NL8403231A - Werkwijze voor het isomeriseren van glucose. - Google Patents

Description

* ' VO 6612

Werkwijze voor het isomeriseren van glucose.

De uitvinding betreft een enzymatische werkwijze voor het omzetten van glucose in fructose.

De meeste levensmiddelkwaliteit glucose wordt verkregen als een enzymatisch hydrolysaat van maïszetmeel, d.w.z. de handelsmaisstroop.

5 Glucose wordt gewoonlijk beschouwd als 60-80% zo zoet als saccharose en wordt daarom voor een overeenkomstig lagere prijs verkocht. Het is reeds lang bekend, glucose tot fructose (dat zelfs zoeter is dam saccharose) te isomeriseren onder toepassing van een enzym met een glucose isomerase activiteit,bij voorkeur een dat is geïmmobiliseerd op een in-10 erte drager, zoals diethylaminoethyl-cellulose,poreus glas of chitine.

Gedetailleerde beschrijvingen van de enzymatische omzetting van glucose < in fructose onder toepassing van isomerase kan.worden gevonden in Hamilton et al. "Glucose Isomerase a Case Study of Enzyme-Catalyzed Process Technology", Immobilized. Enzymes, in Food and.Microbial Processes, IS Olson et al., Plenum Press, New York, (1974), biz. 94-106, 112,115-137;

Antrim , et al·, "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", ♦

Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2, Academic Press (1979);

Chen, et al., "Glucose Isomerase (a Review)", Process Biochem.,(1980), biz. 30-35? Chen, et al. "Glucose Isomerase (a Review)" Process Biochem., 20 (1980), biz. 36-41? Nbrdahl, et al., "Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled Glucose Isomerase1*, Chem. Abstracts, Vol.82, (1975) ,Abs.

Mb. 110316h; and Takasaki, "Fructose Production Glucose Isomerase",

Chem. Abstracts, Vol. 82 (1975), Abs. NO. 110316h? and Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase", Chem·. Abstracts, Vol.81 25 (1974), Abs. No. 76474a. Bovendien bestaan er vele octrooien met betrek king tot een glucose-isomerisatie, waarvan de Amerikaanse octrooi-schriften 3.616.221? Reissue.28,885 (oorspronkelijk 3.623.953)? 3.694.314? 3.708.397? 3.715.276? 3.788.945? 3.326.714? 3.843.442? 3.909.354? 3.960.663? 4.144.127 en 4.308.349 representatief zijn.

30 De gehalten aan fructose, die via een isomerisatie .van glucose met glucose isomerase bereikbaar zijn is beperkt door het evenwicht van de isomerisatiereactie. Bij 65°C ligt dit evenwicht voor de reactie bij ongeveer 51 gew.% fructose bij een uitgangssubstraat van zuivere glucose. Wanneer een geraffineerde glucosestroop als substraat wordt 35 toegepast (met tot ca 6% niet-monosacchariden) en deze stroop een redelijke tijd in de enzymreactor verblijft,, kan een fructosegehalte 8403231 ¢. 4 -2- van hooguit 48-52% (op droge basis) worden verkregen.volgens de bovenweergegeven methoden. Om stropen te verkrijgen met een hoger fructose-gehalte moeten fractioneringssystemen. worden toegepast,, waardoor de prijs van het eindprodukt, aanmerkelijk wordt, verhoogd- Bij hogere 5 temperaturen evenwel, ligt. het evenwicht, gunstiger en enzymatisch,, glucose isomerase procédé,dat zal kunnen werken bij temperaturen tussen 90 en 140°C zal. bijvoorbeeld direct kunnen worden toegepast voor het verkrijgen vein een maisstroop met hoog. fructosegehalte -(HFCS) te weten 53-60 gew.% fructose op. droge basis, waarbij de behoefte aan een 10 fractionering en recirculatie, zal verdwijnen. De. neiging· van bekende glucose, isomerase systemen om. bij thermische belasting snel te denatureren waardoor een sterke vermindering: van de activiteit, optreedt heeft tot dusverre, alle pogingen omtrent gebruik van alle hogere temperaturen voor het verbeteren van het evenwicht in. de richting van 15 fructose gefrusteerd,. Bovendien, zijn glucose en speciaal fructose gevoelige reducerende suikers ,, met een duidelijke tendens om ongewenste nevenprodukten, zoals psicose, . gekleurde produkten, kleur-voorlopers, fructose dianhydriden, mannose, tagatose, en zuren te vormen ter verhitting op temperaturen die., nodig zijn voor een isomerisatie volgens 20 de uitvinding.

Er werd nu. verrassenderwijze gevonden, dat door uitvoering van een glucose-isomexisatie proces binnen bepaalde kritische grenzen van pH en verblijfstijd in een enzym- reactor,.· zoals hieronder gedefinieerd, isomerisatietemperaturen tussen 90 en ca 140°C- effectief kunnen 25 worden toegepast voor het direct, bereiden van HFCS stropen met. een hoge te kwaliteit, (d.w.z. zonder al ver nevenproduktvorming) en met daarin ca 52 tot 60 gew..% fructose, waardoor de behoefte aan een dure en ingewikkelde fractionering en recirculatie vervalt, welke nodig zijn bij bekende glucose isomerisatieprocessen.. voor het bereiken van het 30 bovengenoemde, fructosegehalte.

Volgens de uitvinding wordt, glucose, tot fructose gelsomeriseerd door een werkwijze,waarbij een glucose-houdende vloeistof, met chemisch gestabiliseerde glucose isomerase bij een temperatuur.tussen 90 en ca 140°C en een pH tussen 3 en ca. 8 alsmede een contacttijd voldoende 35 voor een uiteindelijk.gehalte van 53 tot ca 60 gew.% aan fructose 8403231

*- V

-3- berekend op het totale koolhydraatgehalte in de vloeistof, in contact wordt gebracht, zonder dat een aanmerkelijke vorming-van psicose, en/of non-fructose, non-glucose-suikers worden gevormd.

De glucose die volgens de uitvinding tot fructose wordt ge-5 isomeriseerd kan worden verkregen uit elke bekende bron voor deze suiker.

Om economische redenen wordt de glucose gewoonlijk verkregen door een hydrolyse van cellulose of zetmeel onder toepassing van zuur en/of enzymen, liefst de laatste volgens op. zichzelf bekende methoden. Glucose-houdende vloeistoffen die op deze wijze zijn verkregen, bevatten 10 gewoonlijk ondergeschikte hoeveelheden aan polysacchariden,. suiker-oligomeren, enz. afhankelijk van de gébruikte koolhydraatbron en de toegepaste hydrolysemethode. Graansoorten, zoals mais, milo, tarwe, rogge en dergelijke, en zetmeelhoudende wortels en.knollen,- zoals aardappels, yamwortels, worteltjes, cassave, (manioc) en dergelijke, zijn voortref-15 felijke zetmeelbronnen voor een omzetting in glucose uitgangsmateriaal volgens de uitvinding. In de Verenigde. Staten wordt speciaal maïszetmeel voor dit doel gébruikt,, omdat het goedkoop, is en op grote schaal beschikbaar. Aangezien de produktie van glucose van voedselkwaliteit het best wordt gediend met een enzymatische zetmeeihydrolyse,- verdienen 20 dit soort procedures de voorkeur. Enzymhydrolysemethoden. zijn beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 4.017.363, 3.912.590, 3.922.197-201 en 4.284.722.

De hier gebruikte glucose isomerase. als enzymbron. voor chemische stabilisatie kan worden geïsoleerd uit elk bekend, glucose ispmerase-25 producerend organisme zoals Streptomyces . flavorirens,. Streptomyces achro-mogenes, Streptomyces echinatus,. Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis,. Streptomyces- phaeochromogenesStreptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae,. Aerobacter aerogenes, Aerobacter. cloacae,Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, 30 Bacillus fructosus, Brevibacterium. pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides en Paracolobactrum.aerogenoides. Bovendien kunnen glucose isomerasen, gevormd door de genera Nocardia, Micromonospora, Microbispora,. Microellobospora. en Arthrobacter worden gebruikt. Streptomyces sp. ATCC 21, 175 is 35 een voortreffelijke bron voor glucose isomerase. die bij de uitvinding kan worden toegepast. Als eerder gezegd kan het gunstig zijn een glucose 8403231 -4- 'i *- isomerase toe te passen, die bij de betrekkelijk hoge isomerisatie-temperaturen stabiel is, te weten een glucose isomerase geproduceerd door Bacillus stearothermophilus, in het bijzonder stammen gekozen uit de groep bestaande uit Bacillus stearothermophilus ATCC 21,365, HRRL * 5 B-3680 en NRRL B-3681 en NERL B-3682 zoals beschreven in US-octrooischrift 3.826.714; voorts glucose isomerase bereid door een microörganisme van het geslacht ampullariella zoals Ampullariella digitata, Ampulla-riella. lobata, Ampullariella campanulata en Ampullariella regularis (Amerikaans octrooischrift 4.308.349); een glucose isomerase geprodu-10 ceerd. door Bacillus licheniformis (Europese octrooiaanvrage 41213)? en glucose isomerase verkregen door de thermofiele vertegenwoordigers van de genera beschreven in de Japanse octrooipublikatie 74.30588.

Naast de bovengenoemde, microörganismen. beoogt de . uitvinding tevens de toepassing van mutanten, en varianten daarvan alsmede een genetisch 15 getransformeerde microörganisme afgeleid daarvan, en-wel door een introductie van gemuteerde glucose isomerase genen in andere microörganismen met inbegrip van mesof iele en thermofiele microörganismen. De gemuteerde glucose isomerase genen, geselecteerd voor dit doel, zijn die, welke een glucose isomerase leveren, die stabiel is bij verhoogde temperaturen, 20 speciaal boven 90°C, liefsttot ca 140°C. Dergelijke genen kunnen worden verkregen door de gebruikelijke technieken, toegepast voor het muteren van microörganismen, zoals bestraling of met ‘chemische mutagenen. Ook kunnen geïsoleerde glucose isomerase genen, die glucose isomerase met een matige thermische stabiliteit produceren, zoals bijvoorbeeld be-25 paalde Streptomyces stammen, in vitro kunnen worden gemuteerd. Selectie van de passende gemuteerde genen kan plaatsvinden door herintroductie van het gemuteerde gen in ofwel de oorspronkelijke dan wel een ander organisme, gevolgd door groei en replicatie van het organisme en het beproeven van dë thermische stabiliteit vèn de verkregen glucose-30 isomerase.

