JP3831252B2 - 化粧料 - Google Patents
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Description
本発明は酸性糖化合物の化粧料への利用に関する。
背景技術
従来より、しみ、そばかす、しわは皮膚美容上の悩みであり、近年これらを防止する多くの化粧料が知られ、その有効成分としてレチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール等が報告されている。しかしながら、これらの有効成分は皮膚刺激性や安定性等に問題点があり、且つその効果も十分なものとは言い難いものであった。
一方、育毛料は、頭髪の成長を促進又は刺激する製品であり、頭髪の脱毛を育毛により補い、頭髪の絶対数の減少を阻止する目的で使用される。一般に、頭部の脱毛の原因としては、毛根や皮脂腺の器官における男性ホルモンの活性化、毛包への血流量の低下、皮脂の分泌過剰、過酸化物の生成による頭皮の異常、栄養不良、ストレス等多様な因子が考えられる。一般的に従来の育毛料は、これらの頭部の脱毛の原因として考えられる因子を取り除いたり、軽減する作用を有する物質を配合したものである。例えばビタミンB、ビタミンE等のビタミン類、セリン、メチオニン等のアミノ酸類、センブリエキス、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤、紫根エキス、ヒノキチオール等の抗炎症剤、エストラジオール等の女性ホルモン剤、セファランチン等の皮膚機能亢進剤等が配合されて、脱毛の予防及び治療に用いられている。
しかしながら、前記の様に多くの試みがなされているにもかかわらず、従来の育毛料は、その脱毛予防作用や発毛作用等が弱く、必ずしも十分な育毛効果が得られなかった。
本発明の主たる目的は、皮膚美容(皮膚の老化防止、敏感肌の改善、かゆみ抑制等)に効果があり、且つ育毛料の有効成分ともなりうる物質を見出し、当該有効成分を含有する化粧料を提供することにある。
発明の開示
本発明を概説すれば、本発明はフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする化粧料に関する。また、化粧料の製造のためのフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの使用に関する。
本発明において使用するフコイダンは、皮膚美容効果(例えば、皮膚の老化防止作用、敏感肌の改善作用、かゆみ抑制作用等による)及び/又は育毛効果(例えば、発毛作用、育毛作用、養毛作用、脱毛防止作用等による)を発現し得るものであれば特に限定はない。フコイダンとしては藻類由来のフコイダン、棘皮動物由来のフコイダンが好適に使用できる。本発明において使用するフコイダンとしては、構造が明確なフコイダンが好適であり、下記一般式(I)〜(IV)で表わされる硫酸化糖をそれぞれ構成糖の必須成分とするガゴメコンブ由来のU−フコイダン、F−フコイダン、G−フコイダン及びオキワナモズク由来のフコイダンから選択されるフコイダンの使用が好ましい。
(式中、RはOH又はOSO3H、nは1以上の整数である。)
(式中、RはOH又はOSO3H、nは1以上の整数である。)
(式中、RはOH又はOSO3H、nは1以上の整数である。)
(式中、RはOH又はOSO3H、nは1以上の整数である。)
また、フコイダンとしては、非沈澱形成性、化粧料の基剤への溶解性等の観点から、非曳糸性フコイダンが好ましい。
フコイダンの分解物としては、例えばフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物が使用できる。本発明に使用するフコイダンの酸分解物、フコイダンの酵素分解物としては、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を示せば良く、それらの作用を指標に調製することができる。本発明においては下記式(V)で表される化合物、下記式(VI)で表される化合物及び下記式(VII)で表わされる化合物から選択される化合物が好適に使用できる。
(式中、RはOH又はOSO3Hである。)
(式中、RはOH又はOSO3Hである。)
(式中、RはOH又はOSO3Hである。)
本発明の化粧料の形状としては、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、洗顔剤、毛髪剤、育毛料、又は洗髪剤が例示される。また、医薬品、医薬部外品、食品又は飲料等の形状で提供することができる。
本発明の化粧料は、老化防止用、敏感肌改善用、かゆみ抑制用、アレルギー改善用、アトピー症状改善用化粧料等として使用することができる。
また、本発明の化粧料としては、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有する育毛作用に優れた育毛料、及びさらにフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものと共に用いることにより育毛作用を相乗的に増強し得る成分(育毛作用増強成分)を含有する育毛料が提供される。また、かかる化粧料、育毛料は、食品又は飲料としても提供され得る。なお、好適な育毛作用増強成分としては、ミノキシジル及び塩化カルプロニウムが例示される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の化粧料は、特に皮膚美容作用及び/又は育毛作用という生理作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものを有効成分として含むことを1つの大きな特徴とする。本明細書において「選択される」とは、1種又は2種以上のものが選ばれることを意味する。
なお、本明細書において「皮膚美容作用」とは、皮膚の老化防止作用、敏感肌改善作用、かゆみ抑制作用等をいい、また、かかる作用により奏される効果を「皮膚美容効果」という。なお、皮膚の老化防止作用とは、肌にしっとり感やなめらかさを与え、かさつき、しみ等を減少させる等の皮膚の老化を抑制する作用を意味する。皮膚美容作用は、例えば、実施例13−(8)〜(10)に記載の方法により評価することができる。少なくとも実施例13−(8)〜(10)に記載の評価事項について優れた効果を示し得るフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものであれば、所望の皮膚美容効果を発現し得る。
また、「育毛作用」とは、発毛作用、育毛作用、養毛作用、脱毛防止作用等をいい、また、かかる作用により奏される効果を「育毛効果」という。育毛作用は、例えば、実施例13〜20に記載の方法により評価することができ、かかる作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものは、育毛効果を発現し得る。
本発明において使用するフコイダン及びその分解物は、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有すれば良く、特に限定はないが、例えば藻類由来のフコイダンが使用できる。なお本発明においてフコイダンとはフコース硫酸(硫酸化フコースという場合がある)を構成糖とする多糖の総称であり、すなわち、本発明においてはフコース硫酸含有多糖、及び/又はその分解物を使用することができる。
フコース硫酸含有多糖としては、硫酸化フカン、硫酸化フコガラクタン、硫酸化フコグルクロノマンナン、硫酸化グルクロノキシロフカン、硫酸化キシロフコグルクロナン、硫酸化アスコフィラン、硫酸化グルクロノガラクトフカン、硫酸化グルクロノフカン等が例示される。
これらのフコイダンの調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該フコイダン含有物等を本発明に使用することができる。
例えばガゴメコンブ、マコンブ、トロロコンブ、ヒバマタ、モズク、オキナワモズク、ワカメ、ワカメ メカブ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア ニグレセンス、アスコフィラム ノドッサム等の昆布目、ながまつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。なお、紅藻由来の硫酸化多糖、例えばマグサ、オゴノリ、おばくさ(Pterocladiella capillacea)由来の硫酸化多糖も本発明に使用するフコイダンと同様の効果を有し、本発明に使用することができる。
本発明に使用するフコイダンとしては、前出の藻類由来のフコイダンが例示されるが、硫酸化フコースを構成成分とする多糖で皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するものであれば特に限定はなく、棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等由来のフコイダンを使用してもよい。
例えばガゴメコンブからフコイダンを調製し、該フコイダンを一般式(I)で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するグルクロン酸含有フコイダン(前出U−フコイダン)と一般式(II)で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するグルクロン酸非含有フコイダン(前出F−フコイダン)とを分離することができ、本発明の有効成分としてそれぞれのフコイダンを好適に使用することが出来る。またガゴメコンブから一般式(III)で表される硫酸化糖の繰返し構造を有する硫酸化フコガラクタン(前出G−フコイダン)を調製し、好適に使用することができる。
また、オキナワモズクより、一般式(IV)で表される硫酸化糖の繰返し構造を有するオキナワモズク由来フコイダンを調製し、好適に使用することができる。
U−フコイダン及びF−フコイダンはガゴメコンブから公知の方法に従ってフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメコンブ由来のU−フコイダン及びF−フコイダンの存在比は重量比で約1:2である。U−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約20重量%、F−フコイダンはフコースを主成分として含み、硫酸含量は約50重量%であり、分子量は両物質共に約20万を中心に分布している(第18回糖質シンポジウム要旨集、第159頁、1996年)。
例えばガゴメコンブから調製したフコイダン溶液をDEAE−セルロファインA−800カラムにアプライ後、NaCl含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、U−フコイダンとF−フコイダンに分離することができる。第1図にその1例を示す。すなわち第1図はU−フコイダンとF−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがU−フコイダン、後ピークがF−フコイダンである。
また例えばヒバマタ由来フコイダン、モズク由来フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン、ワカメ由来フコイダン、ワカメ メカブ由来フコイダン、マクサ由来硫酸化多糖、オゴノリ由来硫酸化多糖、レッソニア由来フコイダン、アスコフィラム由来フコイダン、おばくさ由来硫酸化多糖、他の藻類由来のフコイダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。
本発明において好適に用いられる棘皮動物由来のフコイダンとしては、例えば特開平4−91027号公報に記載のナマコに含有されるフコイダンを挙げることができ、当該公報記載の方法にてナマコより当該フコイダンを調製することができる。
また、本発明の皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するフコイダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて調製し、目的の皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する分解物を選択し、使用することができる。
本発明で使用するフコイダンの分解物の好適な調製方法としては酸分解法及び酵素分解法があり、フコイダンを酸分解又は酵素分解することにより、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する分解物を調製することができる。
