DE69315911T3

DE69315911T3 - Stärke mit geringem Gehalt an Amylopektin

Info

Publication number: DE69315911T3
Application number: DE69315911T
Authority: DE
Inventors: Virgil Decatur Fergason; Roger Bridgewater Jeffcoat; John E. Denver Fannon; Teresa A. Clark Capitani
Original assignee: National Starch and Chemical Investment Holding Corp
Current assignee: Brunob II BV
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-25
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2013-08-26
Also published as: DK0584809T4; ATE161545T1; EP0584809B1; DE69315911D1; CA2104851A1; DE69315911T2; AU649374B2; AU4452793A; EP0584809B2; US5300145B1; MX9305232A; US5300145A; JPH0751602B2; EP0584809A2; JPH06172402A; EP0584809A3; CA2104851C

Description

Diese Erfindung betrifft eine Stärke mit geringem Amylopektingehalt, die einmalige molekulare und funktionelle Eigenschaften aufweist. Die Stärke kann aus einer Anzahl von Quellen erhalten sein, einschließlich einer neuen Maiszüchtungspopulation, die Keimplasmaselektionen umfaßt, die für das rezessive (ae)-Gen, das für hohe Amylsosegehalte steht (im folgenden der Einfachheit halber als "Amyloseextendergen" bezeichnet), homozygot sind, und in welchen ae-modifizierende Gene durch Wiederholungsselektion akkumuliert worden sind.
Stärken mit hohem Amylosegehalt sind seit vielen Jahren bekannt. Derartige Stärken sind aus einmaligen Züchtungsquellen gewonnen worden, wie z. B. Hochamylosemais-Inzuchtlinien und ihren Hybriden, Kichererbsenkulturformen, Hochamylosegerstekulturformen und dergleichen. Die aus diesen Quellen erhaltenen Stärken sind kommerziell aufgrund ihrer einmaligen funktionellen Eigenschaften, z. B. einer überlegenen Filmbildungsfähigkeit, höherer Kochtemperatur, höherer Gelfestigkeit, verbesserter Wasserbeständigkeit, und anderen dem im Vergleich zum Amylopektingehalt höheren Amylosegehalt zugeschriebenen Eigenschaften dieser Stärken genutzt worden. Amylose ist ein lineares Polymer; Amylopektin ist ein größeres verzweigtes Polymer von Glucose.
Der Amylosegehalt von aus der Natur erhaltenen Stärken variiert erheblich, bleibt jedoch für die Mehrzahl von aus landwirtschaftlichen Nutzpflanzen hergeleiteten Stärken bei weniger als einem Drittel des Gesamtstärkegehaltes. Der Rest der Stärke wird im allgemeinen als Amylopektin beschrieben.
Bisher wurden kommerziell erhältliche Hochamylosestärken entweder als eine Stärke mit 50 oder 70% Amylosegehalt gehandelt. Ein Bereich von 40 bis 75% Amylose ist für kommerzielle Produkte berichtet worden. Die Existenz von Hochamylosemaisstärken, die bis zu 88% Amylose enthalten, ist in wissenschaftlichen Veröffentlichungen offenbart worden. Die Fachwelt akzeptiert jedoch allgemein, daß früher zum Isolieren und Analysieren von Hochamylosestärken auf Amylosegehalt angewendete Verfahren fehlerhaft waren, und frühere Berichte eines Amylosegehaltes von mehr als 70% werden mit Skepsis gesehen. Der Amylosegehalt ist als "offensichtliche Amylose" beschrieben worden, weil verzweigte Moleküle mit langen Außenketten eine Überbewertung des Amylosegehaltes durch potentiometrische Iodanalyse ergeben. Vgl. Shannon, J. C. und Garwood, D. L., Kapitel 3 in Starch: Chemistry and Technology, 2. Aufl., Whistler, R. L., BeMiller, J. N., und Paschall, E. F., Herausgeber, Academic Press, Orlando, Florida (1984) Seiten 54–59. Diese Veröffentlichung legt auch nahe, daß das Vorliegen von Amylose mit niedrigem Molekulargewicht zu einer Unterbewertung des Amylosegehaltes führen kann. Man weiß, daß zusätzlich zum Versuchsfehler die Lokalisation des Kornes auf dem Kolben, Wachstumsbedingungen, der Ort des Wachstums und andere Pflanzenvariablen den Amylosegehalt beeinflussen. Ungünstige Wachstumsbedingungen (z. B. Dürre) verringern bekanntlich den Amylosegehalt um bis zu 7,7% in einer aus dem Korn von Hochamylosemaispflanzen extrahierten Stärke. Vgl. z. B. V. L. Fergason, et al., CroP Sci, 5: 169 (1965).
Die WO 94/03049 offenbart Hybridmaissamen, die eine Stärke mit einem Amylosegehalt von 80% oder mehr liefern. Ebenfalls offenbart sind Stärken mit diesem Amylosegehalt. Das Verfahren, nach dem die Amylose bestimmt wird, bedient sich der colorimetrischen Iodbestimmung.
Nachdem verläßlichere Analysemaßnahmen entwickelt worden sind, hat sich gezeigt, daß kommerzielle Hochamylosestärken, die von Maishybriden abgeleitet sind, mindestens 25% Amylopektin und typischerweise nicht mehr als 75% Amylose enthalten, bestimmt durch potentiometrische und colorimetrische Iodanalyse.
In den sechziger und frühen siebziger Jahren haben C. T. Greenwood, G. K. Atkins, W. Banks und andere an einer Studie der chemischen Struktur der aus Hochamylosepflanzenquellen erhaltenen Stärke zusammengearbeitet. Die Arbeit beinhaltete die Fraktionierung der Hochamylosemaisstärke in verschieden molekulare Komponenten und physikalische, enzymatische und chemische Analysen der Feinstruktur der Stärke. Es wurde keine Ausschlußchromatographie oder andere ähnliche Molekulargewichtsanalysen des Amylopektingehaltes berichtet. Die an der Studie Beteiligten verwendeten kommerziell erhältliche Stärken mit einem "offensichtlichen Amylose"-Gehalt von etwa 50 bis 7–5%. Ihre Arbeit ist in den folgenden Publikationen berichtet:

Greenwood, C. T., und J. Thomson: Chem. Ind. (1960), 1110; Greenwood, C. T., und J. Thomson: Biochem. J. 82 (1962), 156;
G. K. Adkins und C. T. Greenwood, Stärke, 18 (1966) 171; Greenwood, C. T., und S. MacKenzie: Carbohydrate Res. 3 (1966), 7:
G. K. Adkins und C. T. Greenwood: Stärke, 18 (1966) 237; G. K. Adkins und C. T. Greenwood: Stärke, 18 (1966) 240;
G. K. Adkins und C. T. Greenwood: Carbohydrate Res. 3, (1966), 81;
G. K. Adkins und C. T. Greenwood: Carbohydrate Res. 3, (1966), 152;
Banks, W., und C. T. Greenwood: Carbohydrate Res. 6, (1968), 241;
G. K. Adkins und C. T. Greenwood: Carbohydrate Res. 11, (1969), 217;
G. K. Adkins und C. T. Greenwood and D. J. Hourston: Cereal Chem. 47 (1970), 13;
Banks, W., C. T. Greenwood und D. D. Muir: Stärke 23 (1971), 199;
Greenwood, C. T. und D. J. Hourston: Stärke 23 (1971), 344; und
Banks, W., C. T. Greenwood and D. D. Muir: Stärke 26 (1974), 289

In ihren Veröffentlichungen identifizierten die Beteiligten das Vorliegen eines Stärkebestandteils mit niedrigerem Molekulargewicht zusätzlich zu den normalen Amylose- und Amylopektinbestandteilen. Die Forscher berichteten, daß – obwohl die Zusammensetzung dieser niedrigermolekularen Fraktion nicht vollständig verstanden und charakterisiert war – die Fraktion eine niedermolekulare, lineare, amyloseartige Komponente zu sein schien. Diese Fraktion bildete einen Komplex mit Iod, was typisch für Amylose (und atypisch für Amylopektion) war. Die Forscher waren sich nicht sicher, ob die niedermolekulare Fraktion verzweigte Moleküle enthielt. Der Amylosegehalt ("Normalamylose") lag nicht über 65%, selbst in einer Probe mit einem "offensichtlichen Amylose"-Gehalt von 75%. Die Forscher offenbarten die Schwierigkeit beim vollständigen Löslichmachen der Hochamylosestärken. Sie legten nahe, daß der in der Literatur berichtete Amylosege halt der Stärken überbewertet worden war und stellten fest, daß der den Iodaffinitätsmessungen des Amylosegehaltes inhärente Fehler zu einer Unfähigkeit führte, die Iodbindungsergebnisse durch Messungen mit anderen Techniken, z. B. Butanolkomplexbildung und -fraktionierung, oder enzymatische Charakterisierung zu bestätigen. Sie schlossen jedoch aus der Butanolfraktionierung, Iodbindung und Enzymstudien, daß ein Amylopektingehalt von nur 4% der Gesamtstärke in einer Stärke mit "75% offensichtlicher Amylose" (65% "Normalamylose") festgestellt worden war.
