ES2307540T3 - Uso de fucoidano como ingrediente eficaz para la restauracion del pelo. - Google Patents

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Abstract

Un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo, como un medicamento para restaurar el pelo, en el que dicho producto de degradación es un compuesto seleccionado entre el compuesto representado por la siguiente fórmula: (Ver fórmula) en la que R es OH o OSO 3H; (Ver fórmula) en la que R es OH o OSO 3H; o (Ver fórmula) en la que R es OH o OSO3H.

Description

Uso de fucoidano como ingrediente eficaz para la restauración del pelo.
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de un compuesto sacárido ácido para cosméticos.
Antecedentes de la técnica
Convencionalmente, las pústulas, pecas y arrugas han sido problemas para el tratamiento cosmético de la piel. Recientemente, se ha conocido un gran número de cosméticos que los evitan, y el ácido retinoico, ácido \alpha-hidroxi, retinol y similares han sido descritos como un ingrediente eficaz para los mismos. Sin embargo, estos ingredientes eficaces tienen algunos problemas de irritabilidad de la piel, estabilidad y similares, y sus efectos apenas se puede decir que sean satisfactorios.
Por otra parte, un producto para el cuidado del pelo es un producto que acelera o estimula el crecimiento del pelo, usado para los fines de complementar la pérdida del pelo mediante la restauración del pelo, evitando así la reducción del número absoluto de pelos. Generalmente, como causas para la pérdida del pelo, han sido considerados diversos factores como la activación de hormonas andrógenas en órganos como las raíces del pelo y las glándulas sebáceas, que disminuyen el caudal sanguíneo en los folículos pilosos, la hipersecreción de sebo, la anormalidad del cuero cabelludo debido a la generación de peróxidos, oligotrofia y tensiones. Generalmente, los productos convencionales para el cuidado del pelo son formulados con una sustancia que elimina o alivia un factor que es considerado como causa de pérdida del pelo. Por ejemplo, son formulados en un producto para el cuidado del pelo las vitaminas como vitamina B y vitamina E, aminoácidos como serina y metionina, vasodilatadores como extracto de Lithospermi Radix y derivados de acetil-colina, agentes antiinflamatorios como extracto de raíces de litospermo e hinokitiol, agentes de hormonas femeninas como estradiol, agentes para la hiperesgasia de la piel como cefalantina, y estos productos para el cuidado del pelo han sido usados para la profilaxis y el tratamiento de la pérdida del pelo.
Sin embargo, aunque se han hecho diversos intentos como los anteriormente descritos, los productos convencionales para el cuidado del pelo tenían una acción profiláctica más débil para la pérdida del pelo y una acción tricogenosa más débil, por lo que no se obtenían necesariamente efectos satisfactorios de restauración del pelo.
Un objeto principal de la presente invención es encontrar una sustancia que pueda servir como un ingrediente eficaz para un producto para el cuidado del pelo, proporcionando así cosméticos que comprenden el ingrediente eficaz.
Descripción de la invención
Resumiendo la presente invención, la presente invención se refiere a un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo como un ingrediente eficaz en un medicamento para restaurar el pelo. Además, la presente invención se refiere al uso de un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo como una composición cosmética para restaurar el pelo.
El fucoidano usado en la presente invención no está particularmente limitado, en la medida en el que el fucoidano sea capaz de exhibir efectos de restauración del pelo (por ejemplo, los provocados por la acción tricogénica, acción de crecimiento del pelo, acción de nutrición del pelo, acción para prevenir la pérdida del pelo). Como el fucoidano, se han usado preferentemente fucoidanos derivados de algas y fucoidanos derivados de Echinodermata. Como el fucoidano usado en la presente invención, son preferibles los fucoidanos que tienen estructuras definidas, y es preferible usar fucoidanos seleccionados entre fucoidano U, fucoidano F y fucoidano G derivados de kjellmaniella crassifolia y un fucoidano derivado de Cladosiphon okamuranus, que comprenden cada uno sacáridos sulfatados representados por la siguiente fórmulas generales (I) a (IV) como el componente esencial del sacárido constituyente.
1
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
2
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
3
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
4
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más.
Además, el fucoidano es preferentemente un fucoidano no fibroso, desde los puntos de vista de la propiedad de no precipitación y la solubilidad en un material de base para cosméticos.
Como el producto de degradación del fucoidano se pueden usar los siguientes compuestos
5
en la que R es OH o OSO_{3}H:
6
en la que R es OH o OSO_{3}H; y
7
en la que R es OH o OSO_{3}H.
Las formas de los cosméticos de la presente invención están ilustradas por una loción, una loción lechosa, crema, un emplasto facial, un ungüento, un agente para el baño, un detergente para el baño, un agente de limpieza facial, una loción para el pelo, un producto para el cuidado del pelo o un agente de champú. Además, la presente invención puede ser proporcionada en la forma de un medicamento, un cuasifármaco, un alimento o una bebida.
Además, como los cosméticos de la presente invención, se proporciona un producto para el cuidado del pelo que tiene una excelente acción de restauración del pelo, que comprende un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo como un ingrediente eficaz; y un producto para el cuidado del pelo que comprende adicionalmente un componente capaz de aumentar sinérgicamente la acción de restauración del pelo (componente de aumento de la acción de restauración del pelo) cuando el componente es usado junto con el compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo. Además, los cosméticos y el producto para el cuidado del pelo pueden ser proporcionados como alimentos o bebidas. En este caso, el componente preferido para aumentar la acción de restauración del pelo está ilustrado por minoxidilo y cloruro de calpronio.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra un modelo de elución del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia en una columna DEAE-Cellulofine A-800.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
Una de las grandes características de los cosméticos de la presente invención consiste en que los cosméticos comprenden como un ingrediente eficaz un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, que tienen especialmente una acción de restauración del pelo. La expresión "seleccionado entre", como se cita en la presente memoria descriptiva, indica que son seleccionados uno o más compuestos.
La expresión "acción de restauración del pelo" se refiere a una acción tricogenosa, acción de crecimiento del pelo, acción de nutrición del pelo, acción para prevenir la pérdida del pelo y los efectos exhibidos por estas acciones se denominan "efectos de restauración del pelo". La acción de restauración del pelo puede ser evaluada, por ejemplo, mediante los métodos descritos en los ejemplos 13 a 20. Un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, que tienen la acción, pueden exhibir un efecto de restauración del pelo.
El fucoidano usado en la presente invención no está particularmente limitado, en la medida en que el fucoidano tenga una acción de restauración del pelo. Por ejemplo, puede ser usado un fucoidano derivado de un alga. En la presente invención, el fucoidano es un término genérico para un polisacárido que comprende fucosa sulfatada como un sacárido constituyente. Dicho de otro modo, en la presente invención puede ser usado un polisacárido que contenga fucosa sulfatada.
El polisacárido, que contiene fucosa sulfatada está ilustrado por fucanosulfatado, fucogalactano sulfatado, fucoglucuronomanano sulfatado, glucuronoxilofucano sulfatado, xilofucoglucuronano sulfatado, ascorfilano sulfatado, glucuronogalactofucano sulfatado o glucuronofucano sulfatado.
Estos fucoidanos pueden ser preparados cada uno mediante un método conocido y los productos purificados resultantes, productos que contienen fucoidanos, pueden ser usados en la presente invención.
Por ejemplo, las algas marinas de Laminariales, Chordariales, Fucales como Kjellmaniella crassifolia, Laminaria japonica, Kjellmaniella, Fucus, Nemacystus, Cladosiphon okamuranus, Undaria, Undaria pinnatifida (Wakame Mekabu), Ecklonia kurome, Eisenia, Ecklonia, Giant kelp, Lessonia nigrescence y Ascophyllum nodosum contienen abundantemente fucoidanos especialmente adecuados para ser usados en la presente invención. Este es el motivo por el que son preferibles como la materia prima. En este caso, los polisacáridos sulfatados derivados de Rhodophyceae, por ejemplo, los polisacáridos sulfatados derivados de gelidiun amansii, Gracilaria y Pteroclavia capillacae tienen los mismos efectos que el fucoidano usado en la presente invención, y pueden ser usados también en la presente
invención.
El fucoidano usado en la presente invención está ilustrado por los fucoidanos derivados de las algas anteriormente mencionadas y el fucoidano no está particularmente limitado, en la medida en que el fucoidano sea un polisacárido que comprenda fucosa sulfatada como un constituyente, en que el polisacárido tiene una acción de restauración del pelo. Pueden ser usados fucoidanos derivados de Echinodermata, por ejemplo, cohombro de mar japonés, Echnoihea o Asterofoa.
Por ejemplo, un fucoidano se prepara a partir de Kjellmaniella crassifolia y el fucoidano resultante puede ser separado en forma de un fucoidano que contiene ácido glucurónico que tiene una estructura de repetición de sacáridos sulfatados representada por la fórmula general (I) ("fucoidano U" anteriormente mencionado) y un fucoidano que no contiene ácido glucurónico que tiene una estructura de repetición de sacáridos sulfatados representada por la fórmula general (II) ("fucoidano F" anteriormente mencionado). Cada uno de los fucoidanos puede ser usado como un ingrediente eficaz de la presente invención. También, un fucogalactano sulfatado que tiene una estructura de repetición de sacáridos sulfatados representada por la fórmula general (III) ("fucoidano G" anteriormente mencionado) puede ser preparado a partir de Kjellmaniella crassifolia y ser adecuadamente usado.
Además, un fucoidano que tiene una estructura de repetición de sacáridos sulfatados representada por la fórmula (IV) puede ser preparado a partir de Cladosiphon okamuranus, y ser adecuadamente usado.
Después de la preparación de los fucoidanos a partir de Kjellmaniella crassifolia según métodos conocidos, el fucoidano U y fucoidano F son separados usando una resina de intercambio aniónico o un tensioactivo. La relación existente de fucoidano U a fucoidano F derivado de Kjellmaniella crassifolia es de aproximadamente 1:2 en una relación en peso. El fucoidano U contiene fucosa, manosa, galactosa, ácido glucurónico y su contenido de sulfato es de aproximadamente 20% en peso. El Fucoidano F contiene fucosa como su componente principal y su contenido de sulfato es de aproximadamente 50% en peso. El peso molecular para ambas sustancias está distribuido, centrándose en aproximadamente 200.000 (Sumary of 18th Sugar Symposium, pag. 159, 1996).
El fucoidano U y el fucoidano F pueden ser separados, por ejemplo, aplicando una solución de fucoidanos preparada a partir de Kjellmaniella crassifolia a una columna DEAE-Cellulofine A-800 y llevando a cabo la elución mediante una técnica de gradiente de concentraciones usando un tampón que contiene NaCl. Uno de los ejemplos se muestra en la Figura 1. Concretamente, la Figura 1 es un diagrama que muestra la separación de fucoidano U y fucoidano F, en la que el primer pico en la Figura es fucoidano U y el último pico es fucoidano F.
Además, por ejemplo, cada uno de los fucoidanos derivados de Fucus, el fucoidano derivado de Nemacystus, el fucoidano derivado de Cladosiphon okamuranus, el fucoidano derivado de Undaria, el fucoidano derivado de Undaria pinnatifida, el polisacárido sulfatado derivado de Gelidium amansii, el polisacárido sulfatado derivado de Gracilaria, el fucosano derivado de Lessonia, el fucoidano derivado de Ascopillum, el polisacárido sulfatado derivado de Pteroclavia capillacae, y el fucoidano derivado de otras algas pueden ser preparados también mediante un método conocido y ser usados en la presente invención.
El fucoidano derivado de Echinodermata adecuadamente usado en la presente invención incluye, por ejemplo, el fucoidano contenido en el cohombro de mar japonés descrito en la patente japonesa puesta a disposición del público nº Hei 4-91027, y el fucoidano puede ser preparado a partir de cohombro de mar japonés mediante el método descrito en la solicitud.
Además, los productos de degradación de los fucoidanos que tienen una acción de restauración del pelo pueden ser preparados mediante un método conocido como método enzimológico, método químico o un método físico y puede ser seleccionado y usado un producto de degradación deseado que tenga una acción de restauración del pelo.
El método de preparación preferible para el producto de degradación del fucoidano usado en la presente invención es un método de degradación ácida y un método de degradación enzimática. El producto de degradación que tiene una acción de restauración del pelo puede ser preparado sometiendo el fucoidano a una degradación ácida o una degradación enzimática.
Las condiciones para la degradación ácida del fucoidano usado en la presente invención no están particularmente limitadas, en la medida en que las condiciones hagan posible la generación del producto de degradación que tiene una acción de restauración del pelo (en lo sucesivo citado como "producto de degradación de la presente invención"). Las condiciones pueden ser determinadas evaluando las acciones fisiológicas del producto de degradación resultante.
Por ejemplo, el fucoidano es disuelto o puesto en suspensión en un ácido y sometido a la reacción, generando así un producto de degradación de la presente invención. También, la mezcla de reacción puede ser calentada durante la reacción, acortando así el período de tiempo necesario para la generación del producto de degradación de la presente invención.
Los tipos de los ácidos para disolver o poner en suspensión el fucoidano no están particularmente limitados. Pueden ser usados ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico; ácidos orgánicos como ácido cítrico, ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico y ácido ascórbico y ácidos sólidos como una resina de intercambio catiónico, fibra de intercambio catiónico y membrana de intercambio catiónico.
La concentración del ácido no está particularmente limitada, y el ácido puede ser usado a una concentración preferentemente de 0,0001 a 5 N aproximadamente, más preferentemente de 0,01 a 1 N aproximadamente. Además, la temperatura de la reacción no está particularmente limitada y la temperatura de la reacción puede ser ajustada preferentemente de 0º a 200ºC, más preferentemente de 20º a 130ºC.
Además, el tiempo de reacción no está particularmente limitado y el tiempo de reacción puede ser ajustado preferentemente desde varios segundos hasta varios días. Los tipos y la concentración de los ácidos, la temperatura de reacción y el tiempo de reacción pueden ser apropiadamente seleccionados dependiendo de la cantidad generada del producto de degradación de la presente invención y del grado de polimerización del producto de degradación. Por ejemplo, durante la preparación del producto de degradación del fucoidano, es usado el ácido orgánico como ácido cítrico, ácido láctico o ácido málico y la concentración del ácido se selecciona apropiadamente en el intervalo de varias docenas de mM a varios M, la temperatura de calentamiento en el intervalo de 50º a 110ºC, preferentemente 70º a 95ºC y el tiempo de calentamiento en el intervalo de varios minutos a 24 horas, con lo cual puede ser preparado el producto de degradación de la presente invención. El producto de degradación ácida del fucoidano está ilustrado por el producto de degradación ácida del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y este producto de degradación puede ser usado como fibra dietética que tiene especialmente una nueva función fisiológica de una fuerte acción de restauración del pelo.