本発明で使用するフコイダンの酸分解条件は、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する分解物(以下、本発明の分解物と称す)が生成する条件であれば、特に限定はなく、得られる分解物の生理作用について評価することにより、その条件を決定することができる。
例えばフコイダンを酸に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。
フコイダンを溶解またはけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。
酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは0.0001〜5規定、より好ましくは0.01〜1規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが0〜200℃、好ましくは20〜130℃に設定すれば良い。
また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒間〜数日間に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、フコイダンの分解物の製造に際しては、好ましくはクエン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数10mM〜数M、加熱温度は50〜110℃、より好適には70〜95℃、加熱時間は数分間〜24時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコイダンの酸分解物としてはガゴメコンブ由来フコイダンの酸分解物が例示され、当該分解物は特に皮膚美容作用及び/又は育毛作用の強い新生理機能を有する食物繊維として使用することができる。
本発明の分解物は皮膚美容作用及び/又は育毛作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等により分子量分画することができる。
ゲルろ過法の例としては、セルロファインGCL−300を使用し、例えば分子量25000超、分子量25000〜10000超、分子量10000〜5000超、分子量5000以下等の任意の分子量画分を調製でき、セルロファインGCL−25を用い、例えば分子量5000以下の画分を分子量5000〜3000超、分子量3000〜2000超、分子量2000〜1000超、分子量1000〜500超、分子量500以下等の任意の分子量画分に調製することができる。
また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うことができ、例えばダイセル社製FE10−FUSO382を用いることにより分子量30000以下の画分を、同FE−FUS−T653を使用することによって分子量6000以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量500以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。例えばヒバマタ由来フコイダンの分解物は分子量3万以上の画分が強い皮膚美容作用及び/又は育毛作用を示し、本発明においては分子量3万以上のヒバマタ由来フコイダンの使用が好適である。
本発明で使用できる皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するフコイダンの分解物としては、式(V)で表される化合物、式(VI)で表される化合物、式(VII)で表される化合物が例示され、これらの化合物は、例えば、国際公開第99/41288号パンフレット、国際公開第96/34004号パンフレット、国際出願番号PCT/JP00/00965号明細書記載の方法で調製することができる。なお、式(V)で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖、また式(VI)で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖もそれぞれ本発明において使用することができる。更に、式(VII)で表される化合物を基本骨格とし、その繰返し構造を有するオリゴ糖もそれぞれ本発明において使用することができる。また、本発明の分解物としては、国際公開第99/41288号パンフレット、国際公開第96/34004号パンフレット、国際出願番号PCT/JP00/00965号明細書記載のフコイダンの分解物も例示される。
式(V)で表される化合物は前出F−フコイダンを、アルテロモナス sp.SN−1009(FERM BP−5747)が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素(F−フコイダン分解酵素)で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式(V)で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
式(VI)で表される化合物は前出U−フコイダンを、フラボバクテリウム sp. SA−0082(FERM BP−5402)が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素(U−フコイダン分解酵素)で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式(VI)で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
ガゴメコンブ由来フコイダンをアルテロモナス sp.SN−1009(FERM BP−5747)が産生するF−フコイダン分解酵素、及びフラボバクテリウム sp. SA−0082(FERM BP−5402)が産生するU−フコイダン分解酵素で分解し、分解物を除去することにより、前出G−フコイダンを精製することができる。
フラボバクテリウム sp. SA−0082(FERM BP−5402)はこのG−フコイダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素(G−フコイダン分解酵素)も産生し、当該G−フコイダン分解酵素をG−フコイダンに作用させることにより、当該G−フコイダンの分解物を調製し、当該分解物中より、目的に応じ分解物を精製することができる。式(VII)で表される化合物はその例である。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式(VII)で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。
なお式(V)で表される化合物の例としては後述の式(VIII)で表される化合物がある。また式(VI)で表される化合物の例としては後述の式(X)で表される化合物がある。更に、式(VII)で表される化合物の例としては後述の式(IX)で表される化合物がある。
また、前記F−フコイダン分解酵素、U−フコイダン分解酵素、G−フコイダン分解酵素の1単位(U)は、1分間に1μmol相当のF−フコイダン、U−フコイダン、G−フコイダンのそれぞれのグリコシル結合を切断する酵素量と定義する。
フコイダンの塩、その分解物の塩は、フコイダン又はその分解物より通常の方法で調製することができる。また、フコイダンの分解物は所望により適宜硫酸化して使用することもでき、硫酸化の方法は公知の方法に従えばよい。
皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する本発明で使用するフコイダン、その分解物及びそれらの塩は、その皮膚美容作用(皮膚老化防止作用等)より、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、又は洗顔剤等の化粧料の有効成分として有用である。また、その育毛作用により、育毛料としての化粧料、例えば毛髪剤、育毛剤、養毛剤、脱毛防止剤の有効成分として有用であり、本発明により皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする、皮膚美容作用及び/又は育毛作用に優れた化粧料が提供される。当該化粧料の有効成分としては、例えばU−フコイダン、F−フコイダン、G−フコイダン、オキナワモズク由来フコイダン及びそれらの分解物から選択されるものが好適であり、これらの物質を有効成分とするバイオ化粧料が提供できる。ここでフコイダンの分解物としては、例えば式(V)〜(VII)で表される化合物から選択される化合物を好適に使用することができる。
フコイダンは硫酸化フコースを含有する多糖であるが、本発明者らは硫酸化単糖にも皮膚美容作用及び/又は育毛作用があることを見出した。すなわち、本発明者らは硫酸化単糖又はそれらの塩を有効成分として含有する化粧料も提供する。
当該化粧料に使用される硫酸化単糖又はその塩は皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する硫酸化単糖又はその塩であれば良く、特に限定はされないが、硫酸化フコース、硫酸化グルコース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化2−デオキシ−グルコース、硫酸化マンノース、硫酸化タロース及びこれらの塩が例示される。
これらの硫酸化単糖は公知の合成法で合成しても良く、また天然物中より硫酸化多糖を分解し、当該分解物中より精製して調製しても良い。また常法によりその塩を調製することが出来る。
本発明の化粧料における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、通常、好ましくは0.0001〜20重量%、より好ましくは0.001〜5重量%、更に好ましくは0.03〜3重量%である。
本発明の化粧料は常法に従って製造することができ、通常、化粧料に使用される炭化水素類、ろう類、油脂類、エステル類、高級脂肪酸類、高級アルコール類、界面活性剤類、香料、色素、防腐剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、アルコール類、pH調整剤、各種薬効成分等を適宜選択して配合できる。なお、本発明の化粧料の有効成分であるフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるもの以外の皮膚美容作用を有する成分や、育毛作用を有する発毛成分、育毛成分、養毛成分、脱毛防止成分等を所望により加えても良い。例えば、かかる皮膚美容作用を有する成分としては、レチノイン酸、α−ヒドロキシ酸、レチノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、苛性カリ、トリエタノールアミン、その他糖類等が、かかる育毛作用を有する成分としては、ミノキシジル、塩化カルプロニウム、ヘパリン類似物質、グリセリルモノリレート、リノール酸、各種生薬エキス等が挙げられる。
本発明の化粧料に含有されるフコイダンとしては、非曳糸性のフコイダンが、非沈澱形成性、化粧料の基材への溶解性等において、曳糸性のフコイダンより優れており、非曳糸性のフコイダンが好適である。
化粧料の形態は皮膚美容作用を期待しうるものであれば特に限定はなく、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、軟膏類、浴用剤、浴用洗剤、洗顔剤、洗髪剤等が挙げられる
また、育毛料としての化粧料の形態は、毛髪への作用を期待しうるものであれば特に限定はなく、例えばローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、毛髪剤、育毛剤、養毛剤、脱毛防止剤、又は洗髪剤が挙げられる。
本発明の化粧料の一態様としての育毛料は、育毛を要する部位に塗布或いは張り付けて用いても良い。また本発明の育毛料は飲食が可能な形状にして経口的に摂取しても良い。
本発明の化粧料の使用態様は特に限定されるものではないが、例えば、前記育毛料の使用態様としては、例えば1mL中にフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及び/又はそれらの塩が0.1ng〜100mg含まれる該育毛料の数mLを少なくとも1日1回、育毛を要する部位に、塗布、或いは同量を含むパック類等を張り付ければよい。
なお、皮膚美容作用を期待する観点から、本発明の化粧料を用いる場合も、前記育毛料と同様の使用態様で用いることにより所望の効果を得ることができる。
経口摂取される量としてはフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及び/又はそれらの塩が皮膚美容作用及び/又は育毛作用を示す量が摂取できればよく、特に限定は無いが、通常、一日当たり好ましくは0.1mg〜10g、より好ましくは2mg〜5g、さらに好ましくは10mg〜2gである。