Ähnliche Schwierigkeiten bei der Messung des Amylosegehaltes (sowohl in üblichen als auch Hochamylosestärken) sind anderswo berichtet worden. Vgl. z. B. A. H. Young, Kapitel 8 in Starch: Chemistry and Technology, supra Seiten 249–265, 274–277 und 282.
Durch Anwendung verläßlicherer Meßtechniken (z. B. Vollstärkedispersion, gefolgt von Butanolfraktionierung und Ausschlußchromatographie) wurde nun herausgefunden, daß eine Maisstärke, die mehr als 75%, fakultativ mehr als 85%, normale Amylose zusammen mit etwa 8 bis 25% niedermolekularer Amylose und weniger als 10%, fakultativ weniger als 5%, Amylopektin, alle bestimmt mit der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie, enthält, aus einer neuen Maiszüchtungspopulation mit einem rezessiven Amyloseextendergen extrahiert werden kann. Die Maispopulation ist ein genetisches Komposit, umfassend Keimplasmaselektionen, die für das ae-Gen homozygot sind und in die ae-modifizierende Gene durch Wiederholungsselektion akkumuliert worden sind. Die "ae-modifizierenden Gene" sind Nebengene, die epistatisch mit dem ae-Gen zur Produktion von Hochamylosesamenstärke wechselwirken. Es ist gefunden worden, daß diese "ae-Stärke" einmalige funktionelle Eigenschaften im Vergleich zu Hochamylosestärke mit 50 oder 70% Amylose sowie im Vergleich zu üblicher Maisstärke oder Wachsmaisstärke (100 Amylopektion) aufweist.
Es ist weiter gefunden worden, daß bei Herstellung eines Stärkegemisches aus Nicht-ae-Stärkefraktionen zur Nachahmung der molekularen Zusammensetzung der ae-Stärke, die von der Maiszüchtungspopulation abgeleitet ist, ein derartiges Stärkegemisch ähnliche funktionelle Vorteile bei verschiedenartigen Anwendungen zeigt.
Schließlich ist gefunden worden, daß eine im Wesentlichen reine Maisstärke, extrahiert aus einer pflanzlichen Quelle, die einen Genotyp aufweist, der für hohe Amylosegehalte steht, wobei die Stärke weniger als 10% Amylopektin und 5 bis 15% niedermolekulare Amylose enthält, wobei die niedermolekulare Amylose im Wesentlichen lineare Polymere mit 30 bis 250 Anhydroglucoseeinheiten, die im Wesentlichen durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden sind, darstellt, beide bestimmt mit der in der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie, einmalige funktionelle Eigenschaften aufweist, die bei vielen kommerziellen Anwendungen ausgenutzt werden können, wo Stärken und andere Polysaccharide und mehrwertige Alkohole traditionellerweise verwendet worden sind.
Die Erfindung stellt eine Maisstärke bereit, abgeleitet von einer Maiszüchtungspopulation, die ein genetisches Komposit von Keimplasmaselektionen ist, wobei die Maisstärke weniger als 10% Amylopektin und 5 bis 15% niedermolekulare Amylose enthält, beide bestimmt mit der in der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie. Die Maisstärke mit niedrigem Amylosepectingehalt enthält vorzugsweise mindestens 75% normale Amylose, gegebenenfalls 85% Amylose, bestimmt mit der in der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie. Die Stärke wird vorzugsweise in im wesentlichen reiner Form aus dem Korn einer stärketragenden Pflanze extrahiert, die einen rezessiven Genotyp, der für hohe Amylosegehalte steht, gekoppelt mit zahlreichen Genen, die den Genotyp hoher Amylosegehalte modifizieren, aufweist.
Die maisstärketragende Pflanze, aus der die Stärke extrahiert wird, eine Maispflanze.
In einem anderen Aspekt dieser Erfindung wird eine Maisstärkezusammensetzung bereitgestellt, die mindestens 75% Amylose, nicht mehr als 10% Amylopektin und bis zu 25% niedermolekulare Amylose, alle bestimmt mit der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie, enthält. Eine derartige Stärkezusammensetzung kann aus einem genetischen Komposit von Keimplasmaselektionen oder aus Stärkefraktionen erhalten werden, die aus zwei oder mehreren Stärkequellen extrahiert und in den angemessenen Verhältnissen kombiniert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Stärke im wesentlichen aus 80% normaler Amylose, 5% Amylopektion und 15% niedermolekularer Amylose, alle bestimmt mit der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie, stärker bevorzugt 87% normale Amylose, 2% Amylopektin und 11% niedermolekularer Amylose.
Die erfindungsgemäßen Stärken sind durch schnelle Gelbildung gekennzeichnet und ergeben so eine hohe Gelfestigkeit mit federnden, elastischen Eigenschaften.
1 ist eine Diagramm, das die Geschwindigkeit der Gelierung und Gelsteifheit der erfindungsgemäßen Stärken veranschaulicht. Das Diagramm zeigt auch die Geleigenschaften einer kommerziellen Maisstärkegelkontrolle mit 70% Amylosegehalt. Die Beschreibungen dieser Proben und das zum Messen der Geleigenschaften angewendete Testverfahren sind im folgenden Beispiel 5 angegeben.
