DE3438960A1 - Verfahren zum isomerisieren von glucose zu fructose - Google Patents
Verfahren zum isomerisieren von glucose zu fructoseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein enzyxnatisches Verfahren zum
Umwandeln von Glucose (Dextrose) in Fructose (Lävulose),
Die meiste Nahrungsmittelglucose wird als enzymatisches
Hydrolysat von Maisstärke zur Verfügung gestellt, d.h. als handelsüblicher Maissirup. Glucose hat im allgemeinen
eine 60- bis 80%ige Süße im Vergleich zu Saccharose und wird deshalb mit einem entsprechend niedrigeren Preis
gehandelt. Seit langem ist es bekannt. Glucose zu Fructose (die noch süßer als Saccharose ist) . zu isomerisieren
unter Verwendung eines Enzyms mit Glucoseisomeraseaktivität,-vorzugsweise
eines solchen, das auf einem inerten Träger, wie Diethylaminoethylcellulose, p.orösem Glas
oder Chitin/ immobilisiert wurde. Genauere Beschreibungen über die enzymatische Umwandlung von Glucose und Fructose
unter Verwendung von Glucoseisomerase findet man bei Hamilton, et al. "Glucose Isomerase: a Case Study of
Enzyme-Catalyzed Process Technology", Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et al., Plenum
Press, New York, (1974), Seiten 94-106, 112, 115-137;
Antriin, et al., "Glucose Isomerase Production of High-Fructose
Syrups", Applied Biochemistry and Bioengineering,
3438360
Band 2, Academic Press (1979); Chen, et al-, "Glucose Isomerase (a
Review)", Process Biochem. (1980) , Seiten 30 bis 35; Chen, et al. "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem., (1980), Seiten 36-41?
Nordahl, et al,, "Fructose Manufacture from Glucose by Inroobiled
Glucose Isomerase", Chem. Abstracts , Band 82, (1975), Abs. Nr.110316h;
and Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem. Abstracts, Band 81, (1974), Abs. Nr. 76474a. Darüber
hinaus sind zahlreiche Patente über die Isomerisierung von Glucose bekannt. Typische US-Patentschriften sind:
3 616 221; Reissue 28 885 (ursprünglich 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714;
3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127 und 4 308 349.
Das Niveau an Fructose,* das durch Isomerisierung von
Glucosesirup mit Glucoseisomerase erhältlich ist, ist durch das Gleichgewicht der Isomerierungsreaktion begrenzt.
Geht man von einem Ausgangssubstrat aus reiner Dextrose aus, so liegt bei 650C das Reaktionsgleichgewicht bei annähernd
51 Gew.-% Fructose. Wird eine raffinierte Dextroseflüssigkeit
als Substrat verwendet (enthaltend bis zu 6 Gew.-% an Nicht-Monosacchariden) und läßt diese eine
ausreichende Zeit in einem Enzyiareaktor verweilen, dann
erhält man einen annähernd 48 bis 52 %igen Fructosesirup
als höchste Konzentration nach den vorerwähnten Verfahren des Standes der Technik, um Sirupe mit höherem Fructosegehalt
zu erzielen, muß man Fraktioniersysteme anwenden, durch welche die Kosten des Endproduktes erheblich erhöht
werden. Bei höheren Temperaturen wird das Gleichgewicht günstiger. Ein Glucoseisomeraseverfahren, das bei
> e-iner Temperatur von etwa 90-1400C betrieben werden kann,
könnte man verwenden, um direkt Maissirupe mit hohem
Fructosegehalt von 53-60 Gew.-% zu erzielen, wobei man dann eine Fraktionierung und ein Kreislaufverfahren vermeiden
würde. Die Neigung der bekannten Glucoseisomerasesysteme, in der Wärme abgebaut zu werden, wodurch eine
scharfe Verminderung der Aktivität eintritt, hat die
Fachwelt bisher davon abgehalten, höhere Temperaturen anzuwenden, um das Gleichgewicht der Isomerisierung zu Gunsten
der Fructose zu verschieben. Darüber hinaus sind Glucose und insbesondere Fructose empfindliche reduzierende
Zucker, die eine ausgeprägte Tendenz haben, unerwünschte Nebenprodukte wie Psicose, gefärbte Produkte, Farbstoffvorläufer,
Fructosedianhydride, Mannose," Tagatose und Säuren zu bilden, wenn man sie auf die Temperaturen erwärmt,
die gemäß dieser Erfindung zur Isomerisierung er-
10 forderlich sind.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man bei der Durchführung eines Glucoseisomerisationsvexfahrens innerhalb
bestimmter pH-Grenzen und Verweilzeiten in einem Enzymreaktor der nachfolgend beschriebenen Art und bei
Isomerisationstemperaturen von etwa 900C bis etwa 1400C
wirksam und direkt HFCS-Sirupe hoher Qualität mit einer tolerierbaren Bildung von Nebenprodukten, mit einem Gehalt
2Q von etwa 52 bis etwa 60 Gew.-% Fructose erhalten kann
und dadurch kostspielige und verfahrcnsmäßig komplizierte
Fraktionierungen und Kreislaufverfahren vermeiden kann,
die bei den bekannten Glucoseisomerisationsverfahren erforderlich
sind, um HFCS-Siiupe mit dem vorerwähnten Be-
25 reich der Fructosekonzentration zu erhalten.
Erfindungsgemäß wird Glucose zu Fructose-Glucose-Sirupen isomerisiert, indem man eine glucosehaltige Flüssigkeit
mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwi-
3Q sehen etwa 90 und etwa 1400C bei einem pH von etwa 3 bis etwa 8
eine ausreichende Zeit in Berührung bringt bis eine Endkonzentration von wenigstens 53 bis etwa 60 Gew.-% an
Fructose, bezogen auf den gesamten Kohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, erhalten wurde und wobei keine wesentliche
Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Fructose-, Nicht-Glucose-Zuckern eintritt.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung in Fructose isomerisierte Glucose kann aus allen bekannten Quellen für diesen
Zucker stammen. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen stammt die Glucose im allgemeinen aus den Hydrolysaten von
. Cellulose oder Stärke unter Verwendung von Säuren und/oder Enzymen, vorzugsweise letzteren, in Übereinstimmung mit
bekannten Verfahren. Auf diese Weise erhaltene glucosehaltige Flüssigkeiten enthalten typischerweise kleinere
Mengen an Polysacchariden, Zuckeroligomeren etc., in
Abhängigkeit von der angewendeten Kohlehydratquelle und
der angewendeten Hydrolysemethode. Getreidekörner, wie Mais, MiIo, Weizen, Roggen und dgl. und stärkehaltige
Quellen, wie Kartoffein,Süßkartoffein, Karotten,
Tapioka und dgl. sind ausgezeichnete Quellen für Stärke,, die in das Glucoseausgangsmaterial gemäß der Erfindung
umgewandelt wird. In den USA wird Maisstärke wegen seiner vergleichsweise niedrigen Kosten und leichten Verfügbar~
keit besonders bevorzugt. Da man bei der Herstellung von ' Nahrungsmittelglucose die Verwendung von enzymatischen
Stärkehydrolyseverfahren anwendet, werden solche Verfahren hier bevorzugt. Enzymatische Hydrolyseverfahren
werden in den US-Patentschriften 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 und 4 284 722 beschrieben, die
hiermit in die Offenbarung eingeschlossen werden.
Die hier als Enzymquelle für die chemische Stabilisierung verwendete Glucoseisomerase kann aus allen bekannten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen isoliert
werden, einschließlich Streptomyces,·
flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces
echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis,
Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae,
Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae,
Aerobacter aerogens , Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans,
Bacillus megaterium, Bacillus f ructo'sus, Acetobacter oxydans,
Acetobacter suboxydans, Acetobacter roseus, Acetobacter
' melanogenus , Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus mannitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, :
Pseudomonas hydrophili.a, Brevibacterium pentaaminoacidicum,
Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, and
Paracolobactrum aerogenoides, Darüber hinaus kann man
15 Glucoseisomerase, die durch die Genera Nocardia,
Micromonospora, Microbispora, Microellobospora und
Arthrobacter gebildet wird, verwenden. Streptomyces sp.
ATCC 21.175 ist eine ausgezeichnete Quelle für Glucoseisomerase, die
erfindungsgemäß verwendet werden kann. Wie schon festgestellt,
kann man vorteilhaft Glucoseisomerase verwenden, die bei den hier angewandten verhältnismäßig hohen Isomer
isierungs temperatur en stabil ist, z.B. Glucoseisomerase,
die von Bacillus stearothermophilus, gebildet wird, und insbesondere von Stämmen ausgewählt aus Bacillus stearothermophilus
ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 und
NRRL B-3682 gemäß US-PS 3 826 714; Glucoseisomerase, die von hiikroorganismen vom Genus Ampullariella gebildet
werden, wie Ampullariella digitata, Ampullariella lobata,
Ampullariella campanulata und Ampullariella regularis
(US-PS 4 308 349) ; Glucoseisomerase, die von Bacillus
licheniformis (europäische Patentanmeldung 41213) gebildet
wird sowie Glucoseisomerase, die von Thermophilen der in der japanischen Patentveröffentlichung 74-39588 beschriebenen
Genera gebildet wird.
Außer den vorerwähnten Mikroorganismen schließt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Mutanten und
Varianten davon sowie von genetisch umgewandelten Mikroorganismen,
die durch Einführung von mutierten"Glucoseisomerase dienen, in andere Mikroorganismen, einschließlich
mesophilen und thermophilen Mikroorganismen, abgeleitet werden, ein. Die· mutierten Glucoseisomerasegene,
die für einen solchen Zweck ausgewählt werden, sind solche, die Glucoseisomerase ergeben, die bei höheren Temperaturen,
insbesondere oberhalb 900C und vorzugsweise
bis zu etwa 1400C stabil ist. Solche Gene können durch
übliche Verfahren, wie sie zum Mutieren von Mikroorganismen verwendet werden, z.B. durch Bestrahlen oder Chemischherstellen.
Alternativ kann man isolierte Glucoseisomerasegene, die eine Glucoseisomerase mit einer ausreichenden
Wärmestabilität ergeben, und wie sie beispielsweise durch gewisse Streptomyces-Stämme gebildet werden, in vitro
mutieren. Die Auswahl von geeigneten mutierten Genen ist begleitet von dem Wiedereinführen des mutierten Gens,
in. entweder dem Eltern- oder einem anderen Organismus und anschließendem Wachstum und Vervielfältigen des
Organismus und Prüfen der Wärmestabilität der gebildeten Glucoseisomerase.