ところで、従来、ヒトの頭髪の成長を促進又は維持させることに使用される育毛料には種々の技術が提案され、また実際に使用されている。
従来の育毛料の有効成分としてはミノキシジル(特開平9−169622号公報)、塩化カルプロニウム(特開平9−175950号公報)等が知られている。
本発明者らは、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものと共に従来の育毛料の有効成分を用いることにより育毛作用が相乗的に増強されることを見出した。
すなわち、本発明によりフコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分、例えば、従来の育毛料の有効成分を含有する育毛料が提供される。
前記育毛作用増強成分としては、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものと共に用いることにより育毛作用を相乗的に増強し得るものであれば良く、本発明に開示の方法(例えば、実施例19に記載の方法)に従って適宜選択することができる。かかる育毛作用増強成分として、本発明において好適に使用され得る従来の育毛料の有効成分としてはミノキシジル及び塩化カルプロニウムが例示される。なお、これらは単独で、又は混合して使用することができる。
フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分を含有する育毛料における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるもの、及び育毛作用増強成分の含有量は、それらによる相乗効果が発揮され得る量であれば良く、特に限定はないが、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖及びそれらの塩から選択されるものとしては該育毛料中、好ましくは0.01〜30重量%、より好ましくは0.1〜10重量%である。また、育毛作用増強成分の含有量としては、ミノキシジルの場合、該育毛料中、好ましくは0.1〜5重量%、より好ましくは0.5〜2重量%である。一方、塩化カルプロニウムの場合、該育毛料中、好ましくは0.1〜10重量%、より好ましくは0.5〜5重量%である。本発明に使用する前記有効成分及び育毛作用増強成分が、それぞれかかる含有量範囲内で含有された育毛料は、育毛作用に非常に優れ好ましい。
また、本発明の育毛料にはミノキシジル及び/又は塩化カルプロニウムの効果を増強できるものを更に含有させても良い。例えば、かかる効果を有するものとして、エピネフリン、テトラヒドロゾリン、塩酸ナファゾリン等の局所滞留化剤、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール等の極性溶媒、シコン、ドッカツ、マオウ、カシュウ、チクセツニンジン等の生薬エキス、パンテノールエチルエーテル、水溶性キチン誘導体等を挙げることができる。
さらに、本発明の一態様として、食品又は飲料として使用され得る化粧料を提供する。かかる化粧料は、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩を含有、添加及び/又は希釈してなり、その皮膚美容作用及び/又は育毛作用により、例えば、皮膚美容用食品又は飲料、脱毛防止用食品又は飲料、又は育毛用食品又は飲料として極めて有用である。
本発明の皮膚美容用食品又は飲料、育毛用食品又は飲料等の製造方法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている公知の食品又は飲料の製造方法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する、本発明で使用するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩から選択されるものが有効成分として含有、添加及び/又は希釈されていれば良い。
なお、本態様において、「含有」とは、食品又は飲料中に本発明で使用される有効成分が含まれる態様を、「添加」とは、食品又は飲料の原料に本発明で使用される有効成分を添加する態様を、「希釈」とは、本発明で使用される有効成分に食品又は飲料の原料を添加する態様をいう。
本発明の皮膚美容用食品又は飲料、又は育毛用食品又は飲料等の形状としては、特に限定はないが、例えば穀物加工品(小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等)、油脂加工品(可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等)、大豆加工品(豆腐類,味噌、納豆等)、食肉加工品(ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等)、水産製品(冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等)、乳製品(原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等)、野菜・果実加工品(ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等)、菓子類(チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等)、アルコール飲料(日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等)、嗜好飲料(緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等)、調味料(しょうゆ、ソース、酢、みりん等)、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品(牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品)、半乾燥又は濃縮食品(レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類)、乾燥食品(即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等)、冷凍食品(すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等)、固形食品、液体食品(スープ等)、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品又は飲料としては、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩から選択されるものが含有、添加及び/又は希釈されており、その生理機能を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する藻類由来のフコイダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。
本発明の皮膚美容用食品、育毛用食品等における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を示す量が含有されておれば良く限定はないが、好ましくは0.001〜100重量%、より好ましくは0.01〜10重量%、さらに好ましくは0.05〜5重量%である。当該皮膚美容用食品、育毛用食品等として、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものをそのまま粉末として、また錠剤として摂取しても良い。
また、皮膚美容用飲料、育毛用飲料等における、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものの含有量は、皮膚美容作用及び/又は育毛作用を示す量が含有されていれば良く限定はないが、好ましくは0.0001〜10重量%、より好ましくは0.005〜5重量%、さらに好ましくは0.02〜2重量%である。
皮膚美容用食品又は飲料、育毛用食品又は飲料等の使用態様は特に限定されるものではないが、皮膚美容効果及び/又は育毛効果を有効に得る観点から、一日当たり、本発明に使用する前記有効成分が好ましくは0.1mg〜10g、より好ましくは2mg〜5g、さらに好ましくは10mg〜2g摂取できるように摂取するのが望ましい。
本発明に使用するフコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩はラットへの経口投与において1g/kgを経口単回投与しても死亡例は認められない。
また、ハーレー系モルモットの背部を剃毛し、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩の3%溶液を1日1回、0.05mLずつ5日間連日塗布投与し、投与開始後6日目にパッチテスト基準(日本皮膚科学会)に基づいて判定したが、無反応であり、フコイダン、その分解物、硫酸化単糖、及びそれらの塩の皮膚刺激性は認められない。
本発明により提供される化粧料は皮膚美容用及び/又は育毛用化粧料として極めて有用である。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、特に記載のない限り実施例における%は重量%を意味する。
実施例1
(1)ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物20kgを自由粉砕機(奈良機械製作所製)により粉砕し、ガゴメ昆布粉砕物を得た。
水道水900リットルに塩化カルシウム二水和物(日本曹達社製)7.3kgを溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物20kgを混合した。液温12℃から液温90℃となるまで水蒸気吹込みにより40分間昇温させ、次いで攪拌下90〜95℃に1時間保温し、次いで冷却し、冷却物1100リットルを得た。
次いで固液分離装置(ウエストファリアセパレーター社製CNA型)を用い、冷却物の固液分離を行い、約900リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液360リットルをダイセル社製FE10−FC−FUS0382(分画分子量3万)を用い、20リットルまで濃縮した。次いで水道水を20リットル加え、また20リットルまで濃縮するという操作を5回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液25リットルを調製した。
該溶液1リットルを凍結乾燥し、非曳糸性のガゴメ昆布由来フコイダンの乾燥物13gを得た。
上記方法に準じ、マ昆布乾燥粉砕物から非曳糸性のマ昆布由来フコイダンの乾燥物を調製した。また同様に、レッソニア ニグレセンス(Lessonia nigrescens)の乾燥粉末(商品名シーウィード パウダー:アンデス貿易株式会社販売)から非曳糸性のレッソニア ニグレセンス由来のフコイダン乾燥物を調製した。
(2)実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダン乾燥物7gを、50mMの塩化ナトリウムと10%のエタノールを含む20mMのイミダゾール緩衝液(pH8.0)700mLに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。DEAE−セルロファインA−800カラム(φ11.4cm×48cm)を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの50mMから1.95Mの濃度勾配により溶出させた(1フラクション:250mL)。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を求め、溶出順にフラクション43〜49、フラクション50〜55、フラクション56〜67の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション43〜49よりI画分(340mg)、フラクション50〜55よりII画分(870mg)、フラクション56〜67よりIII画分(2.64g)をそれぞれ調製した。
第1図にガゴメ昆布由来フコイダンのDEAE−セルロファインA−800カラム溶出パターンを示す。第1図において、縦軸はカルバゾール硫酸法での530nmの吸光度(図中黒丸)、フェノール硫酸法での480nmの吸光度(図中白丸)、及び電導度(mS/cm:図中白四角)、横軸はフラクション番号を示す。
実施例2