Die Stärke wird vorzugsweise aus der hier beschriebenen modifizierten ae-Maispopulation erhalten. Es können jedoch auch Stärken aus anderen Pflanzenquellen zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sein; auch Stärkezusammensetzungen, die aus mehr als einer Stärkequelle gemischt oder formuliert sind, sind zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet, vorausgesetzt, die Zusammensetzung ist auf die richtigen Verhältnisse von Amylose, Amylopektin und niedermolekularer Amylose eingestellt worden. Die Pflanze mit dem ae-Genotyp, aus der die Stärke extrahiert ist, kann durch Standardzüchtungsverfahren oder durch Translokation, Inversion oder irgendein anderes Verfahren der Chromosomgentechnik erhalten werden, einschließlich Variationen derselben, wodurch die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Stärke erhalten werden. Jede Pflanzenquelle, die Stärke produziert und die zur Produktion einer Pflanze mit homozygotem ae-Genotyp gezüchtet werden kann, kann verwendet werden.
STÄRKE MIT GERINGEM AMYLOPEKTINGEHALT
Stärke ist ein Polysaccharid, das typischerweise eine Mischung von Amylose- und Amylopektinmolekülen umfaßt, die zu kompakten granularen Strukturen organisiert sind. Die hier verwendete Bezeichnung "Stärke" bezieht sich auf Stärke in ihrer nativen Form sowie auf eine durch physikalische, chemische und biologische Verfahren modifizierte Stärke. Amylose ist ein lineares Polymer aus D-Anhydroglucoseeinheiten, die durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden sind. Amylopektin ist ein größeres, verzweigtes Polymer aus Amyloseketten, die durch alpha-1,6-D-Glucosidbindungen zu einer baumartigen Struktur verbunden sind. In Abhängigkeit vom Genotyp, aus welchem die Stärke erhalten ist, enthält Amylose üblicherweise zwischen 250 und 12.500 D-Anhydroglucoseeinheiten (Gelpermeationschromatographie ("GPC") Peakmolekulargewicht etwa 200.000) ("normale Amylose"), und Amylopektin enthält zwischen 400.000 und 3.125.000 D-Anhydroglucoseeinheiten (gewichtsgemitteltes Molekulargewicht größer als etwa 1.500.000 durch GPC). Die hier verwendete Bezeichnung "niedermolekular Amylose" bezieht sich auf im wesentlichen lineare Polymere, die etwa 30 bis 250 Anhydroglucoseeinheiten enthalten (GPC Peakmolekulargewicht etwa 15.000), im wesentlichen durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden.
Die hier verwendete Bezeichnung Stärke bedeutet nicht nur im wesentlichen reine Stärkekörner, wie sie aus einer stärketragenden Pflanze extrahiert sind, sondern auch Kornprodukte des Stärkekornes, wie z. B. Mehl, Grütze, Maismehl und Schrotmehl. Die Stärke kann in Form einer granularen oder gelatinierten Stärke (eine vorgekochte, in kaltem Wasser quellende Stärke) vorliegen.
Die Stärkekomponenten, die zur Herstellung von Stärkegemischzusammensetzungen mit niedrigem Amylopektiongehalt verwendet werden können, können aus jeder Quelle einschließlich Mais, Kartoffeln, Süßkartoffeln, Weizen, Reis, Sago, Tapioka, Wachsmais, Sorghum, Hirse, Hafer, Gerste, Erbsen, und dergleichen und Mischungen davon und ihren vorgelatinierten oder thermisch behandelten Produkten abgeleitet sein. Das Gemisch kann geringe Mengen anderer Stärken, z. B. modifizierter Stärken, enthalten, vorausgesetzt, daß derartige Stärkekomponenten die wesentlichen funktionellen und molekularen Eigenschaften des Gemisches nicht verändern.
Die Stärken mit geringem Amylopektingehalt dürfen nicht mehr als 10% Amylopektin und 5 bis 13% nidermolekulare Amylose enthalten, beide bestimmt mit der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie. Die Maisstärke mit niedrigem Amylosepectingehalt enthält vorzugsweise mindestens 75% normale Amylose, gegebenenfalls 85% Amylose, bestimmt mit der nachstehend unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie.
Für die Butanolfraktionierung wird die Stärke vorzugsweise aus Maiskörnern in einer kommerziellen oder Pilotanlagenmenge (z. B. 300 lbs) zur Erzielung einer repräsentativen Probe gemahlen, die extrahierte granulare Stärke wird entfettet und vollständig löslich gemacht (z. B. durch Lösen in Dimethylsulfoxid(DMSO)-Lösungsmittel), um die Stärkekörner zu lösen und die Stärkemoleküle vollständig zu dispergieren. Die Stärke wird aus der DMSO-Lösung vorzugsweise durch Ethanolausfällung entfernt.
Nach Abtrennung der Stärke aus dem Ethanol wird der Amyloseanteil der Stärke aus dem Amylopektin durch Komplexbildung mit 1-Butanol, gefolgt von Zentrifugieren bei etwa 10.000 g, entfernt, unter wiederholten Schritten des erneuten Lösens und der erneuten Komplexbildung, um die vollständige Trennung der Amylosefraktion zu gewährleisten.
Die Fraktionierung erfolgt unter einer inerten Atmosphäre (und nach Entfetten der Stärke), um einen Stärkeabbau zu vermeiden. Die überstehenden Fraktionen werden gesammelt, und der endgültige kombinierte Überstand wird mit Ethanol und/oder Aceton zur Ausfällung der nicht komplexbildenden Stärke behandelt.
Für die Ausschlußchromatographie wird die Gelpermeationschromatographie, wie sie hier im Abschnitt der Testverfahren beschrieben ist, zur Bestätigung des Amylose- und Amylopektingehaltes von Stärkezusammensetzung mit niedrigem Amylopektingehalt, gefolgt von Butanolfraktionierung, bevorzugt.
Durch Anwendung dieser Techniken ist der Fachmann leicht in der Lage, die erfindungsgemäßen Stärken zu identifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform erhält man eine Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt aus einer Kompositpopulation der hier offenbarten ae-Keimplasmaselektionen. Eine solche "ae-Stärke" umfaßt mindestens 75% normale Amylose, weniger als 10% Amylopektin und etwa 8 bis 25% niedermolekulare Amylose. Diese "ae-Stärken" enthalten fakultativ mindestens 85% normale Amylose, nicht mehr als 5% Amylopektin und 5 bis 15% niedermolekulare Amylose.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird Amylose oder niedermolekulare Amylose einer üblichen Stärke (z. B. Mais) zum Verdünnen des Amylopektingehaltes zugefügt. Die Amylosekomponente(n) werden vorzugsweise einer Hochamylosestärke (d. h. 50 oder 70% Amylose) zugefügt, um den Amylopektingehalt zu minimieren. Die niedermolekulare Amylose wird vorzugsweise erhalten, indem man sie aus Stärkekörnern mit 50 oder 70% Amylosegehalt in eine wäßrige Lösung auslaugt. Sie kann auch durch enzymatische Entzweigung (z. B. mit Pullu lanase, Isoamylase oder einem anderen Enzym mit α-1,6-D-Glucosidase-Aktivität) einer Stärke mit niedrigem Amylosegehalt (z. B. Mais- oder Wachsmaisstärke), gefolgt von der Entfernung irgendwelcher restlicher verzweigter Stärke durch Kristallisation oder Filtration, erhalten werden. Das kurzkettige Amyloseprodukt der enzymatischen Entzweigung von Amylopektin (d. h. mit einem DP von 15 bis 65) retrogradiert (kristallisiert) bekanntlich schnell aus einer wäßrigen Lösung oder Dispersion nach Abkühlen auf Raum- oder Kühlschranktemperaturen. Verfahren zur enzymatischen Entzweigung sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. U.S. Pat. Nr. A-4,971,723, veröffentlicht am 20. November 1990 für Chiu; A-3,532,475, veröffentlicht im Januar 1972 für Sugimoto, et al.; A-3,532,602, veröffentlicht am 6. Oktober 1970 für Seidman, et al.; A-3,730,840, veröffentlicht am 1. Mai 1973 für Sugimoto, et al.; A-3,879,212, veröffentlicht am 22. April 1975 für Yoshida; und A-3,881,991, veröffentlicht am 6. Mai 1975 für Kurimoto, et al., die hiermit als Bezugsliteratur einverleibt sind.