Man kann gleichfalls rekombinierte DNA-Verfahren anwenden, um Glucoseisomerase mit einer für die vorliegende
Erfindung geeigneten verbesserten Wärmestabilität zu erhalten. Argos et al. (Biochemistry 18 (25) :5698-5703
(1979)) hat festgestellt, daß gewisse Substitutionen von
35
Alanyl für Glycyl, Seryl, Valyl und Lysyl in Enzymen
von mesophilen Organismen in den entsprechenden Enzymen aus thermophilen Organismen gefunden werden. Perutz
(Science, 2JTl_, 1187-91 (1978)) stellt fest, daß die
Enzyme von thermophilen Bakterien ihre Extrastabilität hauptsächlich durch zusätzliche Salzbrücken an der Proteinoberfläche
erlangen. Zuber gibt in "Biochemistry of Thermo-• phily", Freidman, S.M., ed., Seiten 267-285, Academic
Press, N.Y., 1978) weitere Informationen über den Aufbau thermostabiler Enzyme. Sind die Aminosäuresequenz und
die dreidimensionale (tertiäre) Struktur einer Glucoseisomerase bekannt, dann ist es möglich, in den Isomerasegenen
eine verbesserte Stabilität durch seitenspezifische Mutationen zu entwickeln unter Ausbildung von Enzymen,
die erhöhte Mengen an solchen Aminosäuren enthalten und dadurch stabilere Strukturen aufweisen. Nachdem man die
DNA-Sequenz der Glucoseisomerase bestimmt hat, kann ein Gensynthesizer verwendet werden, urr. eine neue Sequenz
zu erzeugen und durch solche künstlich gemachten Gene wird die Wärmestabilität von derart erzeugter Glucoseisomerase
erhöht. Man kann erwarten, daß solche manipulierten Enzyme für die Praxis der vorliegenden Erfindung besonders
brauchbar sind.
2^ Da Glucoseisomerase typischerweise intrazellulär von
diesen und anderen Mikroorganismen gebildet wird, kann man eine Quelle für Glucoseisomerase durch einfaches
Ernten dieser Zellen gewinnen. Die Glucoseisomerase kann von den Zellen in bekannter Weise abgetrennt werden,z.B.
durch Zellautolyse oder durch Beschallung in einem Enzymreaktor bekannter
Bauart. Vorzugsweise wird die hier verwendete Glucoseisomerase, unabhängig von ihrer Quelle, auf einem
inerten Substrat in üblicher und bekannter Weise immobilisiert. Verfahren und Material, die zum Immobilisieren
von Enzymen verwendet werden können, sind bekannt und werden in zahlreichen Publikationen beschrie-
ben einschließlich Wang et al., Fermentation & Enzyme
Technology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1979), Seiten 318-338 und Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical
Technology/ 3. Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc., New York (1980), Band 9, Seiten 148-172, die in die Offenbarung
der Erfindung einbezogen werden. Die Gegenwart von geringen Mengen an Kobaltkation und/oder einem wasserlöslichen
Salz von schwefeliger Säure, wie Natriumsulfit, Natriumbisulfit, Magnesiumsulfit und/oder
Magnesiumbisulfit gemäß ÜS-Reissue-Patent Nr. 28 885,
um die Denaturierung der Glucoseisomerase während des Verfahrens zu vermindern, kann ebenfalls vorgesehen werden.
Es ist erforderlich, daß die Konzentration an Kohlehydrat in der glucosehaltigen Flüssigkeit im Bereich von etwa
20 bis etwa 85 und vorzugsweise etwa 30 bis etwa 50 Gew.-%, liegt-
Es ist auch erforderlich, daß man die Isomerisierung bei einem pH-Wert im Bereich von -etwa 3 bis etwa 8 und vorzugsweise
im Bereich von etwa 4 bis etwa -und insbesondere zwischen 5-und 6,5 durchführt. Nimmt man die Isomerisierung
erheblich unterhalb oder oberhalb des vorerwähnten pH-Bereiches
vor, dann bilden sich sehr große Mengen an unerwünschten Nebenprodukten, wie Psicose, organischen Säuren,
gefärbten Produkten, Farbvorläufern, Fructosedianhydriden und dergleichen.
Es-wurde festgestellt, daß der pH für eine optimale Akti-0
vität der Glucoseisomerase merklich bei hohen Temperaturen a.bnimmt. Für Glucoseisomerase aus Streptomyces rubingenosus
liegt das Aktivitätsoptimum bei pH 8,6-9,2 bei 250C,
bei pH 6,9-7,5 bei 75°C und bei pH 5,6-6,2 bei 125°C. Wenn, also die Isomerisationstemperatur ansteigt, kann
man den pH der Isomerisierung erniedrigen, um eine maxi-
3438S60
male Enzymaktivität aufrechtzuerhalten und um die Bildung
von Nebenprodukten zu vermeiden.
Eine weitereswichtiges Erfordernis bei der vorliegenden
Erfindung ist die Kontaktdauer der glucosehaltigen Flüssigkeit mit der chemisch stabilisierten Glucoseisomerase.
Diese Kontaktzeit muß im Bereich von etwa 1 s bis etwa 5h, vorzugsweise etwa 30 s bis etwa 1 h und ganz
besonders bevorzugt etwa 2 min bis etwa 30 min aufrecht-1Q
erhalten werden, um einen Fructosesirup einer annehmbaren Qualität zu ergeben.
Die bevorzugte Kontaktzeit zwischen der Glucoseisomerase
und der glucosehaltigen Flüssigkeit hängt zu einem gro-Ben Teil von dem pH ab, bei dem Isomerisierungsreaktion
durchgeführt wird. Am unteren Ende des pH-Bereiches kann man längere Kontaktzeiten tolerieren, ohne daß ein zu
großer Glucose- und Fructoseabbau durch Bildung von Psicose und anderen unerwünschten Abbauprodukten eintritt.
Am oberen Ende des Bereiches sind kürzere Kontaktzeiten erforderlich, um die Bildung von Psicose und von
Farbstoffen zu vermeiden. In der Praxis wird die Gesamtzeit, bei welcher sich der glucosehaltige Sirup
bei oder in der Nähe der Endreaktionstemperatur befindet, als die Abbauzeit (t,) angesehen, weil die eintretenden
Zuckerabbaureaktionen nicht enzymatisch sind und unabhängig davon ablaufen ob die Flüssigkeit
in Kontakt mit der Glucoseisomerase ist oder nicht. Die Abbauzeit (t,) schliesst die tatsächliche Kontaktzeit
(t ) während das Enzym und das Substrat in Kona
takt sind,, plus jede manipulierte Zeit, d.h. zum
Einbringen und Herausnehmen aus dem Reaktor, bei welcher das Substrat bei oder in der Nähe der Reaktionstemperatur ist, ein. Die tatsächliche Kontaktzeit
(t ) ist die die Zeit, während welcher das Enzym reaka
tiv in Kontakt mit dem Substrat ist, d.h. dass ein direkter Kontakt zwischen dem Substrat und dem Enzym
besteht. Deshalb ist die Durchführung der Isomerisierungen oberhalb 9O0C wichtig, um die Zeit zu minimieren,
die erforderlich ist, um die Glucoseflüssigkeit auf die gewünschte Isomerisationstemperatur zu bringen
(wie dies beispielsweise der Fall ist, wenn man die Flüssigkeit mit Wasserdampf unmittelbar vor dem
Kontakt mit Isomerase vermischt) und wenn einmal die gewünschten Fructoseniveaus erreicht worden sind,
15 dann soll die Flüssigkeit schnell von irgendeiner
aktiven Isomerase getrennt werden und so schnell wie möglich auf unterhalb 9O0C und vorzugsweise unterhalb
700C gekühlt werden.
Um deshalb Sirupprodukte mit annehmbaren Eigenschaften zu erhalten, bei denen kein zu starker Abbau der
Fructose oder Glucose eingetreten ist, soll die Abbauzeit in Übereinstimmung mit der folgenden Gleichung
td = a log (4300/(T+273) - pH - 3,23)
überwacht werden, wobei t-, die Abbauzeit in Minuten,
T die Reaktionstemperatur in 0C und pH der pH-Wert der Reaktionsmischung, während welcher sich die Mischung
bei der Reaktionstemperatur befindet, ist.
Die obige Gleichung zeigt, dass kürzere effektive Kontaktzeiten bei höheren Temperaturen und/oder höheren
pH-Werten erforderlich sind. Die für die Umsetzung verwendeten pH-Werte liegen im allgemeinen
nahe oder bei dem Optimum-pH-Wert für die ausgewählte Isomerase. Die Temperatur T kann, je nach der Zusammensetzung
des Subsbrates und des gewünschten Fructosegehaltes,
wie dies nachfolgend noch diskutiert wird, eingestellt werden. Diese Beziehungen werden
beispielsweise in dan Gleichungen 5, 6 und 7 gezeigt.
Eine weitere Überwachung der Kontaktzeit kann man dadurch
erzielen, das3 man die Beziehung zwischen der Gleichung 4 ausnutzt, in welcher gezeigt wird, dass
die Kontaktzeit umgekehrt proportional der Enzymaktivität ist. Deshalb sollte bei einer Isomerase mit
einem optimalen pH von 6,0 und einer Reaktionszeit von 1100C die Abbauzeit auf etwa 100 Minuten oder weniger
eingestellt werden.
Verwendet man eine lösliche Form von chemisch stabiler Glucoseisomerase, ist es erforderlich, eine Inaktivierung
vor der Kühlstufe vorzunehmen (z.B. durch eine pH-Verringerung auf einen Bereich, bei dem die
Isomerase inaktiviert wird), um jegliche Rückwandlung von Glucose zu Fructose, die sich während der Isomerisationsstufe
bei den hohen Temperaturen ausgebildet hat, zu vermeiden, denn die Isomerisationsreaktion
ist selbstverständlich reversibel.
Der erzielbare maximale Umwandlungsgrad von Glucose in Fructose wird durch das thermodynamische Gleichgewicht
zwischen Glucose und Fructose bestimmt, welches wiederum von der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt
wird, abhängig ist. Sehr sorgfältige Untersuchungen über Gleichgewichtsmischungen von Glucose und Fructose
haben folgende Beziehung ergeben:
F = 100 K/(K+1) (2)
10 -1InK = - — + 2.3005
T+273 <3>
worin F der. Prozentsatz an Fructose beim Gleichgewicht,
bezogen auf Gesamtgewicht von Glucose und Fructose, τ die Temperatur (0C), bei welcher die Isomerisierung
durchgeführt wird und K die Glucose-Fructose-Gleichgewichtskonstante
darstellen.