Ook recombinant-DNA-technieken kunnen worden toegepast voor het maken van een glucose isomerase met verbeterde thermische stabiliteit die bruikbaar is voor chemische stabilisatie en toepassing van de uitvinding·. Argos, et al. (Biochemistry 18(25): 5698-570¾ (1979) zetten 35 uiteen, dat bepaalde vervanging van alanyl door glycyl, seryl, valyl en lysyl in enzymen van mesofiele organismen is gebleken bij de overeen- 8403231 * i -5- komstige enzymen uit thermofiele organismen. Perutz (Science, 201, 1187-91 (1978)) geeft aan dat de enzymen van thermofiele bacteriën een extra stabiliteit merendeels ontlenen-aan extra zoutbruggen op het eiwitoppervlak. Zuber (in Biochemistry of Thermophily", Freidman, S.M., ed., 5 pp. 267-285, Academic Press. N.Y. 1978) verschaffen verdere gegevens over de structuur van thermos tab iele enzymen. Indien bijvoorbeeld de aminozuurvolgorde en de driedimensionale (tertiaire) structuur van een glucose isomerase bekend is, is het mogelijk een verbeterde stabiliteit te ontwikkelen door plaats-specifieke mutaties in het isomerasegen waar-10 door enzymen ontstaan, die verhoogde hoeveelheden aan aminozuren bevatten, welke een meer stabiele structuur opleveren. Nadat de DNA volgorde van glucose isomerase is bepaald, kan een gen-synthesizer worden toegepast voor het doen optreden van nieuwe volgorden, waardoor de thermostatiliteit van de glucose isomerase van deze synthetische genen wordt verbeterd.

15 Gezegd. kan worden, dat dit soort kunstmatige enzymen bijzonder bruikbaar zijn-voor de- praktijk van de uitvinding.

Aangezien glucose isomerase binnen de cellen door deze en andere mierodrganismen worden geproduceerd, kan een glucose isomerase bron worden verkregen door de cellen eenvoudig te winnen en een enzym uit 2Q de cellen af te scheiden door op zichzelf bekende teenieken, bijvoorbeeld een cel-autolyse of een sonische verbreking, en daarna in een enzym-reactor worden toegepast van bekende en gebruikelijk ontwerp. Bij voorkeur kan de chemisch gestabiliseerde glucose isomerase op een inerte drager worden geïmmobiliseerd volgens bekende en gebruikelijke procedures, 25 indien hij niet reeds was gelnsolubiliseerd als gevolg van de chemische stabilisatie. Materialen en methoden voor het immobiliseren van enzymen zijn algemeen bekend en beschreven in een reeks publikaties met inbegrip van wang, et al., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons,

Inc., New York (1979), pp. 318-338 and Kirk-Othmer, Encyclopedia of 30 Chemical Technology, 3rd Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York (1980) Vol. 9 pp. 148-172,waarnaar hier-wordt verwezen·*-De aanwezigheid van kleine hoeveelheden kobalt, mangaan en magnesium kationen en/of in water oplosbare zouten van zwaveligzuur, zoals natriumsulfiet, natriumblsulfiet, magnesiumsulfiet en/of magnesiumbisulfiet, zoals 35 beschreven in Amerikaans Reissue octrooischrift 28.885 vermindert en remt eveneens de denaturering van glucose isomerase tijdens de onder- 8403231 ♦ v -6- havige werkwijze.

Het is nodig, dat de concentratie aan koolhydraat in de glucose-houdende voedingsvloeistof is gelegen tussen ca 2Q en 85, liefst tussen 30 en 50 gew.%, indien men de gewenste resultaten wil bereiken.

5 Het is tevens nodig, dat de isomerisatia wordt uitgevoerd bij een pH tussen ca 3 en ca 8, bij voorkeur tussen ca 4 en ca 7 en liefst tussen 5 en 6,5. Uitvoering van de isomerisatie duidelijk beneden of boven de boven weergegeven pH grenzen leidt tot een vorming van overmatige hoeveelheden ongewenste nevenprodukten, zoals psicose, organische 10 zuren, gekleurde produkten, kleur-voorlopers, fructose dianhydriden en dergelijke.

Gevonden is,- dat de pH> voor een optimale glucose isomerase activiteit duidelijk afneemt bij hogere temperaturen. Zo ligt. het activiteits-optimum voor glucose isomerase uit Streptomyces rubigenosus bij 25° C 15 tussen pH 8,6 en 9,2., bij 75°C tussen 5,9 en 7,5 en bij 125°C tussen pH 5,6 en 6,2. Indien dus de isomerisatietemperatuur wordt verhoogd, kan- de isomerisatie pH worden, verlaagd om een maximale enzymactiviteit te handhaven , waardoor een ongewenste nevenproduktvorming- wordt vermeden.

Hen verdere nodige maatregel bij de uitvinding ligt in de duur van 20 contact van de glucose-houdende voedingsoplossing en de chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase.. Dit contact moet liggen tussen ca 1 sec en ca 5 uren, bij voorkeur tussen 30 sec en ca 1 uur en liefst tussen 2 min en ca 30 min, wil men. een fructose stroop krijgen met redelijke kwaliteit.

De voorkeurscontacttijd tussen een chemisch gestabiliseerde 25 glucose isomerase en een glucose houdende vloeistof hangt in hoge mate af van de pH, waarbij de isomerisatiereactie wordt uitgevoerd. Bij de lagere pH's lean een langere contacttijd worden toegestaan, zonder dat ongewenste afbraak van glucose en fructose door de vorming van psicose en andere ongewenste afbraakprodukten optreedt. Bij de hogere pH's is een 30 kortere contacttijd nodig om de psicose en kleurvorming tegen te gaan.

In de praktijk wordt de totale tijd, waarbij de glucose houdende stroop op of nabij de uiteindelijke reactietemperatuur wordt gehouden berekend als de afbraaktijd (t^) omdat de suikerafbraakreacties die optreden niet enzymatisch zijn en plaatsvinden onverschillig of de vloeistof 35 in contact staat met de glucose isomerase. De afbraaktijd (t^) omvat 8403231 i i -7- de eigenlijke contacttijd (T ) tijdens welke het enzym en substraat met el-kander in contact staan plus de tijd voor handelingen, b.v. het invoeren of afvoeren uit de reactor, waarbij het substraat 2ich nabij de reactietemperatuur bevindt. De eigenlijke contacttijd (t ) is de tijd tijdens 5 welke het enzym reactief in contact staat met het substraat, d.w.z. het directe contact tussen substraat en enzym* Het is daarom bij het uitvoeren van isomeraties boven 90°C belangrijk, de tijd benodigd voor het op de gewenste isomerisatietemperatuur brengen van de glucosevloeistof (bijvoorbeeld door de vloeistof met stoom te mengen vlak voor of tijdens de iso-10 meratie) -m-jn-inwaT te houden, en na het bereiken van het gewenste fructose-gehalte vervolgens de vloeistof snel van actieve isomerase te scheiden en de vloeistof zo snel mogelijk tot beneden 90°c en liefst beneden 70°C af te koelen.

Om dus produkten met goede eigenschappen zonder ongewenste 15 afbraak van fructose of glucose te krijgen moet de afbraaktijd worden geregeld volgens de volgende vergelijking: td » a log (4300/ (T+273) -pH-3.23) 20 waarin t^ de afbraaktijd in minuten; T de reactietemperatuur in °C en pH de pH-waarde van het reactiemengsel tijdens het houden van het mengsel op de reactietemperatuur voorstellen*

De boven weereggeven vergelijking toont aan dat kortere effectieve contacttijden nodig zijn bij hogere temperaturen en/of hogere pH-waarden.

25 De voor de reactie toe te passen pH zal gewoonlijk op of nabij de optimale pH vsorda geselecteerde isomerase liggen. De temperatuur (T) kan worden geregeld naar de samenstelling van het substraat en het gewenste fructosegehalte, zoals hieronder nader is beschreven. Deze verbanden zijn bijvoorbeeld neergelegd in de vergelijkingen 5,6 en 7.

30 Een verdere regeling van de contacttijd kan worden verkregen onder toepassing van het verband weergegeven in vergelijking 4.die aangeeft dat de contacttijd omgekeerd evenredig is met de enzymactiviteit .

Daarom moet bij een isomerase met een optimale pH van 6,0 en een reactietemperatuur van 110°C de afbraaktijd zo worden geregeld, dat deze ca 35 100 minuten of minder bedraagt.

8403231 » % -8- /

Indien een oplosbare vorm van chemisch gestabiliseerde glucose isomerase wordt toegepast, zal, het nodig zijn deze te inactiveren (bijvoorbeeld door pH-verlaging naar een traject, die de isomerase inactiveert, alvorens wordt afgekoeld, om eventuele terugomzetting in glucose 5 van de gevormde fructosetijden de hoge temperatuursisomerisatie trap te vermijden, aangezien de isomeratiereactie vanzelfsprekend omkeerbaar is.

De maximale, omzettingsgraad van glucose in fructose die kan worden bereikt, wordt geregeld door het thermodynamisch evenwicht tussen, glucose en fructose, dat op zijn beurt afhankelijk is van de tempera-10 tuur, waarbij de isomeratie wordt uitgevoerd. Een zeer nauwkeurige analyse van evenwichtsmengsels van glucose en fructose heeft het volgende verband onthuld: F * 100 K/(K+1) (2)

InK + 2.3005 (3) T+273 waarin F het percentage, fructose bij evenwicht, berekend op het geza-15 menlijke gewicht van glucose en fructose. T de temperatuur in °C tijdens de isomerisatie en K de glucose/fructose evenwichtconstante voorstellen.