Zum schnellen Gelieren in wäßriger Dispersion und für die Gelelastizität sind weniger als 5% Amylopektin und ein höheres Verhältnis von Amylose zu niedermolekularer Amylose (z. B. mindestens 80% bzw. weniger als 12%) bevorzugt. Die gleiche Zusammensetzung liefert unerwarteterweise auch eine hohe Gelfestigkeit, verglichen mit Stärken mit einem Amylosegehalt von 50 und 70%.
Für eine maximale Gelierungstemperatur wird ein Amylosegehalt von mindestens 85% bevorzugt.
MODIFIZIERTE AE-MAISPFLANZE
Viele genetische Faktoren im Mais beeinflussen den Anteil und Typ der Stärke und anderer Moleküle, die im Endosperm des Maiskornes vorliegen. Eine detaillierte Beschreibung des Ursprungs, der Vererbung und Expression von Genen, die bekanntlich die Kornzusammensetzung und Morphologie beeinflussen, wird in "The Genetics of Corn" von Coe, E. H., Jr., M. G. Neuffer und D. A. Hoisington, Kapitel 3 von Corn and Corn Improvement, 3. Auflage, 1988, G. F. Sprague und J. W. Dudley, Herausgeber, American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, S. 81–258 gegeben.
Das Amyloseextendergen ist ein homozygotes rezessives Allel in Stellung 5L-57 auf Chromosom 5 des Maisgenoms. Die ae-Gen-Mais-Mutante wurde zuerst von Vineyard, M. L., und R. P. Bear, in Maize Newsletter 26 : 5 (1952), und weiter von C. W. Moore und R. G. Creech in Genetics, 70 611–619 (1972) und Corn and Corn Improvement, oben, Seiten 85–115, 124–125 und 399–407 beschrieben.
Die erfindungsgemäße ae-Maisstärke wird aus einer Maiszüchtungspopulation extrahiert und hat neue funktionelle Eigenschaften und neue molekulare Eigenschaften. Die im wesentlichen reine Stärke kann aus dem Korn jeder stärketragenden Pflanze in einer Population extrahiert werden, die für das ae-Gen homozygot ist. Bevorzugterweise wird die erfindungsgemäße Stärke durch eine selektierte Population von Keimplasmaselektionen des eingedellten Maises produziert, die für den rezessiven Genotyp, der für hohe Amylosegehalte steht, homozygot sind und in die ae-modifizierende Gene akkumuliert worden sind. Dellenmais ist der in den USA für landwirtschaftliche Zwecke üblicherweise angebaute Mais und läßt sich durch Phenotyp und Genotyp leicht von Popcorn, Giant of the Cuzco-Mais und anderen Maisvarietäten unterscheiden.
Die neuen funktionellen Eigenschaften (z. B. schnelles Gelerstarren) werden prinzipiell in wäßrigen Stärkegelen beobachtet, die Wasser und im wesentlichen reine Stärke, extrahiert aus einer stärketragenden Pflanze mit einem ae-Genotyp, worin das Gel etwa 1 bis 20 Gew.-% Stärke enthält, umfassen. Die neuen molekularen Eigenschaften sind das niedrige Amylopektin/Amylose-Verhältnis und die anderen einmaligen molekularen Aspekte der Stärke, die im folgenden beschrieben werden.
Die reine Stärke kann aus Korn extrahiert werden, erhalten aus der Maispflanze mit modifiziertem ae-Gen, durch Einweichen der Körner der Maispflanze in Wasser, Mahlen der eingeweichten Maiskörner und Abtrennen der Stärke vom Rest des gemahlenen Maiskornes. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Naßmahlverfahrens wird das saubere Korn in einer schwachen Lösung von Schwefeldioxid 24 bis 48 Stunden und bei Temperaturen von 48 bis 55°C eingeweicht. Nach dem Einweichen wird das Einweichwasser entfernt, und das gequollene und erweichte Korn wird grob gemahlen. Dieses erste Mahlen setzt den Keim frei, der den größten Teil des Maisöles enthält. Der Keim wird dann abgetrennt und in einem Hydrozyklon gewaschen. Die Trennung beruht auf dem Unterschied der Dichte zwischen dem Keim und dem Rest der Komponenten. Der Keim ist das erste Nebenprodukt.
Der Rest der Aufschlämmung wird fein vermahlen, um den größten Teil der Stärke und des Proteins aus der Faser freizusetzen. Die gesamte Mischung läuft dann durch ein feines Vibrationssieb, um die Faser von der Stärke und Proteinaufschlämmung abzutrennen. Die Faser wird gewaschen und als zweites Nebenprodukt gesammelt. Die gemahlene Stärke wird durch eine Reihe kleiner Hydrozyklonanordnungen weiter behandelt, um das Protein von der Stärke zu trennen. Das Protein wird als drittes Nebenprodukt gesammelt, und die gereinigte Stärke, die das Endprodukt darstellt, wird durch Zentrifugieren entwässert und in einem Blitztrockner getrocknet.
ZÜCHTUNGSVERFAHREN
Ein genetisches Komposit aus Maiskeimplasmaselektionen (Zea mays L.), die zur Produktion von Stärke mit einem niedrigen Amylopektin- und hohen Amylosegehalt befähigt sind, kann mittels Akkumulieren von ae-modifizierenden Genen in einem homozygoten ae-genetischen Hintergrund durch Wiederholungsselektion gezüchtet werden. Die Wiederholungsselektion ist ein Züchtungssystem, bestimmt zum Erhöhen der Häufigkeit von Genen für besondere quantitativ vererbte Eigenschaften durch wiederholte Zyklen der Selektion. Ein Wiederholungsselektionszyklus beinhaltet die Identifizierung von Genotypen, die zum Verbessern der spezifischen quantitativen Eigenschaften überlegen sind und die anschließende Kreuzung der überlegenen Genotypen zur Erzielung neuer Genkombinationen.
Gemäß dieser Vorgehensweise wird eine ae-Züchtungsquelle mit einem breiten Spektrum an genotypisch diversem Keimplasma gekreuzt. Dieses diverse Keimplasma dient als Quelle der ae-modifizierenden Gene. Das als Quelle von ae-modifizierenden Genen gewählte Keimplasma kann ein Keimplasma sein, gezüchtet in dem US-Maisgürtel, sowie ein nicht adaptiertes Keimplasma, das außerhalb der Vereinigten Staaten angetroffen wird. Das als Quelle des ae-modifizierenden Gens verwendete Keimplasma, das zur Produktion genetischer Komposite des in der vorlieganden Anmeldung beschriebenen Beispiels 1 führte, wurde aus einem Maiszüchtungsprogramm der Custom Farm Seed Company, Decatur, Illinois, erhalten.
