Format A4. N«jklj-J 120 JG. Ch.j tO«M. PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania enzymu kariogenazy, znamienny tym, ze mikroorganizm Bacillus sp. NRRL nr.5300 poddaje sie hodowli w srodowisku odzywczym, zawierajacym kariogenan jako jedyne zródlo weglowo¬ danów do momentu zuzycia calego kariogenanu. nastepnie oddziela sie nierozpuszczalne substancje z brzeczki, zateza sie klarowny przesacz okolo dziesieciokrotnie, po czym dodaje sie do niego aceton w temperaturze okolo •60 C w takiej ilosci, aby uzyskac stezenie koncowe okolo 60%, a nastepnie wytracony osad rozpuszcza sie w buforze fosforanowym o wartosci pH okolo 7 i oddziela substancje nierozpuszczalne, po czym nasyca sie roztwór siarczanem amonu i wytracony osad poddaje sie dializie. Sklad-PraO. Po»igr;if. UP P* PL PL PL