(1)アルテロモナス sp. SN−1009(FERM BP−5747)を、グルコース 0.25%、ペプトン 1.0%、酵母エキス 0.05%を含有させた人工海水(ジャマリンラボラトリー社製)pH8.2からなる培地600mLを分注して殺菌した(120℃、20分間)2リットルの三角フラスコに接種し、25℃で26時間培養して種培養液とした。ペプトン 1.0%、酵母エキス 0.02%、下記実施例2−(2)に記載の硫酸化多糖 0.2%、及び消泡剤(信越化学工業社製KM70)0.01%を含有させた人工海水pH8.0からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファメンターに入れて120℃、20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mLを接種し、24℃で24時間、毎分10リットルの通気量と毎分250回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後、85%飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、10分の1濃度の人工海水を含む20mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)に対して充分透析し、600mLのF−フコイダンに選択的に作用するF−フコイダン分解酵素液を調製した。
(2)乾燥したガゴメ昆布2kgを直径1mmのスクリーンを装着させたカッターミル(増幸産業社製)により粉砕し、得られた昆布のチップを20リットルの80%エタノール中に懸濁し、25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、95℃に加温した40リットルの50mMの塩化ナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5に懸濁し、時々攪拌しながら95℃で2時間処理し、硫酸化多糖を抽出した。
抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を3.5リットルの100mM塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。
両ろ液を合わせた後、30℃まで温度を下げ、3000Uのアルギン酸リアーゼ(ナガセ生化学工業社製)を添加後、エタノールを4リットル加え25℃で24時間攪拌した。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量10万のホロファイバーを備えた限外ろ過機により4リットルに濃縮し、更に、10%のエタノールを含む100mMの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。
非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を5℃まで温度を下げ、0.5N塩酸によりpHを2.0とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに1N水酸化ナトリウムによりpHを8.0とした。
次に、排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過を行い、20mM塩化ナトリウムpH8.0により完全に溶媒置換後、再度pHを8.0として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約95gの硫酸化多糖を調製した。
(3)乾燥したガゴメ昆布2kgを直径1mmのスクリーンを装着させたカッターミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを20リットルの80%エタノール中に懸濁し、25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、30mLの上記実施例2−(1)で調製したF−フコイダン分解酵素、10%のエタノール、100mMの塩化ナトリウム、50mMの塩化カルシウム、及び50mMのイミダゾールを含む20リットルの緩衝液(pH8.2)に懸濁し、25℃で48時間攪拌した。この懸濁液を網目の直径32μmのステンレス金網でろ過し、残渣を50mMの塩化カルシウムを含む10%のエタノールで洗浄した。更にその残渣を10リットルの50mM塩化カルシウムを含む10%のエタノール中に懸濁し、3時間攪拌後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、16時間攪拌し、直径32μmのステンレス金網でろ過、洗浄した。
こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量3000のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。
このろ過液をロータリーエバポレーターで約3リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に0.1Mとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ50mMの酢酸カルシウムにより平衡化させたDEAE−セルロファイン(樹脂量4リットル)にかけ、50mMの酢酸カルシウム及び50mMの塩化ナトリウムで充分洗浄後、50mM〜800mMの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。この時の分取量は1本当り500mLで行った。分取した画分をセルロースアセテート膜電気泳動法[アナリティカル バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)、第37巻、第197〜202頁(1970)]により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約0.4Mで溶出される硫酸化糖(フラクションナンバー63付近)が均一であった。
そこで、まずフラクションナンバー63の液を150mLに濃縮後、濃度が4Mとなるように塩化ナトリウムを添加し、あらかじめ4Mの塩化ナトリウムにより平衡化したPheny1−セルロファイン(樹脂量200mL)にかけ、4Mの塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液505mLを得た。
得られた脱塩液のうち40mLを10%のエタノールを含む0.2Mの塩化ナトリウムによって平衡化させたセルロファインGCL−90のカラム(4.1cm×87cm)にかけて、ゲルろ過を行った。分取は1フラクション当り9.2mLで行った。
全フラクションに対して総糖量の分析をフェノール硫酸法〔アナリティカル ケミストリー(Analytical Chemistry)、第28巻、第350頁(1956)〕により行った。
この結果、硫酸化糖は1つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー63〜70を集め、排除分子量300の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、112mgの下記式(VIII)で表される化合物の乾燥品を得た。以下、該化合物を7−12SFd−Fと称す。
(4)実施例1−(2)で調製したIII画分(F−フコイダン)の2.5%水溶液80mLに1M トリス−塩酸緩衝液(pH7.6)を16mL、1M CaCl2水溶液を16mL、4M NaCl水溶液を24mL、実施例2−(1)で得たF−フコイダン分解酵素液を8mL、蒸留水を176mL添加し、30℃で3時間加熱した。この酵素処理F−フコイダン溶液を酵素処理F−フコイダンの最終濃度が2%になるようにロータリーエバポレーターで濃縮し、その後蒸留水中で透析操作を行い、2%酵素処理F−フコイダン水溶液を調製した。この試料をHPLC(カラム:SB802.5、カラム温度:35℃、移動相:50mM NaCl、流速:0.5mL/min、検出:RI ATT=8)で分析した。その結果、試料中の約40%が式(VIII)記載の7−12SFd−Fであることが明らかになった。
実施例3
(1)乾燥ガゴメ昆布2kgを穴径1mmのスクリーンを装着したカッターミル(増幸産業社製)により破砕し、20リットルの80%エタノール中で25℃、3時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を50mMの塩化カルシウム、100mMの塩化ナトリウム、10%のエタノール、及び参考例2−(1)で調製したアルテロモナス sp. SN−1009(FERM BP−5747)F−フコイダン分解酵素を1U含む20リットルの30mMイミダゾール緩衝液(pH8.2)に懸濁し、25℃で2日間攪拌し、次いで穴径32μmのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を100mMの塩化ナトリウム、10%のエタノール、及び4gのアルギン酸リアーゼ(ナガセ生化学工業製)を含む40リットルのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.6)に懸濁し、25℃、4日間攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量10万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により2リットルに濃縮後、10%のエタノールを含む100mMの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の400mM酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、1Nの塩酸でpH2とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を1Nの水酸化ナトリウムによりpH8.0とした。この溶液を限外ろ過により1リットルに濃縮後、100mMの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に1Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、1Mの塩化ナトリウムで平衡化した3リットルのフェニルセルロファインカラム(生化学工業製)にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、20mMの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は29.3gであった。
(2)上記の凍結乾燥物15gを、国際公開第97/26896号パンフレット記載の、フラボバクテリウム sp.SA−0082(FERM BP−5402)を培養し、該培養物から得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素(U−フコイダン分解酵素)を9U、及び400mMの塩化ナトリウムを含む1.5リットルの50mMトリス−塩酸緩衝液に溶解し、25℃で6日間反応後、エバポレーターで約300mLに濃縮した。濃縮液を排除分子量3500の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、50mMの塩化ナトリウムで平衡化した4リットルのDEAE−セルロファインA−800にかけ、50mM塩化ナトリウムで充分洗浄後、50〜650mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを650mMの塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち650mMの塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量10万の限外ろ過機により濃縮後、10mMの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して非曳糸性の硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物0.85gを得た。得られた硫酸化フコガラクタン(G−フコイダン)は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約2:1であった。
