KR20210002047A

KR20210002047A - 삼치가수분해물의 항노화 효과 및 삼치가수분해물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20210002047A
Application number: KR1020200079273A
Authority: KR
Inventors: 변희국; 김용재
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2021-01-06
Also published as: KR102406037B1

Abstract

본 발명은 삼치 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼치 가수분해물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 가져 피부 노화 방지 효과를 나타냄으로써 의약품, 화장료 또는 건강식품에 사용할 수 있다.

Description

삼치가수분해물의 항노화 효과 및 삼치가수분해물을 포함하는 조성물{Composition for antiaging comprising hydrolysates from Scomberomorus niphonius}

본 발명은 삼치가수분해물을 포함하는 항노화용 조성물에 관한 것이다.

기능성 화장품은 피부노화를 지연시켜 피부의 주름개선에 도움을 주는 제품, 자외선 및 외부환경으로부터 피부를 보호하는 제품, 또는 피부의 미백에 도움을 주는 제품을 포함할 수 있다. 이러한 기능성 화장품의 개발을 위해서는 피부 내에서 생리적으로 효능을 나타낼 수 있는 기능성 원료의 개발이 선행되어야 한다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 된다. 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

피부 노화 현상에 대한 자세한 메커니즘으로는 각질형성세포 및 섬유아세포의 분열 감소, 콜라겐 합성의 감소, MMP (Matrix metalloproteinase)생성의 증가, 멜라닌 생성의 신호 전달 증가 등이 발생하게 되고, 이로 인하여 주름은 증가하게 되고 피부의 탄력은 감소하며, 기미, 주근깨 및 검버섯 등은 증가하게 된다. 특히, 40대 전후로 호르몬의 균형이 깨져 세포 재생 능력, 콜라겐의 합성 능력, 피부 보습에 중요한 역할을 하는 피부 지질의 생성 능력이 크게 저하된다. 또한, 폐경 후 첫 5년 동안 콜라겐은 약 30％ 감소하며, 이들 콜라겐 섬유들의 비정상적인 엉킴 현상이 증가하여 피부 탄력이 현저히 저하되며, 피부 속의 수분을 담당하는 히아루론산과 당단백질의 일종인 글리코스아미노글리칸의 생성량이 현저히 저하된다고 알려져 있다.

한편, 자외선은 반복적으로 스트레스 호르몬을 활성화하여 피부에 해를 입힌다. 이는 스테로이드를 피부에 과량 도포하였을 시와 동일하게 진피 섬유 조직의 붕괴와 같은 피부 부작용을 가져올 수 있다. 자외선 자극은 사람 피부에서 코티졸 과 같은 스트레스 호르몬으로 알려져 있는 글루코코르티코이드 활성의 주요 원인이다. 또한 이는 코티졸 을 활성화하는 인체 내 효소인 11β-하이드록시스테로이드 디하이드로게나아제 타입 1(11β-HSD1)의 발현을 증가시킨다. 자외선에 의한 11β-HSD1의 활성 및 발현 증가는 피부 노화와 밀접한 관련이 있기 때문에 피부 노화 억제를 위한 새로운 타겟으로 주목되고 있다.

본 발명은 삼치가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 삼치 가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 항산화용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 삼치 가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 삼치 가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 삼치 가수분해물은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 피부 노화 방지 또는 항산화 효과를 나타냄으로써 의약품, 화장료 또는 건강식품에 사용할 수 있다.