Die aus dem Kreuzen einer ae-Maislinie an genotypisch diverses Keimplasma produzierten Samen werden willkürlich ausgewählt. Aus diesen Samen gezüchtete Pflanzen werden über zwei bis drei Generationen eigenbestäubt, und Maiskörner aus so hergestellten Einzelpflanzen werden gesammelt. Die Stärke in den gesammelten Maiskörnern wird unter Anwendung der im folgenden zur Bestimmung des Amylosegehaltes angewendeten Verfahren einer chemischen Analyse unterzogen. Pflanzen, die Stärken mit den höchsten Amylosegehalten produzieren, werden identifiziert und in allen Kombinationen gekreuzt. Die Nachkommen werden über zwei bis drei Generationen eigenbefruchtet, und Maiskörner aus so produzierten Einzelpflanzen werden gesammelt. Wiederum wird die Stärke in den gesammelte Maiskörnern zur Bestimmung des Amylosegehaltes einer chemischen Analyse unterzogen. Pflanzen, die Stärke mit den höchsten Amylosegehalten produzieren, werden identifiziert und in allen Kombinationen gekreuzt.
Ein Wiederholungsselektionszyklus besteht daher aus einem Verfahren der Selbsbefruchtung über zwei bis drei Generationen, gefolgt vom Kreuzen derjenigen Einzelpflanzen, die Samenstärke mit dem höchsten Amylosegehalt produzieren, in allen Kombinationen. Der Wiederholungsselektionszyklus wird wiederholt, bis ein genetisches Komposit von Maisinzuchtlinien erhalten ist, die Stärke mit den gewünschten Eigenschaften produzieren. Im Fall des genetischen Komposits VJR-1 waren 10 Wiederholungsselektionszyklen erforderlich, um eine Maispopulation zu erhalten, die zum Produzieren von Stärke mit den in den Tabellen I bis V gezeigten Eigenschaften fähig ist. D. h., ausgehend von einer Maispopulation, die Samenstärke mit 61 bis 75% Amylose pro duzierte, waren 10 Wiederholungsselektionszyklen erforderlich, um eine Maispopulation zu erhalten, die Samenstärke mit 80 bis 91% Amylose produzierte. Aus dieser letzteren Maispopulation wurden Keimplasmaselektionen, von denen sich zeigte, daß sie den höchsten Samenstärkeamylosegehalt produzierten, willkürlich ausgewählt, um das genetisch Komposit VJR-1 zu konstruieren.
Individuelle Maiskeimplasmaselektionen in dem genetischen Komposit, die Samenstärke mit den gewünschten Eigenschaften produzieren, können zum Konstruieren von Inzuchtlinien und ihren anschließenden Hybriden, die zur Produktion von Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt fähig sind, verwendet werden. Alternativ kann das Komposit selbst mittels offener Bestäubung in Isolation zur Produktion einer Quelle von Hochamylosestärke verstärkt werden. Die Erhöhung im Samen des Komposits mittels offener Bestäubung in Isolation wird im folgenden Beispiel 1 gezeigt.
TESTVERFAHREN
Die folgenden Analysmethoden wurden zum Charakterisieren der erfindungsgemäßen Stärken verwendet.
BUTANOLFRAKTIONIERUNG
Die Butanolfraktionierungsverfahren von Adkins and Greenwood, Carbohydrate Research, 11: 217–224 (1969) und Takeda, Hizukuri und Juliano, Carbohydrate Research, 148: 299–308 (1986) wurden wie im folgenden beschrieben modifiziert und zum Bestimmen des Amylosegehaltes von Hochamylosestärken verwendet.
Die Stärken wurden aus kommerziell erhältlichen Quellen (d. h. Mais-, Hylon^® V Mais-(50% Amylose) erhalten und Hylon VII Mais-(70% Amylose) Stärken wurden von National Starch and Chemical Company, Bridgewater, New Jersey) erhalten. Stärken wurden auch durch Vermahlen von Maiskörnern aus den im folgenden Beispiel 1 beschriebenen Versuchsmaisernten erhalten. Alle Stärken (mit Ausnahme von Mais) wurden durch kalte Soxhlet-Extraktion mit Ethanol über Nacht entfettet.
Teil I: Stärken wurden zu 90% DMSO in Wasser unter Stickstoff zugefügt und 1 ½ Stunden bei 65 bis 70°C zum Löslichmachen der Stärke gerührt. Die Stärke wurde durch Zugeben von Ethanol gewonnen, wobei die Probe unter Kühlung (4°C) mindestens 1 Stunde unter Stickstoff gehalten und die Probe bei 10.000 g ("g" ist die relative Zentrifugalkraft) bei 4°C 10 bis 15 Minuten zentrifugiert wurde. Dieses Verfahren wurde mit dem Stärkepräzipitat dreimal wiederholt.
Teil II: Schritt 1: Das Präzipitat wurde in DMSO dispergiert, unter Stickstoff auf 65°C erhitzt, und die komplexbildende Lösung (eine wäßrige Lösung aus 10% 1-Butanol Vol./Vol. und 0,1% NaCl Vol./Gew. bei 65°C) wurde unter Rühren zu der Stärke/DMSO-Dispersion zugefügt. Die Probe wurde langsam auf Kühlschranktemperatur (4°C) unter Stickstoff abgekühlt und bei 5.000. bis 10.000 g 10 bis 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Teil II: Schritt 2: Unmittelbar nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand dekantiert, und das Präzipitat (der Amylose-Butanolkomplex) wurde erneut in destilliertem Wasser (etwa 0,4%ige Stärkelösung) bei 65 bis 70°C gelöst. Das erneut gelöste Präzipitat wurde mit 10% 1-Butanol und 0,1% NaCl behandelt und unter Kühlung mindestens 12 Stunden belassen. Die Amylosefraktion wurde aus der Lösung durch Zentrifugieren bei 5000 bis 10000 g 10 bis 15 Minuten lang bei 4°C gewonnen. Schritt 2 von Teil II wurde wiederholt.
Der Überstand (aus Teil II) wurde mit Ethanol und/oder Aceton zum Ausfällen der nicht komplexbildenden Stärkekomponenten behandelt, zum Kühlen auf 4°C abgekühlt, und der Überstand wurde bei 10000 g 10 bis 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Die Präzipitatfraktionen (komplexbildend und nicht komplexbildend) wurden mit einer Ethanol/Acetonserie unter Vakuum zu einem Pulver entwässert und unter Vakuum bei 60°C im Ofen getrocknet.