El producto de degradación de la presente invención puede ser fraccionado usando su acción de restauración del pelo como un índice. Por ejemplo, un producto de degradación ácida puede ser fraccionado basado en un peso molecular por medio de un método de fraccionamiento como un método de filtración sobre gel o de membrana de fraccionamiento del peso molecular.
Como un ejemplo de método de filtración sobre gel, puede ser usado Cellulofine GCL-300 para preparar cualesquiera fracciones de pesos moleculares, por ejemplo, una que tenga un peso molecular que sobrepasa 25.000, una que tenga un peso molecular de 25.000 hasta por encima de 10.000, una que tenga un peso molecular de 10.000 hasta por encima de 5.000, una que tenga un peso molecular de 5.000 o menos. Puede ser usado Cellulofine GCL-25 para preparar cualesquiera fracciones de peso moleculares, por ejemplo, una que tenga un peso molecular de 5.000 o menos, una que tenga un peso molecular de 5.000 hasta por encima de 3.000, una que tenga un peso molecular de 3.000 hasta por encima de 2.000, un que tenga un peso molecular de 2.000 hasta por encima de 1.000, una que tenga un peso molecular de 1.000 hasta por encima de 500 o una que tenga un peso molecular de 500 o menos.
Además, el fraccionamiento del peso molecular se puede llevar a cabo a nivel industrial usando una membrana de ultrafiltración. Por ejemplo, una fracción que tenga un peso molecular de 30.000 o menos puede ser preparada usando FE10-FUSO382 fabricada por la empresa DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD., y una fracción que tenga un peso molecular de 6.000 o menos puede ser preparada usando FE-FUS-T653 fabricada por la misma empresa. Adicionalmente, puede ser obtenida una fracción que tenga un peso molecular de 500 o menos usando una membrana de nanofiltración. Pueden ser preparadas cualesquiera fracciones de peso moleculares combinando este método de filtración sobre gel y un método de fraccionamiento de pesos moleculares. Por ejemplo, en el producto de degradación del fucoidano derivado de Fucus, una fracción que tenga un peso molecular de 30.000 o más exhibe una fuerte acción de restauración del pelo, de forma que el uso del fucoidano derivado de Fucus que tiene un peso molecular de 30.000 o más es adecuado en la presente invención.
El producto de degradación del fucoidano que tiene una acción de restauración del pelo que puede ser usado en la presente invención es el compuesto representado por la fórmula (V), el compuesto representado por la fórmula (VI) o el compuesto representado por la fórmula (VII), y cada uno de estos compuestos puede ser preparado, por ejemplo, según el método descrito en los documentos WO 99/41288, WO 96/34004 y en la solicitud internacional nº PCT/JP 00/00965. El oligosacárido que tiene una estructura de repetición del compuesto representado por la fórmula (V) como una estructura de cadena principal básica o el oligosacárido que tiene una estructura de repetición del compuesto representado por la fórmula (VI) como una estructura de cadena principal básica, pueden ser usados cada uno en la presente invención. Adicionalmente, el oligosacárido que tiene una estructura de repetición del compuesto representado por la fórmula (VII) como una estructura de cadena principal básica puede ser usado también en la presente invención.
El compuesto representado por la fórmula (V) puede ser obtenido tratando el fucoidano F previamente mencionado con enzima de degradación de polisacárido endo-sulfatado (enzima de degradación de fucoidano F) producida por Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) y purificando el producto de degradación. En lo que se refiere al contenido y el sitio del grupo sulfato en el compuesto, pueden ser purificados cualesquiera a partir del producto de degradación. Además, el polímero del compuesto representado por la fórmula (V) está contenido en el producto de degradación y puede ser separado y purificado dependiendo de sus finalidades.
El compuesto representado por la fórmula (VI) puede ser obtenido tratando el fucoidano U anteriormente mencionado con enzima de degradación de polisacárido endo-sulfatado (enzima de degradación de fucoidano U) producida por Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) y purificando el producto de degradación. En lo que se refiere al contenido y el sitio del grupo sulfato en el compuesto, pueden ser purificados cualesquiera a partir del producto de degradación. Además, el polímero que comprende el compuesto representado por la fórmula (VI) como una estructura de cadena principal básica está contenido también en el producto de degradación, y puede ser separado y purificado dependiendo de sus finalidades.
Además, el fucoidano G anteriormente mencionado puede ser obtenido degradando el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia con fucoidano norbitocon enzima de degradación de fucoidano F producida por Ateromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) y enzima de degradación de fucoidano U producida por Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP- 5402) y purificando el producto de degradación.
El Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) produce también enzima de degradación de polisacárido endo-sulfatado (enzima de degradación de fucoidano G). Un producto de degradación de fucoidano G puede ser preparando fucoidano G con enzima de degradación de fucoidano G y el producto puede ser purificado cuando lo requiera la ocasión. El compuesto representado por la fórmula (VII) es un ejemplo de este tipo. En lo que se refiere al contenido y el sitio del grupo sulfato en el compuesto, pueden ser purificados cualesquiera a partir del producto de degradación. Además, el polímero cuya estructura de cadena principal básica comprende el compuesto representado por la fórmula (VII) está contenido también en el producto de degradación y puede ser separado y purificado dependiendo de sus finalidades.
Un ejemplo del compuesto representado por la fórmula (V) incluye el compuesto representado por la fórmula (VIII) proporcionado con posterioridad. Adicionalmente, un ejemplo del compuesto representado por la fórmula (VII) incluye el compuesto representado por la fórmula (IX) proporcionada con posterioridad.
Además, una unidad (U) de la enzima de degradación de fucoidano F, la enzima de degradación de fucoidano U o la enzima de degradación de fucoidano G mencionada anteriormente, se define como una cantidad de enzima para escindir cada enlace glicosilo de fucoidano F, fucoidano U o fucoidano G en una cantidad equivalente a 1 \mumol en un minuto.
La sal del fucoidano o la sal del producto de degradación del mismo puede ser preparada mediante un método usual a partir del fucoidano o el producto de degradación del mismo. Además, el producto de degradación del fucoidano puede ser apropiadamente sulfatado en la medida deseada para ser usado y el método de sulfatación se puede llevar a cabo según un método conocido.
El fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, que tiene una acción de restauración del pelo que es usado en la presente invención, es útil como un ingrediente eficaz para cosméticos como una loción para el pelo, un tonificante para el pelo, un agente de nutrición del pelo y un agente para prevenir la pérdida del pelo, debido a su acción de restauración del pelo. Por lo tanto, la presente invención proporciona cosméticos que tienen una excelente acción de restauración del pelo, que comprenden como ingrediente eficaz un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, que tiene una acción de restauración del pelo. El ingrediente eficaz de los cosméticos es preferentemente, por ejemplo, un compuesto seleccionado entre fucoidano, fucoidano F, fucoidano G, el fucoidano derivado de Cladosiphon okamuranus y un producto de degradación del mismo, y pueden ser preparados productos bio-cosméticos que comprenden el compuesto como un ingrediente eficaz. En este caso, como el producto de degradación del fucoidano, es usado un compuesto seleccionado entre los compuestos representados por las fórmulas (V) a (VII).
El contenido del compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo en los cosméticos de la presente invención es habitualmente y preferentemente de 0,0001 a 20% en peso, más preferentemente de 0,001 a 5% en peso, todavía más preferentemente de 0,03 a 3% en peso.
Los cosméticos de la presente invención pueden ser preparados según un método convencional, y los habitualmente usados en cosméticos como hidrocarburos, ceras, grasas y aceites, ésteres, ácidos grasos superiores, alcoholes superiores, tensioactivos, perfume, pigmentos, agentes anticorrosivos, antioxidantes, absorbentes ultravioletas, alcoholes, agentes para ajustar el pH, diversos ingredientes con un efecto medicinal que pueden ser apropiadamente seleccionados y formulados. En este caso, puede ser añadido en la medida deseada un componente que tenga una acción cosmética sobre la piel distinto del compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, que sea un ingrediente eficaz para los cosméticos de la presente invención, y un componente tricogenoso, un componente de crecimiento del pelo, un componente de nutrición del pelo, un componente para prevenir la pérdida del pelo, teniendo cada uno una acción de restauración del pelo. El componente que tiene una acción cosmética sobre el pelo incluye ácido retinoico, ácido \alpha-hidroxi, retinol, glicerol, polietilenglicol, hidróxido de potasio, trietanolamina y otros sacáridos y el componente que tiene una acción de restauración del pelo incluye minoxidilo, cloruro de calpronio, análogos de heparina, monolinoleato de glicerilo, ácido linoleico y diversos extractos de fármacos en bruto.
Como el fucoidano contenido en los cosméticos de la presente invención, es más excelente un fucoidano no fibroso que un fucoidano fibroso desde los puntos de vista de la propiedad de no precipitación o la solubilidad para un material de base para cosméticos, y es preferible un fucoidano no fibroso.
Además, la forma de los cosméticos como productos para el cuidado del pelo no está particularmente limitada, en la medida en que se pueda esperar la acción para el pelo y la forma incluye, por ejemplo, una loción, una loción lechosa, crema, un ungüento, una loción para el pelo, un tonificante para el pelo, un agente de nutrición para el pelo, un agente para prevenir la pérdida del pelo o un agente de champú.
El producto para el cuidado del pelo como una realización de los cosméticos de la presente invención puede ser aplicado o empastado en un sitio que necesita restaurar el pelo. Alternativamente, el producto para el cuidado del pelo de la presente invención puede ser tomado por vía oral, formándolo como una forma para beber o comer.
La realización de uso de los cosméticos de la presente invención no está particularmente limitada. Por ejemplo, la realización de uso del producto para el cuidado del pelo anteriormente mencionado puede ser tal que se puedan aplicar varios mililitros del producto para el cuidado del pelo, que contiene el fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo en una cantidad, por ejemplo, de 0,1 ng a 100 mg por un mililitro del producto para el cuidado del pelo a un sitio que necesita restaurar el pelo, o empastado al sitio en la forma de un emplasto que contenga la misma cantidad que anteriormente, al menos una vez al día.
La cantidad tomada por vía oral no está particularmente limitada, en la medida en que sea una cantidad mediante la que el fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo exhiba una acción de restauración del pelo. La cantidad tomada por vía oral por día habitualmente es preferentemente de 0,1 mg a 10 g, más preferentemente de 2 mg a 5 g, todavía más preferentemente de 10 mg a 2 g.
De forma incidental o conveniente, se han propuesto diversas técnicas para los productos para el cuidado del pelo usados para acelerar o mantener el crecimiento del pelo, y han sido realmente usadas.
Como ingrediente eficaz convencional para los productos para el cuidado del pelo, se han conocido el minoxidilo (patente japonesa puesta a disposición del público nº Hei 9-169622) o cloruro de calpronio (patente japonesa puesta a disposición del público nº Hei 9-175950).
Los presentes inventores han encontrado que las acciones de restauración del pelo son sinérgicamente aumentadas usando el ingrediente eficaz convencional para el producto para el cuidado del pelo junto con el compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo.
Dicho de otro modo, la presente invención proporciona un producto para el cuidado del pelo que comprende un compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo y el componente para aumentar la acción de restauración del pelo, por ejemplo, un ingrediente eficaz convencional para el producto para el cuidado del pelo.
El componente anteriormente mencionado de aumento de la acción de restauración del pelo puede ser de los que muestran una acción de restauración del pelo sinérgicamente aumentada cuando es usado conjuntamente con el compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo y puede ser apropiadamente seleccionado según el método descrito en la presente invención (por ejemplo, el método descrito en el ejemplo 19). Como el componente de aumento de la acción de restauración del pelo, el ingrediente eficaz convencional para el producto para el cuidado del pelo adecuadamente usado en la presente invención está ilustrado por minoxidilo y cloruro de calpronio. En este caso, estos pueden ser usados solos o en una mezcla.
El producto para el cuidado del pelo que comprende el compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo y el componente para aumentar la acción de restauración del pelo, el contenido de cada uno de los compuestos seleccionados entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, y el componente para aumentar la acción de restauración del pelo, no está particularmente limitado en la medida en que la cantidad pueda exhibir los efectos sinérgicos a través de la misma. El compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo está contenido en una cantidad preferentemente de 0,01 a 30% en peso, más preferentemente de 0,1 a 10% en peso del producto para el cuidado del pelo. Además, como el contenido del componente para aumentar la acción de restauración del pelo, en el caso del minoxidilo, es preferentemente de 0,1 a 5% en peso, más preferentemente de 0,5 a 2% en peso del producto para el cuidado del pelo; por otra parte, en el caso de cloruro de calpronio, es preferentemente de 0,1 a 10% en peso, más preferentemente de 0,5 a 5% en peso del producto para el cuidado del pelo. El producto para el cuidado del pelo, en el que es usado el ingrediente eficaz anteriormente mencionado, y el componente para aumentar la acción de restauración del pelo en la presente invención están contenidos cada uno en el intervalo anteriormente mencionado es preferible debido a su excelente acción de restauración del pelo.
Además, el producto para el cuidado del pelo de la presente invención puede contener adicionalmente un compuesto capaz de aumentar los efectos del minoxidilo y/o cloruro de calpronio. El compuesto capaz de aumentar los efectos de minoxidilo y/o cloruro de calpronio incluye, por ejemplo, un agente de retención tópica como epinefrina, tetrahidrozolina e hidrocloruro de nafazolina; disolventes polares como propilenglicol y 1,3-butilenglicol; extractos de fármacos en bruto de Lithospermi Radix, Araliae Cordatae Rhizoma, Ephedrae Herba, Polygoni Multiflori Radix, Paracis Japonici Rhizoma; pantenol-etil-éter y derivados de quitina solubles en agua.