De eigenlijke contacttijd tussen de glucosehoudende stroop en de isomerase in een reactor kunnen gewoonlijk worden berekend aan 20 de hand van de volgende formule, waarin een reactor met een geïmmobiliseerde vorm van isomerase wordt toegepast.

8403231 i * -9- « ^' 1 F P ( e - o t = CV ln - a F - F (4) __ e_-ï.

kA

waarin t * de eigenlijke contact tijd C = concentratie aan glucose en fructose V * het vrije volume aan vloeistof in de reactor 5 (volume van het reactiemengsel minus het volume ingenomen door de geïmmobiliseerde enzymdeeltjes) F * fractie aan fructose in het glucose/fructose mengsel e bij evenwicht tijdens toepassing van de isomerisatie-temperatuur 10 F * fractie aan fructose (berek. op G + F) bij de invoer in het o reactiemengsel F * fractie aan fructose (berek. op G + F) in de oplossing,die het reactiemengsel aanzet k = reactiesnelheidsconstante van de isomerisatie onder de 15 isomerisatie-voorwaarden en A * de activiteit van de isomerase in het reactiemengsel.

Waarden voor k voor geïmmobiliseerde isomerase, bereid volgens de volgende voorbeelden liggen tussen ca 0,07 en ca 5 g per uur per IGIU bij temperaturen tussen 90°C en 140°C respectievelijk. Dit verband toont 20 de noodzaak aan om de contacttijd minimaal te houden bij hoge temperaturen door een toepassing van gepakte bedden met een hoge activiteit per volume-eenheid. Gecontacteerde bedden gevormd volgens de werkwijzen volgens de volgende voorbeelden kunnen tot 2000 IGIU/cm^ bevatten waardoor een 99.5% van het evenwicht fructosegehalte in minder dan 25 1 minuut in een hoge temperatuursreactor kan worden bereikt wanneer trapsgewijze werkende reactoren bij verschillende temperaturen worden toegepast en de voeding voor de eerste reactor wordt gêïsomeriseerd bij een lage temperatuur alvorens in een tweede reactor bij hoge temperatuur te isomeriseren. Bij toepassing van een trapsgewijze reactor-30 systeem wordt de voorkeur gegeven aan een toepassing van een werkwijze voor het enzymatisch omzetten van glucose in fructose, waarbij een glucose houdende voedingsvloeistof met ca 20 tot ca 85 gew.% glucose in contact wordt gebracht met glucose-isomerase bij een temperatuur 8403231 \ -lotussen 20° en 80°C bij een pH van 6,0 - 9,0 en een contacttijd van ca 0,5 tot ca 2 uren waardoor 40 tot ca 45 gew.% van de glucose in deze vloeistof in fructose wordt omgezet, vervolgens de temperatuur van het isomerisatiemedium op ca 90 - 140°C te verhogen, de pH van het 5 isomerisatiemedium naar behoefte binnen het traject tussen 3 en ca 8 .te regelen, de fructose houdende vloeistof met de glucose isomerase gedurende een verdere periode van ca 1 seconde tot ca 5 uren in contact te houden voor het verhogen van de omzettingsgraad tot ca 53-60 gew.% van de glucose aanwezig in de oorspronkelijke glucose-10 houdende voedingsvloeistof, waarbij nagenoeg geen psicose of andere niet-fructose, niet-glucose suikers worden gevormd. De toepassing van hoog actieve, gepakte bedden kan dus leiden tot zeer lage effectieve contacttijden, die op hun beurt de ontleding van fructose, welke bij * de hoge temperaturen benodigd voor de uitvinding optreden, minimaal 15 houdt.

Bij de keuze van de glucose isomerase immobilisatietechnieken, verdient het de voorkeur, dat methoden worden toegepast die kleine, nagenoeg niet-comprimeerbare poreuze katalaysatordeeltjes opleveren, waardoor een remming van de isomerisatiesnelheidsdiffusie-effecten minimaal 20 wordt*

Desgewenst kan de isomerase ook worden geïmmobiliseerd in de poriën van een' membraan, waardoor men de glucose oplossing tijdens de hoge temperatuursisomerisatie heen doet bewegen, als een middel voor het bevorderen van een goed. contact tussen enzym en substraat waardoor de 25 diffusiebeperkingen minimaal worden gehouden. De gebruikte drager voor de immobilisatie is bij voorkeur volledig onoplosbaar en inert om een ongewenste contaminatie of ontleding van de glucose/fructose componenten in de substraatoplossingen tegen te gaan.

In de technische praktijk evenwel worden fructose houdende 30 stropen niet bereid uit zuivere glucose. Veeleer wordt een zetmeel hydrolysaat (als bereid volgens de boven weergegeven citaten) als glucose-bron toegepast en deze bevatten steeds non-glucose en non-fructose sacchariden (hieronder aangeduid als polysacchariden) ontstaan door een onvolledige hydrolyse van zet-meel en de omzetting van glucose.

35 Meestal vormen deze bestanddelen 3-8% van het totale gewicht aan sacchariden afkomstig van de zetmeelhydrolyse. Het is daarom nodig bij het 840 323 1 4 » -liber ekenen van de temperatuur, waarbij men de isomerisatie wil doen verlopen rekening te houden met eventueel polysacchariden in de glucose vloeistof alsmede andere factoren, zoals het totale gehalte aan fructose berekend op droog gewicht,, dat men wil bereiken,de 5 vorming van psicose en andere niet-glucose en niet-fructose produkten tijdens de effectieve contacttijd tussen glucosevloeistof en isomerase. Verbanden voor het berekenen van de isomerisatietemperatuur zijn hieronder weergegeven: 10 T » 25!_-273 (5) 2.3005-lnk K * __F_ 100-P (6) P - 10.000 (M+C) (7) Q(100-P) .

T 3 isomerisatietemperatuur (°C) F = evenwichtsfructosegehalte (% berekend op totaal 15 glucose + fructose) bij temperatuur T.

M * %· fructose op droge stof, nodig in het gefsomeriseerde produkt, C * % psicose + andere afbraakprodukten en gevormd tijdens de effectieve isomerisatiecontacttijd.

20 Q * % .evenwicht bereikt tijdens de. isomerisatiereactie.

P * % polysaccharidegehalte van de glucosevloeistof.

HeestaL zal minder dan 1%, liefst minder dan 0,5% psicose en andere afbraakprodukten worden gevormd en 99,5 % evenwicht worden bereikt. Daarom zijn voor het bereiden van stropen met 55,5% fructose 25 (droge stof), de volgende i somerisat ie temperaturen nodig voor glucose-vloeistoffen met de aangegeven polysaccharide gehalten.

8403231 -12-

Polysaccharide in Isomerisatie glucose vloeistof temperatuur (% op droge stof) oc 0 95.7 5 1 99.1 2 104.3 3 108.9 4 113.8 6 124.3 10 8 136.1

Het aanvaarde handelspordukt bevat gemiddeld 55,5% fructose berekend op droge stof. Dit is zo omdat bij dit fructose gehalte een maisstroop met hoog fructosegehalte (HFCS) eenzelfde zoetheid bereikt als saccharose in een. gelijke gewichtshoeveelheid. Bovendien wordt een 15 HFCS met 55,5% fructose, algemeen beschouwd als een handelsprodukt dat in vele voedingsmiddelen en speciaal in koolzuurhoudende dranken de saccharose geheel of gedeeltelijk kan vervangen. De consumptie van dit type aan HFCS ia de Verenigde Staten bedroeg ca 1,4 miljard kg in 1982 welke mogelijk zal groeien tot ca 1,8 miljard kgèn 1983.

20 Vanwege de moeilijkheden bij aflevering ,opslag, afmeting en het verwerken van HFCS in levensmiddelen, bestaat er een algemene behoefte aan een uniform HFCS produkt wat betreft alle leveranciers, zodat produkten van verschillende leveranciers onder elkaar en gelijktijdig kunnen worden gebruikt. Daarom heeft een fructosegehalte van 55-56% op droge stof 25 een bijzondere betekenis gekregen als gewenst gehalte in de technologie van de HFCS produktie.

De onderhavige werkwijze levert fructosegehalten van 53%, bij voorkeur tenminste 54 en liefst ten minste 55% .

Indien gewenst, kan in plaats van een oplossing die alleen 30 glucose bevat als substraat voor de uitvinding ook een oplossing van glucose worden toegepast, waarin een deel van de glucose reeds tot. fructose is geisomeriseerd. Bij voorbeeld kan een oplossing van ge-isomeriseerde glucose met daarin tot 50% fructose volgens de uitvinding worden behandeld ter verhoging van de fructoseconcentratie tot de 35 meer gewenste gehalten boven 50% en de voorkeursgehalten van 55-56% en hoger.

840 3 23 1 -13-

Glucoseoplossingen mei: daarin fructose in hoeveelheden van minder dan 50 gew.% van het koolhydraat kunnen worden bereid volgens bekende procédé's.

Het de boven weergegeven vereisten wat betreft glucoseconcentratie, 5 pH en contacttijd in gedachte, kunnen bekende glucose isomerisatie- werkwijzen passend worden aangepast tot het werken met temperaturen van ca 90 tot ca 150°C, bij voorkeur 100°C tot ca 110°C, waardoor de onderhavige stropen met een hoog fructosegehalte worden verkregen.·

De thermostabiliteit van glucose isomerase kan aanmerkelijk 10 worden verhoogd met. een of meer chemische behandelingen waarbij het enzym een duidelijke activiteit behoudt, zoals hieronder nader wordt aangegeven.. Aldus behandeld enzym wordt aangeduid als "chemisch gestabiliseerde isomerase" in de onderhavige beschrijving.