(3)G−フコイダン分解酵素の生産のため、フラボバクテリウム sp. SA−0082(FERM BP−5402)を、グルコース0.1%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.05%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー製)pH7.5からなる培地600mLを120℃、20分間殺菌した後、該培地に接種し、24℃で23時間培養して種培養液とした。実施例3−(1)の方法で調製したガゴメ昆布由来のフコイダン画分0.2%、ペプトン2.0%、酵母エキス0.01%、及び消泡剤(KM70、信越化学工業製)0.01%を含む人工海水(pH7.5)からなる培地20リットルを30リットル容のジャーファーメンターにいれ120℃で20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液600mLを接種し、24℃で23時間、毎分10リットルの通気量と毎分125回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を得た。
得られた菌体を、1200mLの0.4M塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。得られた菌体抽出液を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。得られた上清に終濃度が90%飽和となるように硫安を添加し生じた沈殿を遠心分離して集めた。得られた沈殿を150mLの50mM塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解させ、同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離した。得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した500mLのDEAE−セファロースFF(アマシャムファルマシア社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、50mMから600mMの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。
得られた活性画分を0.1M塩化ナトリウムを含む10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で充分透析し、同じ緩衝液で平衡化した100mLのDEAE−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、0.1Mから0.4Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に4Mとなるように塩化ナトリウムを添加し、4Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した20mLのPheny1−セルロファイン(チッソ社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、4Mから1Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに1Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分に3Mとなるように塩化ナトリウムを添加し、3Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化した10mLのPheny1−セルロファイン(チッソ社製)のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、3Mから0.5Mの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出後、さらに0.5Mの塩化ナトリウムを含む10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で充分溶出させ、活性画分を集めた。このようにして得られた精製酵素をG−フコイダン分解酵素として用いた。
(4)実施例3−(2)記載のG−フコイダンに上記の精製G−フコイダン分解酵素を作用させ低分子化物を調製した。すなわち、1.94gのG−フコイダンを0.2Mの塩化ナトリウムを含む25mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解後、186mUのG−フコイダン分解酵素を加え、25℃で、6日間反応させた。反応液をエバポレーターにより80mLに濃縮し、セルロファインGCL−1000(チッソ社製)のカラム(4×90cm)による分子量分画を行った。分子量15,000以下の画分を集め、G−フコイダン酵素消化物画分とした。
(5)上記G−フコイダン酵素消化物画分をエバポレーターで500mLに濃縮後、電気透析装置により脱塩し、あらかじめ10mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平衡化した1リットルのDEAE−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、10mMから900mMの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は61mLずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。270mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分が糖含量のピークを形成していたので、それを集め270mM溶出画分(ロ)とした。
また上記の270mM溶出画分(ロ)に関しては、150mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)と同じ電導度になるように水を添加し、あらかじめ150mMの塩化ナトリウムを含む10mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH8)で平衡化した200mLのDEAE−セルロファインA−800(チッソ社製)のカラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、150mMから300mMの塩化ナトリウムのグラジエントにより溶出させた。溶出画分は12mLずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。160mMから180mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、スピードバック(サバントインストルメンツ社製;SAVANT Instruments Inc.)で2mLに濃縮後、あらかじめ10%のエタノールで平衡化した200mLのセルロファインGCL−25(チッソ社製)のカラムにかけ、同溶液で溶出させた。溶出画分は2mLずつ分取し、それぞれの糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。糖含量がピークを形成している画分を集め、(D)とした。
上記画分(D)について電気透析装置により脱塩後、凍結乾燥し、糖組成及び分子量を分析した。また、定法により重水で置換後NMR分析による構造解析を行った。
(D)の物性
分子量;1358
1H−NMR(D2O)
δ;5.19(1H,d,J=4.3Hz,F1−1−H),4.93(1H,d,J=3.7Hz,F2−1−H),4.62(1H,HODと重複,G1−1−H),4.59(1H,HODと重複,G2−1−H),4.54(1H,d−d,J=10.6,2.7Hz,F1−3−H),4.46(1H,d,J=7.6Hz,G3−1−H),4.46(1H,m,F2−3−H),4.41(1H,br−s,G2−4−H),4.41(1H,d,J=7.6Hz,G4−1−H),4.37(1H,q,J=6.4Hz,F2−5−H),4.27(1H,m,G2−3−H),4.24(1H,br−s,G3−4−H),4.21(1H,m,G3−3−H),4.19(1H,m,G4−3−H),4.15(1H,br−s,G4−4−H),4.13(1H,q,J=6.7Hz,F1−5−H),4.09(1H,d,J=2.7Hz,F1−4−H),4.04(1H,d,J=2.8Hz,F2−4−H),3.98(1H,m,G2−6−H)、3.96(1H,d−d,J=10.6,4.3Hz,F1−2−H),3.93(1H,m,G3−6−H),3.88(1H,br−s,G1−4−H),3.86(1H,m,G2−5−H),3.81(1H,m,G2−6−H),3.81(1H,m,F2−2−H),3.80(1H,m,G3−5−H),3.80(1H,m,G3−6−H),3.66(1H,m,G1−3−H),3.65(1H,m,G2−2−H),3.64(1H,m,G1−6−H),3.64(1H,m,G4−6−H),3.61(1H,m,G4−5−H),3.58(1H,m,G1−2−H),3.56(1H,m,G1−6−H),3.56(1H,m,G4−6−H),3.55(1H,m,G4−2−H),3.54(1H,m,G1−5−H),3.54(1H,m,G3−2−H),1.20(3H,d,J=6.7,F1−6−H),1.14(3H,d,J=6.4,F2−6−H)
糖組成(モル比) L−フコース:D−ガラクトース=2:4
硫酸基 5分子
なお、1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式(IX)の通りである。以下、該化合物を6−5SFd−Gと称する。
実施例4
実施例2−(2)で調製した硫酸化多糖120gを20mMの塩化カルシウム、300mMの塩化ナトリウム、10%のエタノール、及び10Uの実施例2−(1)で調製したF−フコイダン分解酵素を含む8リットルの20mMイミダゾール緩衝液(pH7.5)に懸濁し、25℃で3日間攪拌し、排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過装置を用い、上記緩衝液を添加しながら限外ろ過した。
限外ろ過内液に34Uの実施例3−(2)記載のU−フコイダン分解酵素を添加して、25℃で2日間攪拌し、排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過を行い、水を添加しながら限外ろ過した。
ろ液を集め、エバポレーターで1.5リットルに濃縮後、脱塩装置により完全に脱塩し、あらかじめ30mMの塩化ナトリウムを含む5mMのイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6.5)で平衡化した3リットルのDEAE−セルロファインA−800のカラムにかけ、6リットルの同緩衝液で洗浄後、30mMから500mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に要した液量は48リットルであった。溶出液は180mLずつ分取し、その糖含量をフェノール−硫酸法により測定した。また、232nmにおける吸光度も同時に測定した。130mMから170mMの塩化ナトリウム溶出画分が一つのピークを形成したので、これらの画分を集め、脱塩装置により脱塩後、凍結乾燥し、5.85gのオリゴ糖を得た。このオリゴ糖は質量分析により、分子量1128でありNMR分析により下記式(X)で表される化合物であることを確認した。以下、該化合物を6−2SFd−Uと称す。
実施例5
(1)ガゴメ昆布500gを細断し、10リットルの80%エタノールで洗浄後、50リットルの1mM塩化カリウムを含有する10%エタノール中にて内径40cmの容器で25℃で2日間、1分間当り120回転の速度で攪拌し、フコイダンを抽出し、抽出物を網目32μmのステンレス金網でろ過し、フコイダン溶液を調製した。
該フコイダン溶液46リットルに、1gのパームオイル(花王社製:化粧品用)を1リットルのエタノールに溶解し調製した、パームオイル溶液1リットルを攪拌しながら添加し、更に1リットルのグリセロールを添加し、化粧水を調製した。また、同様の方法で、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても化粧水を調製した。
(2)実施例5−(1)で調製したフコイダン溶液に、終濃度が0.02%となるようにゼラチン及び香料を添加しゼラチン使用の化粧水を得た。また同様にコラーゲンを添加しコラーゲン使用の化粧水を得た。また、同様の方法で、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても化粧水を調製した。
(3)実施例5−(1)で調製したフコイダンに香料を添加し、毛髪剤を調製した。また同様に、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても毛髪剤を調製した。
実施例6
