DE3035193A1

DE3035193A1 - Neues antibiotikum sf-1130-x(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts), verfahren zur herstellung desselben sowie mittel, welche das neue antibiotikum

Info

Publication number: DE3035193A1
Application number: DE19803035193
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Yokohama Kanagawa Inouye; Jiro Yokohama Kanagawa Itoh; Shigeharu Kawasaki Kanagawa Niizato; Tomizo Yokuhama Kanagawa Niwa; Shoji Tokyo Kanagawa Omoto; Takashi Yokohama Kanagawa Shomura
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1979-09-19
Filing date: 1980-09-18
Publication date: 1981-04-09
Also published as: JPS5643294A; GB2060629B; FR2465742B1; JPS6220993B2; FR2465742A1; US4316894A; DE3035193C2; GB2060629A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, welches die Bezeichnung SF-1130-x- erhalten hat und welches als Mittel zur Inhibierung der enzymatischen Wirkung von Glucosidase brauchbar ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung des neuen Antibiotikums, gemäss welchem ein Stamm der Gattung Streptomyces gezüchtet und anschliessend aus der Gärbrühe das entstandene Antibiotikum isoliert wird. Schliesslich betrifft die Erfindung auch noch verschiedene Mittel, die das Antibiotikum SF-1130-xenthalten und welche als O^-Glucosidase- und Saccharase-Inhibitoren wirken; diese Mittel lassen sich auch als Therapeutika zur Verhütung einer Erhöhung des Blutzuckerspiegels bei lebenden Tieren - auch bei Menschen - welche Stärke und/oder Zucker mit der Nahrung aufgenommen haben, verwenden.

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Eingesandte Modelle werden nach 2 Monaten, falls nicht zurückgefordert, vernichtet. Mündliche Abreden, insbesondere durch Fernsprecher, bedürfen schriftlicher Bestätigung. — Die in Rechnung gestellten Kasten sind mit Rechnungsdatum ohne Abzug fällig. — Bei verspäteter Zahlung werden Bankzinsen berechnet.

Gerichtsstand und Erfüllungsort Bremen.
Bremer BanR^ Bremen, Nr. 2310028 - Die Sparkasse in Bremen, Nr. 1045855 - Postscheckkonto-..Hamburg 33952-202

- tf- i6.o9.3ogp35193

. S-

Aus der Kulturbrühe verschiedener Stämme der Gattung Streptomyces lassen sich verschiedene wertvolle Substanzen gewinnen bzw. isolieren. Es ist bekannt, dass Streptomyces myxogenes SF-113O (hinterlegt unter der Nummer FERM-P 676 bzw. ATCC 31305) ein Antibiotikum erzeugt, welches die Bezeichnung SF-1130 trägt (vergl. japanische Auslegeschrift 30393/73). Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung war zu einem früheren Zeitpunkt bereits festgestellt worden, dass in der Gärbrühe des Mikroorganismus Streptomyces myxogenes SF-1130 weitere Antibiotika vorhanden sind, die eine Wirkung gegen gramnegative Bakterien aufweisen. Es war auch gelungen, diese aktiven Substanzen aus der Gärbrühe zu isolieren» Die Substanzen erhielten die Bezeichnungen SF-1130-x. und SF-1130-Xr, und sind in der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai" 26398/78 sowie in der US-PS 4,160,026 beschrieben.

Bei weiteren Untersuchungen an der Gärbrühe von Streptomyces myxogenes SF-1130 bzw. dem daraus gewonnenen Rohprodukt, welches die Antibiotika bzw. Substanzen SF-IlSO-X₁ und -x₂ enthielt, zeigte sich jetzt, dass das Rohprodukt auch noch einen dritten Bestandteil enthielt, der bisher nicht entdeckt worden war, der jedoch auch eine sehr schwache antibakterielle Wirkung aufweist. Es ist jetzt gelungen, diese dritte Komponente aus dem Rohprodukt zu isolieren; diese dritte Komponente hat die Bezeichnung SF-1130-x„ erhalten. Untersuchungen an dieser Substanz SF-1130-x_ haben gezeigt, dass es sich um

ein Oligosaccharid mit schwach basischem Charakter handelt, dessen physikalisch-chemische Eigenschaften im Folgenden beschrieben werden. Aus den Kenndaten ergibt sich, dass die neue Substanz bzw. das neue Antibiotikum von bekannten verwandten Antibiotikaarten verschieden ist.

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S-

Ausserdem konnte festgestellt werden, dass das erfindungsgemässe neue Antibiotikum SF-1130-x_ ein hochwirksames Mittel zur Unterdrückung der enzymatischen Aktivität von Glucosidase ist.

gegenstand der Erfindung ist infolgedessen das im Anspruch beanspruchte und gekennzeichnete neue Antibiotikum SF-1130-x„. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das in den Ansprüchen 2 und 3 beanspruchte und gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums SF-1130-x.,.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind schliesslich Mittel, welche das erfindungsgemässe neue Antibiotikum SF-1130-X-7 enthalten und welche als Inhibitoren der enzymatischen Wirkung von Glucosidase sowie als Mittel zur Unterdrückung einer Erhöhung des Blutzuckerspiegels bei Mensch und Tier, die Stärke und/oder Zucker zu sich nehmen, wirken.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann mit beliebigen Stämmen der Gattung Streptomyces durchgeführt werden, vorausgesetzt, dass diese in ausreichendem Maße das Antibiotikum SF-1130-x,, produzieren. Besonders geeignet für das erfindungsgemässe Verfahren ist beispielsweise ein Stamm, der aus einer Bodenprobe isoliert worden ist und die Bezeichnung Streptomyces myxogenes SF-1130 erhalten hat (vergl. "The Research Annual Report of Meiji Confectionery Co.", Nr. 14, Seiten 6 bis 9 (1975) oder US-PS 4,160,026). Dieser Stamm SF-1130 ist bei der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermantation Research Institute" unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 676 und bei der "American Type Culture Collection" in Washington, D.C., USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31305 hinterlegt worden.