Adicionalmente, como una realización de la presente invención, se proporcionan cosméticos que pueden ser usados como alimento o bebida. Los cosméticos pueden ser preparados conteniendo, añadiendo y/o diluyendo el fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo, que tienen una acción de restauración del pelo y son extremadamente útiles, por ejemplo, como alimentos o bebidas para prevenir la pérdida del pelo o para restaurar el pelo debido a sus acción de restauración del pelo.
El método para preparar el alimento o bebida para restaurar el pelo de la presente invención no está particularmente limitado. Por ejemplo, el procedimiento de elaboración que incluye cocinar y tratar se puede llevar a cabo según los generalmente empleados para alimentos o bebidas, en la medida en que el compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, usado en la presente invención, que tiene una acción de restauración del pelo, pueda estar contenido, añadido y/o diluido como un ingrediente eficaz en los alimentos o bebidas resultantes.
En esta realización, la expresión "que contiene" se refiere a una realización que contiene el ingrediente eficaz usado en la presente invención en el alimento o bebida; el término "añadir" se refiere a una realización de añadir el ingrediente eficaz usado en la presente invención a una materia prima para el alimento o bebida; y el término "diluir" se refiere a una realización de añadir una materia prima al alimento o bebida para el ingrediente eficaz usado en la presente invención.
La forma del alimento o bebida para restaurar el pelo de la presente invención no está particularmente limitada. El alimento o bebida incluye, por ejemplo, productos agrícolas y forestales tratados, productos de explotaciones tratados, productos marinos tratados que incluyen productos de granos tratados como productos de maíz tratados, productos de almidón tratados, productos de mezclas previas tratados, fideos, macarrones, pan, confitura de judías, fideos de alforjón, pan de gluten de maíz, fideos de arroz, fen-tiao, y tarta de arroz rellena; productos de grasas y aceites tratados como grasa y aceite de materias plásticas aceite de tempura, aceite para ensaladas, mayonesa y aliños; productos de soja tratados como productos de queso de soja, pasta de soja y sojas fermentadas; productos de carne tratados como jamón, bacón, jamón comprimido y salchichas; productos marinos como pescado triturado congelado, pasta de pescado hervida, pasta en rodillos tubulares o de pescado hervido, pasta de pescado triturado, hamburguesa de pasta de pescado frita, bolas de pescados, nervios, jamón y salchichas de pescado y carne, bonito seco, productos de huevos de pescados tratados, botes de productos marinos y alimentos conservados hervidos en salsa de soja (tsukudani); productos lácteos como materia prima de leche, crema, yogurt, mantequilla, queso, leche condensada, leche en polvo y helado; productos tratados de verduras y frutas como pasta, confitura, ensalada de verduras, bebidas de frutas, bebidas de verduras y bebidas mixtas; productos de repostería como chocolates, bizcochos, boletos dulces, tarta, aperitivos de tarta de arroz y aperitivos de arroz; bebidas alcohólicas como vino de arroz, licor chino, vino, whisky, licor destilado japonés (shochu), vodka, brandy, ginebra, ron, cerveza, bebidas alcohólicas refrescantes, zumos y licores de frutas; bebidas suntuosas como té verde, té, té de oolong, café, bebidas no alcohólicas y bebidas de ácido láctico; aderezos como salsa de soja, salsa, vinagre y vino de arroz dulce; alimentos en lata, botes o bolsas como ternera y verduras cocinadas con arroz, arroz hervido junto con carne y verduras en un bote pequeño, arroz al vapor con judías pintas, salsa de harina y arroz al curry y otros productos previamente cocinados; alimentos semi-secos o concentrados como pastas de hígado y otros productos para untar, sopas para fideos de trigo negro o fideos de trigo y sopas concentradas; alimentos secos como fideos instantáneos, salsa al curry instantánea, café instantáneo, jugo en polvo, sopa en polvo, sopa de pasta de soja instantánea (miso), alimentos precocinados, bebidas precocinadas y sopa precocinada; alimentos congelados como sukiyaki, guiso de carne al vapor en botes, anguilas troceadas y a la plancha, filete de hamburguesa, shao-mai, bolas de masa rellenas de carne de cerdo picada, diversas barritas y cócteles de fruta; alimentos sólidos o alimentos líquidos y especias.
El alimento o bebida de la presente invención se prepara conteniendo, añadiendo y/o diluyendo un compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo, en el que el compuesto tiene una acción de restauración del pelo y su forma no está particularmente limitada en la medida en que contenga una cantidad necesaria para que el compuesto exhiba las funciones fisiológicas, que incluyen productos conformados como pastillas, gránulos o cápsulas que pueden ser tomados por vía oral. En este caso, el fucoidano derivado de un alga y un producto de degradación del mismo que tiene una acción de restauración del pelo son extremadamente útiles como un material alimenticio sanitario y como un material de producción para un alimento o bebida, que tiene una acción fisiológica y una función de fibra dietética.
El contenido del compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo en el alimento para restaurar el pelo de la presente invención no está particularmente limitado, en la medida en que contenga la cantidad para que exhiba la acción de restauración del pelo. El contenido del compuesto es preferentemente de 0,001 a 100% en peso, más preferentemente de 0,01 a 10% en peso todavía más preferentemente de 0,05 a 5% en peso. Como el alimento para restaurar el pelo, el compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo puede ser tomado directamente en forma de un polvo o en forma de una pastilla.
Además, el contenido del compuesto seleccionado entre el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo en la bebida para restaurar el pelo no está particularmente limitado, en la medida en que esté contenida la cantidad para exhibir la acción de restauración del pelo. El contenido del compuesto es preferentemente de 0,0001 a 10% en peso, más preferentemente de 0,005 a 5% en peso, todavía más preferentemente de 0,02 a 2% en peso.
La realización de uso para el alimento o bebida para restaurar el pelo no está particularmente limitada. Es deseado que el alimento o bebida se tome de forma que el ingrediente eficaz anteriormente mencionado usado en la presente invención se tome por día en una cantidad preferentemente de 0,1 mg a 10 g, más preferentemente de 2 mg a 5 g, todavía más preferentemente de 10 mg a 2 g desde el punto de vista de la eficacia para obtener el efecto de restauración del pelo.
Además, no se encontró ningún caso de muerte incluso cuando el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo usado en la presente invención son administrados por vía oral a una rata en una dosis única de 1 g/kg.
Además, el lado posterior de la cobaya Hartley es afeitado y se administró una solución al 3% del fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo mediante la aplicación al lado posterior durante cinco días consecutivos en una cantidad de 0,05 ml una vez al día. La irritación de la piel se evalúa de acuerdo con un patrón de ensayo de parches (Asociación Dermatológica Japonesa) en el sexto día después del comienzo de la administración y se encontró que no era reactivo. Por lo tanto, no se pudo encontrar una irritación de la piel para el fucoidano, un producto de degradación del mismo y una sal del mismo.
Los cosméticos proporcionados por la presente invención son extremadamente útiles como cosméticos para restaurar el pelo.
Ejemplos
La presente invención se describirá más concretamente a continuación por medio de ejemplos, sin limitar la presente invención a los mismos. En los mismos, "%" en los Ejemplos significa "% en peso" salvo que se especifique otra cosa.
Ejemplo 1
(1) Se secó suficientemente Kjellmaniella crassifolia y posteriormente se hizo un polvo de 20 kg del producto seco con un laminador de corte (fabricada por la entidad Nara Kikai Seissakusho), para proporcionar un producto en polvo de Kjellmaniella crassifolia.
En 900 litros de agua corriente se disolvieron 7,3 kg de dihidrato de cloruro de calcio (fabricado por la empresa Nippon Soda Co., Ltd.) y seguidamente se mezclaron con el mismo 20 kg del producto en polvo de Kjellmaniella crassifolia. La mezcla resultante se calentó durante 40 minutos hasta que la temperatura del líquido se elevó desde 12ºC hasta 90ºC haciendo soplar vapor de agua. Posteriormente, la mezcla se mantuvo de 90º a 95ºC durante 1 hora bajo agitación y seguidamente se enfrió para proporcionar 1100 litros de un producto enfriado.
Posteriormente, el producto enfriado se sometió a una separación sólido-líquido con un separador sólido-líquido (fabricado por la empresa West Farrier Separator, Model: CNA) para proporcionar aproximadamente 900 litros de materia sobrenadante después de la separación sólido-líquido.
La cantidad de 3660 litros de la materia sobrenadante después de la separación sólido-líquido se concentró hasta un volumen de 20 litros con FE10-FC-FUS0382 (peso molecular de la fracción: 30.000) fabricado por la empresa DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. Posteriormente, se repitieron 5 veces las etapas de añadir 20 litros de agua corriente y concentrar nuevamente la mezcla líquida resultante hasta un volumen de 20 litros, y el concentrado se sometió a un tratamiento de desalación para proporcionar 25 litros de un extracto derivado Kjellmaniella crassifolia.
Se liofilizó un litro del extracto para proporcionar 13 g de un producto seco no fibroso de fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia.
Se preparó un producto seco no fibroso de fucoidano derivado de Laminaria japonica a partir de un producto en polvo liofilizado de Laminaria japonica según el método anteriormente descrito. Análogamente, se preparó un producto seco no fibroso de fucoidano derivado de Lessonia nigrenscence a partir de un polvo seco de Lessonia nigrenscence (denominación comercial: Seawed Powder, comercializado por la empresa Andesu Boeki K.K.).
(2) Se disolvieron siete gramos del producto seco de fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1 en 700 ml de un tampón de imidazol 20 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 50 mM y etanol al 10% y las materias insolubles se separaron por centrifugación. La materia sobrenadante después de la centrifugación se aplicó a una columna DEAE-Cellulofine A-800 (\Phi 11,4 cm x 48 cm) equilibrada con el mismo tampón y seguidamente se lavó con el mismo tampón. La elución se llevó a cabo con una gradiente de concentración de cloruro de sodio 50 mM a 1,95 M (250 ml por fracción). Se determinó un contenido total de azúcares y un contenido de ácido urónico mediante el método de fenol-ácido sulfúrico y el método de carbazol-ácido sulfúrico, para proporcionar las fracciones 43 a 49, fracciones 50 a 55 y fracciones 56 a 67, en el orden de elución. Seguidamente, estas fracciones fueron desaladas por electrodiálisis y posteriormente fueron liofilizadas para proporcionar cada una de la fracción I (340 mg) de las fracciones 43 a 49, fracción II (870 mg) de las fracciones 50 a 55 y fracción III (2,64 g) de las fracciones 56 a 67.
La Figura 1 muestra un modelo de elución del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia en la columna DEAE-Cellulofine A-800. En la Figura 1, el eje de ordenadas es la absorbancia a 530 nm determinada mediante el método de carbazol-ácido sulfúrico (sólidos negros en la Figura), la absorbancia a 480 nm determinada mediante el método de fenol-ácido sulfúrico (círculos blancos en la Figura) y la conductividad eléctrica (mS/cm: cuadrados blancos en la Figura) y el eje de abscisas es el número de fracción.
Ejemplo 2
(1) En un matraz Erlenmeyer de 2 litros se introdujeron 600 ml de un medio de cultivo que comprendía agua marina artificial (fabricada por la entidad Jamarin Laboratory), pH 8,2, que contenía 0,25% de glucosa, 1,0% de peptona y 0,5% de extracto de levadura y seguidamente se esterilizó (a 120ºC durante 20 minutos). Se inoculó Alteromonas sap. SN-1009 (FERM BP-5747) en el medio de cultivo y se cultivó a 25ºC durante 26 horas para proporcionar un medio de cultivo de semilla. En un fermentador de depósito de 30 litros se introdujeron 20 litros de un medio de cultivo que comprendía un agua marina artificial, pH 8,0, que contenía 1,0% de peptona, 0,02% de extracto de levadura, 0,2% del polisacárido sulfatado descrito en el apartado (2) del Ejemplo 2 descrito con posterioridad y 0,01% de agente antiespumante (fabricado por la entidad Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KM70) y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Después de enfriar, se inocularon 600 ml del medio de cultivo de semilla anteriormente mencionado y se cultivó a 24ºC durante 24 horas bajo las condiciones de 10 litros de aireación por minuto y una velocidad de agitación de 250 revoluciones por minuto. Después de terminar el cultivo, el medio de cultivo se centrifugó para proporcionar células y materia sobrenadante del cultivo. La materia sobrenadante del cultivo obtenida se concentró con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 10.000 y el concentrado se sometió seguidamente a una desalación con un sulfato de amonio saturado al 85%. Los precipitados formados se recolectaron por centrifugación y se dializaron suficientemente frente a tampón de Tris mM HCl (pH 8,2) que contenía un agua marina artificial a una concentración de una décima parte, para proporcionar 600 ml de una solución de una enzima de degradación de fucoidano F que actuaba selectivamente sobre fucoidano F.
(2) Se hizo un polvo de 2 kilogramos de Kjellmaniella crassifolia seco con un laminador de corte (fabricada por la entidad Masuko Sangyo) equipada con un tamiz que tenía un diámetro de 1 mm y los trozos de algas resultantes se pusieron en suspensión en 20 litros de etanol al 80%. La suspensión se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró con un papel de filtro y posteriormente el residuo se lavó suficientemente. El residuo obtenido se puso en suspensión en 40 litros de un tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 6,5, que se calentó a 95ºC, conteniendo el tampón cloruro de sodio 50 mM. La suspensión se trató a 95ºC durante 2 horas con agitación ocasional, para extraer un polisacárido
sulfatado.
La suspensión del extracto se filtró para proporcionar un filtrado. Posteriormente, el residuo de filtración se lavó con 3,5 litros de cloruro de sodio 100 mM, para proporcionar un filtrado adicional.
Los dos filtrados se combinaron y seguidamente la temperatura se disminuyó a 30ºC. Después de que se añadieron 3.000 U de liasa en ácido algínico (fabricada por la entidad Nagase Seikagaku Kogyo) a la mezcla resultante, se le añadieron 4 litros de etanol. La mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 24 horas. Seguidamente, la mezcla se centrifugó y la materia sobrenadante resultante se concentró hasta un volumen de 4 litros con ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000. Adicionalmente, la ultrafiltración se continuó con cloruro de sodio 100 mM que contenía etanol al 10% hasta que ya no se filtró una sustancia coloreada.