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
Stärken zur Analyse wurden hergestellt, indem man 10 bis 15 mg Stärke in 4 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), das 0,03 M Natriumnitrat enthielt, aufschlämmte und die Auschlämmung 16 Stunden zum Dispergieren der Stärke auf 80°C erhitzte. Die Proben (200 μl) wurden in einen ALC/GPC-150C-Chromatographen (Waters Associates, Milford, Mass.) injiziert (ausgerüstet mit einem Chromatographiedatensystem der Serie Nelson 3000 und zwei PL gelgemischten 10 μm Säulen (Polymer Laboratory, Amherst, Mass.), unter Verwendung von DMSO, das 0,03 M Natriumnitrat enthielt als mobile Phase), und mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. eluiert. Die Säulen wurden unter Verwendung von Dextranstandards (mit Molekulargewichten von 2000, 20000, 80000, 500000 und 2000000, erhalten von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N. J.) kalibriert. Der Prozentsatz an niedermolekularer Amylose wurde aus der relativen Fläche des Peaks, erhalten innerhalb des Molekulargewichtsbereiches von etwa 500 bis 20000; der Prozentsatz an Amylose wurde aus der Fläche von etwa 20000 (über 20000 und weniger als 1500000) und der Prozentsatz an Amylopektin aus der Fläche über 1500000 berechnet.
IODANALYSE
COLORIMETRISCHE BESTIMMUNG
Etwa 0,2 Gramm einer Stärkeprobe (0,35 Gramm eines gemahlenen Korns) wurden in 10 ml konzentriertem Calciumchlorid (etwa 30 Gew.-%) 30 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 8,0 ml verdünnter Calciumchloridlösung (etwa 12 Gew.-%) verdünnt, gründlich gemischt und dann 1 Minute bei etwa 1800 U/min zentrifugiert. Dann wurde die Probe zu einer klaren Stärkelösung filtriert.
Die Stärkekonzentration wurde polarimetrisch unter Verwendung einer 10 cm-Polarimeterzelle bestimmt. Genau 1 ml der Probe wurde auf 50,0 ml mit 12%-igem Calciumchlorid verdünnt, und 5,0 ml dieser Lösung wurden einem 100 ml-Meßkolben mit etwa 50 ml 12%-igem Calciumchlorid und 4,0 ml Iodlösung (0,008 N Iod und 0,01 N KI) zugeführt. Die Lösung wurde mit 12%-igem Calciumchlorid auf Volumen gebracht und geschüttelt. Die Amylosemenge wurde durch Ablesen der prozentualen Durchlässigkeit der Lösung bei 600 nm auf einem Spectronic 20-Spektrophotometer unter Verwendung von 4,0 ml Iodlösung, verdünnt auf 100 ml als Leerlösung, bestimmt. Die Ergebnisse wurden durch Anwendung einer Kalibrierkurve bestimmt, die aus Proben von bekanntem Amylosegehalt hergestellt war.
POTENTIOMETRISCHE BESTIMMUNG
Etwa 0,5 g einer Stärkeprobe (1,0 g eines gemahlenen Korns) wurden in 10 ml konzentriertem Calciumchlorid (etwa 30 Gew.-%) 30 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 5 ml einer 2,5%-igem Uranylacetatlösung verdünnt, gründlich gemischt und 5 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert. Dann wurde die Probe zu einer klaren Lösung filtriert.
Die Stärkekonzentration wurde polarimetrisch unter Verwendung einer 1 cm-Polarimeterzelle bestimmt. Ein Aliquot der Probe (normalerweise 5 ml) wurde dann direkt mit einer standardisierten 0,01 N Iodlösung titriert, wobei das Potential unter Verwendung einer Platinelektrode mit einer KCl-Bezugselektrode aufgezeichnet wurde. Die zum Erreichen des Inflektionspunktes benötigte Iodmenge wurde direkt als gebundenes Iod gemessen. Die Amylosemenge wurde berechnet, indem man annahm, daß 1,0 g Amylose mit 200 mg Iod bindet.
Beispiel 1
PRODUKTION VON GENETISCHEN KOMPOSITEN VJR-1, VJR-2 UND VJR-3
Die Maispopulationen VJR-1, VJR-2 und VJR-3 waren unterschiedliche Generationen desselben genetischen Materials, das unter offenen Bestäubungsbedingungen auf isolierten Feldern verstärkt worden war. Die das genetische Komposit VJR-1 umfassenden Keimplasmaselektionen wurden aus dem Wiederholungsselektionszüchtungsprogramm ausgewählt, weil sie Samen mit den höchsten Gehalten an Stärkeamylose innerhalb einer zufälligen Probe von Maispflanzen produzierten.
Das genetische Komposit VJR-1 wurde während des Winters 1990–91 unter offenen Bestäubungsbedingungen auf einem isolierten Feld in Florida gezüchtet. Insgesamt 5 Chargen, die jeweils 4 Bushel umhüllter Maiskörner von VJR-1-Mais enthielten, wurden naß unter Anwendung der in R. W. Rubens, Cerreal Foods World, 35: 1166–1169 (1990) beschriebenen Anlage und des Verfahrens naß vermahlen, das hierdurch als Bezugsliteratur einverleibt wird. Die aus den VJR-1-Maiskörnern isolierte Stärke wurde einer chemischen Analyse unterzogen.
Individuelle Keimplasmaselektionen aus VJR-1 sind bezüglich des Amylosegehaltes der produzierten Stärke genetisch stabil. Die Beständigkeit dieser Eigenschaft wurde bestätigt, indem man willkürlich vier verschiedene Pflanzen in der VJR-1-Population als Eltern auswählte. Ein Kolben von jeder dieser vier Pflanzen wurde geerntet, und der Amylosegehalt der Maiskörner aus jedem Kolben wurde bestimmt. Zusätzlich wurden Samen aus diesen selben Kolben in einem Züchtungstreibhaus gepflanzt. Die aus diesen Samen gezüchteten Pflanzen wurden zur Produktion der Nachkommen eigenbestäubt. Der Amylosegehalt der durch individuelle Nachkommen produzierten Maiskörner wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind unten angegeben.
Die Ergebnisse zeigen, daß die durch Selbstbestäubung individueller Keimplasmaselektionen aus der VJR-1-Population produzierten Nachkommen in stabiler Weise die Stärkeamylosegehalte der Eltern produzierten. Unterschiede im Amylosegehalt zwischen den vom selben Elternteil produzierten Nachkommen und zwischen Nachkommen und ihrem jeweiligen Eltern teil beruhen auf einem Versuchsfehler und Unterschieden in den Züchtungsbedingungen im Züchtungstreibhaus. So ist der Stärkeamylosegehalt individueller Keimplasmaselektionen innerhalb des genetischen Komposits eine stabile genetische Eigenschaft der Selektionen.
Pflanzen, die das genetische Komposit VJR-2 umfaßten, wurden aus willkürlich ausgewählten Samen gezüchtet, die von dem offen bestäubten genetischen Komposit VJR-1 produziert waren. Das genetische Komposit VJR-2 wurde unter offenen Bestäubungsbedingungen auf einem isolierten Feld in Illinois während des Sommers von 1991 unter Dürrebedingungen gezüchtet. Insgesamt 4 Bushel umhüllter Maiskörner, die aus VJR-2 entnommen waren, wurden wie oben beschrieben naß gemahlen. Die aus VJR-2-Maiskörnern isolierte Stärke wurde einer chemischen Analyse unterzogen.
Die das genetische Komposit VJR-3 umfassenden Pflanzen wurden aus willkürlich ausgewählten Samen gezüchtet, die durch das offen bestäubte genetische Komposit von VJR-2 produziert waren. Das genetische Komposit VJR-3 wurde unter offenen Bestäubungsbedingungen auf einem isolierten Feld in Florida während des Winters 1991–1992 gezüchtet. Insgesamt 4 Bushel umhüllter Maiskörner, die von VJR-3 entnommen waren, wurden wie oben beschrieben naß vermahlen. Die aus den VJR-3-Maiskörnern isolierte Stärke wurde einer chemischen Analyse unterzogen.