市販のワカメ メカブの乾燥物1kgを穴の径が1mmのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、10リットルの80%エタノール中に懸濁し、3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を50mMの塩化ナトリウムを含む40mMのリン酸緩衝液(pH6.5)20リットルに懸濁し95℃で2時間処理した。処理液を37℃まで冷却後、10%となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼK(ナガセ−生化学工業社製)を12000U添加後、室温で24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を5℃に冷却後0.5Nの塩酸を添加してpHを2.0とした後30分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のpHを0.5Nの水酸化ナトリウムにより8.0とし、限外ろ過により溶液を20mMの塩化ナトリウムに置換した。溶液のpHを8.0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、90.5gの非曳糸性のワカメ メカブ由来フコイダンを得た。
実施例7
粉砕したヒバマタ(Fucus vesiculosus)の乾燥物1kgを、10リットルの80%エタノール中に懸濁し、3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を100mMの塩化ナトリウムを含む30mMのリン酸緩衝液(pH6.0)30リットルに懸濁し95℃で2時間処理した。処理液を37℃まで冷却後、100gの活性炭を添加し30分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼKを3000U添加後、10%となるようにエタノールを添加し室温で24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を5℃に冷却後0.5Nの塩酸を添加してpHを2.0とした後30分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のpHを0.5Nの水酸化ナトリウムにより8.0とし、限外ろ過により溶液を20mMの塩化ナトリウムに置換した。溶液のpHを8.0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、71gの非曳糸性のヒバマタ由来フコイダンを得た。
上記方法に準じ、アスコフィラム ノドッサム(Ascophyllum nodosum)の乾燥粉末(商品名アルギンゴールド:アンデス貿易株式会社販売)から非曳糸性のアスコフィラム ノドッサム由来フコイダンを調製した。
実施例8
実施例1−(1)記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコイダン2gを100mLの水に溶解し、そのpHをクエン酸にてpH3に調整後、100℃で3時間処理し、当該フコイダンの酸分解物を調製した。この加水分解物をセルロファインGCL−300、又はセルロファインGCL−25によるゲルろ過で分子量分画し、セルロファインGCL−300を用い分子量25000超(A画分)、25000〜10000超(B画分)、10000〜5000超(C画分)、セルロファインGCL−25を用い5000〜2000超(D画分)、2000〜500超(E画分)、500以下(F画分)に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物及び酸分解物の各分画物を調製した。
実施例9
市販の塩蔵モズク5kgをはさみで細断し、20リットルのエタノールと混合した。1晩放置後ろ紙でろ過し、得られた残渣を12.5リットルの水に懸濁し、95℃で2時間処理した。処理液をろ紙によりろ過後、350mMの塩化ナトリウムを含む2.5%の塩化セチルピリジニウム溶液を2600mL添加し3日間放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に2.5リットルの350mMの塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を3回繰り返した。得られた沈殿に400mLの400mM塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、80%となるようにエタノールを添加して30分間攪拌後ろ紙でろ過した。得られた残渣に500mLの塩化ナトリウム飽和80%エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、1リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノールを添加して30分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の260nmの吸光度がゼロになるまで繰り返した(通常5回)。得られた残渣を1.5リットルの2Mの塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離により除去し、あらかじめ2Mの塩化ナトリウムにより平衡化した100mLのDEAE−セルロファインA−800のカラムを素通りさせた。素通り画分を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により2リットルに濃縮後、限外ろ過により溶液を2mMの塩化ナトリウムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、22.9gのモズク由来フコイダンを得た。
実施例10
(1)乾燥したマクサ50gをはさみで細断し、500mLの80%エタノール中に懸濁後25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を1リットルの100mMの塩化ナトリウムを含む30mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に懸濁し、95℃で2時間処理後、穴径106μmのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に上記のリン酸ナトリウム緩衝液を加え、3リットルとし、5gの活性炭を添加し、25℃で1晩攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で200mLに濃縮後、限外ろ過機により溶液交換して10mM塩化ナトリウム溶液とした。溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、マクサ由来硫酸化多糖画分の乾燥物を2.3g得た。
(2)実施例10−(1)記載の方法により乾燥オゴノリ50gよりオゴノリ由来硫酸化多糖4.4gを調製した。また、同様に乾燥おばくさ(Pterocladiella capillacea)より、おばくさ由来硫酸化多糖1.0gを調製した。
(3)−▲1▼ 市販の乾燥レッソニア ニグレセンスの粉末1kgを10リットルの80%エタノール中に懸濁後25℃で3時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を20リットルの100mMの塩化ナトリウムを含む30mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)に懸濁し、95℃で2時間処理後、穴径106μmのステンレス製ふるいでろ過した。得られたろ液に100gの活性炭、2.4リットルのエタノール、6,000Uのアルギン酸リアーゼKを添加し、25℃で22時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で1.2リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去し、5℃で24時間放置した。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を限外ろ過機により溶液交換して100mM塩化ナトリウム溶液とした。この溶液を4℃以下に冷却後、塩酸によりpHを2.0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のpHを水酸化ナトリウムにより8.0とし、2リットルに濃縮後、限外ろ過機により20mMの塩化ナトリウムに溶液交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、非曳糸性のレッソニア由来フコイダン画分の乾燥物を41gを得た。
(3)−▲2▼ 上記の凍結乾燥物6gを100mMの塩化ナトリウムを含む600mLの20mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH6)に溶解し、あらかじめ同緩衝液で平衡化した5リットルのDEAE−セルロファインA−800にかけ、10リットルの同緩衝液で洗浄後、100〜1600mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。溶出に使用した液量は13リットルで、分取は1本あたり500mLで行った。溶出画分のうち250mM、530mM、及び700mM付近の塩化ナトリウム溶出画分をそれぞれ500mLずつ純水で透析し、凍結乾燥して凍結乾燥物をそれぞれDEAE33画分、DEAE37画分、DEAE40画分と命名し、それぞれ57mg、24mg、及び62mgを得た。
実施例11
マナマコを5kg解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量200g当り500mLのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がでなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、140gの乾燥物を得た。この乾燥物に0.4Mの食塩水2.8リットルを加え、100℃で1時間処理後、ろ過し、残渣を0.4Mの食塩水で充分洗浄し、抽出液3.7リットルを得た。この抽出液に5%のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を0.4Mの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に1リットルの4M食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、攪拌しながら4リットルのエタノールを添加し、1時間攪拌後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、80%エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の260nmの吸光度がほぼ0になるまで繰り返した。得られた沈殿を2リットルの2M食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量3万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し3.7gのナマコ由来フコイダンを得た。
実施例12
(1)市販の塩蔵オキナワモズク625gを4375mLの30mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に懸濁し、ホモジナイザーにより8000回転/分、5分処理後、95℃、1時間処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に10gの活性炭を添加後30分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により2リットルに濃縮後、20mMの塩化ナトリウムで溶液置換し、凍結乾燥して10.9gの非曳糸性のオキナワモズク由来のフコイダンの乾燥物を得た。
(2)当該フコイダンにフコフィラス フコイダノリティカス(Fucophilus fucoidanolyticus)SI−1234(FERM P−17517)の生産するフコイダン分解酵素を作用させ、得られた酵素分解物のNMR、MASS等による機器分析の結果、当該フコイダンは前記一般式(IV)の構造を繰返し単位とするフコイダンであることが判明した。また当該フコイダンはフコースとグルクロン酸を35:10〜44:10のモル比で含有するフコイダンで、その平均分子量は約100万であった。
実施例13