Los precipitados formados en una solución no filtrada se separaron por centrifugación y la temperatura de la materia sobrenadante resultante se disminuyó a 5ºC. El pH se ajustó a 2,0 con ácido clorhídrico 0,5 N y posteriormente los precipitados formados como una proteína se separaron por centrifugación. El pH de la materia sobrenadante resultante se ajustó rápidamente a 8,0 con hidróxido de sodio 1 N.
Seguidamente, se llevó a cabo una ultrafiltración con un ultrafiltro equipado con una holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 y el disolvente se sustituyó completamente con cloruro de sodio 20 mM, pH 8,0. Posteriormente, el pH se ajustó nuevamente a 8,0 y la mezcla resultante se centrifugó y seguidamente se liofilizó para proporcionar aproximadamente 95 g de un polisacárido sulfatado.
(3) Se hizo un polvo de 2 kilogramos de Kjellmaniella crassifolia seco con un laminador de corte equipado con un tamiz que tenía un diámetro de 1 mm y los trozos de algas resultantes se pusieron en suspensión en 20 litros de etanol al 80%. La suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró con un papel de filtro y posteriormente el residuo se lavó suficientemente. El residuo obtenido se puso en suspensión en 20 litros de un tampón (pH 8,2) que contenía 30 ml de una solución de la enzima de degradación de fucoidano F preparada en el apartado (1) del Ejemplo 2 anteriormente mencionado, 10% de etanol, cloruro de sodio 100 mM, cloruro de calcio 50 mM e imidazol 50 mM y la mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 48 horas. Esta suspensión se filtró con una malla de acero inoxidable que tenía un diámetro de abertura del tamiz de 32 \mum y el residuo se lavó con etanol al 10% que contenía cloruro de calcio 50 mM. Adicionalmente, el residuo se puso en suspensión en 10 litros de etanol al 10% que contenía cloruro de calcio 50 mM y la suspensión se agitó durante 3 horas y posteriormente se filtró con una malla de acero inoxidable y residuo se lavó. Adicionalmente, el residuo se puso en suspensión bajo las mismas condiciones y la suspensión seguidamente se agitó durante 16 horas. La suspensión se filtró con la malla de acero inoxidable que tenía un diámetro de 32 \mum y el residuo se lavó.
El filtrado y los líquidos de lavados así obtenidos se recogieron y la mezcla combinada se sometió a ultrafiltración con un ultrafiltro equipado con una holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 3.000, separando así una solución filtrada a partir de una solución no filtrada.
La solución filtrada se concentró hasta un volumen de aproximadamente 3 litros con un evaporador rotatorio y posteriormente el concentrado se centrifugó, para proporcionar una materia sobrenadante. La materia sobrenadante obtenida se desaló con un electrodializador equipado con una membrana que tenía un peso molecular de exclusión de 300. A la solución resultante se añadió acetato de calcio con el fin de proporcionar una concentración de 0,1 M y los precipitados formados se separaron por centrifugación. La materia sobrenadante resultante se aplicó a una columna DEAE-Cellulofine (cantidad de resina: 4 litros) previamente equilibrada con acetato de calcio 50 mM y se lavó suficientemente con acetato de calcio 50 mM y cloruro de sodio 50 mM. Posteriormente, se llevó a cabo la elución con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 50 mM a 800 mM. El eluato en este momento fue recogido en 500 ml cada uno. La fracción recogida se analizó mediante electroforesis de membrana de acetato de celulosa [Analytical Biochemistry, 37, 197-202 (1970)]. Como consecuencia, un sacárido sulfatado que fue eluido en una concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 0,4 M (proximidades de la fracción nº 63) era homogéneo.
Seguidamente, una solución de la fracción nº 63 se concentró en primer lugar hasta un volumen de 150 ml y posteriormente se añadió cloruro de sodio con el fin de proporcionar una concentración de 4 M. La solución resultante se aplicó a una columna Phenyl-Cellulofine (cantidad de resina: 200 ml) previamente equilibrada con cloruro de sodio 4 M y se lavó suficientemente con cloruro de sodio 4 M. Las fracciones de sacárido sulfatado no adsortivas se recogieron y se desalaron con un electrodializador equipado con una membrana que tenía un peso molecular de exclusión de 300, para proporcionar 505 ml de una solución desalada.
Se aplicaron 40 mililitros de la solución desalada a una columna Cellulofine GCL-90 (4,1 cm x 85 cm) equilibrada con cloruro de sodio 0,2 M que contenía 10% de etanol, para realizar una filtración sobre gel. La recogida se realizó a 9,2 ml por fracción.
Todas la fracciones se analizaron en cuanto a un contenido total de azúcares mediante el método de fenol-ácido sulfúrico [Analytical Chemistry, 28, 350 (1956)].
Como consecuencia, como el sacárido sulfatado formó un pico único, se recogieron las fracciones nº 63 a 70, que eran las fracciones correspondientes a una parte central del pico. La fracción combinada se desaló con un electrodializador equipado con una membrana que tenía un peso molecular de exclusión de 300 y posteriormente se liofilizó, para proporcionar 112 mg de un producto seco del compuesto representado por la siguiente fórmula (VIII). El compuesto se denomina en lo sucesivo 7-12SFd-F.
8
(4) A 80 ml de una solución al 2,5% de la fracción III (fucoidano F) preparada en el apartado (2) de Ejemplo 1 se añadieron 16 ml de tampón Tris 1 M-HCl (pH 7,6), 16 ml de una solución acuosa 1 M de CaCl_{2}, 24 ml de una solución acuosa 4 M de NaCl, 8 ml de la solución de la enzima de degradación de fucoidano F obtenida en el apartado (1) del ejemplo 2 y 176 ml de agua destilada y la mezcla resultante se calentó a 30ºC durante 3 horas. La solución resultante de fucoidano F enzimáticamente tratada se concentró con un evaporador rotatorio con el fin de proporcionar una concentración final de fucoidano F enzimáticamente tratado de 2% y posteriormente el concentrado se dializó en agua destilada, para proporcionar una solución acuosa al 2% del fucoidano F enzimáticamente tratado. Esta muestra se analizó mediante HPLC (columna: SB802.5; temperatura de la columna: 35ºC; fase móvil: NaCl 50 mM; caudal:0,5 ml/min; detección: RI ATT=8). Como consecuencia, se puso de manifiesto que aproximadamente un 40% de la muestra era 7-12SFd-F según se muestra mediante la fórmula (VIII).
Ejemplo 3
(1) Se hizo un polvo de 2 kilogramos de Kjellmaniella crassifolia con un laminador de corte (fabricado por la empresa Masuko Sagyo) equipado con un tamiz que tenía un diámetro de orificios de 1 nm. Posteriormente el producto en polvo se agitó en 20 litros de etanol al 80% a 25ºC durante 3 horas, la mezcla se filtró y el residuo se lavó. El residuo resultante se puso en suspensión en 20 litros de un tampón de imidazol 30 mM (pH 8,2) que contenía cloruro de calcio 50 mM, cloruro de sodio 10 mM, 10% de etanol y 1 U de enzima de degradación de fucoidano F de Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) preparada en el apartado (1) del ejemplo 2. La suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 2 días y posteriormente se filtró con una malla de acero inoxidable que tenía un diámetro de orificios de 32 \mum y el residuo se lavó. El residuo resultante se puso en suspensión en 40 litros de tampón de fosfato de sodio (pH 6,6) que contenía cloruro de sodio 100 mM 10 & de etanol y 4 g de una liasa en ácido algínico (fabricada por la empresa Nagase Seikagaku Kogyo). La suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 4 días y posteriormente se centrifugó para proporcionar una materia sobrenadante. Con el fin de separar los productos de bajo peso molecular del ácido algínico contenido en la materia sobrenadante obtenida, la materia sobrenadante se concentró hasta un volumen de 2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 y posteriormente el disolvente se sometió a intercambio de cloruro de sodio 100 mM que contenía 10% de etanol. A la solución resultante se añadió con agitación un volumen equivalente de acetato de calcio 400 mM y posteriormente la mezcla se centrifugó. El pH de la materia sobrenadante resultante se ajustó a 2 con ácido clorhídrico 1 N, con enfriamiento en hielo. Los precipitados formados se separaron por centrifugación y el pH de la materia sobrenadante resultante se ajustó a 8,0 con hidróxido de sodio 1 N. Esta solución se concentró hasta un volumen de 1 litro por ultrafiltración y posteriormente el disolvente se sometió a intercambio de cloruro de sodio 100 mM. Los precipitados formados en este momento se separaron por centrifugación. Con el fin de separar las sustancias hidrófobas en la materia sobrenadante resultante, se añadió cloruro de sodio a la materia sobrenadante con el fin de proporcionar una concentración de 1 M y la mezcla resultante se aplicó a una columna que contenía 3 litros de Phenyl-Cellulofine (fabricado por la empresa Seikagaku Corporation) equilibrada con cloruro de sodio 1 M, para recoger una fracción efluente. La fracción se concentró con un ultrafiltro y posteriormente el cloruro de sodio 20 mM se sometió a intercambio con el disolvente se sometió a intercambio iónico de cloruro de sodio 20 mM. La solución resultante se liofilizó y el peso del producto liofilizado era de 29,3 g.
(2) Se disolvieron 15 gramos del producto liofilizado anteriormente mencionado en 1,5 litros de tampón Tris 50 mM- HCl que contenía cloruro de sodio 400 mM y 9 U de una enzima de degradación de polisacáridos endo-sulfatados (enzima de degradación de fucoidano U) obtenida a partir de un cultivo preparado cultivando Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) descrito en el documento Wo 97/26896. Posteriormente la solución resultante se sometió a la reacción a 25ºC durante 6 días, la mezcla de reacción se concentró hasta un volumen de aproximadamente 300 ml con un evaporador. El concentrado se colocó en un tubo de diálisis que tenía un peso molecular de exclusión de 3.500 y se dializó a fondo. La solución que permanecía en el tubo de diálisis se aplicó a una columna que contenía 4 litros de DEAE-Cellulofine A-800 calibrado con cloruro de sodio 50 mM y se lavó suficientemente con cloruro de sodio 50 mM. Posteriormente, se llevó a cabo la elución en un gradiente de concentración de cloruro de sodio 50 a 650 mM. Adicionalmente, se llevó a cabo suficientemente la elución en la misma columna con cloruro de sodio 650 mM. Entre las fracciones eluidas, las fracciones eluidas con cloruro de sodio 650 mM se recogieron como una fracción de fucogalactano sulfatado y se concentraron con ultrafiltro que tenía un peso molecular de exclusión de 10.000. Posteriormente, el disolvente se sustituyó con cloruro de sodio 10 mM y la solución resultante se liofilizó para proporcionar 0,85 g de un producto liofilizado no fibroso de fucogalactano sulfatado. El fucogalactano sulfatado obtenido (fucoidano G) se encontró que contenía galactosa y fucosa como sacáridos constituyentes en una relación en moles de aproximadamente 2:1.
(3) Para la producción de enzima de degradación de fucoidano G, se esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos 600 ml de un medio de cultivo que comprendía un agua marina artificial (fabricada por la entidad Jamarin Laboratory), pH 7,5, que contenía 0,1% de glucosa, 1,0% de peptona y 0,05% de extracto de levaduras y posteriormente se inoculó Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-5402) en el medio de cultivo y se cultivó a 24ºC durante 23 horas para proporcionar un medio de cultivo de semilla. En un fermentador con depósito de 30 litros se introdujeron 20 litros de un medio de cultivo que comprendía un agua marina artificial (pH 7,5) que contenía 0,2% de fracción de fucoidano derivada de Kjellmaniella crassifolia preparada mediante el método del apartado (1) del Ejemplo 3, 2,0% de peptona, 0,01% de extracto de levadura y 0,01% de agente antiespumante (fabricado por la entidad Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KM70), y se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos. Después de enfriar, se inocularon 600 ml del medio de cultivo de semilla anteriormente mencionado y se cultivó a 24ºC durante 23 horas bajo las condiciones de 10 litros de aireación por minuto y una velocidad de agitación de 125 revoluciones por minuto. Después de terminar el cultivo, el medio de cultivo se centrifugó para proporcionar células.
Las células obtenidas se pusieron en suspensión en 1200 ml de un tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,4 M y se sometieron a disgregación ultrasónica. Posteriormente, el producto resultante se centrifugó para proporcionar un extracto celular. El extracto celular obtenido se dializó suficientemente frente al mismo tampón y se centrifugó para proporcionar una materia sobrenadante. A la materia sobrenadante resultante se añadió sulfato de amonio con el fin de proporcionar una concentración final de 90% de saturación y los precipitados formados se recogieron por centrifugación. Los precipitados obtenidos se disolvieron en 150 ml de un tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 50 mM. La solución resultante se dializó suficientemente frente al mismo tampón y se centrifugó. La materia sobrenadante obtenida se aplicó a una columna de 500 ml DEAE-Sepharose FF (fabricada por la empresa Amersham-Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente, la elución se llevó a cabo con un gradiente de concentración de cloruro de sodio de 50 mM a 600 mM, para recoger una fracción activa.
La fracción activa obtenida se dializó suficientemente frente a tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,1 M, se aplicó a una columna que contenía 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (fabricada por CHISSO CORPORATION) equilibrada con el mismo tampón y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente, la elución se llevó a cabo con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 0,1 M a 0,4 M, para recoger una fracción activa. Se añadió cloruro de sodio a la fracción activa resultante con el fin de proporcionar una concentración de 4 M. La solución obtenida se aplicó a una columna que contenía 20 ml de Phenyl-Cellulofine (fabricada por la empresa CHISSO CORPORATION) equilibrada con tampón Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 4 M y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente, la elución se llevó a cabo con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 4 M a 1 M. Posteriormente, se llevó a cabo una elución suficiente con un tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 1 M, para recoger una fracción activa. Se añadió cloruro de sodio a la fracción activa obtenida con el fin de proporcionar una concentración de 3 M. La solución resultante se aplicó a una columna que contenía 10 ml de Phenyl-Cellulofine (fabricada por CHISSO CORPORATION) equilibrada con un tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 3 M y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente, la elución se llevó a cabo con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 3 M a 0,5 M. Posteriormente, se llevó a cabo una elución suficiente con tampón de Tris 10 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,5 M, para recoger una fracción activa. La enzima purificada así obtenida se usó como enzima de degradación de fucoidano G.