Die tatsächliche Kontaktzeit zwischen dem glucosehaltigen • Sirup und der Isomerase in dem Reaktor kann unter Bezug
auf die nachfolgende Gleichung errechnet werden, wenn man einen Reaktor, der Isomerase in immobilisierter Form enthält,
verwendet,
F - F
e ο
e ο
t = CV In
C-4)
F-F
e
e
kA
Darin bedeuten:
t '= die tatsächliche Kontaktzeit
t '= die tatsächliche Kontaktzeit
C = Konzentration an Glucose und Fructose V =" das freie Flüssigkeitsvolumen in dem gepackten Bett
(Bettvolumen minus dem von den immobilisierten Enzymteilchen eingenommenen Volumen)
F = Fructosefraktion in der Glucose/Fructosemischung beim
Gleichgewicht bei der Isomerisierungstemperatur
F = Fraktion von Fructose (bezogen auf G + F) am Eingang des gepackten Bettes·· ■
F = Fraktion an Fructose (bezogen auf G + F) in der aus dem gepackten Bett austretenden Lösung
k = Reaktionkonstante für die Isomerisierung unter Isomerisierungsbedingungen
A = Isomeraseaktivität in dem gepackten Bett.
Werte für k für die in den Beispielen hergestellte immobilisierte Isomerase liegen im Bereich von etwa 0,07 bis
etwa 5 g h IGIU bei Temperaturen von 900C bzw.
1400C. Diese Beziehung zeigt die Notwendigkeit, die Kontaktzeit
bei hohen Temperaturen bei Verwendung von gepackten Betten mit hoher Aktivität pro Volumeneinheit zu minimieren.
Die nach den in den folgenden Beispielen beschriebenen
Verfahren hergestellten gepackten Betten können bis zu 2000 IGIU/ml erhalten, wodurch man in weniger als 1 min
in einem Hochtemperaturreaktor einen Gleichgewichts-Fructosegehalt von 99,5 % erzielt, wenn man Stufenreaktoren,
die bei unterschiedlichen Temperaturen betrieben werden, verwendet und die Zufuhr zu einem ersten Reaktor
bei einer niedrigen Temperatur isomerisiert wird, bevor man in einem zweiten Reaktor bei einer höheren Temperatur
isomerisiert. Wendet man ein Stufenreaktorsystem an,
dann ist es vorteilhaft, ein Verfahren zum enzymatischen Umwandeln von Glucose in Fructose anzuwenden, bei man
eine glucosehaltige Flüssigkeit, enthaltend etwa 20 bis etwa 85 Gew.-% Kohlehydrat«, mit Glucoseisomerase bei
einer Temperatur von etwa 200C bis etwa 8O0C und einem
pH von etwa 6,0 bis 9,0 bei einer Kontaktzeit von etwa T5 0,5 bis etwa 2 h in Berührung bringt, um 40 bis etwa
45 Gew.-% der in der Flüssigkeit enthaltenen Glucose in Fructose umzuwandeln, worauf man dann
die Temperatur in dem Isomerisierungsmedium auf etwa
900C bis etwa 140pC erhöht und den pH im Isomerisierungsmedium
auf einen Bereich von etwa 3 bis etwa 8, je nachdem, wie es erforderlich ist, einstellt und dann die
fructosehaltige Flüssigkeit mit der Glucoseisomerase eine weitere Zeit zwischen etwa 1 J bis etwa 5 h in Berührung
bringt, um dadurch das Umwandlungsniveau auf etwa 53 bis etwa 60 Gew.-% der in der ursprünglichen glucosehaltigen
Lösung enthaltenen Glucose zu bringen, wobei sich dann im wesentlichen keine Psicose oder andere Nicht-Fructose-,
Nicht-Glucose-Zucker bilden. Die Verwendung von hochaktiven gepackten Betten kann somit zu sehr niedrigen wirksamen
Kontaktzeiten führen, wodurch wiederum ein Abbau der Fructose, der bei den erfindungsgemäß erforderlichen hohen
Temperaturen eintritt, minimiert werden kann.
Bei der Auswahl der Immobilisierungstechnik für die
Glucoseisomerase werden Methoden bevorzugt, die in der Lage sind, kleine im wesentlichen nicht-komprimierbare
poröse Katalysatorteilchen zu ergeben, so daß eine Limitierung der Isomerisierungsrate durch Diffusionseffekte
minimiert wird. Alternativ kann man die Isomerase in den Poren einer Membran immobilisieren,, durch welche die
Glucoselösung während der Hochtemperaturisomerisierung hindurchgezwängt wird, so daß ein guter Kontakt zwischen
dem Enzym und dem Substrat vorliegt und Diffusionseinschränkungen minimiert werden. Der zum Immobilisieren
verwendete Träger ist vorzugsweise vollkommen unlöslich und inert, um eine unzulässige Verunreinigung oder einen
Abbau der Glucose/Fructosekomponenten in den Substratlö-
15 sungen zu vermeiden.
In der Praxis werden jedoch fructosehaltige Sirupe nicht aus reiner Glucose hergestellt. Vielmehr verwendet man
Stärkehydrolysate, die nach den vorerwähnten Druckschriften hergestellt werden, als Glucoseguelle und diese enthalten
immer"Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Saccharide
(nachfolgend als Polysaccharide bezeichnet), die sich von einer unvollständigen ■ Stärkehydrolyse- ableiten und
die Umwandlungsprodukte von Glucose. Typischerweise macheri
diese 3 bis 8 % des Gesamttrockengewichts von den durch die Stärkehydrolyse erhaltenen Sacc.hariden aus.
Deshalb ist es erforderlich, unter Berücksichtigung der Temperatur, bei welcher die Isomerisierung durchgeführt
werden soll, daß alle in der Glucoseflüssigkeit enthal- ';
tenen Polysaccharide sowie auch die anderen Faktoren, wie der Gesamtfructosegehalt auf Trockenbasis, die Bildung
von Psicose und von anderen Nicht-Glucose- und Nicht-Fructose-Produkten
während der effektiven Kontaktzeit der Glucoseflüssigkeit und der Isomerase berücksichtigt
werden. Die Beziehungen zur Berechnung der Isomerisationstemperatur werden nachfolgend gezeigt:
m β 215 273 (5)
1 2.3005-InK J
K ~ 100-F
_ 10,000 (M+C) (?)
* " Q(IOO-P)
05
05
T = Isomerisierungstemperatur (0C)
F = Gleichgewichtsfructosegehalt (%, bezogen auf Gesamt-
glucose + Fructose) bei der Temperatur T M = % Fructosetrockengehalt, erforderlich in dem isomerisierten
Produkt
C = Psicose und andere Abbauprodukte, die sich während
der effektiven Isome'risierungskontaktzeit bilden Q = % des Gleichgewichts, das sich während der Isoinerisierungsreaktion
einstellt
P = % Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.
P = % Polysaccharidgehalt der Glucoseflüssigkeit.
Typischerweise bilden sich weniger als 1 % und vorzugsweise weniger als 0,5 % Psicose und andere Abbauprodukte
und man kann ein 99,5 %iges Gleichgewicht erzielen. Um deshalb Sirupe mit 55,5 % Fructose (Trockengehalt) herzustellen,
benötigt man die nachfolgenden Isomerisierungstemperaturen für Glucoseflüssigkeiten-mit den angegebenen
Polysaccharidgehalten.
Polysaccharid in Isomerisierungs-
der Glucoseflüssig- temperatur keit
(% Trockenbasis) (0C)
0 95.7
1 99,1
2 104,3
3 108,9
4 113.8 6 124,3 8 136,1
J Für den Handel geeignete Produkte enthalten durchschnittlich
55,5 % Fructose auf Trockenbasis. Dies beruht darauf,
— 2. ό ~
daß bei einem solchen Fructosegehalt ein Maissirup mit
hohen Fructosegehalt (HFCS) die gleiche Süße entwickelt, wie Saccharose, jeweils auf das gleiche- Trockengewicht
bezogen. Weiterhin ist ein HFCS mit 55,5 % Fructosegehalt ·
QC ein im Handel eingeführter Artikel, den man ganz oder zum
Teil als Ersatz für Saccharose in zahlreichen Nahrungsmitteln und insbesondere in kohlensäurehaltigen Säften
und Getränken verwendet. Der Verbrauch von HFCS in den USA beträgt erwartungsgemäß 1,3VlO kg (2,9 billion pounds)
in 1982 und wächst 1983 auf 1,8-10 kg (4,0 billion
pounds). Aufgrund der Schwierigkeiten, die beim Liefern, Lagern, Abmessen und Formulieren von EFCS in Nahrungsmitteln
auftreten, besteht ein großer Bedarf an gleichmäßigen Produkten, unabhängig von den HFCS-Herstellern,
so daß man Produkte aus unterschiedlichen Quellen austauschbar und gleichzeitig verwenden kann. Deshalb haben Fructoseniveaus
von 55 - 56 % auf Trockengewichtbasis eine besondere Bedeutung bei den HFCS-Herstellern erlangt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ergibt Fructoseniveaus
von wenigstens 53 % und vorzugsweise wenigstens 54 % und insbesondere wenigstens 55 %.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, anstelle
von einer Lösung, die nur Glucose als Substrat enthält) eine Lösung von Glucose zu verwenden, in welcher
bereits ein Teil der Glucose zu Fructose isomerisiert ist. Beispielsweise kann man nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren eine Lösung von isomerisierter Glucose, die bis
zu 50 % Fructose enthält,behandeln, um dadurch die Konzentration der Fructose auf die erwünschteren Niveaus
oberhalb 50 % und vorzugsweise auf Niveaus von 55 bis 56 % oder darüber zu bringen.
Lösungen von Glucose, die Fructose in Mengen von weniger als 50 Gew.-%, bezogen auf die Kohlehydrate enthalten,
können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Unter Berücksichtigung der vorerwähnten Erfordernisse des pH-Wertes und der Kontaktzeit kann man bekannte
Glucoseisomerisierungsverfahren in geeigneter Weise so anpassen, daß sie bei etwa 90 bis etwa 1400C und vorzugsweise
bei etwa 100 bis etwa 11O0C betrieben werden und
wobei man die erfindungsgemäßen Hoch-Glucose-Fructose-Sirupe
erhält.
Die Thermostabilität der Glucoseisomerase kann durch ein oder mehrere chemische Behandlungen merklich erhöht werden,
wobei das Enzym jedoch eine beachtliche Aktivität beibehält. Ein so behandeltes Enzym wird als "chemisch
stabilisierte Isomerase" bei der vorliegenden Erfindung bezeichnet.
Die chemische Stabilisierung der Isomerase kann auf verschiedene Weise, mittels welcher man eine erhöhte Stabilität
erzielen kann, erfolgen. Eine fundamentale Arbeitsweise besteht darin, daß man strukturelle Elemente in
das Enzymmolekül derart einführt, daß das Enzym beim Erhitzen oberhalb seines normalen thermischen Denaturisierungspunktes
beständig bleibt. Eine bevorzugte Methode, um dies zu erzielen, besteht darin, daß man das
Enzym durch chemische Substitution mit Resten, welche polymerisierbar Vinylgruppen enthalten, modifiziert,
wobei die letzteren fest an die Oberfläche des Enzymmoleküls an einigen Punkten gebunden sind. Anschließend
wird das modifizierte Enzym mit einer oder mehreren polymerisierbaren
Vinylverbindung(en) in einer wässrigen
Lösung vermischt und die Mischung wird unter Ausbildung eines chemisch stabilisierten Enzyms, in welchem das
Enzym fest an verschiedenen Punkten an eine dreidimensionale Polymermatrix gebunden ist, welche eine Struktur auf-
weist, die komplementär der Struktur des Enzyms ist,
copolymerisiert.