(1)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後5週齢より実験に用いた。実施例1−(1)で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをエタノールで3%濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に1匹あたり200μLづつ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日8日間行った。投与開始9日目に背部の毛を一部脱毛し、顕微鏡下でカリパーを用いて毛の長さを測定した。また、脱血致死後皮膚を剥離し、裏側皮膚色を画像解析ソフト(NIH Image)により解析処理した。
結果を表1に示す。なお、表中、毛の長さについては5例の平均値±標準誤差で示し、皮膚色については対照群の色合いを100とした時の色調の黒さの5例の平均値で示す。
対照群では明らかに休止期に移行している状態が観察され、皮膚色は白色に移行していた。一方、フコイダン投与群では成長期を維持しており、皮膚色は対照群より灰色がかっていた。毛の長さはフコイダン投与群では対照群より長かった。すなわち、フコイダン投与群では育毛効果が確認された。
C3H/Heマウスは、育毛効果の評価に繁用される。5週齢時の毛髪は成長期に相当し、毛および毛包が盛んに成長する時期である。かかる時期では、毛包細胞における色素や酵素の分泌が盛んであるため、皮膚色はかなり黒っぽく見える。しかし、毛髪の状態が成長期から休止期に移行し始めると毛は成長を止め、毛包も小さくなり分泌機能も衰える。そのため、皮膚色は次第に薄くなり、ピンクから白っぽく見えるようになる。毛髪のサイクルはもともと生理的なものであるが、成長期を維持することができれば、成長している毛髪の割合が増加することになり、育毛剤として有用である(The Journal of Dermatology 10:45−54,1983.)。
また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(2)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンで毛刈りした。
実施例1−(1)で調製したガゴメ昆布由来フコイダンをエタノールで3%濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に1匹あたり200μLづつ、上記の毛刈り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日行った。
投与開始から経時的に投与部位を観察し、皮膚色調の変化をスコア化して判定した。すなわちスコア化の基準は、スコア0;皮膚色の変化無し、スコア1;皮膚色が青色に変化、スコア2;皮膚色が青黒〜灰色に変化、スコア3;発毛が見られる、スコア4;ほぼ毛刈り前の状態に復帰、とした。
各群のスコアの平均値を求め、その結果を表2に示す。
表2に示すように対照群に対して、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群は早期より、皮膚色の変化が観察され、育毛が促進され、最終的には発毛に至った。すなわち、育毛効果が確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(3)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更に剃刀により毛剃りした。
実施例1−(1)で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、又は実施例2−(3)で調製した7−12SFd−Fを用い、実施例13−(2)と同様の方法でそれらの育毛効果について試験した。
各群のスコアの平均値を求め、その結果を表3に示す。
表3に示すように対照群に対して、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群、7−12SFd−F投与群で各々、皮膚色の変化が早期に観察され、育毛が促進され、最終的には発毛に至った。なお、ガゴメ昆布由来フコイダン投与群、7−12SFd−F投与群を比較すると、7−12SFd−F投与群が、やや早い時期から皮膚色の変化が見られはじめた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(4)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後5週齢より実験に用いた。実施例2−(3)で調製した7−12SFd−Fをエタノールで3%濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に1匹あたり200μLづつ塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日8日間行った。投与開始9日目に脱血致死後皮膚を剥離し、裏側皮膚色を画像解析ソフトにより解析処理した。
結果を表4に示す。表中の数字は、5例の平均値±標準誤差を表す。表中の*印は、対照群に対して、5%以下の危険率で有意な差を有することを意味する。皮膚色調は白色を0、黒色を100とした時の色調の程度を表す。
対照群では明らかに休止期に移行している状態が観測され、皮膚色は白色に移行していた。一方、7−12SFd−F投与群では成長期を維持しており、皮膚色は対照群より灰色がかっていた。以上より、7−12SFd−Fは後期成長期維持作用、すなわち、実施例13−(1)と同様に育毛作用を示すことが分かった。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(5)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例2−(3)で調製した7−12SFd−Fをエタノールで3%濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に1匹あたり200μLづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日行った。投与開始日(毛剃りの翌日)から21日目に発毛した面積を測定し、毛剃りした面積に対する割合(%)で表した。
結果を表5に示す。表中の数字は、7〜8例の平均値±標準誤差を表す。
対照群に比し、7−12SFd−F投与群では明らかに休止期から成長期への移行が促進されており、発毛に至った割合が多かった。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(6)実施例13−(5)と同様の方法で実施例1−(1)で調製したガゴメ昆布由来フコイダン、後述の実施例16−(2)で調製したF−richフコイダンを用いてその育毛効果を確認した。結果を表6に示す。対照群に比し、フコイダン投与群、F−richフコイダン投与群では発毛に至った割合が高かった。
(7)雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウスの背部をバリカンによる毛刈り後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例2−(3)で調製した7−12SFd−Fをエタノールで3%濃度に懸濁溶解し、マウスの背部に1匹あたり200μLづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群にはエタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日行った。投与開始日(毛剃りの翌日)から21日目に脱血致死後背部皮膚を剥離し、ホモジナイズにより抽出液を作製した。背部皮膚抽出液中のグルコース−6−リン酸脱水素酵素活性(G−6−PDH活性)をロッシュ・ダイアグノスティックス株式会社製のテストキットで、また、アルカリホスファターゼ活性(ALP活性)を和光純薬工業株式会社製のテストキットで測定した。なお、G−6−PDHおよびALPは育毛効果の見られた組織においてその酵素活性の上昇することが知られている。
それらの結果を表7に示す。表中の数字は、7〜8例の平均値±標準誤差を表す。対照群に比し、7−12SFd−F投与群では明らかに皮膚組織中の酵素活性が上昇しており、休止期から成長期への移行が促進されていることが示された。すなわち、育毛効果が確認された。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(8)実施例5−(1)記載の本発明のガゴメ昆布由来フコイダン含有化粧水と、フコイダンを含有しない対照の化粧水とを比較して、20〜35才の成人女性25人に対しブラインドで官能検査を行った。その結果、より有効と判定した人数を表8に示す。
以上の結果、フコイダン配合の本発明の化粧水は肌のしっとりさ、なめらかさ、はりのいずれの事項についても優れた検査結果を示し、皮膚美容作用のある化粧水であることが示された。
また、その他のフコイダン及びその分解物を含有する化粧水について、それぞれ同様の試験を行ったところ、同様な皮膚美容効果が確認できた。
(9)実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダンを200mg含有する50mL容の清涼飲料(麦芽糖溶液3%、梅粉末0.05%、1/5レモン透明果汁0.2%、無水クエン酸0.02%)を作製し、この飲料の皮膚美容効果を検討した。当該飲料を毎日1本3ヵ月飲用したところ、皮膚のかゆみ、目のかゆみが抑制され、しみの減少が確認された。また毛髪の増毛、白髪の進行抑制も認められた。更に乾燥肌も改善された。
またその他のフコイダン及びその分解物を含有する飲料についても、それぞれ同様の試験を行ったところ同様の皮膚美容効果、育毛効果が確認された。
(10)実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダンを用い、以下の成分の乳液を調製した。なお、「部」は重量部を表わす。
流動パラフィン 23.0部
ミリスチン酸イソプロピル 5.0部
ワセリン 6.0部
ミツロウ 5.0部
ステアリン酸 2.0部
ベヘニルアルコール 1.0部
モノステアリン酸ソルビタン 3.0部
ポリオキシエチレン(20)モノステアリン酸ソルビタン 3.0部
1,3−ブチレングリコール 3.0部
パラベン 0.3部
フコイダン 1.0部
香料 適量
精製水 残余
敏感肌の人6名に上記乳液を朝晩2回、連日3ヵ月使用させたが、炎症等の好ましくない現象は全く現れず、肌状態も全員改善した。
実施例14
(1)D−(+)−グルコース200mg(1.1mmol)をピリジン10mLに溶解し、室温にてPyridine Sulfur Trioxide Complex(Pyr・SO3:東京化成製)1.05g(6.6mmol)を添加した後、室温にて数分間、さらに60℃で1時間攪拌した。反応液を水で希釈し、飽和水酸化バリウム水溶液でpHを中性付近に調整してから減圧乾固した。得られた濃縮物に再度水を添加し再び減圧乾固した。この操作をもう一度繰り返した。得られた濃縮物に少量の水を添加し遠心で硫酸化バリウムの沈殿を除去し、得られた上清を陽イオン交換カラム〔アンバーライト IRA−120(Na+)(オルガノ)〕に供じた。最終的に、得られたカラム素通り画分を減圧濃縮し硫酸化(−SO3−Na+)D−(+)−グルコース700mgを得た。又、同様にして硫酸化フコース、硫酸化マンノース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化2−デオキシ−グルコース、硫酸化タロースを調製した。
(2)実施例13−(3)と同様の方法で実施例14−(1)で調製した硫酸化グルコースの育毛効果について検討した。ただし、硫酸化グルコースは、50%エタノールに3%になるように溶解し、マウスの背部に1日1回200μLづつ塗布した。対照群には50%エタノールのみを塗布した。その結果、表9に示すように対照群に対して、硫酸化グルコース投与群では、皮膚色の変化が早期に観測され、育毛が促進されて、最終的には発毛に至った。また、硫酸化フコース、硫酸化マンノース、硫酸化ガラクトース、硫酸化キシロース、硫酸化2−デオキシ−グルコース、硫酸化タロースについて同様の試験を行い、同様な育毛効果を確認した。
実施例15
(1)生後2日齢の雄性C3H/Heマウスを母獣と一緒に日本SLC社から購入し、5日齢で実験に用いた。マウスを脱血致死させ、ハサミとピンセットを用いてヒゲを、皮下組織ごと採取した。さらに、Ogawaらの方法(J.Invest.Dermatol 103:306−309,1994)に従い、顕微鏡下、シャーレの中でヒゲを毛包ごと分離した。一匹の左右より14〜16本のヒゲを採取した。