(4) El fucoidano G descrito en el apartado (2) del Ejemplo 3 se trató con la enzima de degradación de fucoidano G purificada anterior para preparar un producto de bajo peso molecular. Específicamente, se disolvieron 1,94 g de fucoidano G en un tampón de Tris 25 mM-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,2 M. Posteriormente se le añadieron 186 mU de enzima de degradación de fucoidano G y la solución resultante se sometió a la reacción a 25ºC durante 6 días. La mezcla de reacción se concentró hasta un volumen de 850 ml con un evaporador. El concentrado se aplicó a una columna Cellulofine GCL-1.000 (4 x 90 cm) (fabricada por la entidad CHISSO CORPORATION) para el fraccionamiento del peso molecular. Las fracciones que tenían un peso molecular de 15.000 o menos se recogieron y la fracción combinada se denomina fracción digerida con enzima de degradación de fucoidano G.
(5) La fracción anterior digerida con enzima de fucoidano G se concentró hasta un volumen de 500 ml con un evaporador y posteriormente el concentrado se desaló co un electrodializador. El producto desalado resultante se aplicó a una columna que contenía 1 litro de DEAE-Cellulofine A-800 (fabricada por la empresa CHISSO CORPORATION) previamente equilibrada con un tampón de imidazol 10 mM-ácido clorhídrico (pH 8) que contenía cloruro de sodio 10 mM y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente se llevó a cabo la elución con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 10 mM a 900 mM. El eluato se recogió en 65 ml cada uno y cada uno de su contenido de azúcares se determinó mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas con un valor próximo de cloruro de sodio 270 mM se recogieron ya que formaban un pico de contenido de azúcares y la fracción combinada se denominó fracción (ii) 270 mM eluida.
Además, a la fracción (ii) 270 mM eluida anteriormente mencionada se añadió agua con el fin de tener la misma conductividad eléctrica que la de un tampón de imidazol 10 mM-ácido clorhídrico que contenía cloruro de sodio 150 mM y la solución resultante se aplicó a una columna que contenía 200 ml de DEAE-Cellulofine A-800 (fabricada por la entidad CHISSO CORPORATION) previamente equilibrada con un tampón de imidazol 10 mM-ácido clorhídrico (pH 8) que contenía cloruro de sodio 50 mM y se lavó con el mismo tampón. Posteriormente se llevó a cabo la elución con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 150 mM a 300 mM. El eluato se recogió en 12 ml cada uno y se determinó el contenido de azúcar de cada uno mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones eluidas en las proximidades de cloruro de sodio 160 mM a 180 mM se recogieron y se concentraron hasta un volumen de 2 ml con un evaporador a vacío de velocidad elevada (fabricado por la entidad SAVANT Instruments Inc.). Posteriormente, el concentrado se aplicó a una columna que contenía 200 ml de Cellulofine CGL-25 (fabricada por la entidad CHISSO CORPORATION) previamente equilibrada con solución al 10% de etanol y la elución se llevó a cabo con la misma solución. El eluato se recogió en 2 ml cada uno y se determinó sus contenidos de azúcar en cada uno mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Las fracciones que forman un pico de contenido de azúcar se recogieron y se denominaron (D).
La fracción (D) anterior se desaló con un electrodializador y posteriormente se liofilizó. Se analizaron la composición de los azúcares y el peso molecular. Además, se llevó a cabo un análisis estructural mediante análisis por RMN después de una sustitución con agua pesada mediante un método prescrito.
Propiedades de (D)
Peso molecular: 1358
^{1}H-RMN (D2O)
\delta, 5,19 (1H, d, J=4,3HZ, F1-1-H), 4,93 (1H, d, J=3,7HZ, F2-1-H), 4,62 (1H, solapado con HOD, G1-1-H), 4,59 (1H, solapado con HOD, G2-1-H), 4,54 (1H, d-d, J=10,6, 2,7 Hz, F1-3-H), 4,46 (1H, d, J= 7,6 Hz, G3-1-H), 4,46 (1H, m, F2-3-H), 4,41 (1H, s ancho, G2-4-H), 4,41 (1H, d, J=7,6 Hz, G4-1-H), 4,37 (1H, q, J=6,4 Hz, F2-5-H), 4,27 (1H, m, G2-3-H), 4,24 (1H, s ancho, G3-4-H), 4,21 (1H, m, G3-3-H), 4,19 (1H, m, G4-3-H), 4,15 (1H, s ancho, G4-4-H), 4,13 (1H, q, J=6,7 Hz, F1-5-H), 4,09 (1H,d,J=2,7 Hz, F1-4-H), 4,04 (1H, d, J=2,8 Hz, F2-4-H), 3,98 (1H, m, G2-6-H), 3,96 (1H, d-d, J=10,6, 4,3 Hz, F1-2-H), 3,93 (1H, m, G3-6-H), 3,88 (1H, s ancho, G1-4-H), 3,86 (1H, m, G2-5-H), 3,81 (1H, m, G2-6-H), 3,81 (1H, m, F2-2-H), 3,80 (1H,m, G3-5-H), 3,80 (1H, m, G3-6-H), 3,66 (1H, m, G1-3-H), 3,65 (1H, m, G2-2-H), 3,64 (1H,m, G1-6-H), 3,64 (1H, m, G4-6-H), 3,61 (1H, m, G4-5-H), 3,58 (1H, m, G1-2-H), 3,56 (1H, m, G1-6-H) 3,56 (1H,m, G4-6-H), 3,55 (1H, m, G4-2-H), 3,54 (1H, m, G1-5-H), 3,54 (1H, m, G3-2-H), 1,20 (3H, d, J=6,7, F1-6-H), 1,14 (3H, d, J=6,4, F2-6-H).
Composición de azúcares (Relación en moles): L-fructosa: D-galactosa=2,4
Grupo sulfato: 5 moléculas.
En este caso, los números asignados a los picos en la H^{1}-RMN son como se muestran en la siguiente fórmula (IX). El compuesto es denominado en los sucesivo 6-5SFd-G.
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Ejemplo 4
Se pusieron en suspensión 120 gramos del polisacárido sulfatado preparado en el apartado (2) del Ejemplo 2 en 8 litros de un tampón de imidazol 20 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de calcio 20 mM cloruro de sodio 300 mM, 10% de etanol y 10 U de la enzima de degradación de fucoidano F preparada en el apartado (1) del Ejemplo 2. La suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 3 días y se sometió a una ultrafiltración con ultrafiltro equipado con una holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000, con adición del Tampón anteriormente mencionado.
Se añadió la cantidad de 34 U de enzima de degradación de fucoidano U descrita en el apartado (2) del Ejemplo 3 a la solución ultrafiltrada y la mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 2 días y se sometió a una ultrafiltración con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 con adición de agua.
El filtrado se recogió y se concentró hasta un volumen de 1,5 litros con un Evaporador. Posteriormente, el concentrado se desaló completamente con un aparato de desalación, se aplicó a una columna que contenía 3 litros de DEAE-Cellulofine A-800 previamente equilibrada con tampón de imidazol-ácido clorhídrico (pH 6,5) que contenía cloruro de sodio 30 mM y se lavó con 6 litros del mismo tampón. Posteriormente, se llevó a cabo la elución con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 30 mM a 500 mM. La cantidad de la solución requerida para la elución fue de 48 litros. El eluato se recogió en 180 ml cada uno y su contenido de azúcares se determinó mediante el método de fenol-ácido sulfúrico. Además, se determinó la absorbancia a 232 nm en el mismo momento. Las fracciones eluidas con cloruro de sodio 130 mM a 170 mM se recogieron, ya que formaban un único pico. La fracción combinada se desaló con un aparato de desalación y posteriormente se liofilizaron para proporcionar 5,85 g de un oligosacárido. Se confirmó que este oligosacárido tenía un peso molecular de 1128 mediante espectrometría de masas y este es el compuesto representado por la siguiente fórmula (X) mediante análisis por RMN. El compuesto se denomina en los sucesivo 6-2SFd-U.
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Ejemplo 5
(1) se cortaron 500 gramos de Kjellmaniella crassifolia en piezas delgadas y se lavaron con 10 litros de etanol al 80%. Posteriormente, el producto resultante se agitó en un recipiente que tenía un diámetro interno de 40 cm que contenía 50 litros de etanol al 10% que contenía cloruro de potasio 1 mM a 25ºC durante 2 días, a una velocidad de 120 revoluciones por minuto para extraer fucoidano. El extracto resultante se filtró con una malla de acero inoxidable que tenía un diámetro del tamiz de 32 \mum, para proporcionar una solución de fucoidano.
A 46 litros de la solución de fucoidano se añadió un litro de solución de aceite de palma con agitación, siendo preparada la solución de aceite de palma disolviendo 1 g de aceite de palma (fabricado por la entidad Kao Corporation, para un uso cosmético) en 1 litro de etanol y se le añadió adicionalmente 1 litro de glicerol, para proporcionar una loción. También, se prepararon lociones usando el fucoidano y un producto de degradación del mismo descrito en cada ejemplo de la misma manera.
(2) A la solución de fucoidano preparada en el apartado (1) del Ejemplo 5, se añadieron a cada uno gelatina y perfume con el fin de tener una concentración final de 0,02%, para proporcionar una loción que contenía gelatina. También, se añadió análogamente colágeno, para proporcionar una loción que contenía colágeno. Además se prepararon lociones usando el fucoidano y su producto de degradación, descritos en cada ejemplo, de la misma manera.
(3) Se añadió un perfume al fucoidano preparado en el aparatado (1) del Ejemplo 5, para preparar una loción para el pelo. Análogamente, se prepararon lociones para el pelo usando el fucoidano y un producto de degradación del mismo, descritos en cada ejemplo.
Ejemplo 6
Se hizo un polvo de un kilogramo de un producto seco de un esporofilo disponible en el comercio de Undaria pinnatifidia (Wakame Mekabu) con un laminador de corte equipado con un tamiz que tenía un diámetro de orificios de 1 mm. Posteriormente, el esporofilo en polvo se puso en suspensión en 10 litros de etanol al 80% y la suspensión se agitó durante 3 horas y posteriormente se filtró con un papel de filtro, para proporcionar un residuo. El residuo se puso en suspensión en 20 litros de tampón de fosfato 40 mM (pH 6,5) que contenía cloruro de sodio 50 mM y se trató a 95ºC durante 2 horas. La solución tratada se enfrió a 37ºC y posteriormente se le añadió etanol con el fin de proporcionar una concentración de 10%. Posteriormente se añadieron 12.000 U de una liasa K en ácido algínico disponible en el comercio (fabricada por la entidad Nagase Seikagaku Kogyo) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución tratada resultante se centrifugó y la materia sobrenadante se concentró hasta un volumen de 2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000. Posteriormente, los precipitados formados se separaron por centrifugación. La materia sobrenadante resultante se enfrió a 5ºC y posteriormente se le añadió ácido clorhídrico 0,5 N para ajustar el pH a 2,0. Posteriormente, la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos y los precipitados formados se separaron por centrifugación. El pH de la materia sobrenadante se ajustó a 8,0 con hidróxido de sodio 0,5 N y el disolvente se sustituyó con cloruro de sodio 20 mM por ultrafiltración. El pH de la solución resultante se ajustó a 8,0 y posteriormente la materia sobrenadante obtenida después de la centrifugación se liofilizó, para proporcionar 90,5 g de fucoidano no fibroso derivado de esporofilo de Undaria pinnatifida.
Ejemplo 7
Un kilogramo de un producto seco de Fucus vesiculosus en polvo se puso en suspensión en 10 litros de etanol al 80% y la suspensión se agitó durante 3 horas y posteriormente se filtró con un papel de filtro, para proporcionar un residuo. El residuo se puso en suspensión en 30 litros de un tampón de fosfato 30 mM (pH 6,0) que contenía cloruro de sodio 100 mM y se trató a 95ºC durante 2 horas. Posteriormente la solución tratada se enfrió a 37ºC, se añadieron 100 g de carbono activado y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Posteriormente se añadieron 3.000 U de una liasa K en ácido algínico disponible en el comercio, se añadió etanol con el fin de proporcionar una concentración 10% y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución tratada resultante se centrifugó y la materia sobrenadante se concentró hasta un volumen de 2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000. Posteriormente, los precipitados formados se separaron por centrifugación y la materia sobrenadante se ultrafiltró con un extracto añadido, para separar un pigmento. La solución no filtrada obtenida se enfrió a 5ºC y posteriormente se le añadió ácido clorhídrico 0,5 N para ajustar el pH a 2,0. Posteriormente, la solución resultante se agitó durante 30 minutos y los precipitados formados se separaron por centrifugación. El pH de la materia sobrenadante se ajustó a 8,0 con hidróxido de sodio 0,5 N y el disolvente se sustituyó con cloruro de sodio 20 mM por ultrafiltración. El pH de la solución resultante se ajustó a 8,0 y posteriormente la materia sobrenadante obtenida después de la centrifugación se liofilizó, para proporcionar 71 g de fucoidano no fibroso derivado de Fucus vesiculosus.
El fucoidano no fibroso derivado de Ascophyllum nodosum se preparó a partir de un polvo seco de Ascophyllum nodosum (denominación comercial: Algin Gold, comercializada por la entidad Adesu Boeki K.K.) según el método anteriormente descrito.
Ejemplo 8
Se disolvieron 2 gramos del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia preparado mediante el método descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1 en 100 ml de agua y el pH de la solución se ajustó a 3 con ácido cítrico. Posteriormente, la mezcla resultante se trató a 100ºC durante 3 horas, para proporcionar un producto descompuesto con el ácido del fucoidano. Este hidrolizado se sometió a fraccionamiento del peso molecular mediante filtración sobre gel en Cellulofine GCL-300 o Cellulofine GCL-25, en fracciones de un peso molecular por enzima de 25.000 (Fracción A), por encima de 10.000 hasta 25.000 (fracción B) y por encima de 5.000 hasta 10.000 (fracción C) usando Cellulofine GCL-300; y por encima de 2.000 hasta 5.000 (fracción D), por encima de 500 hasta 2.000 (fracción E) y 500 o menos (fracción F) usando Cellulofine GCL-25. Adicionalmente cada una de estas fracciones y el producto descompuesto con el ácido se desalaron y seguidamente se liofilizaron, para proporcionar el producto descompuesto con el ácido y cada fracción del producto descompuesto con el ácido.