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Das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x- weist die im Anspruch 1 genannten sowie folgende weitere Kenndaten auf:

1) Schmelzpunkt: 183⁰C (unter Zersetzung) 2) Natur: schwach basisches Oligosaccharid.

3) Molekulargewicht: etwa 830 (bestimmt mit Hilfe der Massenspektrometrie an dem permethylierten Derivat).

4) Gewichtsanalyse: C 43,3196; H 5,88%; N 1,71%; 0 49,10% (Rest).

5) Spezifische optische Drehung: (oO_D +154° (c 1; in Wasser).

6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: kein charakteristischer Absorptions-Peak (in wässriger Lösung mit 100 /ig SF-1130-x- pro ml).

Infrarot-Absorptionsspektrum: dargestellt in Fig. 1; Peaks bei 3350 (breit), 1647, 1400 (breit) 1147 und 1033 (breit) Cm^-1.

7) Protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum: dargestellt in Fig. 2.

8) Kohlenstoff-kernmagnetisches Resonanzspektrum: dargestellt in Fig. 3.

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9) Löslichkeit in Lösungsmitteln: löslich in Wasser und Dimethylsulfoxid; weniger bzw. schwach löslich in Alkoholen wie Methanol und Äthanol; unlöslich in Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol.

10) Farbreaktionen: positiv gegenüber Silbernitrat-Natriumhydroxid, Tetrazol-Rot, Anthron und Greig-Leaback-Reagenz.

11) R_n „„. -Werte bei der Papierchromatographie:

Kaiιino s e

' beim Arbeiten nach der absteigenden Methode unter Verwendung von Toyo-Filterpapier Nr. 50 ergeben sich ein Wert von 0,64, wenn Äthylacetat-Pyridin-Wasser (10:4:3) als Lösungsmittelgemisch beim Entwickeln eingesetzt wird, sowie ein Wert von 0,62, wenn ein Lösungsmittelgemisch aus

n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) zum Entwickeln eingesetzt wird; die Werte werden errechnet unter der Annahme, dass der R„-Wert von Raffinose bei der beschriebenen Art von Papierchromatographie 1,00 beträgt.

12) Säure-Hydrolisat: enthält eine erhebliche Menge an D-Glucose.

In den beigefügten Zeichnungen bedeutet:

Fig. 1 : die Kurve des Infrarot-Absorptions-spektrums einer reinen Probe des Antibiotikums SF-1130-x_,

in Kaliumbromid-Tablette;

Fig. 2 : die Kurve des protonen-kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrums einer reinen Probe von

SF-1130-x_ in Deuteriumoxid bei 100 MHz; ο

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-Sr-

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Fig. 3 : die Kurve des kohlenstoff-kernmagnetischen Resonanzspektrums einer reinen Probe von
SF-113O-x_ in Deuteriumoxid bei 100 MHz.

Mit Bezug auf die vorstehend angegebenen physikalischchemischen Eigenschaften wird die erfindungsgemässe neue Substanz mit analogen bekannten Substanzen verglichen. Eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieses Vergleiches findet sich nachfolgend.

(l) In der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai" 53593/78 (entsprechend der DT-OS 23 47 782) ist ein Aminozucker der allgemeinen Formel

OH OH

CH₂OH

OH OH

beschrieben, in welcher R ein Oligosaccharid mit 1 bis Monosaccharideinheiten bedeutet, der ein Amylase-Inhibitor ist. In der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai" 122342/77 (entsprechend der DT-OS 26 14 393) und der Zeitschrift "Naturwissenschaften" 6£, 535 (1977) ist ein Aminozucker der allgemeinen Formel

Γ CH₀OH

OH OH

CH₂OH

-NH-

OH OH OH OH

OH OH

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7 ~

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beschrieben, in welcher m eine ganze Zahl von 1 bis 8 und η Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 8 bedeuten und m + η einer Zahl zwischen 3 und 8 entspricht ₃ welcher ein Inhibitor der Glucosid-Hydrase ist. In der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai" 92909/79 ist weiterhin ein Aminozucker der allgemeinen Formel

CH₂OH

H—0

CH₂OH

OH OH ί CH₂OH
/m

beschrieben, in welcher m Null oder eine Zahl zwischen 1 unb 8 und η eine Zahl zwischen 1 und 8 bedeuten und m + η einer Zahl zwischen 1 bis 8 entspricht _y der ein

Inhibitor der cC-Amylase, Saccharase, Maltase und ähnlicher Produkte ist. Alle diese bekannten Aminozucker, die in den genannten Vorveröffentlichungen beschrieben sind, enthalten das Vinyl-Proton, welches einen Peak bei ο 5,8 bis 6,0 im protonen-kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum zeigt. Die neue Verbindung gemäss vorliegender Erfindung zeigt diesen Peak bei 0 5,8 bis 6,0 im protonen-kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum dagegen nicht, was bedeutet, dass im Molekül der Verbindung das Vinyl-Proton nicht enthalten sein kann.