도 1은 삼치(Scomberomorus niphonius) 껍질 펩신 가수분해물 활성 획분의 분리ㆍ정제도이다.
도 2 및 3은 삼치 껍질 펩신 가수분해물의 CM-cellulose 활성 획분을 HPLC를 이용하여 분리한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 삼치 껍질(a), 근육(b), 전어체(c)의 펩신 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 삼치 껍질의 아미노산 조성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6 및 도 7은 삼치 껍질 펩신 가수분해물의 HPLC 획분별 DPPH 라디칼 소거 활성 EC₅₀ 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 삼치 껍질 펩신 가수분해물의 CM-cellulose 활성 획분의 Raw 264.7 macrophage cell에 대한 세포독성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 삼치 껍질 펩신 가수분해물의 CM-cellulose 활성 획분의 Raw 264.7 macrophage cell에서 과산화수소에 의해 유도되는 DNA 손상 보호 효과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 삼치 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 삼치 가수분해물의 제조 시에는 건조 또는 미건조시킨 삼치 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 삼치의 껍질, 근육 및 전어체로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 사용하여 가수분해물을 제조할 수 있다. 가수분해의 효율성을 위해 삼치는 잘게 부수어 사용할 수 있다. 또한, 효과적인 피부 노화 방지 또는 항산화용 삼치 가수분해물을 얻기 위해, 삼치의 분쇄 전에 약 100℃의 높은 온도에서 약 5분간 블랜칭(blanching)을 수행하여 세포 내 효소를 불활성화시키는 과정을 거칠 수 있다.

본 발명에서 삼치 가수분해물은 효소를 사용하여 제조할 수 있으며, 효소는 알카레이즈(alcalase), 알파-키모트립신(alpha-chymotrypsin), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin) 및 트립신(trypsin)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 삼치의 가수분해는 통상적인 가수분해 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명에서는 삼치 가수분해물에 대해 이온교환, LH-세파덱스, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 분리를 이용하여 정제함으로써 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 본 발명에 있어서, '삼치 가수분해물'은 이와 같이 가수분해, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 가수분해물, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 포함한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 삼치 가수분해물은 삼치를 펩신으로 가수분해하고, 상기 가수분해물을 이온교환수지로 정제한 분획일 수 있다. 또한, 상기 분획에 대해 HPLC를 사용하여 추가 분리할 수 있다.

하기 실시예에서는 이러한 추가적인 정제과정을 통해 가수분해물로부터 피부 노화 방지 또는 항산화 활성을 나타내는 분획을 제조하였다.

본 발명은 또한 삼치를 효소로 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 실시예에서는, 삼치의 껍질, 근육 또는 전어체를 펩신으로 가수분해하여 얻은 가수분해물을, 이온교환수지 및 HPLC로 추가 분리하고 정제하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 본 발명의 가수분해물 및 가수분해물 분획은 우수한 피부 노화 방지 또는 항산화 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 삼치 가수분해물, 분획은 피부 노화 방지 또는 항산화의 유효성분으로 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, "피부 노화 방지 또는 항노화" 효과는, 노화에 따른 피부 세포 및 조직의 변화를 늦추거나 예방하는 모든 기작을 의미하며, 상기 노화에 따른 피부 세포 및 조직의 변화는 예를 들어, 피부 조직의 수분 보유량 감소, 피부의 탄력에 관계된 콜라겐과 엘라스틴 등의 합성이 저하되는 것일 수 있다. 본 발명에서는 특히 피부탄력 개선 또는 주름 개선 효과를 의미할 수 있으며, 바람직하게는, DPPH 라디칼 소거 활성 효과를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "항산화" 효과는 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명의 조성물은, DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 피부 노화 방지 효과 또는 항산화 효과를 나타냄으로써 의약품, 화장료 또는 건강식품에 사용할 수 있다.

상기 조성물은 본 발명의 유효성분뿐만 아니라 기존에 공지된 피부 노화 방지 및 항산화 성분과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 삼치 가수분해물을 유효 성분으로 포함하는 의약 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 의약 조성물 내의 삼치 가수분해물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태, 투여 방법 및 제제의 형태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 10 중량부 또는 0.001 내지 1 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

상기 의약 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 의약 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 노화 방지 또는 항산화용 피부 외용제의 제형으로 제공할 수 있다.