Ejemplo 9
Cinco kilogramos de Nemacystus decipiens conservado en sal, disponible en el comercio, se cortaron en trozos delgados con unas tijeras y se mezclaron con 20 litros de etanol. La mezcla resultante se dejó en reposo durante una noche y seguidamente se filtró con un papel de filtro. El residuo resultante se puso en suspensión en 12,5 litros de agua y se trató 95ºC durante 2 horas. Posteriormente la solución tratada se filtró con un papel de filtro, se le añadieron 2600 ml de una solución al 2,5% de cloruro de cetil-piridinio que contenía cloruro de sodio 350 mM y la mezcla resultante se dejó en reposo durante 3 días. La parte sobrenadante se desechó, la parte precipitada se centrifugó y la materia sobrenadante resultante también se desechó. A los precipitados obtenidos se añadieron 2,5 litros de cloruro de sodio 350 mM y posteriormente la mezcla se homogeneizó con un homogeneizador y se centrifugó. Las etapas de lavado se repitieron 3 veces. Se añadieron 400 mililitros de cloruro de sodio 400 mM a los precipitados obtenidos. Posteriormente, la mezcla se homogeneizó con un homogeneizador y se le añadió etanol con el fin de proporcionar una concentración de 80%. La mezcla se agitó durante 30 minutos y seguidamente se filtró con un papel de filtro. Se añadieron 500 mililitros de etanol al 80% saturado con cloruro de sodio al residuo obtenido y posteriormente la mezcla se homogeneizó con un homogeneizador. Se añadió etanol saturado con cloruro de sodio hasta constituir un volumen de 1 litro y la mezcla se agitó durante 30 minutos y seguidamente se filtró con un papel de filtro. Las etapas de lavado se repitieron hasta que la absorbancia a 260 nm del filtrado se hizo 0 (cero) (habitualmente 5 veces). El residuo obtenido se disolvió en 1,5 litros de cloruro de sodio 2 M y posteriormente las materias insolubles se separaron por centrifugación. La solución resultante se dejó fluir a través de una columna que contenía 100 ml de DEAE-Cellulofine A-800 previamente equilibrados con cloruro de sodio 2 M. Las fracciones efluentes se concentraron hasta un volumen de 2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 y posteriormente el disolvente se sustituyó con cloruro de sodio 2 mM mediante un ultrafiltro. La solución resultante se centrifugó y la materia sobrenadante resultante se liofilizó para proporcionar 22,9 g de fucoidano derivado de Nemacystus decipiens.
Ejemplo 10
(1) se cortaron 50 gramos de Gelidium amansii seco en trozos delgados con unas tijeras y se pusieron en suspensión en 500 ml de etanol al 80%. Posteriormente, la suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró con un papel de filtro. El residuo resultante se puso en suspensión en 1 litro de un tampón de fosfato de sodio 30 mM (pH 6,5) que contenía cloruro de sodio 100 mM y se trató a 95ºC durante 2 horas y posteriormente se filtró con una malla de acero inoxidable que tenía un diámetro de orificios de 106 \mum. El tampón de fosfato de sodio anteriormente mencionado se añadió al filtrado obtenido hasta constituir un volumen de 3 litro. Se le añadieron 5 gramos de carbono activado y la mezcla resultante se agitó a 25ºC durante una noche y seguidamente se centrifugó. La materia sobrenadante se concentró hasta un volumen de 10 ml con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 y posteriormente se sometió a intercambio con disolventes con un ultrafiltro para proporcionar una solución 10 mM de cloruro de sodio. Las materia insolubles en la solución se separaron por centrifugación y posteriormente la solución resultante se liofilizó para proporcionar 2,3 g de un producto seco de una fracción de polisacárido sulfatado derivado de Gelidium amansii.
(2) Según el método descrito en el apartado (1) del Ejemplo 10, se prepararon 4,4 g de un polisacárido sulfatado derivado de Gracilaria verrucosa a partir de 50 g de Gracilaria verrucosa seco. Análogamente, se preparó también 1,0 g de un polisacárido sulfatado derivado de Pterocladiella capillacea a partir de Pterocladiella capillacea seco.
(3)-[1] se puso en suspensión un kilogramo de un polvo disponible en el comercio de Lessonia nigrescence seco en 10 litros de etanol al 80% y posteriormente la suspensión resultante se agitó a 25ºC durante 3 horas y se filtró con un papel de filtro. El residuo resultante se puso en suspensión en 20 litros de tampón de fosfato de sodio 30 mM (pH 6,5) que contenía cloruro de sodio 100 mM y la suspensión resultante se trató a 95ºC durante 2 horas y posteriormente se filtró con una malla de acero inoxidable que tenía un diámetro de orificios de 106 \mum. Al filtrado resultante se añadieron 100 g de carbono activado, 2,4 litros de etanol y 6.000 U de liasa K en ácido algínico y la mezcla resultante se agitó a 25ºC durante 22 horas y seguidamente se centrifugó. La materia sobrenadante resultante se concentró hasta un volumen de 1,2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000 y posteriormente las materias insolubles se separaron por centrifugación. La solución resultante se dejó en reposo a 5ºC durante 24 horas. Los precipitados formados se separaron por filtración y la materia sobrenadante resultante se sometió a intercambio de disolventes con un ultrafiltro para proporcionar una solución 100 mM de cloruro de sodio. Posteriormente la solución se enfrió a 4ºC o menos, el pH se ajustó a 2,0 con ácido clorhídrico y los precipitados formados se separaron por centrifugación. El pH de la materia sobrenadante resultante se ajustó a 8,0 con hidróxido de sodio y la solución resultante se concentró hasta un volumen de 2 litros. Posteriormente, se sometió a intercambio el cloruro de sodio 20 mM con el disolvente usando un ultrafiltro. Las materias insolubles en la solución resultante se separaron por centrifugación y posteriormente el producto resultante se liofilizó, para proporcionar 41 g de un producto seco no fibroso de una fracción de fucoidano derivado de Lessonia.
(3)-[2] se disolvieron seis gramos del producto liofilizado anteriormente mencionado en 600 ml de tampón de imidazol 20 mM-ácido clorhídrico (pH 6) que contenía cloruro de sodio 100 mM y la solución resultante se aplicó a una columna que contenía 5 litros de DEAE-Cellulofine A-800 previamente equilibrada con el mismo tampón. Posteriormente se llevó a cabo un lavado con 10 litros del mismo tampón, la elución se llevó a cabo con un gradiente de concentración de cloruro de sodio 100 a 1600 mM. La cantidad de la solución usada para elución era de 13 litros y el eluato se recogió en 500 ml cada uno. De las fracciones eluidas, 500 ml de cada una de las fracciones eluidas obtenidas en las proximidades de una concentración de cloruro de sodio 250 mM, 530 mM y 700 mM se dializaron frente a agua purificada y se liofilizaron. Los productos liofilizados se denominaron fracción 33 de DEAE, fracción 37 de DEAE y fracción de DEAE, respectivamente, y se obtuvieron en las cantidades de 57 mg, 24 mg y 62 mg, respectivamente.
Ejemplo 11
Se desecaron 5 kilogramos de cohombros de mar japonés y los órganos se separaron para recoger capas somáticas. Se añadieron 500 mililitros de acetona por 200 g de peso en seco de las capas somáticas y la mezcla se trató con un homogeneizador. Posteriormente, el homogenato se filtró y el residuo se lavó con acetona hasta que ya no permanecían sustancias coloreadas. Este residuo se secó con succión, para proporcionar 140 g de un producto seco. A este producto seco se añadieron 2,8 litros de una solución salina 0,4 M y la mezcla se trató a 100ºC durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla se filtró y el residuo se lavó suficientemente con una solución salina 0,4 M, para proporcionar 3,7 litros de un extracto. A este extracto se añadió cloruro de cetil-piridinio al 5% hasta que no se formaron más precipitados y los precipitados formados se recolectaron por centrifugación. Los precipitados se pusieron en suspensión en una solución salina 0,4 M y se centrifugaron nuevamente. Se añadió un litro de una solución salina 4 M a los precipitados resultantes y la mezcla se trató con un homogeneizador. Posteriormente se le añadieron 4 litros de etanol con agitación y la mezcla resultante se agitó durante 1 hora y posteriormente se filtró, para proporcionar precipitados. Las etapas de poner en suspensión los precipitados en etanol al 80% y filtrar posteriormente la suspensión se repitieron hasta que la absorbancia a 260 nm de la materia sobrenadante se hizo casi cero (0). Los precipitados obtenidos se pusieron en suspensión en 2 litros de una solución salina 2 M y las materias insolubles se separaron por centrifugación. La materia sobrenadante se ultrafiltró con un ultrafiltro equipado con una membrana que tenía un peso molecular de exclusión de 30.000 y se desaló completamente. Posteriormente, el producto resultante se liofilizó para proporcionar 3,7 g de fucoidano derivado de cohombros de mar japonés.
Ejemplo 12
(1) se pusieron en suspensión 625 gramos de Cladosiphon okamuranus conservado en sal disponible en el comercio en 4375 ml de un tampón de fosfato de sodio 30 mM (pH 6,0) y la suspensión se trató con un homogeneizador a 8.000 revoluciones por minuto durante 5 minutos. Posteriormente, el homogenato se trató a 95ºC durante 1 hora y se centrifugó, para proporcionar una materia sobrenadante. Se añadieron 10 gramos de carbono activado a la materia sobrenadante obtenida. Posteriormente, la mezcla resultante se agitó durante 30 minutos y se centrifugó, para proporcionar una materia sobrenadante. La materia sobrenadante resultante se concentró hasta un volumen de 2 litros con un ultrafiltro equipado con holofibra que tenía un peso molecular de exclusión de 100.000. Posteriormente, el disolvente se sustituyó con un cloruro de sodio 20 mM y la solución resultante se liofilizó, para proporcionar 10,9 g de un producto seco no fibroso de un fucoidano derivado de Cladosiphon okamuranus.
(2) El fucoidano se trató con la enzima de degradación de fucoidano producida por Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234 (FERM p-17517). Los productos enzimáticamente degradados resultantes se analizaron mediante un análisis instrumental como RMN y MASS. Como consecuencia, el fucoidano se encontró que era un fucoidano que tenía la estructura representada por la fórmula general (IV) anteriormente mencionada como unidad de repetición. Además, el fucoidano era un fucoidano que contenía fucosa y ácido glucurónico en una relación en moles de 35:10 a 44:10 y que tenía un peso molecular medio de aproximadamente 1.000.000.
Ejemplo 13
(1) Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 5 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia preparado en el apartado (1) del Ejemplo 1 se puso en suspensión y se disolvió en etanol en una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó al lado posterior del ratón en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó análogamente etanol. A los ratones se les administró una vez al día durante 8 días consecutivos. El pelo del lado posterior se retiró parcialmente en el noveno día después del comienzo de la administración y se midió la longitud del pelo bajo microscopio usando un calibrador. Además, se desprendió la piel después de que los ratones fueran sacrificados por desangrado y se analizó el color de la piel del lado posterior usando un programa de ordenador de análisis de imágenes (NIH Image).
Los resultados se muestran en la Tabla 1. En la Tabla, la longitud del pelo es expresada mediante un valor medio \pm error típico de 5 casos y el color de la piel se expresa mediante un tono de oscuridad media del color de 5 casos, cuando el tono de color del grupo testigo se define como 100.
En el grupo testigo, se observó aparentemente un estado de transición al telogen y el color de la piel fue blanco. Por otra parte, el grupo al que se administró fucoidano mantuvo el anagen y el color de la piel era más grisáceo que el del grupo testigo. La longitud del pelo era mayor en el grupo al que se administró fucoidano que en el grupo testigo. Dicho de otro modo, se confirmó un efecto de restauración del pelo en el grupo al que se administró fucoidano.
TABLA 1
11
Los ratones C3H/He son frecuentemente usados para la evaluación del efecto de restauración del pelo. El pelo de un ratón de 5 semanas está en el anagen, durante el cual el pelo y los folículos pilosos crecen activamente. Durante esta fase, se secretan activamente pigmentos y enzimas en las células de los folículos pilosos de forma que el color se observa que es considerablemente oscuro. Sin embrago, cuando el estado del pelo comienza a transferirse hasta el telogen desde el anagen, el pelo deja de crecer y los folículos pilosos se hacen más pequeños, de forma que se debilita la función secretora. Por lo tanto, el color de la piel se hace gradualmente más claro de forma que el color se observa que es rosáceo a blanquecino. Aunque el ciclo procede fisiológicamente por naturaleza si puede ser mantenido el anagen, aumentará la proporción de pelo en crecimiento. Un agente que tenga esta función puede ser útil para un producto para el cuidado del pelo (The Journal of Dermatology 10: 45-54, 1983.):
Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada Ejemplo. Como consecuencia, se podrían confirmar efectos similares de restauración del pelo.
(2) Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo en el lado posterior de cada ratón se cortó con tijeras para el pelo.
El fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia preparado en el aparatado (1) del Ejemplo 1 se puso en suspensión y se disolvió en etanol en una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó al sitio de corte del pelo anteriormente mencionado del lado posterior de los ratones en una cantidad de 200 \mul por ratón. Para el grupo testigo se aplicó análogamente etanol. A los ratones se les efectuó la administración una vez al día durante días conse-
cutivos.
El sitio de administración se observó durante el transcurso del tiempo desde el comienzo de la administración y se evaluó mediante puntuación un cambio en el tono del color de la piel. Específicamente, los criterios de puntuación se definieron como sigue: puntuación 0: ningún cambio en el color de la piel, puntuación 1: el color de la piel comienza a cambiar a azul, puntuación 2: el color de la piel comienza a cambiar a negro-azul a gris, puntuación 3: se observa un estado tricogenoso y puntuación 4: el estado antes de cortar el pelo es casi restaurado.
Se calculó la puntuación media para cada grupo. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Como se muestra en la Tabla 2, el grupo al que se administró fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia mostró un cambio en el color de la piel y una aceleración del crecimiento del pelo desde una fase más temprana, conduciendo finalmente a un estado tricogenoso, en comparación con el grupo testigo. Dicho de otro modo, se confirmó un efecto de restauración del pelo. Además, se llevaron a cabo ensayos similares en cuanto al fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada Ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 2
12
(3) Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento desde 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo en el lado posterior de cada ratón se cortó con tijeras para el pelo y posteriormente se afeitó con una cuchilla.