実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダンおよび実施例2−(3)記載の7−12SFd−Fは、RPMI−1640培地に溶解し、所定濃度の20倍濃度液を調製し、培養系には20分の1量を加えた。対照群には同量の培地を加えた。なお、各添加サンプルの所定濃度は表10に、培地1mL当たりの濃度(mg/mL)として、それぞれ示す。ヒゲの培養は、組織培養用ディッシュFalcon 3037(Becton Dickinson Labware社製)を用い、中央のウエルに0.7mLの20%FCS添加RPMI−1640培地を入れ、その上に滅菌したステンレスメッシュ(池田理化株式会社製)とレンズペーパー(ティーシーケース株式会社製)を敷いた。ヒゲはその上に載せて培養した。ガゴメ昆布由来フコイダンおよび7−12SFd−Fは、予め培地の中に添加した。培養は35℃、5%CO2存在下で6日間行った。ヒゲの長さは、培養開始前と終了後に、顕微鏡下でカリパーを用いて0.1mmの位まで測定した。各サンプル濃度の一群について3〜5本のヒゲを用いて測定し、伸長した長さを平均値±標準誤差で表示した。また、有意差検定はステューデントのt検定を行い、対照群に対してP値を求めた。その結果を表10に示す。
その結果、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび7−12SFd−Fは、対照に比べて濃度依存的にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび7−12SFd−Fに育毛効果があることが確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
(2)生後2日齢の雄性C3H/Heマウスを母獣と一緒に日本SLC社から購入し、9日齢で実験に用い実施例15−(1)と同様の方法で、実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダン及び実施例2−(3)記載の7−12SFd−Fの育毛効果について調べた。その結果を表11に示す。
その結果、9日齢のマウスのヒゲを用いた場合にも、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび7−12SFd−Fは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、ガゴメ昆布由来フコイダンおよび7−12SFd−Fに育毛効果があることが確認できた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
実施例16
(1)実施例1−(1)記載のガゴメ昆布由来フコイダン30gを蒸留水12リットルに室温で30分間攪拌溶解した。この懸濁液を10000×gで40分間遠心分離し、その上清を集めた。これをメンブレンフィルター(0.22μm)(ミリポア社製)で無菌ろ過し、凍結乾燥品21.4gを得た。これをTaKaRaコンブフコイダンBf(以下、フコイダンBfと称す)とした。
(2)乾燥ガゴメ昆布500gを細断し、10Lの80%エタノールで洗浄後、50リットルの1mM塩化カリウムを含有する10%エタノール中にて、25℃で3日間攪拌し、網目の直径32μmのステンレス金網でろ過してろ液約45リットルを得た。このろ液34リットルを80℃で3時間加熱した後、50℃まで冷却した。これを分子量1万カットの限外ろ過OMEGAカセット(フィルトロン社製)で液温50℃に保ちながら濃縮した。さらに50℃に加温した蒸留水5リットルで脱塩を行い、同蒸留水200mLを加えて流路を2回洗浄して回収し濃縮液1.5リットルを得た。これを凍結乾燥し、8.2gのF−richフコイダンを得た。
(3)生後2日齢の雄性C3H/Heマウスを母獣と一緒に日本SLC社から購入し、14日齢で実験に用い実施例15−(1)と同様の方法で、実施例16−(1)記載のフコイダンBf及び実施例16−(2)記載のF−richフコイダンの育毛効果について調べた。ヒゲの長さは、培養開始前と終了後に、顕微鏡下でカリパーを用いて0.1mmの位まで測定し、伸長した長さを平均値±標準誤差で表示した。また、有意差検定はステューデントのt検定を行い、対照群に対してP値を求めた。その結果を表12に示す。
その結果、フコイダンBfおよびF−richフコイダンは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、育毛効果があることが確認できた。また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
実施例17
生後2日齢の雄性C3H/Heマウスを母獣と一緒に日本SLC社から購入し、5日齢で実験に用い実施例15−(1)と同様の方法で、実施例16−(2)記載のF−richフコイダン、実施例6記載のワカメ メカブ由来フコイダン、実施例7記載のヒバマタ由来フコイダン、実施例9記載のモズク由来フコイダン及び実施例12記載のオキナワモズク由来フコイダンの育毛効果について調べた。その結果を表13に示す。
その結果、これらのフコイダンは対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。また、F−richフコイダンおよびヒバマタ由来フコイダンは、特に良くマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、フコイダンの種類によってマウスのヒゲを伸長させる作用には強弱があり、ガゴメ昆布由来のF−richフコイダンおよびヒバマタ由来フコイダンには他に比べて強い育毛効果があることが確認できた。また、各実施例に記載のフコイダン及びその分解物について同様の試験を行ったところ、育毛効果が確認できた。
実施例18
生後2日齢の雄性C3H/Heマウスを母獣と一緒に日本SLC社から購入し、6日齢で実験に用い実施例15−(1)と同様の方法で、実施例14−(1)記載の硫酸化グルコースの育毛効果について調べた。その結果を表14に示す。
その結果、硫酸化グルコース1mg/mLは、対照に比べて有意にマウスのヒゲを伸長させた。すなわち、この実験系においても硫酸化グルコースに育毛効果があることが確認できた。また、実施例14に記載の各硫酸化単糖についても同様の効果があることが確認できた。
実施例19
雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウス背部をバリカンによる毛刈りの後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例16−(1)記載のフコイダンBfのみ、又はフコイダンBf及び市販育毛剤の有効成分である塩化カルプロニウム若しくはミノキシジルが30%エタノール溶液中、表15に記載の濃度となるように溶解して各エタノール溶液を調製した。マウスの背部に1匹あたり200μLづつ、上記の毛剃り部位に該エタノール溶液を塗布した。対照群には30%エタノールを同様に塗布した。投与は1日1回とし、連日行った。投与開始日(毛剃りの翌日)から経時的に投与部位を観察し、毛剃り後21日目に発毛した面積を測定し、毛剃り面積に対する割合(%)で表した。各群6匹の平均値±標準誤差を表15に示した。
市販育毛剤である育毛剤Aの有効成分である塩化カルプロニウムの塗布投与による育毛効果は、本実験系においては認められず、従って対照群との差は認められなかった。しかしながら、フコイダンBfと塩化カルプロニウムとの併用投与群では、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。発毛割合も対照群より高かった。60%以上の発毛割合を示した個体は、対照群および塩化カルプロニウム投与群では認められなかったのに対し、フコイダンBf併用投与群では、6例中3例に認められた。
一方、市販育毛剤Bの有効成分であるミノキシジルは1%濃度で塗布することにより育毛効果が認められ、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。0.1%濃度では効果は弱かった。更に、フコイダンBfとミノキシジルとの併用投与群では、育毛効果が促進される傾向が認められた。すなわち、実験終了時に60%以上の発毛割合を示した個体は、ミノキシジルの1%投与群では6例中4例であったのに対し、フコイダンBf併用投与群では、6例全例が良好な発毛状態を呈していた。一方、効果の弱かったミノキシジルの0.1%投与群では6例中1例のみであったのに対し、フコイダンBf併用投与群では、6例中3例であった。
以上から、フコイダンBfと共にミノキシジル又は塩化カルプロニウムを用いることで育毛作用が相乗的に増強されることが分かった。また他のフコイダン、フコイダン分解物、硫酸化単糖等に対しても同様な試験を行ったところ、同様な結果が得られた。
実施例20
雄性C3H/Heマウスを日本SLC社から購入し、予備飼育の後8週齢より実験に用いた。マウス背部をバリカンによる毛刈りの後、更にカミソリにより毛剃りした。実施例16−(1)記載のフコイダンBfを3%濃度になるように軟膏基剤〔親水軟膏(丸石製薬社製)〕に混合(フコイダン軟膏)し、マウスの背部に1匹あたり0.2gづつ、上記の毛剃り部位に塗布した。対照群には軟膏基剤のみを塗布した。投与は1日1回とし、連日行った。投与開始日(毛剃りの翌日)から経時的に投与部位を観察し、皮膚色調の変化をスコア化して判定した。すなわち、スコア化の基準は、スコア0;変化なし、スコア1;皮膚色が青色に変化、スコア2;皮膚色が青黒〜灰色に変化、スコア3;発毛が見られる、スコア4;ほぼ毛剃り前の状態に復帰、とした。各群のスコアについては、6例の平均値±標準誤差として表16に示す。また、毛剃り後21日目に発毛した面積を測定し、毛剃り面積に対する割合(%)で表した。有意差検定はステューデントのt検定を行い、対照群に対してP値を求めた。その結果を表17に示す。なお、表中の発毛割合は、各群6例の平均値±標準誤差として示す。
その結果、フコイダン軟膏を塗布することにより顕著な育毛効果が認められた。対照群に比し、早期より皮膚色の変化が観察され、発毛に至った。また、実験終了時には、全例が毛剃り前の状態にほぼ復帰していた。また各実施例に記載のフコイダン及びその分解物についても同様にして軟膏を調製し、同様の試験を行ったところ、同様な育毛効果が確認できた。
寄託された生物材料
(1)寄託機関の名称・あて名
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305)
(2)寄託された微生物
(i)アルテロモナス(Alteromonas) sp.SN−1009
原寄託日 : 平成8年2月13日
国際寄託への移管請求日: 平成8年11月15日
受託番号: FERM BP−5747
(ii)フラボバクテリウム(Flavobacterium) sp.SA−0082
原寄託日 : 平成7年3月29日
国際寄託への移管請求日: 平成8年2月15日
受託番号: FERM BP−5402
産業上の利用可能性
本発明によりフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする安全性に優れたバイオ化粧料が提供される。またフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする皮膚美容用食品又は飲料、及び育毛用食品又は飲料等として使用され得る化粧料も提供され、これらの食品又は飲料は皮膚美容作用及び/又は育毛作用を有する機能性食品又は飲料として有用である。特にフコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分とする飲料は飲む化粧料、育毛料として日常的に摂取でき、皮膚美容維持、皮膚老化防止、皮膚老化予防、毛髪維持・養毛・増毛等に極めて有用である。
また、本発明に使用される前記有効成分と共に従来の育毛料の有効成分(育毛作用増強成分)を用いることで育毛作用が相乗的に増強され得、従って、本発明により、前記有効成分及び育毛作用増強成分を含む、従来に比し非常に優れた育毛作用を有する育毛料が提供される。
【図面の簡単な説明】
第1図は、ガゴメコンブ由来フコイダンのDEAE−セルロファインA−800カラム溶出パターンを示す図である。
Claims (6)
- フコイダン、その分解物、硫酸化単糖又はそれらの塩から選択されるものを有効成分として含有することを特徴とする育毛料。
- フコイダンが非曳糸性フコイダンである請求項1記載の育毛料。
- さらに育毛作用増強成分を含有してなるものである、請求項1〜4いずれか記載の育毛料。
- 育毛作用増強成分が、ミノキシジル及び/又は塩化カルプロニウムである請求項5記載の育毛料。
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