피부외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 피부 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

또한, 피부 외용제로 제공될 경우, 이에 제한되는 것은 아니나, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제 등의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 삼치 가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물을 화장품으로 사용하는 경우, 상기 삼치 가수분해물을 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 또는 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수; 훼이셜 로션 또는 바디로션 등과 같은 유액; 영양 크림, 수분 크림 또는 아이 크림 등과 같은 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제; 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 상기 화장품은 삼치 가수분해물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 유화제, 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 활성제, 친유성 활성제 또는 지질 소낭 등 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제 또는 세정제와 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 삼치 가수분해물을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림 또는 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 삼치 가수분해물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 삼치 가수분해물을 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.0001 중량% 내지 1 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 삼치 가수분해물을 0.0001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 노화 방지 또는 항산화 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 삼치 가수분해물을 포함하는 피부 노화 방지 또는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 ‘식품 조성물’이란, 상기 삼치 가수분해물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 의약 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 삼치 가수분해물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 삼치 가수분해물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 통상 0.01 내지 50 중량부 또는 0.1 내지 20 중량부의 범위이다. 또한 과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량부, 또는 0.5 내지 80 중량부의 범위에서 첨가하면 된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물은, 추가로 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류 또는 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 이들의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법을 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 청구항의 범위에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1: 삼치 가수분해물의 제조

삼치(Scomberomorus niphonius)의 껍질(skin), 근육(muscle) 및 전어체(whole body)를 사용하여 가수분해물을 제조하였다.

상기 껍질, 근육 및 전어체에 알카레이즈(alcalase), 알파-키모트립신(alpha-chymotrypsin), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin)을 처리하였다.

실시예 2: 이온교환 및 HPLC 법을 이용한 분리정제

실시예 1에서 분리한 가수분해물의 분리 정제는 도 1의 모식도와 같이 수행하였다.

이온 교환 컬럼 CM(CM-cellulose) 카트리지 및 QMA 카트리지를 사용하여 삼치 가수분해물을 정제하고, 이후, HPLC로 분획(Fh1 ~ Fh7)을 분리 하였다.

구체적으로 CM-cellulose의 활성 획분인 CMF1에 대하여 HPLC을 이용하여 획분을 분리하였다. 상기 분리는 1.0 mL/분의 유속 및 YMC-Triart C18, ø 10.0 Х 250 mm, 5μm에서 아세토니트릴의 계단식 구배로 분리를 수행하였다. 용출은 215 nm(A) 및 280nm(B)에서 모니터링 하였다(도 2 및 3).

실험예 1. 삼치 가수분해물의 수율 측정

실시예 1에서 분리된 삼치 껍질, 근육 및 전어체의 가수분해물의 수율을 측정하였다.

측정 결과를 표 1에 나타내었다.

실험예 2. 삼치 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

실시예 1에서 분리된 삼치의 껍질, 근육 및 전어체의 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였다.

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)는 보라색의 안정한 유리기로 항산화제와 반응하면 수소를 받아 환원되어 탈색되는 물질이다. 이와 같은 원리를 이용하여 시료의 DPPH 라디칼 소거 활성을 비교함으로써 이들의 항산화 능력을 평가할 수 있다. 라디칼 소거 활성(%)이 높을수록 시료의 항산화능이 높다고 해석할 수 있다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 먼저, DPPH 4 mg을 메탄올 10 ml에 녹여 DPPH 용액을 만들고, 실시예의 조성물을 100 μg/ml의 농도로 에탄올에 희석하였다. 상기 조성물이 포함된 에탄올 1 ml와 DPPH 용액 1 ml을 잘 섞은 후 37℃에서 30분 정치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 에탄올을 사용하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성은 다음의 식으로 계산하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 = (1 - (시료의 흡광도/대조군의 흡광도)) × 100

도 4는 삼치의 껍질, 근육 및 전어체의 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성으로, a는 껍질, b는 근육 및 c는 전어체 가수분해물의 활성을 나타낸다.

상기 도 4에 나타난 바와 같이, 삼치의 껍질을 사용하고 가수분해 효소로 펩신(pepsin)을 사용할 때 DPPH 라디칼 소거 활성이 높은 것을 확인할 수 있다.