Beispiele für diese Art der Stabilisierung werden von Martinek et al. in Biochem. Biophys. Acta 485,
1-12 (1977) und von Kulys et al. in Biokhimiya, 42,
Nr. 3, 453-59 (1978) beschrieben.
Es ist wichtig, daß man bei der Durchführung der vorerwähnten Reaktionen Bedingungen vermeidet, die zu einer
Denaturisierung der Isomerase mit einem dadurch bedingten Aktivitätsverlust führt. Beispielsweise muß man extreme
pH-Werte und Temperaturen während aller Manipulationen, die erforderlich sind, um die obigen Umsetzungen durchzuführen,
vermeiden.
Beispiele für Reagentien, die zum Modifizieren der Isomerase unter Einführung von polymerisierbaren Vinylgruppen
geeignet sind, sind Acryloylchlorid, Methacryloylchlorid,
Acrolein, Crotonaldehyd, Maleinsäureanhydrid, 3,4-Depoxybuten, Acrylsäure-2,3-epoxypropylester, Acrylsäure
—2,3-thioglycidylester, 1-Allyloxy-3-(N-ethylenimin)-2-propanol,·
Acrylsäure-O-succinamidester, Chlormaleinsäureanhydrid,
Maleinsäureazid, 3-Brompropen und Allylisothiocyanat. Einige Verbindungen sind in der Lage
mit den freien Aminogruppen der Isomerase zu reagieren, z.B. epsilon-Aminogruppen von Lysinresten.
Weitere Verbindungen, die in der Lage sind, mit den freien Carboxylgruppen der Isomerase zu reagieren, kann man
auch verwenden, um polymerisierbare Vinylreste als
Substituenten einzuführen, wie für j'eden Fachmann ersichtlich ist.
Beispiele für Vinylverbindungen, die man mit der modi-
fizierten Isomerase copolymerisieren kann, sind Natriumacrylat,
Natriummethacrylat, Acrylamid, Hydroxyethylmethacrylat,
Acryloylpiperidin-4-spiro-2'-(1',3'-dioxacrylopentan),
1-Aeryloy1-4-piperidon und Acryloylmethoxyamin.
Im allgemeinen bevorzugt man wasserlösliche Monomere oder Monomerengemische, welche wasserlösliche
Polymere ergeben (wenn man sie in Abwesenheit eines Vernetzungsmittels polymerisiert).
Typische difunktionelle Vinylverbindungen werden in die Monomerengemische (in Mengen von 0,1 - 5 % der Gesamtmonomeren)
eingebracht, um Vernetzungsstellen auszubilden, die dann zu dreidimensionalen Polymerennetzwerken führen.
Geeignete Verbindungen sind N,N'-Methylen-bis-acrylamid
und Ethylenglykoldimethacrylat. Bei Verwendung dieser Verbindungen bilden die polymerisieren Mischungen unlösliche
Gele unter Erhalt einer immobilisierten Isomerase.
Die üblicherweise bei Vinylpolymerisationen verwendeten Initiatoren können auch hier verwendet werden, z.B.
Ammoniumpersulfat plus Natriumbisulfit, Hydrogenperoxid
plus Ferrosulfat, Kaliumsulfat plus Ν,Ν,Ν',N'-Tetramethyl-ethylendimain
und Riboflavin (plus Licht).
Alternativ können nicht-kovalente Bindungen an die dreidimensionale
Polymermatrix ausreichen, um dem Isomerasemolekül die gewünschte Festigkeit zu geben und dadurch
eine merkliche Erhöhung der Thermostabilität zu bewirken. Dies kann man erzielen, wenn man Isomerase mechanisch
in ein vernetztes Polymergel einhüllt. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, daß man die Isomerase durch Einführen
einer Vinylverbindung vor der Polymerisationsstufe modifiziert. Die Konzentration des Gels muß jedoch
größer als etwa 30 Gew.-% betragen, um eine merkliche Stabilisierung
zu erzielen, wobei Gele mit einer Konzentration
von etwa 50 % bevorzugt werden. Monomere, die Polymergele ergeben, die elektrostatische und Wasserstoffbindungen
mit der Isomerase ausbilden, sind beispielsweise Natriumacrylat, Natriummethacrylat, Acrylamid und Hydroxyethylmethacrylat.
Beispiele für die Stabilisierung durch Inkorporieren in einen Gel werden von Martinek et al. in Biochem. Biophys.
Acta 485, 13-28 (1977) und von Kulys et al. in J. Solid Phase Biochem. 3_, 95-105 (1978) angegeben.
Eine dritte Methode zur Verfestigung der Isomerase besteht in einer intramolekularen Vernetzung, wodurch eine zusätzliche
Thermostabilität erzielt wird.
Beispiele für solche Stabilisatoren werden von Torchilin et al in Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek
et al. in J. Solid Phase Biochem, 2_, 343-85 (1977) und
Torchilin et al. in Biochem. Biophys. Acta, 568, 1-10
20 (1979) beschrieben.
Geeignete erfindungsgemäß verwendbare Vernetzungsmittel sind zweifunktionelle Verbindungen, die in der Lage sind, mit
den entsprechenden funktioneilen Gruppen an dem Enzymmolekül zu reagieren. Meistens sind solche funktioneilen Gruppen Aminogruppen, und zwar im allgemeinen primäre Aminogruppen,
die mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, wie Carboxylsäuren, SuIfony!halogeniden, Aldehyden, Isocyanaten,
Propiolaten und dergleichen reagieren können.
Die Vernetzungsmittel schließen somit Dicarbonsäureanhydride, wie Bernsteinsäureanhydrid und Adipinsäureanhydrid ein und
die entsprechenden Dialdehyde schließen Glyoxal, Bernsteinsäureanhydrid
und Glutaraldehyd ein. Ungesättigte Verbindüngen, wie Acrolein und Crotonaldehyd, Diolpropiolate,
wie Ethylenglykol-bispropiolat, Propylenglykolbispropiolat
und Hexamethylenglykolbispropiolat sowie Disulfonylhalogenide, wie Benzol-1,3-disulfonylchlorid, Naphthalin-1
,5-disulfonylchlorid und ToIy 1-2 ,4-distilfonylchlorid
sind eingeschlossen.
Da das Enzym Säuregruppen enthält oder so modifiziert wird, daß es Säuregruppen enthält, die mit Aminen reaktiv
sind, kann man difunktionelle Amine als Vernetzungsmittel verwenden. Dazu gehören beispielsweise Diamine mit
bis zu 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Phenylendiamin,
Butylendiamin, Hexylendiamin, Octylendiamin, Pentylendiamin, Ethylendiamin und Dodecylendiamin.
Die Menge des Vernetzungsmittels kann erheblich variieren, wobei das Verhältnis von Enzym zu Vernetzungsmittel im
Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,0001 liegt. Das Verfahren zur Erzielung der jeweiligen Bindung hängt zu einem gewissen
Grad von der Art des ausgewählten Vernetzungsmittels und des Enzyms ab. Im allgemeinen wird das Reagens
in einem geeigneten inerten Lösungsmittel gelöst und die Umsetzung wird bei einer ausreichend niedrigen Temperatur
durchgeführt, um negative Wirkungen auf das Enzym, das gegenüber hohen Temperaturen empfindlich ist, zu vermeiden.
Im allgemeinen wird daher die Umsetzung vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung von
Wasser oder wässrigen Lösungsmitteln cils Reaktionsmedium.
Außer der Einführung von polymerisierbaren Vinylgruppen in das Enzymmolekül und anschließender Polymerisation
gemäß den vorerläuterten Verfahren schließt eine weitere
Ausführungsform ein, daß man ein vorgebildetes Polymer mit der Isomerase unter Ausbildung von intermolekularen
kovalenten Bindungen und Bildung eines stabilisierten Moleküls kondensiert. Beispielsweise kann man Polypeptide,
wie natürlich vorkommende Proteine und deren Hydrolyse-
produkte nach bekannten Verfahren unter Ausbildung von
Peptidbindungen mit Glucoseisomerase unter Bildung eines stabilisierten Enzyms umsetzen. Die so .hergestellten
Produkte können wasserlöslich sein, aber man kann sie unter Verwendung von Vernetzungsmitteln, wie Glutaraldehyd,
unlöslich machen und das dabei gebildete vernetzte Enzym ist dann gewöhnlich besonders stabil. Die Peptidbildungsreaktionen
werden in bekannter Weise durchgeführt, z.B.
unter Verwendung von Carbodiimiden. 10
Gewünschtenfalls kann das Ausgangsenzym derivatisiert werden, um eine gewünschte Funktionalität in das Molekül
zum Zwecke der Kondensation mit dem vorgebildeten Molekül einzubringen. So kann man zum Einbringen einer Carboxyfunktionalität
ein freies Amino-enthaltendes Enzym mit einer Dicarbonsäure umsetzen unter Ausbildung eines Carboxy-enthaltenden
Enzyms.
Bevorzugte Polymere, die in der vorerwähnten Ausführungsform verwendet werden können, sind alle solche, die die
jeweiligen Arten und Mengen der funktionellen Gruppen, z.B. Amino oder Carboxy, für die beabsichtigte Reaktion
enthalten. Bevorzugt werden Polypeptide, wie natürliche Proteine, z.B. Chitosan, Hefeprotein und dergleichen und
auch Mischungen davon und als aminohaltige Polymere PoIyethylenimin.
Im allgemeinen bilden die bevorzugten vorgebildeten Polymere wasserlösliche Produkte, wobei diese
dann vorzugsweise durch Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, z.B. mit Glutaraldehyd und in anderen vorher
erwähnten unlöslich gemacht werden.
Bei den vorerwähnten Modifizierungsmethoden für das Enzym
ist es wesentlich, daß eine ausreichende chemische Funktionalität, z.B. Amino- oder Carboxy-Gruppen, vorliegen,
um ein ausreichendes Niveau des gewünschten Ergebnisses zu erzielen.
- 30 - · ■ !
Bei der Auswahl des vorgebildeten Polymers, das mit dem
Enzym umgesetzt werden soll, ist es beispielsweise erforderlich, daß das Polymer Gruppen enthält, die mit den
verfügbaren Gruppen an dem Enzymmolekül reaktiv sind.