Een chemische stabilisatie van de isomerase wordt, verkregen 15 door een reeks verschillende methoden, die alle kunnen resulteren in een verhoogde thermische stabiliteit. De fundamentele benadering is de introductie van structuurelementen in het enzymmolecuul en wel zo, dat het enzym zich zal verzetten tegen een ontvouwing bij verhitting boven zijn normaal thermisch denatureringspunt. Een voorkeursmethode 20 om dit te bereiken is een modificatie van het enzym door een. chemische aanbrenging daarop van stukken met polymeriseerbare vinylgroepen, zodanig dat de laatste hecht op. het oppervlak van het enzym op verschillende punten worden bevestigd.. Hierna wordt het gemodificeerde enzym gemengd met een of meer polymer iseerbare vinyl verb indingen in een wate-25 rige oplossing en het mengsel gecopolymeriseerd tot een chemisch gestabiliseerd enzym, waarin het enzym stevig op verschillende punten aan een driedimensionele polymere matrix is gebonden,, die zich heeft gevormd tot een structuur welke in vorm complementair is met die van het enzym.

Voorbeelden van dit soort stabilisatiemetboden zijn beschreven 30 door Martinek et al. In Biochem. Biophys. Acta 485, 1-12 (1977) en door Kulys et al. in ffiefchimiya, 42, No. 3*453-59 (1978).

Het is bij de uitvoering van de boven weergegeven reacties essentieel dat voorwaarden, die kunnen leiden tot een denaturering van de isomerase met als gevolg verlies aan activiteit worden vermeden.

35 Bijvoorbeeld moeten extremen van pH en temperatuur: tijdens alle handelingen nodig voor het uitvoeren van de boven weergegeven reacties worden tegengegaan.

8403231 -14-

Voorbeelden van reagentia, die worden gebruikt voor een modificatie van isomerase voor het aanbrengen daarop van polymariseer-bare vinylgroepen zijn: acryloylchloride, methacryloylchloride, acrolelne, crotonaldehyde, maleinezuuranhydride, 3,4-epoxybuteen, 5 acrylzuur-2,3-epoxypropylester, acrylzuur-2,3-thioglycidylester, 1-allyloxy-3-(N-ethyleenimine) -2-propanol, acrylzuur-0-succinamideester, chloormalelnezuuranhydride, maleïnezuurazide, 3-broompropeen en allyl-isothiocyanaat. Dit soort verbindingen kunnen met de vrije amino-groepen van. de isomerase, bijvoorbeeld de epsilon-aminogroep van 10 lysine-stukken reageren.

andere verbindingen, die met. de vrije, carbonzuurgroepen van de isomerase kunnen reageren kunnen, eveneens worden toegepast voor het aanbrengen van snel. polymeriserende vinylstukken op de isomerase, zoals de deskundige duidelijk zal zijn. .· 15 Voorbeelden van vinylverbindingen, die met de gemodificeerde isomerase kunnen worden gecopolymeriseerd zijn. natriumacrylaat,. natrium-methacrylaat,. acrylamide, hydroxyethylmethacrylaat, acryloylpiperidine- 4-spiro-2'-(lf ,-3'-dioxacryl opent aan), l-acryloyl-4-piperidon en aeryloylmethoxyamine. Gewoonlijk worden in water oplosbare 20 monomeren of monomere mengsels toegepast^die resulteren, in in wateroplosbare polymeren (indien wordt gepolymeriseerd bij afwezigheid van verknopingsmiddelen).

Meestal worden tevens die. functionele vinylverbindingen in de monomeermengsels opgenomen (Ü,l-5% van de totale hoeveelheid, monomeer) 25 om verknopingsplaatsen te. vormen, die leiden, tot een driedimensionaal polymeernetwerk. Dergelijke verbindingen zijn N,N.· -methyleen-bis-acrylamide en ethyleenglycol-dimethacrylaat. Wanneer deze. verbindingen worden toegepast vormt het gepolymeriseerde mengsel een onoplosbaar gel, hetgeen resulteert in een immobilisatie van de isomerase.

30 Initatiesystemen, gewoonlijk gebruikt bij vinylpolymerisaties, zijn bruikbaar, zoals ammoniumpersulfaat plus natriumbisulfiet, water-stofperoxyde plus ferrosulfaat, kaliumsulfaat plus-Ν,Ν,Ν*,Ν'-tetramethyl-ethyleendiamine en riboflavine (plus licht).

Ook kan een niet-covalente binding aan de drie-dimensionale 35 polymeermatrix voldoende, zijn om de gewenste stijfheid van het isomerase molecuul en daarmee een duidelijke verhoging van de thermostabiliteit 8403231 -15- op te leveren. Dit v»n worden bereikt, wanneer isomerase chemisch wordt vastgelegd binnen., een verknoopt polymeergel. In dit geval is het niet nodig, dat de isomerase is gemodificeerd door aanhechting van een viny 1 ve rb incLLng daarop alvorens wordt gepolymeriseerd. De. concentratie 5 van het gel moet evenwel hoger zijn dan 30 gew.%, alvorens een duidelijke stabilisatie optreedt en gelen met een concentratie van ca 50% verdienen de voorkeur. Monomer en die in staat zijn polymere gelen op te leveren die elektrostatische: en watersto fbindingen met de isomerase kunnen vormen zijn nodig, zoals bijvoorbeeld natriumacrylaat, natrium— 10 methacrylaat, acrylamide en hydroxyethylmethacrylaat.

Voorbeelden van stabilisatie door verwerking in gelen zijn gegeven door Martinek et al. in Biochem.. Biophys. Acta 485, 13-28 (1977) en door Kulys et al. in J. Solid Phase Biochem. 3, 95—105 (1978).

Een derde methode om isomerase een stijf skelet te geven is 15 een intramoleculaire verknoping, die een verdere thermos tab iliteit kan opleveren.

Voorbeelden van een dergelijke stabilisatie zijn beschreven door Torchilin et al* in Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek et al. in J. Solid Biochem. _2, 343-85 (1977) en Torchilin et 20 al. in Biochem. Biophys. Acta, 568,1-10· (1979).

Passende verknopingsmiddelen voor toepassing bij de onderhavige uitvinding omvatten die functionele verbindingen,die met uitstekende functionele groepen op. het enzynnoleeuul kunnen reageren. Meestal zijn deze functionele groepen aminogroepen, gewoonlijk, primaire amino-25 groepen die met een reeks functionele groepen kunnen reageren zoals carbonzuren, sulfonylhalogeniden, aldehyden, isocyanaten, propiolaten en dergelijke.

De verknopingsmiddelen omvatten derhalve veelal dicarbonzuur-anhydriden, zoals barnsteenzuuranhydride en adipinezuuranhydride; de 30 overeenkomstige dialdehyden, zoals glyoxal, succinamdehyde en glutaar-aldehyde; onverzadigde verbindingen zoals acrolelne en.crotonaldehyde, diolpropiolaten zoals ethyleenglycol bispropiolaat, propyleenglycol bis-propiolaat en hexamethyleen glycol bispropiolaat, en disulfonylhaloge-niden zoals benzeen-1,3-difulfonylchloride; naftaleen-l,5-disul£onyl-35 chloride en to!yl-2,4-disulfonylchloride.

8403231 1 * -16-

Indien bovendien het enzym zure groepen, die met aminen kunnen reageren bevat of daarna kunnen worden toegevoegd, kunnen ook difunctio-nele aminen worden gebruikt als verknopingsmiddelen bij de uitvinding. Deze omvatten bijvoorbeeld diaminen met ten hoogste 12 koolstofatomen, 5 zoals fenyleendiamine, butyleendiamine, hexyleendiamine,. octyleendiamine, pentyleendiamine, ethyleendiamine en dodecyleendiamine.

De hoeveelheid verknopingsmiddel kan aanmerkelijk, variëren, de verhouding enzym tot verknopingsmiddel ligt meestal tussen 0,1 en 0,0001. De werkwijze voor het doen optreden van da vereiste binding 10 wordt in hoge mete, bepaald door de aard van de geselecteerde verknopingsmiddelen. en het enzym. Gewoonlijk zal het reagens worden opgelost in een geschikt inert, oplosmedium en de reactie, bij een redelijk lage temperatuur moet verlopen, om ongunstige, invloeden op het enzym, dat toch gevoelig blijft voor hoge temperaturen, te vermijden.. Meestal worden 15 reacties op of nabij de omgevingstemperatuur bij voorkeur toegepast terwijl water of waterige oplosmiddelen meestal als- reactiemedium worden gebruikt.· . - Naast het aanbrengen van polymeriseerbare- vinylgroepen op het enzymmolecuul en vervolgens, polymeriseren volgens.de bovenbeschreven 20 methoden, omvat, een verdere uitvoeringsvorm een condensatie van een voorgevormd polymeer, met de isomerase door de vorming van intermolecu-laire covalente bindingen waardoor een gestabiliseerd molecuul wordt gevormd. Bijvoorbeeld kunnen polypeptiden, zoals natuurlijke eiwitten, en hydrolyseprodukten daarvan volgens gebruikelijke^ technieken voor de 25 vorming van. peptidebindingen met- glucose isomerase worden omgezet, waardoor een gestabiliseerd enzym wordt gevormd. De aldus verkregen produkten kunnen in water oplosbaar zijn, maar in water onoplosbaar worden gemaakt door toepassing van verknopingsmiddelen.zoals glutaar-aldehyde en het verkregen verknoopte enzymsysteem is gewoonlijk zelfs 30 stabieler. De peptidevormingsreacties worden volgens bekende, methoden uitgevoerd, bijvoorbeeld onder toepassing, van carbodilmiden.

Indien gewenst kan het aanvankelijke enzym in een derivaat worden omgezet waardoor de gewenste functionaliteit in het molecuul wordt aangebracht voor de condensatie met het voorgevormde molecuuL. Zo kan voor 35 een carboxylf unctionaliteit, een vrije amino groepen-houdend enzym met een dicarbonzuur worden omgezet in een carboxylhoudende enzym.

8403231 -17-

De voorgevormde bij de boven.-weergegeven uitvoeringsvorm toe te passen polymeren kunnen elk polymeer zijn dat de vereiste soorten hoeveelheid aan functionele groepen, bijvoorbeeld amino o£ carboxyl » voor de beoogde reacties bevat. De voorkeur genieten polypeptiden, 5 zoals natuurlijke eiwitten, bijvoorbeeld chitosan, gisteiwit. en dergelijke, alsmede mengsels? voorts aminohoudende. polymeren, zoals polyethy-leenimine. Gewoonlijk vormen de voorkeurs-voorgevormde polymeren in water oplosbare produkten, en deze worden liefst in water onoplosbaar gemaakt door een reactie met verknopingsmlddelea, zoals glut/raaraldehyde 10 en andere, zoals hierboven beschreven.