Usando el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia preparado en el apartado (1) del Ejemplo 1, o 7-12SFd-F preparado en el apartado (3) del Ejemplo 2, se ensayaron los efectos de restauración del pelo de la misma manera que en el apartado (2) del Ejemplo 13.
Se calculó la puntuación media en cada grupo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Como se muestra en la Tabla 3, cada grupo al que se administró fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y el grupo al que se administró 7-12SFd-F mostró un cambio en el color de la piel y una aceleración del crecimiento del pelo desde una fase más temprana conduciendo finalmente al estado tricogenoso, en comparación con el grupo testigo. En este caso, cuando el grupo al que se administró fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia se comparó con el grupo al que se administró 7-12SFd-F, el grupo al que se administró 7-12SFd-F mostró un cambio en el color de la piel desde una fase ligeramente más temprana. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada Ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 3
13
(4) Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 5 semanas de edad después de pre-criar los ratones. Se puso en suspensión 7-12SFd-F preparado en el apartado (3) del Ejemplo 2 y se disolvió en etanol a una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó sobre el lado posterior de los ratones en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó análogamente etanol. Se aplicó la administración a los ratones una vez al día durante 8 días consecutivos. La piel fue desprendida después de que los ratones fueron sacrificados por desangrado en el noveno día después de comenzar la administración, y se analizó el color de la piel del lado posterior usando un programa de ordenador de análisis de imágenes.
Los resultados se muestran en la Tabla 4. Las cifras numéricas en la Tabla están expresadas por un valor medio \pm error típico de 5 casos y el * en la Tabla significa que hay una diferencia significativa a un nivel de carácter significativo de 5% o menos en comparación con el grupo testigo. El tono del color de la piel se expresa como el nivel del tono de color en el que el blanco se define como 0 y el negro se define como 100.
En el grupo testigo, se observó aparentemente un estado de transición al telogen, y el color de la piel se hizo blanco. Por otra parte, el grupo al que se administró 7-12SFd-F mantuvo el anagen y el color de la piel era más grisáceo que el del grupo testigo. Se observó a partir de lo anterior que el 7-12SFd-F tiene una acción de mantenimiento del anagen tardío, a saber, una acción de restauración del pelo similar a la del apartado (1) del Ejemplo 13. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 4
14
(5) se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo en el lado posterior de cada ratón se cortó con unas tijeras para el pelo y posteriormente se afeitó con una cuchilla. Se puso en suspensión 7-12SFd-F preparado en el apartado (3) del Ejemplo 2 y se disolvió en etanol en una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó al sitio de corte del pelo anteriormente mencionado del lado posterior de los ratones en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó análogamente etanol. A los ratones se les administró una vez al día durante días consecutivos. El área en la que se observó el estado tricogenoso se determinó en el vigésimo primer día desde el día del comienzo de la administración (el día siguiente al afeitado) y se expresa como la relación (%) respecto al área afeitada.
Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las cifras numéricas en la Tabla están expresadas por un valor medio \pm error típico de 7 a 8 casos.
En comparación con el grupo testigo, la transición del telogen al anagen fue claramente acelerada, y el grupo al que se administró 7-12SFd-F condujo a un estado tricogenoso en una proporción mayor. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada Ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 5
15
(6) Usando el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia preparado en el apartado (1) del Ejemplo 1 y el fucoidano con elevado contenido de F preparado en el apartado (2) del Ejemplo 16 descrito con posterioridad, se confirmó el efecto de restauración del pelo de la misma manera que en el apartado (5) del Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 6. En comparación con el grupo testigo, se condujeron relaciones mayores de los animales a un estado tricogenoso en el grupo al que se administró fucoidano y el grupo al que se administró fucoidano con elevado contenido de F.
TABLA 6
16
(7) Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo en el lado posterior de cada ratón se cortó con tijeras para el pelo y posteriormente se afeitó con una cuchilla. Se puso en suspensión 7-12SFd-F preparado en el apartado (3) del Ejemplo 2 y se disolvió en etanol en una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó al sitio de corte de pelo anterior del lado posterior de los ratones en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó análogamente etanol. A los ratones se les administró una vez al día durante días consecutivos. La piel del lado posterior fue desprendida después de que los ratones fueran sacrificados por desangrado en el vigésimo primer día a partir del día del comienzo de la administración (el día siguiente al afeitado) y se homogeneizó, para preparar un extracto. La actividad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (actividad de G-6-PDH) en el extracto de la piel del lado posterior se ensayó usando un estuche de ensayo fabricado por la entidad ROCHE DIAGNOSTICS GmbH y la actividad de fosfatasa alcalina (actividad ALP) se ensayó usando un estuche de ensayo fabricado por la entidad Wako Pure Chemical Industies, Ltd. Incidentalmente, las actividades enzimáticas de G-6-PDH y ALP se conoce que aumentaron en los tejidos en los que se observó un efecto de restauración del pelo.
Los resultados se muestran en la Tabla 7. Las cifras numéricas en la Tabla están expresadas mediante un valor medio \pm error típico de 7 a 8 casos. Se muestra claramente en el grupo al que se administró 7-12SFd-F que las actividades enzimáticas aumentaron en los tejidos de la piel y que se favoreció una transición desde el telogen hasta el anagen, en comparación con el grupo testigo. A saber, se confirmó un efecto de restauración del pelo. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada Ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 7
17
(8) no es según la invención. veinticinco mujeres adultas con edades de 20 a 35 años fueron sometidos a un ensayo funcional ciego en el que la loción que contiene el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia de la presente invención descrito en el aparatado (1) del Ejemplo 5 se comparó con la loción testigo que no contenía fucoidano. Como consecuencia, el número de personas que se estimó "más eficaz" se muestra en la Tabla 8.
TABLA 8
18
Se muestra a partir de los resultados anteriores que la loción que contiene el fucoidano de la presente invención muestra excelentes resultados de los exámenes en todos los aspectos de humedad, suavidad y viveza de la piel, mostrando que la loción tiene una acción cosmética sobre la piel. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para cada loción que contenía los otros fucoidanos y un producto de degradación de los mismos. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares cosméticos sobre la piel.
(9) No es según la invención. Se prepararon 50 mililitros de una bebida refrescante que contenía 200 mg del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1 (solución de azúcar de malta al 3%; 0,05% de polvo Hume; 0,2% de jugo de limón claro 1/5 y 0,02% de anhídrido cítrico) y se estudió el efecto cosmético sobre la piel de esta bebida. Después de beber una bebida cada día durante 3 meses, se suprimió el prurito de la piel y pruritos de los ojos y se confirmó la reducción de pústulas. También, se observaron un aumento del pelo y una supresión del pelo que se volvía plateado. Adicionalmente, mejoró la sequedad de la piel.
Además, se llevaron a cabo ensayos similares para cada bebida que contenía los otros fucoidanos y un producto de degradación de los mismos. Como consecuencia, se confirmaron efectos similares cosméticos sobre la piel y efectos de restauración del pelo.
(10) No es según la invención. Usando el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1, se preparó la loción lechosa que tenía la siguiente composición. En este caso "parte(s)" representa parte(s) en peso.
100
101
Seis personas con piel sensible usaron la loción lechosa anterior dos veces al día, por la mañana y por la tarde, todos los días durante 3 meses. Como consecuencia, el estado de la piel mejoró en todos los miembros, sin desarrollar en absoluto acontecimientos no deseados como inflamación.
Ejemplo 14
No es según la invención
(1) se disolvieron 200 miligramos (1,1 mmol) de D-(+)-glucosa en 10 ml de piridina y se le añadieron 1,05 g (6,6 mmol) de complejo de piridina-trióxido de azufre (Pur\cdotSO_{3}: fabricado por la entidad Tokyo Kasei) a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante varios minutos y se agitó adicionalmente a 60ºC durante 1 hora. La solución de la reacción se diluyó con agua y el pH de la solución se ajustó hasta casi neutralidad con una solución acuosa saturada de hidróxido de bario y la solución resultante se secó seguidamente bajo presión reducida. Se añadió nuevamente agua al concentrado resultante y la solución resultante se secó nuevamente bajo presión reducida. Se repitieron una vez más estas etapas. Se añadió una pequeña cantidad de agua al concentrado resultante y los precipitados de sulfato de bario se separaron por centrifugación. La materia sobrenadante resultante se aplicó a una columna de intercambio catiónico [Amberlite IRA-120(Na^{+})(Organo)]. Finalmente, las fracciones efluentes de la columna resultante se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 700 mg de (-SO_{3}-Na^{+})D-(+)-glucosa sulfatada. También, se prepararon análogamente fucosa sulfatada, manosa sulfatada, galactosa sulfatada, xilosa sulfatada, 2-desoxiglucosa sulfatada y talosa sulfatada.
(2) Se estudió el efecto de restauración del pelo de la glucosa sulfatada preparada en el apartado (1) del Ejemplo 14 de la misma manera que en el apartado (3) del Ejemplo 13. En este caso, la glucosa sulfatada se disolvió en etanol al 50% a una concentración de 3% y la solución resultante se aplicó al lado posterior de los ratones una vez al día en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó solamente etanol al 50%. Como consecuencia, como se muestra en la Tabla 9, el grupo al que se administró glucosa sulfatada mostró un cambio en el color de la piel y una aceleración del crecimiento del pelo desde una etapa más temprana, conduciendo finalmente a un estado tricogenoso, en comparación con el grupo testigo. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para la fucosa sulfatada, la manosa sulfatada, la galactosa sulfatada, la xilosa sulfatada, la 2-desoxi-glucosa sulfatada y la talosa sulfatada. Como consecuencia, se confirmaron efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 9
19
Ejemplo 15
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(1) Se adquirieron ratones C3H/He de dos días de edad de la entidad Nippon SLC junto con los ratones madres y se usaron para un experimento a partir de los 5 días de edad. Los ratones fueron sacrificados por desangrado y los pelos de los bigotes junto con los tejidos subcutáneos se recogieron usando tijeras y pinzas. Adicionalmente, los pelos de los bigotes junto con los tejidos subcutáneos se recogieron usando tejeras y pinzas. Adicionalmente, los pelos de los bigotes con los folículos pilosos se separaron en un plato de petri bajo el microscopio según el método de Ogawa et al. (J. Invest. Dermatol 103: 306-309, 1994). Se recogieron de 14 a 16 pelos de bigotes de los lados derecho e izquierdo por ratón.
El fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) de Ejemplo 1 y 7-12SFd-F descrito en el aparatado (3) del Ejemplo 2 se disolvieron en un medio RPMI-1640 para preparar una solución que tenía una concentración de 20 veces la concentración dada y una cantidad de 1/20 veces de la solución se añadió al sistema de cultivo. Se añadió la misma cantidad del medio al grupo testigo. En este caso, las concentraciones dadas de cada muestra añadida se expresan respectivamente como la concentración por ml de medio (mg/ml) en la Tabla 10. Para el cultivo de los pelos de bigotes, se usaron platos de cultivo de tejidos Falcon 3037 (fabricados por la entidad Becton Dickinson Labware) y se colocaron 0,7 ml de un medio RPMI-1640 complementado con FCS al 20% en los pocillos centrales, y se colocó en los pocillos una malla de acero inoxidable esterilizada (fabricada por la entidad Ikeda Rika K.K.) y papel de lentes (fabricado por la entidad T.C. Case K.K.). Los pelos de bigote se pusieron en el papel y se cultivaron. Previamente se añadió al medio el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y 7-12SFd-F. El cultivo se llevó a cabo a 35ºC durante 6 días en presencia de 5% de SO_{2}. La longitud del pelo de bigote se determinó que era de aproximadamente 0,1 mm antes del comienzo y después de la terminación del cultivo bajo el microscopio, usando un calibrador. Se usaron 3 a 5 pelos de bigotes para la determinación por grupo de cada una de las concentraciones de las muestras y la longitud del pelo de bigote crecido se indicó como un valor medio \pm error típico. Además, se usó un ensayo de Student para ensayar el carácter significativo y el valor de P se determinó frente al grupo testigo. Los resultados se muestran en la Tabla 10.
TABLA 10
20
Como consecuencia, los pelos de bigotes de los ratones se hicieron crecer en los casos del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y 7-12SFd-F en una manera dependiente de la concentración en comparación con los del testigo. Dicho de otro modo, se pudo confirmar que el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y 7-12SFd-F tenían efectos de restauración del pelo. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
(2) Se adquirieron 2 ratones machos C3H/He de dos días de edad de la entidad Nippon SLC junto con los ratones madres y se usaron para un experimento a partir de 9 días de edad. Se evaluaron los efectos de restauración del pelo del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1 y 7-12SFd-F descrito en el apartado (3) del Ejemplo 2 de la misma manera que en el apartado (1) del Ejemplo 15. Los resultados se muestran en la Tabla 11.
TABLA 11
21
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Como consecuencia, en el caso en que se usaron los pelos de bigotes de ratones de 9 días de edad, los pelos de bigotes de ratones crecieron también significativamente en los casos del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y 7-12SFd-F en comparación con los del testigo. Dicho de otro modo, se pudo confirmar que el fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia y 7-12SFd-F tenían efectos de restauración del pelo. Además se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descritos en cada ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
Ejemplo 16
(1) Se pusieron en suspensión 30 gramos del fucoidano derivado de Kjellmaniella crassifolia descrito en el apartado (1) del Ejemplo 1 en 12 litros de agua destilada a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Esta suspensión se centrifugó a 10.000 x g durante 40 minutos y su materia sobrenadante se recogió. Esta materia sobrenadante se sometió a filtración esterilizada con un filtro de membrana (0,22 \mum) (fabricado por la entidad Millipore Corporation) para proporcionar 21,4 g de un producto liofilizado. El producto resultante se denominó TaKaRa Kombu Fucoidano Bf (en lo sucesivo denominado "Fucoidano Bf").