So würde man ein Protein mit Carboxygruppen auswählen, um mit den entsprechenden Aminogruppen des Enzyms zu reagieren.
Darüber hinaus muß eine ausreichende Anzahl der reaktiven Gruppen bei den ausgewählten Reaktanten vorliegen,
um eine Bindung an vielen Stellen zu bewirken, und dadurch eine merkliche Stabilisierung zu erzielen.
Die Bestimmung der Art und der Zahl solcher reaktiven Gruppen für die jeweiligen Reagentien ist natürlich aus
dem Stand der Technik bekannt.
Ein weiteres Verfahren, mittels dessen man die Thermostabilität von Enzymen erhöhen kann, besteht darin, daß man
die Oberflächenstruktur chemisch verändert, und zwar ohne merklichen Aktivitätsverlust. So kann man Oberflächenaminogruppen
amidinieren (Ludwig, M.L. und Hunter, M.J., Meth. Enzymol. 11, 595-604 (1967)) oder guanidinieren
(Kimmel, J.R., Meth. Enzymol. 11, 584-589 (1967)), um
Substituenten auszubilden, die Arginin sehr ähnlich sind. Milchsäuredehydrogenase und andere Proteine sind so,
stabilisiert worden (siehe Tuengler, F. und Pfleiderer,
G., Biochem. Biophys. Acta, 284, 1-8 (1977); Minotani,N.,
et al.> Biochim. Biphys. Acta, 581, 334-341 (1979); und
Cupo, P., et al., J. Bio!. Chem., 255, 10828-10833 (1980)).
Die Aktivität von löslichen Isomerasezubereitungen wurde bestimmt nach Lloyd et al. in Cereal Chemistry, 49, Nr. 5,
Seiten 544-553 (1972). Ein IGIU ist die Menge an Isomerase, die 1 uMol Glucose pro min in Fructose umwandelt, und zwar
in einer Lösung, die 2 Mol Glucose pro 1, 0,02 Mol MgSO, pro 1 und 0,001 Mol CoCl2 pro 1 bei einem pH von 6,85
(0,2 M Natriummaleat).enthält und eine Temperatur von
600C aufweist.
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben, die Erfindung.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird die direkte Isomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem
Maisstärkehydrolysat besteht unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 55,5 % Fructose (Trockenbasis) und
unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahren beschrieben. Zunächst wird eine Niedrigtemperaturisomerisierung
bei 700C durchgeführt und das Produkt dieser Umsetzung wurde in einem zweiten Hochtemperaturreaktor
(105,20C), enthaltend chemisch stabilisierte Isomerase,
eingeführt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein lösliches
Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert wurde.
Das. Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach dem in US-PS 3 644 126 (Verflüssigung) und US-PS 3 280 006 (Saccharifizierung)
beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 3 834 940 raffiniert
unter Erhalt von 95,3 %iger Glucose (Trockenbasis). Es wurde ausreichend kristalline Glucose zugegeben und der
Gesamtglucosegehalt auf 97,6 % (Trockenbasis) gebracht. Die erhaltene Lösung hatte folgende Zusammensetzung:
| Gesamttrockensubstanz (%) | 50,2 |
| Glucose (% Trockenbasis) | 97,6 |
| Fructose (% Trockenbasis) | 0,0 |
| Polysaccharid (% Trockenbasis) | 2,4 |
| Psicose (% Trockenbasis) | 0,0 |
| NaHSO3 (mM) | 50,0 |
| MgSO4 (mM) | 5,0 |
| CoCl2 (mM) | 0,1 |
| pH | 6,8 |
Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt, indem man die obige Substratlösung durch den Niedrigtemperaturreaktor
mit einer Fließrate .von 3,2 ml/min bei 700C pumpte. Der Niedrigtemperatur(700C)-Isomerasereaktor
bestand aus gepackter Isomerase, die auf DEAE-Cellulose (hergestellt gemäß US-PS 3 788 945)
immobilisiert war und die in eine Säule eingebracht wurde mit einem Durchmesser von 2,54 cm, wobei die
Säule einen Einlaß und einen Auslaß hatte und die mit
10 einem Mantel zum Zirkulieren von Wasser aus einem
Thermostaten/versehen war. Der Kopfraum oberhalb der
Packung enthielt ein Thermometer und war im übrigen mit Glasperlen gefüllt, um den toten Raum soweit wie möglich
zu mininieren. Der Reaktor enthielt ausreichend
immobilisierte Isomerase, um 20.000 IGIU zu ergeben und das gepackte Bett hatte eine Höhe von etwa 15 cm.
Die ersten 1000 ml, die aus dem Reaktor heraustraten, wurden verworfen. Anschließend wurde der Abfluß zur
Verwendung in der zweiten Hochtemperaturisomerisierung
20 gesammelt.
Der chemisch stabilisierte Katalysator für den Hochtemperaturreaktor
wurde in folgender Weise hergestellt:
Eine Spezies von Streptomyces rubigenosus, erhalten von
S. rubigenosus ATCC 21175 wurde in einer aeroben Tauchfermentation
auf dnem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Gew.-%
30 Dextrose 9,0
Maismeische 1,6
Diammoniumphosphat 0,08
Mangansulfat , 0,06
Antischaummittel 35 (Pluronic PL-61) 0,003
Das Medium wurde 45 min bei 1210C sterilisiert, abgekühlt
und auf den pH 6,8-7,0 eingestellt. Dann wurde es mit 14 % (V/V) eines Inokulums aus dem Gehalt eines Impfgutfermenters,
hergestellt mit der S. Rubigenosus-Variante der oben erwähnten Art, inokuliert. Die Fermentierung wurde
unter aseptischen Bedingungen bei 300C während etwa 60 h unter Belüftung mit 0,65 vvm. durchgeführt.
• S. rubigenosus ATCC 21175 kann auch zum Inokulieren und
zur Herstellung von Isomerase verwendet werden, wobei in diesem Fall ein Medium folgender Zusammensetzung verwendet
wird.
Gew.-%
Dextrose 0,24
Maismeische (Feststoffe) 1,5 15 Sorbit 1,6
CoCl2 0,02
Diammoniumphosphat 0,56
Xylose 1 ,0
Glucoseisomerase wurde aus dem S. rubigenosus extrahiert
durch Zugabe von 0,35 % Maguat MC 1412 (Mason Chemical Co.)
und 10 ppm Hühnereilysozym und 5-stündigem Schütteln bei 400C und einem pH von 6,3-6,6. Das Gemisch wurde dann filtriert,
wobei man eine Lösung von roher, ungereinigter
25 Glucoseisomerase erhielt.
Die rohe Isomerase wurde dann Absorption auf DEAE-Cellulose
(hergestellt gemäß US-PS 3 823 133) gereinigt, filtriert und das adsorbierte Produkt wurde mit 0,1 M NaCl-Lösung
gewaschen unter Entfernung der Verunreinigungen und dann durch Kontaktieren, mit 0,45 M NaCl-Lösung desorbiert.
Während der Reinigungsstufen wurde der pH-Wert aller Lösungen auf 7,5 gehalten. Die Lösung der partiell gereinigten
Isomerase wurde mit 3 Volumina 95%igem "Ethanol bei 00C zum Ausfällen der Isomerase vermischt. Perlite-Filter-
hilfe wurde zugegeben und der gewonnene Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen und an der Luft getrocknet,
wobei man eine lösliche Isomerasezubereitung erhielt, die 2500 IGIU/g enthielt.
Die gereinigte Isomerase wurde in 1 mM MnCl2 bei Raum- '
temperatur gelöst unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 10 mg Isomerase pro ml und die Mischung wurde zur Entfernung
der Filterhilfe filtriert. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug 37,3 IGIU/mg Protein.
Eine Lösung aus einem löslichen Polyaminpolymer wurde hergestellt, indem man 39,0 g Chitosan in 13 1 0,08 N
HCl auflöste. Die Chitosanlösung wurde durch Zugabe von 380 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene
Lösung wurde mit 8 N NaOH auf 6,15 eingestellt. Dann wurde die Chitosanlösung durch einen Whatman #3-Papierfilter
zum Entfernen von unlöslichem Material filtriert. Zu 13 1 von 0,3 % Chitosan in 0,5 M NaCl bei pH 6,15
wurde folgendes zugegeben: 100 ml lösliche Isomerase enthaltend 100.000 IGIU-Aktivität, 197,6 g Xylit und
0,619 g CoCl2'6H2O. Diese Lösung wurde 2 h gerührt und
anschließend wurden 6,24 g 1-Ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimid
zugegeben und dadurch wurden die Carboxylgruppen der Isomerase kovalent an vielen Punkten mit den
Aminogruppen des Chitosans· gebunden. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurden 15,6 ml einer 50%igen (V/V) Glutaraldehydlösung,
eingestellt mit 8 N NaOH auf pH 6,0, zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan-Komplex
zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 2 1 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 zugegeben, um das Zerkleinern
des bei der Glutaraldehydzugabe gebildeten Gels zu erleichtern. Das gebildete insolubilisierte Isomerase-Chitosan
wurde mit entionisiertem Wasser auf einem Buchner-Vakuumfilter gewaschen. Diese Zubereitung ließ
man über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen
und siebte sie dann auf einer Maschengröße von 12-60 mesh (1,4 - 0,25 mm). Der trockene Katalysator hatte eine
Aktivität von 384 IGIU/g.
Der bei 105,20C betriebene Reaktor wurde in folgender Weise
hergestellt: Ein 13 g-Anteil des Katalysators wurde ■ im Substrat suspendiert und unter einem Laborvakuum bei
Raumtemperatur während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5 χ 20cm-Bettes
in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 4 992 IGIU.
Das aus der ersten bei 700C durchgeführten Isomerisation
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch
die Hochtemperaturreaktorsäule unter einem Druck von 1,7 bar
(10 psig) mit einer Fließrate von 1,96 ml/min bei 600C während 30 min gepumpt. Die Temperatur in der Säule wurde
mittels eines Thermometers überwacht, welches direkt oberhalb des Bettes angebracht war und von 0,5 cm Glasperlen
umgeben war, um das tote Volumen so weit wie möglich zu minimieren. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht,
indem man öl, das in einem thermostatisch gesteuerten Bad auf 1060C eingestellt war, in Kreislauf fuhr.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter gemessen. Der Fructosegehalt betrug
50-58 %. Nachdem die Säulentemperatur 105,20C erreicht
hatte und nachdem der Fructosegehalt des Abflusses das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und
direkt in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,90 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt. Der Abfluß
wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt unterhalb 55 % abfiel.