Der Stärkeamylopektin- und amylosegehalt und die untersuchten funktionellen Eigenschaften waren zwischen den VJR-1-, VJR-2-und VJR-3-Maisproben in bezug auf eine Maiskontrollprobe mit 70% Amylosegehalt stabil.
Beispiel 2
Die oben beschriebenen Testverfahren wurden zum Messen des Amylopektingehaltes von Stärke angewendet, die aus genetischen Kompositen VJR-1-, VJR-2- und VJR-3-Maisproben und Kontrollproben isoliert war. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
Beispiel 3
Die oben beschriebenen Testverfahren wurden zum Messen des Amylosegehaltes von Stärke verwendet, die aus genetischen Kompositen VJR-1-, VJR-2- und VJR-3-Maisproben und Kontrollproben isoliert war. Die niedermolekulare Komponente der nicht komplexbildenden Butanolfraktion bildete einen Farbkomplex mit Iod, der für Amylose typisch war. Die Ergebnisse sind in Tabelle IIA und IIB gezeigt.
TABELLE I AMYLOPEKTINGEHALT VON STÄRKE
Tabelle IIA AMYLOSEGEHALT DURCH IODANALYSE
Tabelle IIB AMYLOSEGEHALT DURCH BUTANOLFRAKTIONIERUNGS/GPC-ANALYSE
BEISPIEL 4
Der Gelatinierungstemperaturbereich und die Gelatinierungsenergie der erfindungsgemäßen Stärken wurden durch Differenzialabtastkaloriemetrie (DSC) gemessen.
Die Messungen erfolgten an einem Perkin-Elmer DSC-4-Instrument (Perkin-Elmer Co., Piscataway, New Jersey) unter Verwendung eines Abtastbereiches von 25 bis 160°C bei 10°C pro Minute und einem Gewichtsverhältnis von Wasser zu Stärke von 4 : 1.
Unmittelbar nach Abkühlen aus dem ersten Abtasten wurden die Proben durch den gleichen Test geführt, um die Energie der Komplexbildung mit Fettsäuren zu messen. Dieses ΔH wurde vom ΔH der ersten Abtastung subtrahiert, um zu der ΔH-Zahl in Tabelle III zu gelangen.
Die Stärkeproben mit niedrigem Amylopektingehalt und 70% Amylose wurden mindestens 7 Tage lang tiefgekühlt, um die Amylopektinreassoziation zuzulassen, und wie oben beschrieben auf Gelatinierungseigenschaften untersucht. In der Stärkeprobe mit 70% Amylose erschien der Peak bei 60°C, was für eine Amylopektindissoziation typisch war. Dieser Peak war bei Stärkeproben mit niedrigem Amylopektingehalt nicht vorhanden, was zeigte, daß diese Proben von signifikanten Amylopektinmengen frei waren.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt.
Tabelle III GELATINIERUNGSEIGENSCHAFTEN VON STÄRKE
Die Ergebnisse zeigen, daß die Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt einen längeren Gelatinierungstemperaturbereich (etwa 75 bis 130°C) und eine höhere abschließende Gelatinierungstemperatur hat als Mais- (etwa 62 bis 70°C), Wachsmais- (etwa 65 bis 89°C) oder Maisstärken mit hohem Amylosegehalt (70%) (etwa 75 bis 110°C).
Die zum Gelatinieren der Stärke erforderliche Energie (ΔH (Kal./g)) war für Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt höher (etwa 2,7 bis 2,9) als für Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%) (etwa 2,32) und niedriger als für Wachsmaisstärke (etwa 3,6). Dies zeigt, daß Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt eine einmalige Kristallstruktur innerhalb des Stärkekornes, verglichen mit bekannten Maisstärken, aufweisen.
BEISPIEL 5
Die rheologischen Eigenschaften der Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt wurden unter Verwendung eines Rheometrics RFS-II Flüssigkeitsspektrometers gemessen und mit den rheologischen Eigenschaften bekannter Hochamylosestärke verglichen.
Die rheologische Analyse erfolgte durch Strahlkochen der Stärke bei 138 bis 149°C (280 bis 300°F) und Halten der erhaltenen Stärkedispersion bei 95°C, bis sie zur Analyse bereit ist. Die parallelen Platten des Rheometers wurden auf 60°C erhitzt. Die Stärke wurde aufgebracht, und die Platten wurden zum Testen auf 25°C abgekühlt. Der Plattenspalt war auf 1,5 mm eingestellt mit einer Belastung von 1%, und die Frequenz betrug 1 Radiant pro Sekunde. Silikonöl wurde auf die Kante des Gels aufgebracht, um einen Feuchtigkeitsverlust während des Testens zu vermeiden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und in 1 dargestellt.
Tabelle IV RHEOLOGISCHE ANALYSE VON STÄRKEGELEN
Die 1 zeigt G'-Messungen in dyn/cm² gegen die Zeit in Minuten (von 0 bis 240 Minuten) für Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%) bei 6% Feststoffen ("Hylon VII") und Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt VJR-1, VJR-2 und VJR-3 bei 5,95, 5,93 bzw. 5,85% Feststoffen. Wie in 1 gezeigt, ist die zum Gelieren von Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt benötigte Zeit signifikant kürzer, und das Gelieren erfolgte im Verlauf der Zeit schärfer (etwa 24 gegen 72 Minuten) als für eine Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%). Die endgültigen Gelfestigkeits- und Steifheitsmessungen waren für VJR-1, -2 und -3 höher als für die Kontrolle mit 70% Amylose. Die VJR-1-, -2- und -3-Stärkegele zeigten einen sehr stabilen Lagerungsmodul (G') nach Erreichen der maximalen G'-Messung. Das G'-Maximum für VJR-1, -2- und -3-Stärkegele wurde innerhalb von 20 Stunden erreicht. Im Gegensatz dazu zeigte das Kontrollstärkegel eine allmähliche Erhöhung von G' und erreichte innerhalb der 20-stündigen Meßdauer kein stabiles G'-Maximum.
Wie in Tabelle IV gezeigt, waren die Gelsteifheit und -elastizität (G' max) für Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt bei demselben Feststoffbereich (d. h. 4 bis 6% Feststoffe bei 25°C) größer als diejenigen der Stärkekontrolle mit hohem Amylosegehalt.
Beispiel 6
Die Gelfestigkeit von Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt in wäßriger Dispersion wurden mit derjenigen bekannter Maisstärken unter Verwendung einer Stevens Textur-Analysevorrichtung (Texture Technology Corporation) verglichen, die auf eine Penetrationsgeschwindigkeit von 0,5 mm/sek. mit einer Sonde von 0,5 inch Durchmesser eingestellt war. Die Stärken wurden durch Strahlkochen bei 138 bis 149°C (280 bis 300°F) in Wasser auf 3 bis 6,5% Feststoffe dispergiert und nach 24 Stunden bei Raumtemperatur getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß Stärken mit niedrigem Amylopektingehalt eine signifikant höhere Gelfestigkeit in wäßriger Dispersion aufweisen als Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%). Die Stärkegele mit niedrigem Amylopektingehalt (mit mindestens 6% Stärkefeststoffen) zeigten keine Synärese unter Kühlung über eine Dauer von 5 Monaten. Im Gegensatz dazu zeigte das Stärkegel mit 70% Amylose innerhalb von Tagen bei Kühlschranktemperatur eine Synärese.