Bij alle boven weergegeven modificatiemethoden voor het enzym, is het essentieel, te garanderen dat een toereikend chemische functionaliteit, bijvoorbeeld amino of carboxylgroepen, aanwezig is can een duidelijke mate van het gewenste resultaat, te bereiken.

15 wanneer bijvoorbeeld het voorgevormde polymeer dat. men met het enzym wil omzetten, wordt.geselecteerd, is het nodig, dat het polymeer groepen bevat, welke reactief zijn met beschikbare groepen op het enzym molecuul. Een eiwit met aangehechte carboxylgroepen. is.dus geschikt voor een reactie met aminogroepen op het enzym. Bovendien.moet er een 20 redelijk aantal reactieve groepen op de geselecteerde .reactanten aanwezig zijn, om een aanhechting op verschillende punten van de reactanten te garanderen, waardoor een duidelijke stabilisatie wordt bereikt.

De bepaling van de aard en het aantal van deze reactieve groepen voor de respectievelijke reagentia, is natuurlijk aan elke deskundige bekend.

25 Een. verdere methode, waarbij de thermostabiliteit van enzymen kan worden verhoogd is een verandering van de oppervlaktestructuur en wel chemisch zonder dat daazbij een verlies aan activiteit optreedt. Daartoe kunnen oppervlakteaminogroepen worden, geamidineerd (Ludwig en Hunter, M.J., Meth., Enzymol·. 11, 595-604 (1967)) of geguanidineerd (Kimmel, 30 Meth.Enzymol, 11, 584-589 (1967)) waardoor substituenten worden gevormd, die veel. op arginine gelijken. Melkzuurdehydrogenase en diverse andere eiwitten zijn aldus gestabiliseerd (mengier, F en Pfleiderer, G., Biochem. Biophys. Acta 284, 1-8 (1977); Minotani, N., et al.,

Biochem. Biphys. Acta, 581, 334-341 (1979); en Cupo, P., et al, 35 J. Biol. Chem., 255 , 10828-10833 (1980).

De activiteit van de oplosbare isomerase preparaten werd bepaald 8403231 -18- door .Lloyd et al. in Cereal Chemistry, 49, No. 5, biz. 544-553 (1972). Een IGIU is de hoeveelheid isomerase die 1 micromol glucose in fructose per minuut omzet in een oplossing met daarin 2 mol glucose per liter, 0,02 mol MgS04 per liter en 0,001 mol .CoCl2 peg liter bij een pH van 5 6,85 (0,2 M natriummaleaat) en een temperatuur van 60°C, wanneer bepaald volgens de bovenweergegeven methode.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

VOORBEELD I

Dit voorbeeld geeft een directe isomerisatie weer van een 10 glucosehoudende oplossing die hoofdzakelijk bestaat uit een geraffineerd maïszetmeel hydrolysaat, tot een preparaat met 55,5% fructose berekend op droge basis, waarbij een tweetraps-isomerisatie werd toegepast.

Eerst werd een isomerisatie bij 70°C uitgevoerd, waarna het aldus verkregen reactieprodukt werd toegepast als voeding voor een tweede, 15 hoge temperatuur reactor (105.2°C) welke een chemisch gestabiliseerde isomerase bevatte. De chemisch gestabiliseerde isomerase was er een, waarbij het enzym covalent was gebonden aan een oplosbaar polymeer, en vervolgens onoplosbaar was gemaakt tot een geïmmobiliseerde katalysator. Het hydrolysaat werd bereid uit maïszetmeel volgens de werkwijze 20 beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.644.126(vervloeiing) en Amerikaans octrooischrift 3.280.006 (versuikering). De versuikerde vloeistof werd geraffineerd volgens Amerikaans octrooischrift 3.834.940 tot een produkt met 95,3% glucose berekend op droge stof. Voldoende kris-tallijne glucose werd toegevoegd om het totale glucosegehalte op 97,6% 25 op de droge stof te brengen. De verkregen oplossing had de volgende samenstelling:

Totaal droge stof (%) 50.2

Glucose (% op droge stof) 97.6

Fructose (% op droge stof) 0.0 30 Polysaccharide (% op droge stof) 2.4

Psicose (% op droge stof) 0.0

NaHS03 (mM) 50.0

MgS04 (mM) 5.0

CoCl2 (mM) 0.1 35 pH 6.8 8403231 -19-

De isomerisatie bij lage temperatuur werd bij 70°C uitgevoerd door de boven weergegeven substraat oplossing door de lage tempe-ratuursreactor met een stroomsnelheid van 3,2 ml/min te pompen.

De lage temperatuur (70°C> isomerasereactor was geconstrueerd door 5 contacteren van isomerase, geimmobiliseerd op DEAE-c ellulose (bereid volgens Amerikaans octrooischrift 3.788.945) in een glazen kolom met een diameter van 25 mm, voorzien van een invoer en een af voer en een mantel voor het doen circuleren van water uit een thermostaat.

De bovenruimte boven het gecompleteerde materiaal bevatte een thermo-10 meter en was verder gevuld met glazen korrels om de dode ruimte zoveel mogelijk minim»»? te houden. De reactor bevatte voldoende geïmmobiliseerde isomerase voor 20.000 IGIU en het gecompacteerde bed was ca 15 cm hoog. De eerste 1000 cm.3 die uit de reactor kwamen werden weggeworpen.

Het effluent, dat vervolgens naar buiten kwam werd opgevangen en gébruikt 15 voor de tweede isomerisatie bij hogere temperatuur.

De chemisch gestabiliseerde katalysator, die gebruikt werd in de reactor met hoge temperatuur werd als volgt bereid.

K»n soort Streptomyces rubigenosus afgeleid van Streptomyces rubigenosus ATCC 21175 werd submers maar aëroob gekweekt in een medium 20 met de volgende samenstelling: gew.% glucose 9.0 maisweekwater (droge stofJ 1.6 rHammnn i nrnifftaftiat; 0.08 mangaansulftaat 0.06 25 antischuim (Pluronic PL-61) 0.003

Dit medium werd 45 minuten bij 121°C gesteriliseerd, afgekoeld en op pH 6,8-7,0 gebracht. Vervolgens werd geënt met 14% (v/v) van een entmateriaal bestaande uit de inhoud van een entgistingsbak, verkregen door kweken van de bovengenoemde j3. rubigenosus variant.

30 De fermentatie werd onder aseptische voorwaarden gedurende 60 uren bij 30°C onder luchten met 0,65 wm uitgevoerd. S. Rubigenosus ATCC 21175 kan eveneens worden toegepast voor het enten en produceren van de isomerase, in welk geval een medium met de volgende samenstelling wordt toegepast.

840323 1 -20- gew.% glucose 0.24 maisweekwater (droge stof) 1.5 sorbitol 1.6 cobaltochloride 0.02 5 diammoniumfosfaat - 0.56 xylose 1.0

Glucose isomerase werd. uit de £. rubigenosus geëxtraheerd door toevoeging van 0,35% Maquat MC 1412 (Maison Chemical Co.,) en 10 mg/1 kippe-eieren lysozym, waarna 5 uren bij 40°C en pH 6,3-6,6 werd ge-10 roerd. Het mengsel werd vervolgens gefiltreerd en daarbij een oplossing van onzuivere, glucose isomerase verkregen.

Deze. onzuivere isomerase werd gezuiverd door een adsorptie over DEAE-cellulose (bereid volgens Amerikaans octrooischrift 3.823.133), filtreren en wassen van het geadsorbeerde produkt met 0,1 M NaCl oplos-15 sing waardoor onzuiverheden kon worden verwijderd, en vervolgens de isomerase te desorberen door contact met een 0,45 M NaCl-oplossing.

De pH van al deze oplossingen werd tijdens de zuiveringstrappen op 7,5 gehouden. De oplossing van het gedeeltelijk gezuiverde, hierbij verkregen isomerase gemengd met 3 voluma 95% ethanol bij 0°C, 20 waardoor de isomerase neersloeg» Perlite filterhulpmiddel werd toegevoegd, het vaste materiaal af gefiltreerd en aan de lucht gedroogd tot een oplosbaar isomerase preparaat met daarin 2500 IGIU/g.

De gezuiverde isomerase werd opgelost in 1 Nm MnC^ waardoor een oplossing werd verkregen met daarin 10 mg isomerase per cm3 bij kamer-25 temperatuur, en dit mengsel gefiltreerd, ter verwijdering van het fil terhulpmiddel . De specifieke activiteit van dit preparaat bedroeg 37,3 IGIU/mg.proteïne.

Een oplossing van een oplosbaar polyamine polymeer werd verkregen door 39,0 g chitosan (Kytex van Hercules Ine., te Wilmington^ Delaware 30 19899) in 13 liter 0,08 N HC1 op te lossen. Eenmaal opgelost werd de chitosanoplossing gebracht op 0,5 M wat betreft NaCl door de toevoeging van 380 g NaCl, waarna de verkregen oplossing met 8 N NaOH op pH 6,15 werd gebracht. Tenslotte werd de chitosanoplossing door Whatmann #3 papier gefiltreerd om het onoplosbare materiaal te verwijderen. Aan 35 de 13 liter 0,3% chitosan in 0,5 M NaCl bij pH 6,15 werd het volgende toegevoegd: 100 cm^ oplosbaar isomerase met 100.000 IGIU activiteit, 197,6 g xylitol (van Sigma Chemical Co.) alsmede 0,619 g C0CI2·5Η20.