Die aus dem bei 7O0C und bei 105,2°C-Reaktoren erhaltene
isomerisierte Lösung wurde auf die Kohlehydratzusammensetzung und Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden
mit gleichen Analysenergebnissen verglichen, die mit • einer unisomerisierten Substratlösung erhalten wurden und
werden in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt. 10
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C und
105,20C isomerisiert wurden
unisomerisiert
bej 700C isomerisiert
bei 105,20C isomerisiert
KohlehydratzusammenSetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis) Fructose Glucose Psicose Polysaccharld
51 ,-3-55,5
2,4
2,3
2,6
2,3
2,6
Farbe
(CIRFX100)
(CIRFX100)
0,5
14,1
14,1
00 CO CO CD CD
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,5%ige Fructose erhält, wobei der Gehalt an Psicose unterhalb 0,4 Gew.-%
(Trockenbasis) lag. Die Erhöhung der Farbe betrug < 20 (CIRF X 100).
05
05
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer ·
glucosehaltigen Lösung (bestehend aus raffiniertem Maisstärkehydrolysat plus kristalliner Glucose) bei einer
hohen Temperatur unter Erhalt einer Zusammensetzung, die 55,2 % Fructose auf Trockenbasis enthielt, gezeigt,
wobei eine zweistufige Isomerisierung angewendet wurde und man bei der zweiten Stufe eine chemisch stabiliserte
Isomerase verwendete, die aus Glucoseisomerase bestand, die mit Polyethylenimin einen Komplex bildete und wobei
der Komplex durch Behandeln mit Glutaraldehyd unlöslich gemacht wurde.
20 Herstellung von stabilisierter Isomerase
Eine lösliche Glucoseisomerase wurde wie im Beispiel 1 beschrieben
hergestellt. Die gereinigte Isomerase wurde in 1 .mM MnCl2 unter Erhalt einer Lösung, enthaltend 9 mg
Isomerase pro ml bei Raumtemperatur gelöst und von der Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert. 60 ml 10%iger
(W/V) PEI-6 (Polyethylenimin, Molekulargewicht 600, pH 8) und 3 g Xylit wurden zu 300 ml der Enzymlösung gegeben
und die erhaltene Lösung wurde für 15 min gerührt.· 10 ml 2,5 M Glutaraldehyd wurden zugegeben und die Mischung
wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das insolubilisierte Enzym wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und
über Nacht in einem Konvektionsofen bei 370C getrocknet.
Nach dem Trocknen erhielt man 12,8 g immobilisierte Isomerase, enthaltend etwa 775 IGIU/g. 12g des immobilisierten Enzyms
wurden in dem Substrat suspendiert, im Vakuum bei 60 min
bei Raumtemperatur entlüftet und zur Herstellung eines Hochtemperaturreaktors mit einem Durchmesser von 1,5 cm
verwendet.
Das Substrat für den Reaktor wurde in der ersten Stufe der zweistufigen Isomerisierung wie im Beispiel 1 hergestellt.
Dieses Substrat hatte folgende Zusammensetzung:
Gesamttrockensubstranz (%) 4 2,6
10 Glucose (% Trockenbasis) 46,4
Fructose (% Trockenbasis) 51,3
Polysaccharid. (% T.rockenbasis) 2,3
Psicose (% Trockenbasis) 0,0
0
15 MgSC (mM) 50
15 MgSC (mM) 50
Das Substrat wurde durch den Reaktor während 45 min bei 600C in einer Rate von etwa 5 ml/min gepumpt. Die Säulentemperatur
wurde auf 101,60C erhöht und die Fließrate
auf 2 ml/min verringert. Ein Rückdruck von 1,84 bar (12 psi) wurde an die Säule.angelegt, um ein Sieden des
Substrats zu verhindern. Der Abfluß wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt
50-58%· Fructose. Der Abfluß,der mehr als"55% Fructose
enthielt, wurde in einem Eisbad gesammelt und mit 1,0 M Zitronensäure auf pH 4,0 eingestellt.
Der Abfluß aus dem Hochtemperaturreaktor, das Substrat aus dem Reaktor der ersten Stufe und die ursprüngliche glucosehaltige
Lösung, die als Substrat in dem Reaktor der ersten Stufe verwendet worden war, wurden analysiert auf
die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe. Die Ergeb-
35 nisse werden in der Tabelle 2 gezeigt.
| NaHSO3 | (mM) |
| MgSO4 | (mM) |
| CoCl2 | (mM) |
| pH |
Zusammensetzungen der Lösungen aus der Isomerisierung der
ersten und zweiten Stufe
Lösungsbehandlung
'.
unisomerisiert
isomerisiert bei 7O0G isomerisiert bei 101,60C
isomerisiert bei 7O0G isomerisiert bei 101,60C
KohlehydratZusammensetzung
Farbe
| • (Gew. | -% auf | aschefreier | Trockenbasis | (CIRF X100) |
| Fructose | Glucose | Psicose | Polysaccharid | |
| 0 | 97,6 | 0 | 2,4 | 0,5 |
| 51,3 | 46,4 | 0 | 2,3 | 0,7 |
| 55,2 | 42,1 | 0 | 2,7 | 51,7 |
O
I
I
CO
CO 00 CO
cn
Diese Ergebnisse zeigen, daß man 55,2%ige Fructose erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-%
(Trockenbasis) liegt.
05 Beispiel 3
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung von
Glucose zu einer 57,2%igen Fructose durch ein zweistufi— ·
ge's Isomerisierungsverf ahren gezeigt, wobei der erste Reaktor bei 700C und der zweite (Hochtemperatur-)Reaktor
bei 110,40C betrieben wurde. Die bei der Hochtemperaturreaktion
verwendete chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein
lösliches Polymer gebunden war, welches dann unter Ausbildung eines immobilisierten Katalysators insolubilisiert
wurde.
Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 700C betriebenen
Reaktor der ersten Stufe wird in Beispiel 1 beschrieben.
Der in dem Hochtemperatur-Reaktor bei 110,40C verwendete
immobilisierte Katalysator wird gleichfalls im Beispiel 1
beschrieben.
Der 110.,4°C-Reaktor wurde in folgender Weise hergestellt.
Ein Anteil von 28,4 g des Katalysators wurde in dem Substrat gelöst und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtempera-·
tür während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung
wurde zur Herstellung eines 2,5 χ 12,4 cm-Bettes in
einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 10.885 IGIU.
Das in der ersten, bei 700C betriebenen Isomerisierungsstufe
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,47 eingestellt
und auf 4 2,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule unter einem
Druck von 1,84 bar (12 psi) mit einer Fließrate von 3,38 ml/min bei einer Temperatur von 6O0C während 30 min
gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule wurde mittels eines Thermometers, das direkt oberhalb des Bettes
angebracht war und das durch 0,3 cm Glasperlen umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren,
überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell erhöht, indem man öl mit einer Temperatur von 1110C aus einem
thermostatisiertem Bad durch die Ummantelung zirkulierte.
Der Abfluß aus der Kolonne wurde mit einem kalibrierten Aufzeichnungspolarimeter überwacht und enthielt 50-58 %
Fructose. Nachdem die Säulentemperatur 110,4° erreicht
hatte, und nachdem der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt und
unmittelbar darauf in einem Eisbad gekühlt. Der pH wurde auf 4,0 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.
Die bei 700C und 110,4° aus den Reaktoren erhaltenen isomerisierten
Lösungen wurden auf die Kohlezydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse wurden
mit Analysen verglichen, die man mit unisomerisierten Substratlösungen erhielt. Die Ergebnisse werden in der
Tabelle 3 gezeigt.
Zusammensetzungen von Substratlösungen, isomierisiert
bei 700C und bei 110,40C
Kohlehydratzusammensetzung (Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)·
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
unisomerisiert ο
isomerisiert bei7Ö°C 52,3
isomerisiert bei.110,4 57,2
0C
| 99,2 | 0 |
| 46,9 | 0 |
| 41 ,5 | 0,3 |
0,8 0,8 1,0
Farbe (CIRFX100)
0,6
0,7
19,8
U)
I
co :
CO
OO '. CD
CD -O
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 57,2%ige Fructose
erhält mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,4 Gew.-% (Trockenbasis) und wobei der Farbwert (CIRFX100) unterhalb
20 liegt.
05
05
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung aus hauptsächlich raffiniertem
Maisstärkehydrolysat gezeigt, wobei man eine Zusammensetzung mit 56,3 % Fructose auf Trockenbasis unter Anwendung
eines zweistufigen Isomerisierungsverfahren erhielt.
Zunächst wurde eine -Isomerisierung bei niedriger Temperatur bei 700C durchgeführt und das Produkt aus dieser Umsetzung
wurde als Zufuhr für einen zweiten Hochtemperaturreaktor
(103,30C) verwendet, wobei der Hochtemperaturreaktor
chemisch stabilisierte Isomerase enthielt. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei
welcher das Enzym mit einem Schutzprotein (z.B. einem solchen, das sich von Hefe ableitet) koreagiert worden war.
Die Niedrigtemperaturisomerisierungsstufe einschließlich
der Beschreibung des Substrats und der Versuchsbedingungen entsprechen denen des Beispiels' 1 .
Das chemisch stabilisierte Glucoseisomeraseenzym, welches in dem Hochtemperaturreaktor verwendet würde, wurde .wie
folgt hergestellt: Lösliche Glucoseisomerase, die chemisch stabilisiert werden sollte, wurde nach dem in Beispiel 1
beschriebenen Verfahren hergestellt und gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa
40 IGIU/mg Protein. Ein Schutzprotein wurde aus Bäckerhefe
wie folgt erhalten: Zu 1229 g eines feuchten Kuchens aus Bäckerhefe wurden 1000 g Wasser und 500 g Toluol gegeben.
Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur erwärmt und dann auf 850C erhitzt und bei dieser Tempera-
tür etwa 30 min gehalten. Dann wurde die Mischung auf
einem Buchner-Trichter filtriert. Nahezu das gesamte Toluol verblieb in der unlöslichen Zelldebris,während
das wässrige Filtrat lösliches Hefeextrakt enthielt.
Das wässrige Filtrat wurde auf einem Drehverdampfer bei
4 00C auf 276 g vermindert und dann wurden 41 "g Tr ichloressigsäure
unter Rühren zugegeben.' Das ausgefallene Hefeprotein wurde gesammelt und in 0,1 M Natriumphosphatpuffer
(pH 7,0) wieder aufgelöst. Dann wurde durch Filtrieren geklärt und die Lösung wurde mit 9 00 ml (etwa 3 Volumina)
Aceton behandelt. Der Niederschlag wurde gesammelt, in 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und die
erhaltene Lösung wurde gegen einen 0,01 M Natriumphosphatpuffer dialysiert. Das erhaltene Produkt (150 ml) war mit
den aus Bäckerhefe erhaltenem Schutzprotein markiert.