(2) In der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai" 54990/76 und der japanischen Auslegeschrift 24119/77 ist ein Glucoamylase-Inhibitor beschrieben, der von einem Mikroorganismus Streptomyces sp. Nr. 33 (hinterlegt

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unter der Bezeichnung FERM-P 2788 und identifiziert
als ein Stamm von Streptomyces atroolivaceus) erzeugt
wird und der eine saure Substanz ohne optische Aktivität ist. Im Gegensatz zu diesem Glucoamylase-Inhibitor weist die erfindungsgemässe neue Verbindung einen schwach

basischen Charakter auf und zeichnet sich durch optische Aktivität aus.

(3) Japanische Auslegeschriften 21596/77 und 21597/77
beschreiben einen Amylase-Inhibitor, welcher als

"Amylostatin A" bezeichnet ist und welcher von einem

Mikroorganismus Streptomyces var. amylostaticus (hinterlegt unter der Nr. FERM-P 2499) erzeugt wird; es handelt sich dabei vermutlich''um ein neutrales Polysaccharid
mit einem Molekulargewicht von etwa 2000. Auch in dieser Hinsicht unterscheidet sich die erfindungsgemässe
neue Verbindung von Amylostatin A, abgesehen davon,
dass die erfindungsgemässe Verbindung einen anderen
Rf-Wert bei der Papierchromatographie ergibt als
Amylostatin A.

(4) In "J. Jap. Soc. Starch Sei." 26_, Nr. 2, Seiten

134-144 (1979) sind weitere Amylase-Inhibitoren, nämlich TAI-A und -B, die von Streptomyces calvus TM-521 gebildet werden und die kein Signal der Methylgruppe bei (Tea. 1,35 im protonen-kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum zeigen. Sie unterscheiden sich daher von der erfindungsgemässen neuen Verbindung, die dieses Signal der
Methylgruppe bei S ca. 1,35 in dem genannten Spektrum
gibt.

(5) Aus der japanischen Offenlegungsschrift "Kokai"
26398/78 bzw. der entsprechenden US-PS 4,160,026 sind
die Antibiotika SF-IlSO-X₁ und SF-1130-x₂ bekannt,

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/fa.

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die mit der erfindungsgemässen neuen Verbindung verwandt sind: in allen drei Fällen handelt es sich um Aminozucker mit schwach basischer Natur, welche bei der Hydrolyse Glucose bilden und welche alle das Signal des Vinyl-Protons in den. protonen-kernmagnetischen Resonanzspektren nicht zeigen. Sie sind aber einzeln voneinander unterscheidbar, da sie verschiedene Molekulargewichte besitzen und unterschiedliche Rf-Werte in der Papierchromatographie zeigen.

Weitere Untersuchungen, die der Aufklärung der Struktur

der Antibiotika SF-1130-x,,,

SF-1130-X₂ und SF-1130-x₃

dienten, haben gezeigt, dass alle drei Substanzen durch die allgemeine Formel

H—

CH₂OH

pn

Q-/ V-NR / \

OH OH OH OH

D-glucose

dargestellt werden können, in welcher m + η im Falle des Antibiotikums SF-1130-x. der Zahl 5, im Falle des Antibiotikums SF-1130-x₂ der Zahl 4 und im Falle des Antibiotikums SF-1130-x_ der Zahl 3 entspricht, wobei im letztgenannten Fall m = Null und η = 3 ist. Das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x., zeichnet sich darüber hinaus durch eine höhere Wirkung gegenüber oC-Glucosidase aus als die Antibiotika SF-1130-x und SF-1130-x,,.

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Aus den vorstehenden Vergleichen ergibt sich eindeutig, dass das erfindungsgemässe Antibiotikum eine neue Verbindung ist.

Bei der Durchführung des erfindungsgeraässen Verfahrens zur Herstellung des neuen Antibiotikums SF-1130-x., wird

der Stamm SF-1130 in einem flüssigen oder festen Medium gezüchtet. Das Kulturmedium muss Nährstoffe enthalten, die für normale Mikroorganismen assimilierbar sind. Es hat sich gezeigt, dass für die Zwecke der Erfindung alle bekannten Nährstoffe verwendet werden können, die auch üblicherweise bei der Züchtung bekannter Stämme der Gattung Streptomyces eingesetzt werden. Beispiele für solche Nährstoffe sind Glucose, Stärke, Stärkesyrup und Melasse als Kohlenstoffquellen, Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Trockenhefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisweichwasser, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können auch anorganische Salze wieCalciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate u.a. zugesetzt werden. Darüber hinaus können solche organischen und anorganischen Materialien mit verwendet werden, die das Wachstum des Stammes unterstützen und die Bildung des Antibiotikums SF-1130-xfördern.

Unter den bekannten Züchtungsmethoden eignet sich für die Zwecke der Erfindung insbesondere die Züchtung in flüssigem Medium, vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen, die auch zur Herstellung anderer bekannter Antibiotika allgemein angewandt wird. In grösserem Maßstab führt man die Züchtung vorteilhafterweise bei 25 bis 38°C, besonders günstig bei etwa 28⁰C unter submersen aeroben Bedingungen durch, wobei man ein geeignetes Produktions-

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kulturmedium verwendet, in welches eine Sporensuspension des Stammes SF-1130 oder eine Samenkultur dieses Stammes, die bereits 2 bis 3 Tage gezüchtet worden ist, eingeimpft worden ist. Das Kulturmedium und die Züchtungsbedingungen können bei dem erfindungsgemässen Verfahren dieselben sein, die auch in Verbindung mit dem Verfahren in der US-PS 4,160,026 beschrieben sind.