또한, 하기 표 2는 삼치 껍질, 근육 및 전어체의 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성 EC₅₀을 측정한 결과를 나타낸다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 삼치의 껍질을 사용할 경우 DPPH 라디칼 소거 활성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 삼치의 일반성분 및 아미노산 조성 분석

삼치 껍질의 일반성분 및 아미노산 조성을 분석하였다.

하기 표 3 및 도 5는 삼치 껍질의 일반성분 및 아미노산 조성을 나타낸다.

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 삼치 껍질의 성분은 단백질이 가장 많은 부분을 차지하며, 도 5에 나타난 바와 같이, 아미노산은 Gly, Ala, Glu 등의 순으로 구성된 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 삼치 가수분해물의 획분 별 DPPH 라디칼 소거 활성 측정

펩신(pepsin)을 사용하여 삼치의 껍질을 가수분해하여 제조한 삼치 껍질 가수분해물(이하, 삼치 껍질 펩신 가수분해물)의 이온교환컬럼 CM-cellulose, QMA 획분별 DPPH 라디칼 소거 활성 EC₅₀을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타난 바와 같이, CMF1 획분의 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.

또한, HPLC 획분별 DPPH 라디칼 소거 활성 EC₅₀을 측정하였다.

그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5는, 구체적으로, 삼치 껍질 펩신 가수분해물을 CM-cellulose 컬럼으로 분리한 후, 우수한 항산화 활성을 나타내는 CMF1 획분에 대해 HPLC으로 분리한 후 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이, Fh4 획분의 DPPH 라디칼 소거 활성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.

한편, 도 6은 강력한 항산화 활성을 가지는 Fh4 획분에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸다. 1.0 mL/min 및 YMC-Triart C18, ø 10.0 Х 250 mm, 5μm에서 60분 동안 20 %의 아세토니트릴의 선형 구배로 분리를 수행했으며, 280 nm에서 용출을 모니터링 하였다.

또한, 도 7은 Fh4-1의 분자 질량 및 아미노산 서열의 확인한 결과를 나타낸다.

실험예 5. 삼치 가수분해물의 세포 독성 측정

삼치 껍질 펩신 가수분해물의 CM-cellulose 활성 획분에 대한 Raw 264.7 macrophage cell에 대한 세포독성을 측정하였다(MTT assay).

샘플 농도는 125, 250, 500, 1000 및 2000 μg/mL로 하여 Raw 264.7 세포의 생존력을 측정하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 나타난 바와 같이, 활성 획분은 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있다.

실험예 6. 삼치 가수분해물의 DNA 손상 보호 효과

삼치 껍질 펩신 가수분해물의 CM-cellulose 활성 획분에 대한 Raw 264.7 macrophage cell에서 과산화수소에 의해 유도되는 DNA 손상 보호 효과를 측정하였다.

샘플 농도는 50, 100, 및 200 μg/mL로 하여 Raw 264.7 세포에서 측정하였다. 대조군(Control)은 증류수(distilled water)를 사용했으며, Blank는 미처리 샘플(Untreated sample) 및 H₂O₂ ^-를 나타낸다.

그 결과를 도 9에 나타내었다.

상기 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 활성 획분은 과산화수소에 의해 유도되는 DNA 손상 보호 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다.

Claims

삼치 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
삼치 가수분해물은 삼치의 껍질, 근육 또는 전어체의 효소적 가수분해물인 피부 노화 방지용 약학적 조성물.
제 2 항에 있어서,
효소는 알카레이즈(alcalase), 알파-키모트립신(alpha-chymotrypsin), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin) 및 트립신(trypsin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 것인 피부 노화 방지용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
삼치 가수분해물은 삼치를 효소로 가수분해하고, 상기 가수분해된 가수분해물을 이온교환수지로 정제한 것인 피부 노화 방지용 약학적 조성물.
삼치 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
삼치 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 건강기능식품.