Eine 0,6%ige Chitosanlösung wurde hergestellt, indem man
24 g Chitosin in 4 1 0,08 N HCl löste. Die Lösung wurde mit 8 N auf den pH-Wert 6,2 eingestellt, durch ein
Whatman #3-Filterpapier filtriert und dann gegen 16 1
entionisiertes Wasser dialysiert. In ein 400 ml Glas wurden etwa 100.000 IGIU lösliches Glucoseisomeraseenzym
(vermischt mit Filterhilfe), 1 g Xylit und 100 ml (2/3) des aus der Bäckerhefe.erhaltenen Schutzproteins vorgelegt.
-Zu dieser Mischung wurden 2,4 mg MgSO -7H^O und
24 μΐ einer molaren Kobaltchloridlösung gegeben. Von der
Mischung wurde die Filterhilfe abfiltriert und die Lösung wurde auf einem Drehverdampfer bei etwa 4 00C bis nahezu
zur Trockne in einem 2 1 Rundkolben konzentriert. Zu dem Kolben wurden dann 800 ml Chitosan (pH 6,2) gegeben. Die
Mischung wurde auf einem Drehverdampfer von etwa 400C
auf nahezu zur Trockne konzentriert und dann wurden 640 μΐ
50%ige Glutaraldehydlösung (pH auf 6,5 eingestellt) zugegeben. Die Mischung wurde in einem kalten Raum über Nacht
aufbewahrt. Dann wurde das Gel aus dem Kolben entnommen
--46 - -
und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,595 mm
gepreßt und bei etwa 370C ofengetrocknet. Die trockene
Enzymzubereitung wurde zur Entfernung von Feinstoffen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,177 mm
gesiebt und dann wurden (8,9 g des Endproduktes) für die Hochtemperaturisomerisierung verwendet.
' · Ein Reaktor, der bei 103,30C betrieben wurde, wurde wie
folgt hergestellt: Die obige Glucoseisomerasezubereitung (8,9 g) wurde in dem Substrat suspendiert und unter
einem Laboratoriumsvakuum 30 min bei Raumtemperatur entlüftet.
Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,5 χ 29 cm-Bettes in einer ummantelten Glassäule
verwendet.
Das aus der ersten bei 700C betriebenen Isomerisierung
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,75 eingestellt und auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt. Dieses Substrat wurde
durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einer Fließrate von etwa 1,5 ml/min und bei einer Temperatur von 600C
während 30 min gepumpt. Die Temperatur innerhalb der Säule wurde mit einem Thermometer, das direkt, oberhalb des
Bettes angebracht.war und das von Glasperlen (0,5 mm Durchmesser) umgeben war, um das tote Volumen zu minimieren,
überwacht. Die Säulentemperatur wurde dann schnell durch, durch die Ummantelung zirkulierendes öl aus einem
1040C thermostatisierten Bad erhöht.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter,
das Ablesungen von 50-58 % Fructose zeigte, überwacht. Fraktionen (etwa 5 ml) wurden gesammelt bis
55 % oder mehr Fructose gebildet wurden und an diesem Punkt wurde der Versuch abgebrochen. Während der Probenentnahme
wurde der Abfluß schnell auf einem Eisbad gekühlt und der pH wurde auf etwa 4,0 durch Zugabe von
molarer Zitronensäure (0,1 ml) und dann durch verdünnte
- 47 HCl auf etwa 4,0 eingestellt.
Die bei 700C und bei 103,30C aus den Reaktoren erhaltenen
isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung
und die Farbe untersucht und die Ergebnisse
wurden mit Analysen verglichen, die mit unisomerisierter Substratlösung erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
wurden mit Analysen verglichen, die mit unisomerisierter Substratlösung erhalten wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C und bei 103,3'
isorr.erisiert wurden
Kohlehydratzusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Farbe (CIRFX100)
unisomerisiert 0
isomerisiert bei 700C 51,3 isomerisiert bei 103,30C 56,3
97,6
46,4
41,5
46,4
41,5
2,4
2,3
2,2
2,3
2,2
0,5
0,7
34,0
CO .£- CjO OO CD OD O
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 56,3%ige Fructose erhält, wobei der Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-%
(Trockenbasis) lag.
05 Beispiel 5
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer
glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus einem raffinierten Maisstärkehydrolysat mit einer niedrigen
Salzkonzentration bestand, gezeigt unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 55,4 % Fructose auf. Trockenbasis
und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahrens.
Zunächst wurde eine Niedrigtemperaturisomerisierunc
bei 700C durchgeführt und das Produkt aus dieser Umsetzung wurde als Zufuhr in einem zweiten
Hochtemperaturreaktor (112,60C), enthaltend chemisch
stabilisierte Isomerase, verwendet. Die chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das
Enzym kovalent an ein lösliches Polymer mit zahlreichen Bindungen gebunden war und welches unter Ausbildung eines
immobilisierten Katalysators dann unlöslich gemacht worden war.
Das Hydrolysat wurde aus Maisstärke nach den in US-PS 3 644 126 (Verflüssigung) und US-PS 3 280 006 (Saccharifizierung)
beschriebenen Verfahren hergestellt. Die saccharifizierte Flüssigkeit wurde gemäß US-PS 3 834
gereinigt unter Erhalt eines Produktes, enthaltend 93/8 % Glucose (Trockenbasis). Es wurde soviel kristalline
Glucose zugegeben, daß der Gesamtglucosegehalt 96,9 % (Trockenbasis) betrug. Die erhaltene Lösung hatte
folgende Zusammensetzung:
Gesamttrockensubstanz (%) Glucose (% Trockenbasis) Fructose (% Trockenbasis)
Polysaccharid (% Trockenbasis) 05 Psicose
NaHSO3 (MM) MgSO4 (mM)
CoCl2 (mM) pH
50,3 96,9 0,1 3,1 0,0 2,5 2,5 0,1 6,8
Die Niedrigtemperaturisomerisierung wurde durchgeführt,
indem man die obige Substratlösung bei 7O0C durch den in Beispiel 1 beschriebenen Niedrigtemperaturreaktor
mit einer Fließrate von 2,5 ml/min pumpte. Die ersten aus dem Reaktor abfließenden 1000 ml wurden verworfen.
Der anschließend aus dem Reaktor erhaltene Abfluß wurde für die Verwendung bei der zweiten Hochtemperaturisomerisierung
gesammelt.
Der in dem Hochtemperaturreaktor verwendete chemisch stabilisierte Katalysator wurde in folgender Weise hergestellt:
Lösliche Glucoseisomerase wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt und
gereinigt. Die spezifische Aktivität dieser Zubereitung betrug etwa 40 IGIU/mg Protein. Eine Lösung eines löslichen
Polymers, eines Polyamine, wurde erhalten, indem man 48,4 g Chitosan in 15 1 0,08 N HCl löste. Die Chitosanlösung
wurde durch Zugabe von 4 38 g NaCl auf 0,5 M NaCl eingestellt und die erhaltene Lösung wurde mit
8 N NaOH auf den pH 6,1 eingestellt. Dann wurde die Chitosanlösung
durch ein Whatman #3-Filter zur Entfernung von unlöslichem Material filtriert. Zu 15 1 0,3 % Chitoson
in 0,5 M NaCl bei pH 6,1 wurden folgende Substanzen zugegeben: 520 ml lösliche Isomerase, enthaltend etwa
602.000 IGIU-Aktivität, 236 g Xylit und 3,07 g MnCl2-4H2O,
Diese Lösung wurde 2 h gerührt und dann wurden 7,44 g 1-Ethyl-S-dimethyl-aminopropylcarbodiimid zugegeben,
um die Carboxylgruppen der Isomerase an die Aminogruppen des Chitosans kovalent an zahlreichen Punkten zu
binden. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurden 15,5 ml einer 50%igen (W/W) Glutaraldehydlösung, eingestellt auf 6,0
mit 8 N NaOH, zu der Reaktionsmischung zugegeben, um den kovalent gebundenen Isomerase-Chitosan-Komplex
zu insolubilisieren. Nach 15 min wurden 4 1 einer 1 M Phosphatlösung bei pH 8,0 in das unlösliche Isomerase-Chitosan
eingemischt. Das immobilisierte Isomerase-Chitosan wurde mit entionisiertem Wasser auf einem
Buchner-Vakuum-Filter mit einem Whatman #3-Filterpapier
gewaschen. Die Zubereitung wurde dann an der Luft getrocknet, zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite
von 1,4 bis 0,25 mm gesiebt. Der trockene Katalysator zeigte eine Aktivität von 803 IGIü/g.
Ein 112,6°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt. Ein 7,0 g
Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspendiert und unter einem Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur
während 60 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur Herstellung eines 1,0 χ 40 cm-Bettes in einer
ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 5621 IGIU.
Das bei der ersten 70°C-Isomerisierung erhaltene Substrat wurde auf pH 6,55 eingestellt und dann mit entionisiertem
Wasser auf 42,0 % Trockensubstanz verdünnt, wodurch '30 auch die Salzkonzentration auf 2,1 mM NaHSCK und 2,1 mM
MgSO- erniedrigt wurde. Dieses Substrat wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,84
bar (12 psig) während 10 min mit einer Fließrate von 8 ml/min bei 600C gepumpt. Die Temperatur in der Säule
wurde mittels eines Thermometers überwacht, welches
direkt oberhalb des Bettes angebracht und das mit Sand bis zur Temperaturskala eingebettet war, um das
tote Volumen soweit wie möglich zu vermindern. Die Säulentemperatur wurde dann schnell durch aus einem
thermostatisierten Bad auf etwa 1140C erhitztes zirkulierendes
Öl erhöht. Die Säulentemperatur wurde auf 112,60C erhöht und die Fließrate auf 1,89 ml/min vermindert
.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter
überwacht, welches Ablesungen zwischen 50 und 58 % Fructose zeigte. Nachdem die Säulentemperatur
112,60C erreicht hatte und der Fructosegehalt
im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß gesammelt. Der pH wurde unmittelbar darauf durch
Zugabe von 1 M Zitronensäure auf 4,0 eingestellt und der Abfluß wurde gesammelt bis der scheinbare Fructosegehalt
unterhalb 55 % absank.
Die aus den 7O0C- und 112,6°C-Reaktoren erhaltenen
isomerisierten Lösungen wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe untersucht und die Ergebnisse
wurden mit. solchen Analysen verglichen-, die mit unisomerisierten Substratlösungen erhalten wurden.
25 Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
Zusammensetzung der SuBstratlösungen, die bei 70°C und 112,60C
isomerisiert wurden
KohlehydratZusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid·
(Gew.-% auf aschefreier Trockenbasis)
Lösungsbehandlung Fructose Glucose Psicose Polysaccharid·
unisomerisiert
isomerisiert bei 700C
isomerisiert bei 112,60C
isomerisiert bei 700C
isomerisiert bei 112,60C
| 0 | ,4 | 96 | ,9 | 0 | ,1 | |
| .51 | ,4 | 45 | ,9 | 0 | ||
| C | 55 | 42 | ,0 | 0 | ||
3,1
2,7 2,5
Farbe
(CIRF X 100)
(CIRF X 100)
0 8,5
CO OO CD
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 55,4%ige Fructose
mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,2 Gew.-% (Trockenbasis) und einen Farbwert <9 (CIRF χ 100) erhält.