Zur Abtrennung des Rohproduktes, welches die erfindungsgemässe Verbindung enthält, aus der Gärbrühe des Stammes SF-1130 lassen sich die üblichen Isolierungs- und Anreicherungsverfahren anwenden, die man auch im Falle der Abtrennung und Anreicherung der Substanzen SF-1130-x. und SF-1130-x₂ anwendet und die in der US-PS 4,160,026 beschrieben sind.

Die Gärbrühe, die das Antibiotikum SF-113O-x_ enthält, wird unter neutralen Bedingungen filtriert, um Mycel und unlösliche Materialien zu entfernen. Das neutrale Brühenfiltrat wird mit Aktivkohle behandelt, die zur Adsorption der aktiven Substanzen dient. Die Kohle wird anschliessend mit einem 50 bis 60%igen Aceton-Wasser-Gemisch behandelt, welches eine Desorption des Antibiotikums SF-1130-x„ von der Aktivkohle bewirkt.

Der Extrakt wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand wird in Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird bei einem schwach sauren pH-Wert der Chromatographie an einem stark sauren Ionenaustauscherharz wie Dowex 50 W χ 2 ^' (H -Form) unterworfen; das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 0,ln wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die antibakteriell aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man erhält so ein Rohprodukt, welches das erfindungsgemässe Antibiotikum enthält und in Form eines farblosen Pulvers anfällt.

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Zur Abtrennung des erfindungsgemässen Antibiotikums von den Antibiotika SF-1130-x., und SF-1130-x₂ wird das pulverförraige Rohprodukt in Wasser aufgenommen. Die wässrige Lösung wird mit 0,5n HCl auf pH 2 eingestellt. Die angesäuerte wässrige Lösung wird der Chromatographie an einem stark^auren Kationenaustauscherharz wie Dowex 50 W χ 2 (Pyridiniumsalz-Form) unterworfen, wobei die Entwicklung mit einem 0,1m Pyridin-Ameisensäure-Puffer (pH 3,1) erfolgt. Die Antibiotika SF-1130-x. und SF-1130-Xo werden zuerst von der Harzkolonne eluiert. Bei der weiteren Eluierung mit demselben Entwicklungslösungsmittel erscheint das Antibiotikum SF-1130-x- in dem weiteren Eluat, welches in Fraktionen aufgefangen wird. Die Fraktionen, die allein das Antibiotikum SF-113O-x_ enthalten, werden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man erhält so das erfindungsgemässe Antibiotikum als reines farbloses Pulver. Aufgrund der Tatsache, dass das Molekulargewicht der erfindungsgemassen Verbindung niedriger ist als das der Antibiotika SF-IlSO-X₁ und SF-1130-x₂ kann dieselbe auch von den beiden letztgenannten Substanzen durch übliche andere Isolierungsmethoden, beispielsweise durch Gelfiltration getrennt werden; als Hilfsmittel für solche Gelfiltration eignen sich insbesondere Biogel p-2^-y Sephadex G-IO^u.a.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum ist ein starker Inhibitor der enzymatischen Wirkung von Glucosidase, insbesondere <A.-Glucosidase und Saccharase. Die inhibierende Wirkung der erfindungsgemassen Verbindung kann mit Hilfe der nachfolgend beschriebenen Methode (veröffentlich in "Acta Chem. Scand," Bd. 12, Seite 1997 (1958) gemessen werden; diese Methode wird mit oC-Glucosidase durchgeführt, die aus der Dünndarmschleimhaut von Schweinen hergestellt worden ist.

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(i) Bestimmung der inhibierenden Wirkung von OC-Glucosidase

Folgende vier Lösungen werden hergestellt:

Lösung A: Enzym-Lösung ( sC-Glucosidase), die mit 0,1m gepufferter Maleatlösung (pH 6,0)

auf die gewünschte Enzymkonzentration verdünnt worden ist:

Lösung B: 0,1m gepufferte Maleatlösung (pH 6,0)

Lösung C: wässrige Lösung von 0,014m p-Nitrophenyl-0\.-D-glycosid (als Substrat)in Wasser

Lösung D: wässrige Lösung von 0,1m Natriumcarbonat in Wasser.

0,5 ml einer Lösung, die durch Auflösen einer Probe des zu prüfenden Enzym-Inhibitors zu der richtigen Konzentration in der Lösung B hergestellt worden war, wurden zusammen mit 0,25 ml der Lösung C in ein Reagenzglas gegeben; das Reagenzglas wurde für 5 Minuten in ein auf 37⁰C gehaltenes Wasserbad gesetzt. Zu der Mischung der Lösungen in den Reagenzglas wurden dann 0,25 ml der Lösung A gegeben, um die enzymatische Reaktion einzuleiten. 20 Minuten nach Beginn der Reaktion wurden 5 ml der Lösung D zugesetzt, um die enzymatische Reaktion abzubrechen. Das Absorptionsvermögen bei 400 nm der gewonnenen Reaktionslösung wurde gemessen und der gefundene Wert des Absorptionsvermögens wurde als T aufgezeichnet. Die beschriebene Operation wurde (als Blindversuch) ohne Probe des Enzym-Inhibitors

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wiederholt, worauf das Absorptionsvermögen dieser Kontroll-Lösung, die nur aus der Lösung B, d.h. der 0,1m gepufferten Maleatlösung bestand, bei 400 nm gemessen und als Wert C aufgezeichnet wurde.