TABELLE V GELFESTIGKEIT EINER STÄRKE MIT NIEDRIGEM AMYLOPEKTINGEHALT
Beispiel 7
Die Kornstrukturen einer Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt wurden mikroskopisch untersucht und mit bekannten Maisstärken verglichen.
Licht- und Abtastelektronen-Mikroskopuntersuchungen zeigten, daß Stärkekörner mit niedrigem Amylopektingehalt unregelmäßiger und länglicher waren als bekannte Maisstärkekörner, einschließlich Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%). Ähnliche Eigenschaften wurden in jeder hier in Beispiel 1 beschriebenen Maisnutzpflanze mit niedrigem Amylopektingehalt beobachtet. Die Körner zeigten auch sehr wenig Doppelbrechung. Weil Doppelbrechung am deutlichsten in Wachsmaisstärke (d. h. praktisch nur Amylopektin) ist, bestätigt die fast vollständige Abwesenheit von Doppelbrechung in den Versuchsstärken die fast vollständige Abwesenheit von Amylopektin, die chemisch beobachtet wurde.
Beispiel 8
Ein entzweigendes Enzym, Isoamylase (eine 1,6-α-D-Glucosidase, Lot No. 01101, erhalten von Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japan) wurde zum Hydrolysieren der Verzweigungspunkte (1,6) der Stärken mit niedrigem Amylopektingehalte von Beispiel 1 verwendet. Die Abbauprodukte wurden mit denjenigen verglichen, die durch Entzweigen bekannter Maisstärken (Wachsmais- und Maisstärke mit hohem Amylosegehalt (70%)) erhalten worden waren.
Die Stärkebeispiele wurden nach dem Verfahren von Hizukuri, et al., Carbohydrate Research, 94: 205–213 (1981) hergestellt.
Nach der Enzymbehandlung wurde das Molekulargewicht der Stärkeprodukte durch Gelpermeationschromatographie gemessen. Wachsmais war vollständig zu niedriger molekularen Fraktionen entzweigt (zwei schlecht aufgelöste GPC-Peaks, entsprechend einem DP von etwa 15 und etwa 60). Für die Stärke mit niedrigem Amylopektingehalt, die aus der VJR-1-Maisprobe von Beispiel 1 extrahiert war, wurden zwei Molekulargewichtsfraktionen beobachtet: bei etwa 21.000 Molekulargewicht (ein Anhydroglucose-DP von etwa 130) und bei etwa 145.000 Molekulargewicht (ein DP von etwa 895). Kein Peak wurde bei einem Molekulargewicht von über 1.000.000 (entsprechend Amylopektin) in der VJR-1-Probe beobachtet, und auch nicht in der Maisstärkekontrolle mit hohem Amylosegehalt (70%). Der Peak hohen Molekulargewichts von VJR-1 (entsprechend normaler Amylose) war um 10% höher als der Peak desselben Molekulargewichts, der in der Maisstärkekontrolle mit hohem Amylosegehalt (70%) beobachtet wurde.
Somit bestätigt die Enzymanalyse, daß die Maisstärke mit niedrigem Amylopektingehalt signifikant mehr Amylose und weniger verzweigte Komponente enthält, als die am nächsten verwandte Maisstärke, eine Stärke mit 70% Amylosegehalt.

Claims

Im Wesentlichen reine Maisstärke, extrahiert aus einer pflanzlichen Quelle, die einen Genotyp aufweist, der für hohe Amylosegehalte steht, wobei die Stärke weniger als 10% Amylopektin und 5 bis 15% niedermolekulare Amylose enthält, wobei die niedermolekulare Amylose im Wesentlichen lineare Polymere mit 30 bis 250 Anhydroglucoseeinheiten, die im Wesentlichen durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden sind, darstellt, beide bestimmt mit der in der Beschreibung unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie.
Stärke nach Anspruch 1, in welcher die Stärke weniger als 5% Amylopektin enthält.
Stärke nach Anspruch 1, in welcher die Stärke mindestens 85% normale Amylose, bestimmt mit der in der Beschreibung unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionisierung/Gelpermeationschromatographie, umfaßt.
Gel, umfassend Wasser und eine wirksame Menge der Stärke nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel stabil ist und bei einer höheren Geschwindigkeit und auf eine höhere Gelfestigkeit und -steifheit gebildet ist als ein Gel, das Wasser und die gleiche Menge einer Stärke mit 70% Amylosegehalt umfaßt.
Im Wesentlichen reine Maisstärke, extrahiert aus dem Korn einer Pflanze, die einen Genotyp mit einem rezessiven Gen aufweist, das für hohe Amylosegehalte steht, und das mit modifizierenden Genen, die für hohe Amylosegehalte stehen, assoziiert ist, wobei die Stärke weniger als 10% Amylopektin und 8 bis 25% niedermolekulare Amylose enthält, wobei die niedermolekulare Amylose im Wesentlichen lineare Polymere mit 30 bis 250 Anhydroglucoseeinheiten, die im Wesentlichen durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden sind, darstellt, beide bestimmt mit der in der Beschreibung unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie.
Stärke nach Anspruch 5, in welcher die Stärke mindestens 75% normale Amylose, bestimmt mit der in der Beschreibung unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie, enthält.
Stärke nach Anspruch 6, in welcher die Stärke mindestens 85% normale Amylose enthält.
Stärke nach Anspruch 5, in welcher die Stärke weniger als 5% Amylopektin enthält.
Stärke nach Anspruch 5, in welcher die stärketragende Pflanze Zea mays L. ist.
Gel, umfassend Wasser und eine wirksame Menge der Stärke nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel stabil ist und bei einer höheren Geschwindigkeit und auf eine höhere Gelfestigkeit und -steifheit gebildet ist als ein Gel, das Wasser und die gleiche Menge einer Stärke mit 70% Amylosegehalt umfaßt.
Maisstärkezusammensetzung, umfassend: a) mindestens 75% normale Amylose, b) weniger als 10% Amylopektin und c) 8 bis 25% niedermolekulare Amylose, wobei die niedermolekulare Amylose im Wesentlichen lineare Polymere mit 30 bis 250 Anhydroclucoseeinheiten, die im Wesentlichen durch alpha-1,4-D-Glucosidbindungen verbunden sind, darstellt, alle bestimmt mit der in der Beschreibung unter Testverfahren beschriebenen Butanolfraktionierung/Gelpermeationschromatographie.
Stärkezusammensetzung nach Anspruch 11, in welcher die Zusammensetzung ein Gemisch aus zwei oder mehreren Stärkefraktionen ist.
Stärkezusammensetzung nach Anspruch 11, in welcher die Zusammensetzung aus einer pflanzlichen Quelle, die einen Genotyp aufweist, der für hohe Amylosegehalte steht, erhalten ist.
Gel, umfassend Wasser und eine wirksame Menge der Stärke nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel stabil ist und bei einer höheren Geschwindigkeit und auf eine höhere Gelfestigkeit und -steifheit gebildet ist, als ein Gel, das Wasser und die gleiche Menge einer Stärke mit 70% Amylosegehalt umfaßt.