05 Beispiel 6
In diesem Beispiel wird die Direktisomerisierung einer glucosehaltigen Lösung, die hauptsächlich aus raffiniertem
Maisstärkehydrolysat mit niedrigem Salzgehalt bestand, unter Erhalt einer Zusammensetzung mit 54,8 %
Fructose auf Trockenbasis und einem sehr niedrigen Gehalt an Psicose (<0,1 %) und einer Farbe (
< 2 CIRF χ 100), und unter Anwendung eines zweistufigen Isomerisierungsverfahrens.
Der erste (Niedrigtemperatur-)Reaktor wurde bei ''00C und der zweite (Hochtemperatur-) Reaktor bei
105,80C betrieben. Die im Hochtemperaturreaktor verwendete
chemisch stabilisierte Isomerase war eine solche, bei welcher das Enzym kovalent an ein geeignetes Polymer
mit zahlreichen Verknüpfungspunkten gebunden war, worauf man dann einen insolubilisierten immobilisierten
Katalysator herstellte.
Das Substrat und dessen Umwandlung in dem bei 700C betriebenen
Reaktor in der ersten Stufe "war das gleiche wie im Beispiel 5.
Der in dem Hochtemperaturreaktor bei 105,80C verwendete
immobilisierte Katalysator war der gleiche wie im Beispiel 5.
Der 105,8°C-Reaktor wurde wie folgt hergestellt: Ein 5,63 g
Anteil des Katalysators wurde in dem Substrat suspendiert und unter Laboratoriumsvakuum bei Raumtemperatur während
30 min entlüftet. Die entlüftete Aufschlämmung wurde zur
Herstellung eines 1,0 χ 32 cm Bettes in einer ummantelten Glassäule verwendet. Das gepackte Bett enthielt 4521 IGIU.
Das in der Isomerisierung der ersten Stufe bei 700C
erhaltene Substrat wurde auf pH 6,5 eingestellt und mit entionisiertem Wasser auf 4 2,0 % Trockensubstanz
verdünnt, wodurch auch die Salzkonzentration auf 2,1 mM MgSO4 und 2,1 mM NaHSO3 erniedrigt wurde. Das Substrat
wurde durch die Hochtemperaturreaktorsäule mit einem Druck von 1,7 bar (10 psig) und mit einer Fließrate
von 8 ml/min während 10 min gepumpt und dabei die Temperatur bei 600C gehalten. Die Temperatur in der Säule
wurde mittels eines Thermometers überwacht, das direkt oberhalb des Bettes angebracht war und welches bis zum
Beginn der Temperaturskala mit Sand umgeben war, um das tote Volumen soweit wie möglich zu minimieren. Die
Säulentemperatur wurde dann schnell durch in der Umwandung zirkulierendes Öl aus einem thermostatisierten
Bad von etwa 1070C erhöht.
Der Abfluß aus der Säule wurde mit einem Aufzeichnungspolarimeter,
das auf Ablesungen zwischen 50 und 58 % Fructose kalibriert war, überwacht. Nachdem die Säulenternpcratur
105,80C erreicht hatte und der Fructosegehalt im Abfluß das gewünschte Niveau aufwies, wurde der Abfluß
gesammelt. Der pH wurde direkt darauf auf 4,90 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.
Die isomerisierten Lösungen aus den 700C- und 1 05,80C-R'eaktoren
wurden auf die Kohlehydratzusammensetzung und die Farbe analysiert und die Ergebnisse wurden mit
Analysen verglichen, die mit der unisomerisierten Substratlösung erhalten worden waren und werden in der Tabelle
gezeigt.
Zusammensetzung der Substratlösungen, die bei 700C and 105,8°C
isomerisiert wurden
Kohlehydratzusammensetzung
(Gew.-% auf aschefreier Trogkenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
(Gew.-% auf aschefreier Trogkenbasis)
Fructose Glucose Psicose Polysaccharid
unisomerisiert <£ 0,1
isomerisiert bei 700C 51,4 isomerisiert bei 105,80C
54,8
96,9 45,9
42,3
0
0
0
3,1 2,7
2,8
Farbe (CIRF X 100)
0 0
1,8
CO CO CD CD O
Diese Ergebnisse zeigen, daß man eine 54,8%ige Fructose
erhält, mit einem Psicosegehalt unterhalb 0,1 Gew.% (Trockenbasis) und einem Farbwert (CIRF χ 100) unterhalb
2.
Claims (18)
- PATENT- UND RECHTSANWÄLTEPATENTANWÄLTE DIPL.-ΙΝΘ. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ΙΝβ. W. LEHN"D1PL.-1NQ. K. FOCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN . DR. RER. NAT. H,-A. BRAUNS · DIPL.-ΙΝβ. K. 6ORQDIPL.-INQ. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE41 021 o/waNABISCO BRANDS, INC., PARSIPPANY, N.J. / USAVerfahren zum Isomerisieren von Glucose zu FructosePATENTANSPRÜCHE\. /Verfahren zum Isomerisieren von Glucose zu Fruc- ^-—' tose, dadurch gekennzeichnet , dass man eine glucosehaltige Flüssigkeit, die mit stabilisierter Glucoseisomerase bei einer Temperatur zwischen etwa 9 0 und etwa 1400C bei einem pH-Wert von etwa 3 bis etwa 8 und einer tatsächlichen Kontaktzeit, die ausreicht, um eine Endkonzentration von wenigstens etwa 53 bis Gew.% Fructose, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt in der Flüssigkeit, zu erhalten,in Berührung bringt und dabei die Abbauzeit auf einen Wert überwacht, der gleich oder weniger alsARABELLASTRASSE 4 - D-BOOO MDNCHEN S1 · TELEFON (Ό89;) 911O87 · TELEX 5-2Q619 CPATHE) . TELEKOPIERER S18356der Wert, berechnet nach der Formeltd = a log (4300/(T+273) - pH - 3,23) (1)ist, worin bedeuten: T die Reaktionstemperatur in 0C; pH den pH-Wert der Reaktionsmischung; und t. die Abbauzeit in Minuten ist und wobei man im wesentlichen die Bildung von Psicose und/oder andere Nicht-Fructuose, Nicht-Glucose-Zuckern ausschliesst.
- 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die glucosehaltige Flüssigkeit durch die Hydrolyse von Maisstärke gewonnen15 wurde.
- 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die glucosehaltige Flüssigkeit durch Isomerisierung von Maisstärkehydrolysat bis zu einem Fructosegehalt von bis zu etwa 52 %, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt, erhalten wurde.
- 4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3,dadurch gekennzeichnet , dass die Quelle der Glucoseisomerase ein Mikroorganismus, ausgewählt aus Streptomyces-Spezies, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon, ist.
- 5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3,dadurch gekennzeichnet , dass die Quelle für die Glucoseisomerase ein Mikroorganismus, ausgewählt aus Streptomyces sp. ATCC 21175, Mutanten, Varianten und genetischen Modifizierungen davon ist.
- 6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn ζ e lehnet, dass die Quelle für die Glucoseisomerase ein Mikro-Organismus ist, in welchen eine mutierte Glucoseisomerase unter Ausbildung von mutierten Genen, die eine Glucoseisomerase mit hoher Wärmestabilität ergeben, eingeführt worden ist.
- 7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , dassdie Glucoseisomerase eine wärmestabile Glucoseisomerase ist.
- 8. Verfahren gemäss Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , dass die wärmestabile Glucoseisomerase von Bacillus Stearathermophilus erhalten worden ist.
- 9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , dass eine Enzymdenaturisierungsinhibierende Menge eines wasserlöslichen Salzes von Schwefelsäure im Isomerisationsmedium vorhanden ist.
- 10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9,dadurch gekennzeichnet , dass die glucosehaltige Zufuhrlösung etwa 30 bis etwa 50 Gew.% Kohlehydrate enthält.
- 11·. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10,dadurch gekennzeichnet , dass die glucosehaltige Zufuhrflüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase bei etwa 100 bis etwa 1100C in Berührung gebracht wird. 10
- 12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , dass der pH-Wert des Isomerisationsmediums auf etwa 5 bis etwa 6,5 gehalten wird.
- 13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Kontaktzeit etwa 2 bis etwa 30 Minuten beträgt.
- 14. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet , dass die chemisch stabilisierte Glucoseisomerase in einer immobilisierten Form verwendet wird.
- 15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch g e k e η η zeichnet , dass die chemisch stabilisierte Glucoseisomerase auf Diethylaminoethylcellulose immobilisiert worden ist.
- 16. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 15,dadurch gekennzeichnet , dass die glucosehaltige zugeführte Flüssigkeit, enthaltend etwa 20 bis etwa 65 Gew.% Glucose, mit Glucoseisomerase bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 800C bei einem pH von etwa 6 bis 9 und einer Kontaktzeit, die ausreicht um einen Endgehalt in der Flüssigkeit von wenigstens etwa 4 0 bis etwa 50 Gew.% an Fructose, bezogen auf den Gesamt-Kohlehydratgehalt, zu erhalten, in Kontakt hält, dass man die Temperatur in dem Isomerisationsmedium von etwa 90 auf etwa 1300C erhöht, dass man den pH-Wert des Isomerxsationsmediums im erforderlichen Masse anpasst innerhalb des Bereiches von etwa 3 bis etwa 8, dass man die f ructosehaltige Flüssigkeit mit chemisch stabilisierter Glucoseisomerase während einer tatsächlichen Kontaktzeit, die ausreicht um einen Endgehalt in der Flüssigkeit von wenigsten etwa 53 bis 60 Gew.% an Fructose, bezogen auf den Gesamt-Kohlenwasserstoffgehalt, zu erzielen, in Kontakt hält, wobei man die Abbauzeit auf einen Wert einstellt, der gleich oder weniger dem Wert ist, der durch die Formeltd = a log (4300/T+273) - pH - 3,23) (T)gegeben ist, worin T die Reaktionstemperatur in 0C, pH der pH-Wert der Reaktionsmischung und t, die Abbauzeit in Minuten ist, wobei man im wesentliehen die Bildung von Psicose und/oder anderen Nicht-Glucose- Nicht-Fructose-Zuckern ausschliesst.
- 17. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet , dass der erhaltene Fructose-Glucose-Sirup auf eine Temperatur unterhalb 8O0C gekühlt wird.
- 18. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , dass man die Isomerisationsmischung auf eine Temperatur von etwa 20 bis etwa 800C kühlt, nachdem das Enzym vom Kontakt mit der Isomerisationsmischung entfernt worden ist.
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