Aus den vorstehend erhaltenen Messwerten wurde der Grad (%) der Inhibierung der zu prüfenden Inhibitorprobe im Verhältnis zur C/u-Glucosidase nach folgender Gleichung berechnet:

Inhibierung (96) = —S— χ 100

(2) Bestimmung der Wirkung zur

Inhibierung von Saccharase

Es wurden folgende drei Lösungen hergestellt:

Lösung A: Saccharaselösung, die mit 0,1 m gepufferter Maleatlösung (pH 6,0) auf eine geeignete Enzymkonzentration verdünnt worden ist;

Lösung B: 0,1 m gepufferte Maleatlösung (pH 6,0) ;

Lösung C: 4%ige wässrige SctcxWoselösung (als Substrat) in Wasser.

1,0 ml einer Lösung, die durch Auflösen einer Probe des zu prüfenden Enzym-Inhibitors zu der gewünschten Konzentration in der Lösung B erhalten worden war, wurden zusammen mit 0,5 ml der Lösung C in ein Reagenzglas gegeben; das Reagenzglas wurde 5 Minuten in ein Wasserbad gesetzt, welches auf einer Temperatur von 30°C gehalten wurde,, Zu dem Gemisch in dem Reagenzglas wurden dann 0,5 ml der Lösung A gegeben, um die enzymatische Reaktion

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einzuleiten. 10 Minuten nach Beginn der Reaktion wurde ein Teil (30 ül) der Reaktionslösung abgenommen und die Reduktionskraft der Reaktionslösung wurde kolorimetrisch nach der Methode von Somogyi-Nelson bestimmt. Der gefundene Wert des Absorptionsvermögens der Reaktionslösung bei 660 nm wurde als T aufgezeichnet.

Die vorstehend beschriebene Operation wurde ohne Probe des zu prüfenden Enzym-Inhibitors als Blindversuch wiederholt. Das in entsprechender Weise bestimmte Absorptionsvermögen der Kontroll-Lösung bei 660 nm wurde ebenfalls, und zwar als Wert C aufgezeichnet.

Die Berechnung des Inhibxerungsgrades der Inhibitorprobe im Verhältnis zu Saccharase wurde nach folgender Gleichung berechnet:
Inhibierung (%) =£j^ χ 100.

Bei dem vorstehend beschriebenen Versuch wurde für das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x,, ermittelt, dass der ID_₀-¥ert (das ist die Dosis, die eine 50%ige Inhibierung ergibt) im Verhältnis zu C^-Glucosidase 2,24 χ 10 M beträgt und dass der ID,__n-Wert im Verhältnis zu Saccharase bei 2,0 χ 10~ M liegt. Zum Vergleich wurde auch die Inhibierungskraft von SF-1130-x. und SF-1130-x₂ sowie von Nojirimycin (einem bekannten Amylase-Inhibitor) in der beschriebenen Weise gemessen, wobei die ID^-Werte

-4 ^ου für das Antibiotikum SF-IlSO-X₁ mit 1,5 χ 10 M,

für das Antibiotikum SF-1130-x_o mit 1,8 χ 10~⁴ M und

-4
für dasNojirimycin mit 3,6 χ 10 M festgestellt wurden.

Eine weitere bemerkenswerte Tatsache ist, dass die erfindungsgemässe Verbindung lebenden Tieren oral verabreicht werden kann, um eine Erhöhung des Blutzucker-

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spiegeis bei der Aufnahme von Stärke und Zucker mit der Nahrung zu verhindern. Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt: Als Versuchstiere wurden männliche ICR-Mäuse (6 Tiere pro Gruppe, Durchschnittsgewicht 25 g) verwendet, Vielehe 20 Stunden lang kein Wasser erhalten hatten. Danach wurden lg/kg Stärke oder 2,5g/kg Soalicfost den Mäusen oral verabreicht. Gleichzeitig wurden 10 mg/kg der erfindungsgemässen Verbindung oder 10 mg/kg Desoxynojirimycin als Vergleichstherapeutikum den Mäusen oral verabreicht.

10 Minuten nach der Verabreichung wurde Glucosespiegel im Blut gemessen. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Blutzuckerspiegel (mg/dl)

Versuchstherapeutikum Gruppen,die Gruppen, die Stärke erhalten Saccharose er

halten

unbehandelt

erfindungsgemässe
Verbindung

20 SF-IlSO-X₁ + -X₂ (2:3)

Desoxynojirimycin

( Vergleichssubstanz)

153 +_ 24,2

88 +_ 20,7

124 + 17,8

101 +. 22,9

189 +_ 41,5

96 +_ 10,2 100 +_ 20,7

93 +_ 15,4

Kontrο11ver such
(Tiere erhalten weder
25 Stärke noch Saccharose
noch das Versuchstherapeutikum)

75 +_ 11,0

66 _+ 13,0

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Die antibakterielle Wirkung des erfindungsgemassen Antibiotikums SF-1130-x^, durch die eine Inhibierung des Wachstums verschiedener Bakterien erreicht werden konnte, wurde nach der üblichen PapierScheibenmethode festgestellt. Zu diesem Zweck wurde das Antibiotikum SF-1130-x-, in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Mit der so hergestellten Testlösung wurde eine F'ilterpapierscheibe imprägniert, die anschliessend an der Luft getrocknet wurde. Dabei zeigte sich, dass die erfindungsgemässe Verbindung in einer Konzentration von 1 mg/ml Inhibierungszonen mit einem Durchmesser von 13,3 mm gegen den Test-Mikroorganismus Escherichia coli K-12R bildet.