(2) Se cortaron 500 gramos de Kjellmaniella crassifolia seco en trozos delgados y se lavaron con 10 l de etanol al 805. Posteriormente, el producto resultante se agitó a 25ºC durante 3 días en 50 litros de etanol al 10% que contenía cloruro de potasio 1 mM y se filtró con malla de acero inoxidable que tenía un diámetro del tamiz de 32 \mum para proporcionar aproximadamente 45 litros de un filtrado. Se calentaron 34 litros de este filtrado a 80ºC durante 3 horas y posteriormente se enfrió a 50ºC. La solución resultante se concentró con un ultrafiltro OMEGA Cassette (fabricado por la entidad Litron) que tenía un peso molecular de exclusión de 10.000 con mantenimiento de la temperatura del líquido a 50ºC. Adicionalmente, el concentrado se desaló con 5 litros de agua destilada y se calentó a 50ºC y la trayectoria del flujo se lavó dos veces añadiendo 200 ml de la misma agua destilada y los líquidos de lavado se recogieron para proporcionar 1,5 litros de un concentrado. Este concentrado se liofilizó para proporcionar 8,2 g de fucoidano con elevado contenido de F.
(3) Se adquirieron ratones machos C3H/He de 2 días de edad de la entidad Nippon SLC junto con los ratones madres y se usaron para un experimento a partir de 14 días de edad. Se evaluaron los efectos de restauración del pelo para fucoidano Bf descrito en el apartado (1) del Ejemplo 16 y fucoidano con elevado contenido de F descrito en el apartado (2) del Ejemplo 16 de la misma manera que en el apartado (1) del Ejemplo 15. Se determinó la longitud del pelo del bigote hasta aproximadamente 0,1 mm antes del comienzo y después de la terminación del cultivo bajo el microscopio usando un calibrador y la longitud del pelo de bigote crecido se indicó mediante un valor medio \pm error típico. Además, se usó el ensayo de Student para ensayar el carácter significativo y se determinó el valor de P frente al grupo testigo. Los resultados se muestran en la Tabla 12.
TABLA 12
22
Como consecuencia, los pelos de bigotes de los ratones se hicieron crecer significativamente en los casos de fucoidano Bf y fucoidano con elevado contenido de F en comparación con los del testigo. Dicho de otro modo, se pudo confirmar que tenían efectos de restauración del pelo. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descrito en cada ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
Ejemplo 17
Se adquirieron ratones machos C3H/He de dos días de edad de la entidad Nippon SLC junto con los ratones madres y se usaron para un experimento a partir de 5 días de edad. Se evaluaron los efectos de restauración del pelo para el fucoidano con elevado contenido de F descrito en el apartado (2) del Ejemplo 16, el fucoidano derivado de esporofilo de Undaria pinnatifida descrito en el Ejemplo 6, el fucoidano derivado de Fucus vesiculosus descrito en el apartado 7, el fucoidano derivado de Nemacystus decipiens descrito en el Ejemplo 9 y el fucoidano derivado de Cladosiphon okamuranus descrito en el Ejemplo 12 de la misma manera que en el apartado (1) del Ejemplo 15. Los resultados se muestran en la Tabla 13.
TABLA 13
23
Como consecuencia, los pelos de bigotes de los ratones se hicieron crecer significativamente en los casos de estos fucoidanos en comparación con los del testigo. Además, los pelos de bigotes de los ratones se hicieron crecer especialmente bien en los casos de fucoidano con elevado contenido de F y el fucoidano derivado de Fucus vesuculosus. Dicho de otro modo, se pudo confirmar que la acción para el crecimiento de los pelos de bigotes de ratones puede ser fuerte o débil dependiendo de los tipos de fucoidanos, y que hay efectos más fuertes de restauración del pelo en el fucoidano con elevado contenido de F derivado de Kjellmaniella crassifolia y el fucoidano derivado de Fucus vesuculosus, en comparación con los de los demás. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para el fucoidano y un producto de degradación del mismo descrito en cada ejemplo. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos de restauración del pelo.
Ejemplo 18
No es según la invención
Se adquirieron ratones machos C3H/He de 2 días de edad de la entidad Nippon SLC junto con los ratones madres y se usaron para un experimento a partir de 6 días de edad. Se evaluó el efecto de restauración del pelo para la glucosa sulfatada descrita en el apartado (1) del Ejemplo 14 de la misma manera que en el apartado (1) del Ejemplo 15. Los resultados se muestran en la Tabla 14.
TABLA 14
24
Como consecuencia, los pelos de bigotes de los ratones se hicieron crecer significativamente en el caso de 1 mg/ml de glucosa sulfatada, en comparación con los del testigo. Dicho de otro modo, se pudo confirmar que la glucosa sulfatada tenía también un efecto de restauración del pelo en este sistema experimental. Además, se pudo confirmar que cada uno de los monosacáridos sulfatados descritos en el Ejemplo 14 tenía también un efecto similar.
Ejemplo 19
Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo del lado posterior de cada ratón se cortó con tijeras para el pelo y posteriormente se afeitó con una cuchilla. Se disolvieron fucoidano Bf descrito en el apartado (1) del Ejemplo 16 solo o fucoidano Bf y cloruro de carpronio o minoxidilo, que es un ingrediente eficaz de un producto para el cuidado del pelo disponible en el comercio, en una solución de etanol al 30% con el fin de tener una concentración como se muestra en la Tabla 15, para proporcionar cada solución en etanol. La solución en etanol resultante se aplicó al sitio de corte del pelo anterior del lado posterior de los ratones en una cantidad de 200 \mul por ratón. Al grupo testigo se le aplicó análogamente una solución en etanol al 30%. Se administró a los ratones una vez al día durante días consecutivos. Los sitios en los que se administró se observaron durante el transcurso del tiempo desde el día del comienzo de la administración (el día siguiente al afeitado) y el área tricogenosa se determinó en el vigésimo primer día después del afeitado y se expresó como la relación (%) respecto al área afeitada. El valor medio \pm error típico de 6 casos para cada grupo se muestra en la Tabla 15.
No se encontró ningún efecto de restauración del pelo mediante la administración por la aplicación de cloruro de carpronio, que es un ingrediente eficaz de un producto A para el cuidado del pelo disponible en el comercio, en este sistema experimental. Por lo tanto, no hubo diferencia con el grupo testigo. Sin embargo, el grupo al que se administró de forma combinada fucoidano Bf/cloruro de carpronio mostró un cambio en el color de la piel que se observó desde una fase más temprana, conduciendo finalmente a un estado tricogenoso. La relación tricogenosa fue también mayor que la del grupo testigo. No se encontraron individuos que mostraran una relación tricogenosa de 60% o más en el grupo testigo ni en el grupo al que se administró cloruro de carpronio, mientras que tales individuos fueron encontrados en 3 de cada 6 casos en el grupo al que se administró de forma combinada fucoidano Bf/cloruro de carpronio.
Por otra parte, se encontró un efecto de restauración del pelo aplicando un ingrediente eficaz de un producto B para el cuidado del pelo disponible en el comercio, minoxidilo, a una concentración de 1%. Se observó que la piel cambió de color a partir de una fase más temprana, que condujo finalmente a un estado tricogenoso. El efecto era débil a una concentración de 0,1%. Adicionalmente, en el grupo al que se administró de forma combinada fucoidano Bf/minoxidilo, se encontró que había una tendencia a aumentar el efecto de restauración del pelo. Específicamente, los individuos que mostraban una relación tricogenosa de 60% o más a la terminación del experimento se encontró que eran 4 de cada 6 casos en el grupo en el que se administró minoxidilo al 1%, mientras que 6 casos mostraron un estado tricogenoso en el grupo en que se administró de forma combinada fucoidano Bf/minoxidilo. Por otra parte, en el grupo al que se administró minoxidilo al 0,1% en el que el efecto era débil, esos individuos se encontraron solamente en uno de cada 6 casos, mientras que esos individuos se encontraron en 3 de cada 6 casos en el grupo al que se administró de forma combinada fucoidano Bf/minoxidilo.
Se observa a partir de lo anterior que el efecto de restauración del pelo fue sinérgicamente aumentado usando fucoidano Bf junto con minoxidilo o cloruro de carpronio. Además, se llevaron a cabo ensayos similares para cada uno de los otros fucoidanos, productos de degradación de fucoidanos. Como consecuencia, se obtuvieron resultados similares.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 15
25
Ejemplo 20
Se adquirieron ratones machos C3H/He de la entidad Nippon SLC y se usaron para un experimento a partir de 8 semanas de edad después de pre-criar los ratones. El pelo en el lado posterior de cada ratón se cortó con unas tijeras para el pelo y posteriormente se afeitó con una cuchilla. Se mezcló fucoidano Bf descrito en el apartado (1) del Ejemplo 16 con una base de ungüento [ungüento hidrófilo (fabricado por la entidad Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd.)] con el fin de tener una concentración de 3% y el ungüento resultante (ungüento de fucoidano) se aplicó al sitio de corte de pelo anterior del lado posterior de los ratones en una cantidad de 0,2 g por ratón. Al grupo testigo, se le aplicó análogamente solo la base del ungüento. A los ratones se les administró una vez al día durante días consecutivos. Los sitios de administración se observaron durante el transcurso del tiempo desde el día de comienzo de la administración (el día siguiente al afeitado) y se determinó un cambio en el tono de color de la piel mediante una puntuación. Específicamente, los criterios de puntuación se definieron como sigue: puntuación 0: ningún cambio, puntuación 1: el color de la piel comienza a cambiar a azul, puntuación 2: el color de la piel comienza a cambiar de negro-azul a gris, puntuación 3: se observa estado tricogenoso, puntuación 4: casi restaurado el estado antes del afeitado. La puntuación para cada grupo se expresa mediante un valor medio \pm error típico de 6 casos en la Tabla 16. Además, se determinó el área tricogenosa el vigésimo primer día después del afeitado y se expresó como la relación (%) respecto al área afeitada. Se usó un ensayo t de Student para ensayar el carácter significativo y se determinó el valor de P frente al grupo testigo. Los resultados se muestran en la Tabla 17. En este caso, la relación tricogenosa en la Tabla se expresa mediante un valor medio \pm error típico de 6 casos en cada grupo.
Como consecuencia, se encontró un considerable efecto de restauración del pelo aplicando el ungüento de fucoidano. Se observó un cambio en el color de la piel desde una fase más temprana en comparación con el grupo testigo, conduciendo finalmente a un estado tricogenoso. También, a la terminación del experimento, el estado anterior al afeitado se había restaurado en casi todos los casos. Además, se prepararon análogamente ungüentos usando el fucoidano y un producto de degradación del mismo descrito en cada Ejemplo, y se llevaron a cabo ensayos similares. Como consecuencia, se pudieron confirmar efectos similares de restauración del pelo.
TABLA 16
26
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TABLA 17
27
Materiales biológicos depositados (1) Nombre y dirección de la autoridad de depósito
Ministerio de Comercio e Industria Internacional, Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial
1,3, Higashi 1 Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón (código postal 305).
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(2) Microorganismos depositados (i)Alteromonas sp. SN-1009
Fecha original de depósito: 13 de febrero de 1996
Fecha de petición para la transferencia al depósito internacional: 15 de noviembre de 1996
Número de acceso: FERM BP-5747.
(ii)Flavobacterium sp. SA-0082
Fecha original de depósito: 29 de marzo de 1995
Fecha de petición de la transferencia a depósito internacional: 15 de febrero de 1996
Número de acceso: FERM BP-5402.
Aplicabilidad industrial
Según la presente invención se proporcionan bio-cosméticos que comprenden como un ingrediente eficaz un compuesto seleccionado entre un fucoidano o un producto de degradación del mismo, o una sal del mismo, en los que los bio-cosméticos son altamente seguros. Además, se proporcionan cosméticos que pueden ser usados como alimentos o bebidas para restaurar el pelo, que comprenden como un ingrediente eficaz un compuesto seleccionado entre un fucoidano o un producto de degradación del mismo, o una sal del mismo, y estos alimentos o bebidas son útiles como alimentos o bebidas funcionales que tienen una acción de restauración del pelo. Especialmente una bebida que comprende como un ingrediente eficaz un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo puede ser tomada diariamente como un producto para el cuidado del pelo para beber, de forma que la bebida es extremadamente útil en el mantenimiento del pelo, la nutrición del pelo o el aumento del pelo.
Además, usando el ingrediente eficaz anteriormente mencionado usado en la presente invención junto con el ingrediente eficaz del producto convencional para el cuidado del pelo (componente para aumentar la acción de restauración del pelo), puede ser sinérgicamente aumentada la acción de restauración del pelo. Por lo tanto, según la presente invención, se proporciona un producto para el cuidado del pelo que tiene una acción de restauración del pelo muy excelente en comparación con los convencionales, que comprende el ingrediente eficaz anteriormente mencionado y el componente para aumentar la acción de restauración del pelo.

Claims (6)

1. Un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo, como un medicamento para restaurar el pelo, en el que dicho producto de degradación es un compuesto seleccionado entre el compuesto representado por la siguiente fórmula:
28
en la que R es OH o OSO_{3}H;
29
en la que R es OH o OSO_{3}H; o
30
en la que R es OH o OSO_{3}H.
2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que el fucoidano se selecciona entre un fucoidano que comprende un sacárido sulfatado representado por la siguiente fórmula general, como un componente esencial de sacárido constituyente:
31
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
\vskip1.000000\baselineskip
32
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
\vskip1.000000\baselineskip
33
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más; o
\vskip1.000000\baselineskip
34
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más.
3. El compuesto según la reivindicación 1, en el que el fucoidano es un fucoidano no fibroso.
4. Un uso cosmético no terapéutico de una composición, que comprende un compuesto seleccionado entre un fucoidano, un producto de degradación del mismo o una sal del mismo, como una composición para restaurar el pelo, en el que dicho producto de degradación es un compuesto seleccionado entre el compuesto representado por la siguiente fórmula:
35
en la que R es OH o OSO_{3}H;
36
en la que R es OH o OSO_{3}H; o
37
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es OH o OSO_{3}H.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que el fucoidano se selecciona entre un fucoidano que comprende un sacárido sulfatado representado por la siguiente fórmula general, como un componente esencial de sacárido constituyente:
38
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
39
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más;
40
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más; o
41
en la que R es OH o OSO_{3}H y n es un número entero de 1 o más.
6. El uso según la reivindicación 4, en el que el fucoidano es un fucoidano no fibroso.
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