840 323 1 -21-

De verkregen oplossing werd 2 uren geroerd, waarna 6,24 g 1-ethyl- 3-dimethylaminopropylcarbodiimide (van Sigma Chemical Co. )werd toegevoegd om op een multipuntswij ze de carhoxylgroepen van de isomerase covalent de aminogroepen van het chitosan te binden. Na 2 uur 5 staan bij kamertemperatuur werd 15,6 cap vein een 50 gew.% glutaaralde-hycüfoplossing (van Eastman Kodak) gebracht op pH 6,0 met 8 N NaOH, aan het reactiemengsel toegevoegd om het. covalent gebonden isomerase-chitosan-complex onoplosbaar te maken. Na 15 minuten werd 2 liter van een 1 M fosfaatoplossing met pS 8,0 toegevoegd om het door de glu-10 taaraldehydetoevoeging gevormde gel te verbreken. Het resulterende onoplosbaar genaakte isomerase-chitosancomplex werd gewassen met gedeai-neraliseerd water, terwijl het zich op een Buchner filter bevond.

Dit preparaat liet men een nacht bij kamertemperatuur aan de lucht drogen,'en vervolgens gemalen en gezeefd tot een grootte van 0,2-1,5 mm. 15 De droge katalysator had een netto activiteit van 384 IGIU/g.

De op 105,2°C gehouden reactor werd op de volgende wijze geïnstalleerd* Een hoeveelheid van 13 g katalysator werd gesuspendeerd in het substraat en onder een laboratoriumvacuum bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten ontlucht* De ontluchte suspensie werd gebruikt 20 voor het bereiden van een 1,5 x 20 cm bed in een glazen kolom met mantel. Eet gecompacteerde bed bevatte 4992 IGIU.

Het substraat verkregen uit de eerste trap (isomerisatie bij 70°C) werd op pB 6,75 gébracht en verdund tot 42,0% droge stof. Dit substraat werd vervolgens door de hoge tenteratuursreactorkolom gepompt onder 25 een druk van 0,7 barr overdruk en bij een stroomsnelheid van 1,96 cm per minuut en wel 30 minuten bij 60°C. De temperatuur binnen de kolom werd opgenomen met een thermometer, die direct boven het bed was aangebracht en was omgeven door glazen korreltjes van 0,5 cm diameter om het dode volume zo klein mogelijk te houden. De kolomtemperatuur werd 30 vervolgens snel met circulerende olie uit een bad van 106°C via de mantel verhoogd.

Het effluent van de kolom werd met een polarimeter bekeken die was geijkt op het aflezen van 50 tot 58% fructose. Nadat de kolom temperatuur de 105,2 had bereikt en het fructosegehalte van het 35 effluent het gewenste niveau had bereikt, werd het effluent opgevangen en onmiddellijk in een ijsbad af gekoeld. De pH werd met behulp van 840323 1 -22- 1M citroenzuur op 4,90 gebracht. Het effluent werd opgevangen, tot het fructosegehalte beneden 55% was gekomen.

Gexsomeriseerde oplossingen, verkregen uit de reactoren van 70°C en 105 .2°C werd geanalyseerd op hun koolhydraatsamenstelling en 5 kleur en de resultaten vergeleken met overeenkomstige analyses uitgevoerd bij de niet-geisomeriseerde substraatoplossing, zoals weergegeven in de volgende tabel.

8403231 -23- u a in r* η 3 δ o ...

® Η 1-1 ο Ο <* * Η Ο X Η Μ ~ ® Ό Η U ΛJ J3 Ο <f m tfl ο ...

IB Ν CM Ν

U

> 1 5 Η ϋ w ο σ* ω cm c Ο · Ή ® ι4 in f-t μ 0« ο i-f λ ο m Ο «η <α <w ο * £ +J ο -η ο ο ο <α! c to +ι « 3 cao* Μ ψ Ο I ® 030 Λ θ' J ΒΙΟ 03 Ο Ο S3t^ a u α ιώ^νο β 03 Λ Ό 0 · · * 3 ίο 3 Ο Γ» ιο ff ^ ζ η u <ΰ ΰ σι ·ν rr 3 SJ Ό ΤΙ Μ > >τ Η θ' Q Λ £ ¢3 2 !-i > ζ 2 0« Η 63 0 3 j η *2 3 η a « cn in Η os ο a · · η 2 0 ο η in « a # +J in in

H 03 £ B

£ H 4) M

3 63 01 fa 03 O — 0°

CM

» 0» in c o •H r-t a Ό m Jm τη

0 ® *H

* a λ a w _ ο Ή Ό Ό

u U U

0> ffl <U 0) c goo i-t o to 03

H 03 Η -H

Ο H H U

Ό O CU CD

C cn S S

3 0 0 jc +j cn cn aj o w h A -wo® C O* 0> 840 323 1 -24-

De resultaten tonen aan, dat 55,5% fructose werd verkregen, terwijl het psicosegehalte beneden 0,4% werd gehouden (berekend op droge stof) terwijl de kleur beneden 20 bleef.(CIREX1Q0).

VOORBEELD II * 5 Dit voorbeeld illustreert de directe isomerisatie van een glucose- houdende oplossing (een geraffineerd maïszetmeel hydrolysaat plus kristallijne glucose) bij hoge temperatuur, waarbij een samenstelling met 55,2 gew-.% fructose op droge basis werd verkregen, waarin een tweetraps isomerisatie werd toegepast waarbij de tweede trap een 10 chemisch gestabiliseerde isomerase bevatte bestaande uit glucose isomerase complexvormig, gebonden met polyethyleenlmine welk complex onoplosbaar was gemaakt door een behandeling met glutaaraldehyde.

Bereiding van de gestabiliseerde isomerase

Een. oplosbare glucose isomerase werd bereid als beschreven in 15 voorbeeld I. De gezuiverde isomerase werd opgelost in 1 mM MnCl2., waardoor een oplossing met 9 mg isomerase per cm^ bij kamertemperatuur werd verkregen, welk mengsel, werd gefiltreerd ter verwijdering van een filter— hulpmiddel. 60 cm 10%'s g/v PEI-6 (polyethyleenimine, met molecuulgewicht 600, pE 3) (Dow Chemical Company) en 3 g xylitol werden toegevoegd aan „ 3 20 300 cm van deze enzymoplossing en de verkregen oplossing 15 minuten geroerd. 10 cm^ 2,5 M glutaaraldehyde werd toegevoegd en het mengsel 2 uren bij kamertemperatuur geroerd. Het onoplosbaargemaakte enzym werd afgefiltreerd, met water gewassen en 1 nacht in een convectie-oven bij 37°C gedroogd. 12,8 g geïmmobiliseerde isomerase met daarin ca 25 775 iGIU/g werd na dit drogen verkregen. 12 g van het geïmmobiliseerde enzym werd gesuspendeerd in het substraat, onder vacuum gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur ontlucht en gebruikt voor het bereiden van een hoge temperatuursreactor met een diameter van 1,5 cm.

Het substraat voor de reactor werd bereid in de eerste trap 30 van de tweetraps isomerisatie als beschreven in voorbeeld I. Dit substraat had de volgende samenstelling: 8403231 -25-

Totaal droge stof (%} 42.6

Glucose (% op droge stof} 46.4

Fructose (% op droge stof) 51.3

Polysaccharide (% op droge stof) 2.3 5 Psicose {% op droge stof) 0.0

NaHS03 (mM> 0

MgS04 (mM) 50 C0C12 (mM) 0.1 pH 6.75 10 Dit substraat werdbij 60°C gedurende 45 minuten met een snelheid van ca 5 cm3/min door de reactor gepompt. De kolomtemperatuur werd vervolgens op 1Q1,6°C verhoogd en de stroomsnelheid verminderd op 2 cm^/min. Een terugdruk van 0,9 barr overdruk werd op de kolom toegepast om koken van het substraat te vermijden. Het effluent werd gecontroleerd met een weerge-JSvende polarimeter, geijkt op het aflezen van 50-58% fructose. Effluent, met . "meer dan-55% fructose wercLop*jev®ngen-±n_een ijsbad en. .de pET daarvan op 4,0 gebracht met 1,0 M citroenzuur.

Het effluent uit de hoge temperatuursreactor, het substraat uit de eerste reactor en de oorspronkelijke glucosehoudende oplossing, gebruikt 20 als substraat voor de eerste reactor werden geanalyseerd ap hun koolhydraat-samenstelling en gekleurd. De resultaten zijn weergegeven in de volgende tabel.

8403231 -26- tr> c- r-

u ïu o' o H

3 « O m <u h o H O ^

Ui '-r X

01 Ό •H "3* m t" U · · *

«PM PM OM

Λ ü ü «3 oi > h a o» c H 0)

Η M

<—i ~ O

01 4·» O O O O

W -M O H

W 01 4-1 01 ö η c oi ft α &» 2 < g 01 < ta Λ O' S w oi p ta μ g ω 4J Ό οι K g (Ö 01

C3 O «OIO v£> *3» H

g Ö3 Sm ti O

HH Ό H 3 Γ» VO Γ0 03 >ι Μ H O' U» «3» 03 ft Λ > O' CM o S H 01

J « 0 «J

β § * 3 8.

S5§ 0 s < H <#> O <n pm

> S · +» O

3 3 0 Η ΙΛ C3 £μ 01 3 m m

g O' M

HM ~ <U

J Q

Ö g e ö

g M U

1 Ë °* < os u

03 W OH

H 0> O O

fi P» H

H

01 -η -η ra η h 0 Ό Λ Λ

Η SM

ft αι ν Ό Ο 0) SM Μ ta αι οι α> η οι οι c n οι ca Η 01 Η Η Η £ Μ Sm οι ο αι αι

Ό 01 s S

β Η ο Ο « αι οι ta JS O' Η Η 0) β 01 01 03 Ο θ' θ' 8403231 -27-

Deze resultaten tonen aan, dat een gehalte van 55,2% fructose werd bereikt, terwijl het psicose gehalte beneden 0,2 gew.% op droge stof werd gehouden.

VOORBEELD III

5 Dit voorbeeld geeft een directe isomerisatie weer van glucose tot 57,2% fructose via een tweetrapsisomerisatieprocede, waarbij de eerste reactor op 70°C en de tweede reactor op 110,4°C werd gehouden.