Um die akute Toxizität des Antibiotikums SF-1130-x_ zu

bestimmen, wurde die Verbindung oral 5 Mäusen verabreicht; alle Mäuse vertrugen eine Dosis von 500 mg SF-1130-x„

pro kg Körpergewicht. Dieses Ergebnis zeigt, dass das erfindungsgemässe Antibiotikum eine sehr geringe Toxizität aufweist. Das erfindungsgemässe neue Antibiotikum zeichnet sich also, wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht , durch eine bemerkenswert hohe inhibierende Wirkung gegenüber Glucosidase nicht nur in vitro, sondern auch in vivo aus.

Wie weiter vorn bereits ausgeführt, gehören infolgedessen zum Gegenstand der Erfinilung auch die Wirkung der Glucosidase hemmende Mittel, die als aktiven Bestandteil das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x_ enthalten, gegebenenfalls in Verbindung mit einem bekannten pharmazeutisch akzeptablen Träger- oder Verdünnungsmaterial.

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Mit Hilfe des erfindungsgemässen, die Wirkung von Glucosidase inhibierenden Mittels lässt sich der Kohlehydratstoffwechsel sowohl bei lebenden Tieren als auch beim Menschen unter Kontrolle halten; infolgedessen können die Mittel nicht nur zur therapeutischen Behandlung von Zuckerkrankheit, Fettsucht, Magenschleimhautentzündung, Magengeschwüren, Zwölffingerdarmgeschwüren, Verstopfung u.a., sondern auch zur Behandlung von sekundären Krankheitsmerkmalen, die als Folge eines abnormen Kohlehydratstoffwechsels auftreten, eingesetzt werden.

Der erfindungsgemässe Glucosidase-Inhibitor lässt sich darüber hinaus auch zur Verhütung der Karies der Zähne verwenden. Kohlehydrate, insbesondere Saccharose, werden durch die Glucosidase bestimmter Mikroorganismen, die im Mund vorkommen, unter anderem zu Glucose abgebaut, welche die Zahnkaries fördert. Der Abbau der Kohlehydrate an der Oberfläche der Zähne kann jedoch durch die Anwesenheit des erfindungsgemässen Glucosidase-Inhibitors im Mund unterbunden werden.

Der erfindungsgemässe Glucosidase-Inhibitor kann in feste oder flüssige Präparate eingearbeitet werden, die neben der aktiven Substanz entsprechende geeignete Verdünnungs- oder Trägermittel enthalten.

Die festen Präparate können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Suppositorien vorliegen; die flüssigen Präparate können die Form eines Gels, Cremes, einer Suspension, Emulsion, eines Syrups oder einer isotonischen Lösung haben. Die festen Präparate können übliche Füllmittel, Streckmittel, Bindemittel, Gleitmittel u.a. enthalten. Wird der erfindungsgemässe Inhibitor ,in die Form eines Suppositoriums gebracht, so kann als Basis desselben beispielsweise Kakaobutter u.a. verwendet

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werden. Die flüssigen Präparate können auch pharmazeutisch akzeptable oberflächenaktive Mittel, Konservierungsstoffe, Aromastoffe, Süßstoffe u.a. zusätzlich zu den üblichen Verdünnungsmitteln wie Wasser, Äthylalkohol, Propylenglycol, tierischen oder pflanzlichen Ölen u.a. enthalten.

Die zu verabreichende Dosis des Antibiotikums SF-1130-x_ kann verschieden bemessen werden und richtet sich nach der Art der Verabreichung^ der Natur der Krankheit, dem Zustand des Patienten, der an der Krankheit leidet, und anderen Bedingungen. Im allgemeinen kann gesagt werden, dass das Antibiotikum SF-1130-x„ oral in einer Dosis von

100 mg/kg bis 1 g/kg pro Tag verabreicht werden kann. Wird das Antibiotikum SF-1130-x„ parenteral verabreicht, so kann die Dosis etwa 1/2 bis 1/5 der vorstehend genannten Werte von 100 bis 1000 mg/kg betragen.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x_ kann nicht nur als Therapeutikum sondern auch für die Zwecke der Prophylaxe eingesetzt werden. Zur Prophylaxe setzt man das Antibiotikum SF-1130-x- Nahrungsmitteln oder Getränken zu, die einen hohen Kohlehydratanteil haben, beispielsweise Schokolade, Brot, Marmelade oder Getränken wie Fruchtsaft; hierdurch wird auch eine Gewichtszunahme bei Menschen, die diese Nahrungsmittel oder Getränke zu sich nehmen, verhindert. Der erfindungsgemä.sse Inhibitor kann auch in Kaugummi oder in Zahnpasta eingearbeitet werden, wodurch eine prophylaktische Behandlung der Zahnkaries erreicht werden kann.

Das erf indungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x kann'"'auch dem Futter für Haustiere beigemischt werden, um die Umwandlung der Kohlehydrate in Fett, die beim normalen Stoffwechsel im Tierkörper abläuft, zu-unterdrücken,

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wodurch Tierkörper mit einem fettarmen Fleischanteil gezüchtet werden können. Das Antibiotikum SF-1130-x-, kann dem Futter in einer Menge von 10 bis 100 mg/kg Futter zugesetzt werden.

Das Antibiotikum SF-1130-x„ lässt sich auch als Amylase-Inhibitor verwenden und als solcher in der biochemischen Analyse bei Laboratoriumsversuchen einsetzen.

Es ist bekannt, dass Kohlehydrate wie Stärke und Zucker im Körper von lebenden Tieren einschliesslich Menschen unter der Wirkung von Glucosidase in Glucose umgewandelt und vom Blut der Tiere aufgenommen werden. Gelangt eine zu grosse Menge Glucose in das Blut der Tiere bzw. Menschen, so steigt das Körpergewicht dadurch stark an, was gegebenenfalls mit Gesundsheitsrisiken verbunden ist.

Nimmt ein Patient, der an Diabetes (Zuckerkrankheit) leidet, zu viele Kohlehydrate zu sich, so steigen die Glucosewerte im Blut abnorm stark an, was für den Patienten ein erhebliches Gesundheitsrisiko bedeutet. Es ist daher wünschenswert, ein Mittel zur Verfugung zu haben, mit dem die Umwandlung von Kohlehydraten in Glucose unter der Einwirkung der Glucosidase im Verdauungstrakt von Menschen unterdrückt werden kann. Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört infolgedessen auch ein Mittel, mit dem sich in erfolgreicher Weise die enzymatische Wirkung der Glucosidase im Verdauungstrakt lebender Tiere, einschliesslich Menschen, bei oraler Einnahme des Mittels unterdrücken lässt.

Die nun folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1

Eine Samenkultur von Streptotnyces myxogenes SF-1130 (Hinterlegungsnummer FERM-P 676 oder ATCC 31305) wurde in 200 1 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, welches 5,0 % Stärkesyrup,2,5 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Weizenkeime und 0,25 % Natriumchlorid enthielt. Das geimpfte Medium wurde in einem Gärkolben unter Belüftung und Schütteln bei 28⁰C 64 Stunden bebrütet.

Am Ende der Bebrütungsdauer wurden 50 1 der entstandenen Kultur- bzw. Gärbrühe durch Zugabe von 5 η Salpetersäure auf pH 2,0 eingestellt, danach mit 50 g Aktivkohle und 2 kg eines Filtrationshilfsmittels versetzt und 15 Minuten lebhaft geschüttelt; danach wurde filtriert. Das gewonnene Filtrat wurde mit wässrigem Ammoniumhydroxid neutralisiert, mit 1 kg Aktivkohle vermischt und 30 Minuten gerührt; auf diese Weise wurde die Adsorption der aktiven Substanz erreicht. Nach Beendigung der Rührdauer wurde das Gemisch filtriert und die abfiltrierte Aktivkohle wurde dreimal mit je 10 1 destilliertem Wasser gewaschen.

Danach wurde die Aktivkohle 15 Minuten mit 4 1 einer wässrigen Lösung von 60 %igem Aceton von pH 2,5 unter Rühren extrahiert; auf diese Weise wurde die aktive Substanz aus der Aktivkohle desorbiert. Der Extraktionsvorgang wurde zweimal wiederholt. Die gewonnenen Extrakte wurden vereinigt und gemeinsam auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde tropfenweise in 5 1 Aceton gegeben, wobei sich 90 g eines farblosen Niederschlages abschieden.

Der farblose Niederschlag wurde abfiltriert und in 250 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne (4 χ 40 cm) mit dem stark sauren

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Kat ionenaustauscherharz Amberlite IR-120 ^-'' (H -Form) geleitet, um die aktive Substanz an dem Harz zu adsorbieren. Die Kolonne wurde anschliessend mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2 %igem wässrigem Ammoniumhydroxyd eluiert. Das Eluat wurde in 20 ml-Fraktionen aufgefangen. Die-Fraktionen, die gegen E. coli K-12R eine Wirkung zeigten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Man erhielt so 5,0 g eines braun gefärbten Pulvers.

Dieses Pulver (5,0g) wurde in 50 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde durch eine Kolonne (3 χ 70 cm) mit Dowex 50 W χ 2 ^ (Pyridiniura-Forrn, Feinheit entsprechend einem Prüfsieb mit 200 bis 400 Maschen) geleitet. Die Harzkolonne wurde anschliessend mit einer Pufferlösung von 0,1 in Pyridin-Ameisensäure (pH 3,1) eluiert. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktiven Fraktionen Nr. 101 bis 120 enthielten das Antibiotikum SF-1130-x^ und die Fraktionen Nr. 130 bis 170 enthielten das Antibiotikum SF-1130-x₂.

Die Harzkolonne wurde anschliessend mit derselben Pufferlösung weiter eluiert, wobei man die aktiven Fraktionen 180 bis 224 gewinnen konnte, welche allein das Antibiotikum SF-1130-x_ gemäss vorliegender Erfindung

enthielten; dieses Antibiotikum ergab einen Einzelfleck (angefärbt mit Silbernitrat-Natriumhydroxid-Reagenz) bei einem R_R ff_n _se~^Wer^ ^von 0,64 in der Papierchromatographie nach der absteigenden Methode, wenn zum Entwickeln ein Gemisch aus Äthylacetat-Pyridin-Wasser (10:4:3) als Entwicklungslösungsmittel benutzt wurde. Die aktiven Fraktionen 180 bis 224, die denselben Rp „„. -Wert,wie oben angegeben, zeigten, wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man erhielt so etwa 800 mg eines farblosen Pulvers.