De chemisch gestabiliseerde isomsrase, toegepast in de tweede reactie bij hoge temperatuur was er een waarbij het enzym covalent was gebonden 10 aan een oplosbaar polymeer en vervolgens onoplosbaar was gemaakt tot een geïmmobiliseerde katalysator.

Het substraat en zijn omzetting bij de eerste trap (de reactor van 70°C) is reeds in voorbeeld I beschreven.

De in de hoge teaperatuursreactor bij 110.4°C gebruikte, ge-15 immobiliseerde katalysator is eveneens reeds beschreven in voorbeeld I.

De reactor van 110,4°C werd als volgt ingesteld. Een hoeveelheid — van 28,4 g van de katalysator werd in het substraat gesuspendeerd en onder een laboratoriumvacuum 60 minuten bij kamertemperatuur ontlucht.

De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het bereiden van een bed van 20 2,5 x 12,4 cm in een glazen mantelkolom. Het gecontacteerde bed bevatte 10.885 IGÏU.

Het substraat bereid in de. eerste trap door een isomerisatie bij 70°C werd op pH 6,47 gebracht en verdund tot 42,0% droge stof.

Dit substraat werd vervolgens door de hoge temperatuursreactorkolom gepompt 25 en wel onder een druk van 0,9 barr overdruk en een stroomsnelheid van 3,38 cm/minuut, waarbij 30 minuten - een temperatuur van 60°C werd gehandhaafd. De temperatuur binnen de kolom werd gemeten met een thermometer aangebracht direct boven het bed en omgeven door glaskorreltjes van 0,3 cm om het dode volume zo klein mogelijk te houden. De kolom-30 temperatuur werd vervolgens snel verhoogd door olie van 111°C door de mantel te laten circuleren.

Het effluent uit de kolom werd gemeten met een schrijvende polarimeter, geijkt op het af lezen van 50-58% fructose. Nadat de kolom-temperatuur 110,4°C had bereikt en het fructosegehalte van het effluent 35 het gewenste niveau had verkregen werd het effluent opgevangen en onmiddellijk af gekoeld in een ijsbad. De pH werd door toevoeging van 1 M citroenzuur op 4,0 gebracht.

840 323 1 c* -28-

De ge'isomeriseerde oplossingen verkregen uit de reactoren van 70°C en 110,4°C werden geanalyseerd op koolhydraatsamenstelling en kleur en de resultaten werden vergeleken met een overeenkomstige analyse uitgevoerd op de niet geisomeriseerde substraat oplossing zoals weergegeven in de volgende tabel.

840 323 1 -29- ΐ -' \ Μ &j

Ρ g Ο VÖ Ο GO

<0 Η Ο * * * Α r4 ο -f ο ο 5 * Μ ~ X ^ <0 Ό •Η Μ <β

St ο u CO C0 Ο ιβ ...

η ο Ο f» >1 r-f ο Ο» 04 C Ή r-4 1"^ ® U ® _ οι —. οι η a α ο „ Λ · ο ο ο ο η ή 2 (0 β « 3 α λ Οι §§ .u ® w Λ θ’ ca <0 0 01 U Μ a ο Ό Ό β η 5« οι

ft Qrr £ to ο Ν φ W

Ο r-t Τ-> Ο “ * *

Ho 0-Η3 2 >£ i idi-i 0 Μ Η θ' ^ ^ 2 Η W > Ο»

Ok ® §4 C «ί

01 (D

Λ Qi DO ο Ο 01 ο ^ « Η ^ . 4-) ΓΟ ίΊ Q S ϋ Ο * * Λ 2 5 % 2 S 5» Ö I “ ^ * I § § Η 63 ►3 01 (J Η §5 § 3 § ω οι S Η 2 63 01 C3

Ο» U

C ο 3 υ ** a ο ο * a ο ο ο γ~ <-ι Η η ο. -η Ο —I -η Ό Λ -Η σι μ Λ C <Β 3 α> <0 Ό ,-ι οι u u α -η <υ α» Ό S4 ® 0) c Μ 01 01

Js 0 U ϋ s oS a a a ο ο ο» . οι οι 8403231 1 " * -30- * *

De resultaten tonen aan, dat 57,2% fructose werd bereikt, terwijl het psicosegehalte beneden 0,4 gew.% bleef, berekend op droge basis en de kleur beneden 20 werd gehouden .

VOORBEELD IV

5 Dit voorbeeld geeft een directe isomerisatie van een glucose- houdende oplossing weer, hoofdzakelijk bestaande uit een geraffineerd maiszetmeelhydrolysaat, waarbij een samenstelling met 56,3% fructose op droge basis door een tweetrapsisomerisatie werd verkregen. Een lage temperatuurisomerisatie bij 70°C werd eerst uitgevoerd en het produkt 10 van deze reactie gebruikt als voeding voor een tweede reactor van hoge temperatuur (103,3°C) met daarin een chemisch gestabiliseerde isomerase. De chemisch gestabiliseerde isomerase was er een, waarbij het enzym in wisselwerking was omgezet met een beschermend proteïne (bijvoorbeeld afkomstig, uit gist) .

15 De lage temperatuurs isomerisatietrap met inbegrip van de be schrijving van substraat en experimentele voorwaarden is weergegeven in; voorbeeld I.

De chemisch gestabiliseerde glucose isomerase, die in de hoge temperatuursreactor werd gebruikt werd als volgt bereidi Oplosbare 20 glucoseïsomerase voor chemische stabilisatie werd bereid en gezuiverd volgens voorbeeld I. De specifieke activiteit van dit preparaat bedroeg ca 40 IglU/mg proteïne. Een beschermend proteïne werd als volgt uit bakkersgist verkregen: Aan 1229 g bakkersgist (vochtige koek) -werden 1000 g water en 500 g tolueen toegevoegd. Het mengsel werd een nacht bij . 25 kamertemperatuur geroerd en daarna verhit op 85°C, welke temperatuur 30 minuten werd aangehouden. Het mengsel werd gefiltreerd op een Buchner-trechter. Nagenoeg alle tolueen bleef in de onoplosbare celdeeltjes achter, terwijl het waterige filtraat het oplosbare gistextract bevatte. Dit waterige filtraat werd op een roterende verdamper bij 40°C inge-30 dampt tot 276 g, waarna 41 g trichloorazijnzuur onder roeren werd toegevoegd. Het neergeslagen gisteiwit werd opgevangen en daarna opnieuw opgelost in 0,1 M_natriumfosfaatbuffer met pH 7,0. Na klaren door filtreren werd de oplossing behandeld met 900 ml (ca 3 volumina) aceton. Het verkregen neerslag werd opgevangen, opgelost in 0,01 M 35 natriumfosf aatbuf f er met pH 7,0 en de verkregen oplossing tegen 0,01 M natriumfosf aatbuf f er gedialyseerd. Het verkregen produkt 840 3231 -31- 1 * ' \ (150 cm3) werd gemerkt als beschermend eiwit, verkregen uit bakkersgist.

Een 0,6% chitosanoplossing werd bereid door oplossen van 24 g chitosan (kytex van Hercules Inc., Wilmington; Delaware) in 4 liter 0,08 N HCl.

Deze oplossing werd met 8 N natronloog op pH 6,2 gebracht, gefiltreerd -at 5 door Whatman Nb. 3 filterpapier, daarna gedialyseerd tegen 16 liter gedemineraliseerd water. In een bekerglas van 400 cm3 werden ca 100.000 I6XU oplosbare glucose isomerase (gemengd met filterhulpmiddel) gebracht, gevolgd door 1 g xylitol en 100 cm3 (2/3) van het beschermende proteïne verkregen uit bakkersgist. Aan dit mengsel werd 2,4 mg MgSO^T^O 10 toegevoegd, gevolgd door 24 ^uliter molair kobaltchlorideoplossing.

Het mengsel werd gefiltreerd om het filterhulpmiddel te verwijderen, waarna de oplossing op een roterende verdamper bij ca 40°C tot nagenoeg droog werd geconcentreerd en wel in een 2 liter rondbodemkolf. Aan deze kolf werd 800 cm3 citrosan met. pH 6,2 toegevoegd. Het mengsel werd 15 vervolgens wederom in een rotererende verdamper bij nagenoeg 40°C tot nagenoeg droog geconcentreerd en 840 ml 50% glutaaraldehyde oplossing (pH gebracht op 6,5) hieraan toegevoegd. Het mengsel werd een nacht in een koude ruimte opgeslagen. Het gevormde gel werd uit de kolf verwijderd en gewerkt door een zeef met gaatjes van 0,8 mm en 20 bij ca 37°C in een oven gedroogd. Dit gedroogde enzympreparaat werd gezeefd om het fijiste verwijderen, (kleiner dan 0,2 mm) en daarna gebruikt (8,9 g eindprodukt) voor een hoge temperatuursisomerisatie.

De reactor van 103.3°C werd als volgt geïnstalleerd. Het bovengenoemde glucose isomerase preparaat (8,9 g) werd in het substraat 25 gesuspendeerd en ander een laboratorium «vacuum 30 minuten bij kamertemperatuur ontlucht. De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het bereiden van een bed van 1,5 x 29 cm in een glazen mantelkolom.

Het substraat, bereid in de eerste trap bij 70°C werd op pH 6,75 gebracht en verdund tot 42,0% droge stof. Dit substraat werd 30 vervolgens door de hoge temperatuursreactorkolom gepoept en wel met een stroomsnelheid van l£ cm3 /min, bij een temperatuur van 60°C en gedurende 30 minuten. De temperatuur binnen de kolom werd gemeten met een thermometer direct aangebracht boven het bed en omgeven door glazen korrels met een diameter van 0 ,5 cm om het dode volume zo klein 35 mogelijk te houden. De kolomtemperatuur werd vervolgens snel verhoogd door olie van 104°C uit een gethermostatiseerd bad door de mantel te laten recirculeren.

840323 1 •4 «.