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Dieses farblose Pulver wurde in 2 ml destilliertem Wasser gelöst und die entstandene wässrige Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine einem Volumen von 100 ml entsprechende Menge eines Gelfiltrationsmittels, nämlich Biogel p-2¹—- enthielt. Zum Entwickeln der Kolonne wurde Wasser verwendet. Das Eluat wurde in 8 ml-Fraktionen aufgefangen. Die antibakteriell wirksamen Fraktionen 35 bis 43 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man erhielt so etwa 400 mg reines Antibiotikum SF-1130-x-r in Form eines farblosen Pulvers. F.: 183°C (Zersetzung): (jOp³+ 154° (c 1; Wasser).

Die folgenden Beispiele 2 und 3 erläutern die Herstellung einer Schokolade bzw. eines Fruchtsaftes, dem das erfindungsgemässe Antibiotikum SF-1130-x- als Glucosidase-Inhibitor zugesetzt worden ist.

Beispiel 2

Die nachfolgend genannten Bestandteile wurden zu einer Schokolade verarbeitet.

Bestandteile Gewichtsprozent

Antibiotikum SF-1130-x₃ 0,1

Bitter 15,85

Oleo-butter 5,0

Zucker 44,0

Vanillin 0,05

Lecithin 0,6

Kakaomilch 23,0

Kakaobutter 11,4

Gesamt 100,00

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	3	- Ά -	16	.09	.80	3035193
	.2?.
Beispiel

Die nachfolgend genannten Bestandteile wurden durch Vermischen in einer Mixvorrichtung zu einem Fruchtsaftgetränk verarbeitet.

Bestandteile Gewichtsprozent

Antibiotikum SF-1130-x„	0,05
Isomerisierter Zucker	13,5
Zitronensäure	0,17
Natriumeitrat	0,016
Zitronenaroma	0,1
Wasser	86,164

Gesamt 100,00.

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Claims

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Patentansprüche

I)/Neues Antibiotikum SF-HoO-X₃, welches ein Oligosaccharid von schwach basischer Natur ist, in Form eines farblosen Pulvers vorliegt, in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich, in Methanol und Äthanol weniger bzw. schwach löslich und in Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol unlöslich ist, eine positive Reaktion gegenüber Silbernitrat-Natriumhydroxid, Tetrazol-Rot-, Anthron- und Greig-Leaback-Reagenz zeigt und darüber hinaus folgende Kenndaten aufweist:

(a) einen Schmelzpunkt von 183⁰C (unter Zersetzung) und eine spezifische optische Drehung von (oC)p + 154° (c 1; in Wasser);

(b) Gewichtsanalyse: C 43,31%; H 5,88%; N 1,71% und 0 49,10% (Restmenge);

(c) ein Ultraviolett-Spektrum ohne charakteristischen Absorptions-Peak, wenn die Messung an einer reinen Probe des Antibiotikums SF-1130-X-, mit einer Konzentration von 100 /ig/ ml vorgenommen wird;

(d) ein Infrarot-Absorptionsspektrum in Kalium-

bromid-Tablette entsprechend dem in Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellten;

(e) ein protonenkernmagnetisches Resonanz-Absorptionsspektrum in Deuteriumoxid entsprechend dem in Fig. 2 der beigefügten

Zeichnungen dargestellten;

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ORIGINAL INSPECTED

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(f) ein kohlenstoffkernmagnetisches Resonanz-Absorptionsspektrum in Deuteriumoxid entsprechend dem in Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellten;

(g) einen Einzelfleck bei ^RR_affi_nose =0,64 bei der Papierchromatographie nach der absteigenden Methode, wenn zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat-Pyridin-lVasser (10 :4:3 ) verwendet wird, sowie einen Einzelfleck bei ^RD_aff-j_nose ^{= 0}^⁶²' wenn

bei derselben Art der Papierchromatographie nach der absteigenden Methode zum Entwickeln ein Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (6:4:1:3) eingesetzt wird, wobei die R_R ~->- -Werte berechnet

werden aufgrund der Annahme, dass Raffinose bei der gleichen Art der Papierchromatographie einen Einzelfleck bei Rf = 1,00 ergibt.
2) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-1130-x„, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Gattung Streptomyces, welcher zur Bildung des Antibiotikums SF-1130-x^ fähig ist, in einem wässrigen flüssigen Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen solange züchtet, bis sich eine ausreichende Menge des Antibiotikums SF-1130-X» gebildet und angesammelt hat, welches anschliessend aus der Kulturbrühe abgetrennt wird.
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum SF-1130-x_ unter Verwendung des

Mikroorganismus Streptomyces myxogenes SF-1130, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 676 sowie ATCC 31305, in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

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4) Glucosidase-Inhibitor, bestehend aus dem Antibiotikum SF-1130-x- gemäss Anspruch 1 als aktivem Bestandteil, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermaterial oder Streckmittel.
5) Arzneimittel zur Unterdrückung der enzymatischen Wirkung der Glucosidase im Verdauungstrakt von lebenden Tieren und Menschen, welches eine ausreichende Menge des Antibiotikums SF-113O-x_ gemäss Anspruch 1 enthält und für eine orale Verabreichung geeignet ist.

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