< -32-

Heteffluent uit de kolom werd gemeten met een schrijvende polarimeter, geijkt voor het af lezen van 50 - 58% fructose. Fracties van ca 5 cm? werden opgevangen tot 55% of meer fructose werd geproduceerd, op welk punt het experiment werd afgebroken. Tijdens het verzamelen van 5 de monsters werd een effluent onmiddellijk af gekoeld in ijsbad en de pH op ca 4,0 gebracht door een toevoeging van 1 molair citroenzuur •3 (0,1 cm' ) en vervolgens verdund zoutzuur.

De geisomeriseerde oplossingen verkregen uit de reactoren van 70°C en 103,3°q werden geanalyseerd op koolhydraatsamenstelling en kleur.

10 De resultaten zijn vergeleken met het overeenkomstige analyse uitgevoerd bij het niet-gelsomeriseerde substraat, zoals blijkt uit de volgende tabel.

840 323 t ‘ I ' \ -33- 2 a o in t- o φ Η O * · · pH U pH O o 2 W - X n 0) 4h Ό

0 -H

P u a as

JS

(DO fO N

O' Ü · ’

ο Λ tN PH PH

SH 0) Ό >1

pH

Q) Q

O' ι-t ft

C *H

W U

H p*

pH CD

2 φ « Φ pH

Ξ *> » Λ ·

Γ3 CD ft Ο Ο Ο O

Η O 0 -S

CQ SOU

co as c a Ο ϋ o ©

So X

ft »n ®

O - M

£h ro 4J Φ jS S S^n O -¾1 *n 2 3H jj O * * ·

Sc Ό C Ο 5* <£

So >ιβ»3 σι ^

m Λ ο pH

DU H p w CO 0 2 u O Q ft

Η Γ* i2 CD

q +) a> •<r ^ Λ » z H o o _ _ W3 tf « £ f, m. m.

h > 5 0

§ Q φ D O pH ID

o 2 O' M in in êh Z H ^ Ή

H W

iJ ra $ Ü & z 1 w s w a h ® β o - 0 po

O

0 n 0» o o

C _ p* pH

•pH Ό CD M m -n

Π φ -p| iH

0 o A Λ ft -Η Ό Ό & Jh M |h φ φ Φ & ε φ φ c o » m

•pH 0) -pH fH

pH «pf iH $H

Q) φ φ Φ Ό O' ε ε c oo « 4-1 m in

_C <D Μ M

φ iH^ Φ <B

S) S O' O' 840 323 1 -34-

Deze resultaten tonen aan, dat 56,3% fructose werd bereikt, terwijl het psicosegehalte beneden 0,2 gew.% op droge basis bleef. VOORBEELD V

Dit voorbeeld geeft een directe isomerisatie weer van een glucose 5 houdende oplossing die in hoofdzaak bestond uit een geraffineerd maïszetmeel hydrolysaat met een lage zoutconcentratie tot een samenstelling met 55,4% fructose op droge basis, waarbij een tweetrapsisomerisatie-procede werd toegepast» Eerst werd een lage temperatuursisomerisatie bij 70°C toegepast waarna het produkt van deze reactie als voeding werd 10 gebruikt voor een hoge temperatuursreactor (112,6°C) met daarin een chemisch gestabiliseerde isomerase. De chemisch, gestabiliseerde isomerase was er een, waarbij het enzym covalent was. gebonden aan een oplosbaar polymeer volgens een multipunt. aanhechting, waarna het geheel onoplosbaar was gemaakt tot een geïmmobiliseerde katalysator.

15 Het hydrolysaat werd bereid uit maïszetmeel door de werkwijze beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.644.126 (vervloeiing) en Amerikaans octrooischrift 3.280.006 (versuikering). De versuikerde vloeistof werd geraffineerd volgens Amerikaans octrooischrift 3.834.940 en wel tot een produkt met daarin 93,8% glucose berekend op droge stof. 20 Voldoende kristallijne glucose werd toegevoegd om het totale glucosegehalte op 96,9% op droge stof te brengen. De verkregen oplossing had de volgende samenstelling: totaal droge stof (%) 50.3 glucose (% op droge basis) 96.9 25 fructose (% op droge basis) 0.1 polysaccharide (% op droge basis) 3.1 psicose (%. op droge basis) 0.0

NaHS03 (mM) 2.5

MgS04 ( mM) 2.5 30 CoCl2 (mM) 0.1 pH 6.8

De lage temperatuursisomerisatie werd bij 70°c uitgevoerd door de boven weergegeven substraatoplossing door de lage temperatuursreactor beschreven in voorbeeld I met een stroomsnelheid van 2,5 cm/min 35 te pompen. De eerste 1000 cm komende uit de reactor werden weggeworpen.

8403231 -35-

Het effluent dat hierna afvloeide werd opgevangen en gebruikt bij de tweede isomerisatie die bij hoge temperatuur verliep.

De chemisch gestabiliseerde katalysator , die werd gebruikt in de hoge temperatuursreactor werd als volgt bereid: Oplosbare glucose 5 isomerase werd bereid en gezuiverd volgens de methode beschreven in voorbeeld I. De specifieke activiteit van dit preparaat bedroeg ca 40 IGXU/mg eiwit. Een.oplossing van een oplosbaar polymeer, een polyamine7werd bereid door oplossen van 48,4 g chitosan (Kytex van Hercules Ine. te Wilmington, Delaware 19899} in 15 liter 0,08 H HC1.

10 Eenmaal opgelost werd de chitosanoplossing op 0,5 NaCl gebracht door de toevoeging van 438 g NaCl, waarna de verkregen oplossing met 8 N natronloog op pH 6,1 werd gebracht. De chitosanoplossing werd vervolgens gefiltreerd door Whatman?^ 3 papier ter verwijdering van onoplosbaar materiaal. Aan de 15 liter 0,3% chitosan in 0,5 M NaCl oplossing 15 bij pH 6,1 werd het volgende toegevoegd.: 520 ml oplosbare isflmerase met een activiteit van ca 602.000 IGIU, 236 g xylitol (van Sigma Chemical Co.) en 3,07 g MnC^^EgO. Deze oplossing werd 2 uren geroerd, waarna 7,44 g 1-ethyl-3-dimethyl-aminopropylcarbodiimide (van Sigma Chemical Co.) werd toegevoegd om op een multipunt wijze de carboxyl— 20 groepen van de isomerase aan de aminogroepen van het chitosan te binden. Ka 2 uren staan bij kamertemperatuur werd 15,5 cm3 van een 50 gew.% glutaaraldehyde oplossing (van Eastman Kodak Chem. Co) toegevoegd, waarvan de pH met 8 N natronloog op 6,0 was gebracht; door deze toevoeging werd het covalent gebonden isomerase-chitosan complex onoplos-25 baar gemaakt. Na 15 minuten werd 4 liter van een 1 M fosfaatoplossing met pH 8,0 onder roeren aan het onoplosbare isomerase-chitosan toegevoegd. Het geïmmobiliseerde isomerase-chitosan complex werd gewassen met gedemineraliseerd water, terwijl het op een Buchner vacuumfilter lag met daaronder een Whatman #3 filterpapier. Het preparaat werd 30 aan de lucht gedroogd, gemalen en gezeefd op een grootte van 0,2-0,8 mm. De droge katalysator had een uitgedrukte activiteit van 803 IGIU/g.

De reactor van 112,6°C werd als volgt ingesteld. Een hoeveelheid van 7,0 g katalysator werd gesuspendeerd in het substraat en onder een laboratoriumvacuum 60 minuten bij kamertemperatuur ontlucht. De ont-35 luchte suspensie werd gebruikt voor het bereiden van een 1,0 x 40 cm bed in een glazen mantelkolom. Het gecompacteerde bed bevatte 5621 IGIU.

840 323 1 -36-

ί V

Substraat, verkregen uit de eerste trap van 70°C werd gebracht op een pH van 6,55 en met gedemineraliseerd water verdund op 42,0% droge stof, waarbij tevens de zoutconcentratie werd verlaagd op 2,1 mM wat betreft NaHSO^ en 2,1 mM wat betreft MgS04· Dit substraat werd 5 vervolgens door -de hoge temperatuursreactorkolom gepompt en wel onder een druk van 0,9 barr overdruk gedurende 10 minuten bij een stroomsnelheid van 8 cm3/min en bij een temperatuur van 60,0°c. De temperatuur binnen de kolom werd gemeten met een thermometer die direct boven het bed was aangebracht en was omgeven door zandkorrels tot aan 10 de temperatuurschaal, om het dode volume zo klein mogelijk te houden.

De kolomtemperatuur werd vervolgens snel verhoogd met circulerende olie uit een gethermostatiseerd bad van ca 114°C. De kolomtemperatuur liep op tot 112,6°C en de stroomsnelheid werd verlaagd op 1,89 cm^/min.

Het effluent uit deze kolom werd gemeten met een schrijvende 15 polar ime ter,, geijkt voor het af lezen van 50 - 58% fructose. Nadat de kolomtemperatuur de 112,6°C had bereikt, en het fructosegehalte van het effluent het gewenste niveau had bereikt, werd het effluent opgevangen.. De. pE werd.Onmiddellijk op 4,0 gebracht door een toevoeging van 1 M citroenzuur. Effluent werd opgevangen tot het schijnbare 20 fructosegehalte beneden 55% daalde.

De gelsomeriseerde oplossingen verkregen uit de reactoren van 70°c en 112,6°C werden geanalyseerd op koolhydraat samenstelling en kleur en de resultaten vergeleken met een zelfde analyse uitgevoerd bij de niet-geisomeriseerde substraatoplossing, zoals is weergegeven in 25 de volgende tabel.* 840 323 1 -37-

ll 5» ^ UI

sosa ·

«HO O O O

H O H

H ~ X

(0 Ό

*rH

M

«J

“O H t*· «O

Ö · · ·

<β m cn (N

ca > öl <tt 8i

SOI

•H +1 I—I CQ «

— H U

§« « O

U 0> Ö H

C3 tn o -H * 2 c u tn o o o H OOft

co S

co <u « „

Soa τη β H 01

Pt -U !-t Q oi cn o o o « > o · · * S+O <β β S ia m cn

(ύ CN Μ Λ H O) 'T

13 % a "

Sc 5 0 « HO o * oi O 0*0

CO CJ « S +J

O dl ü _ HO 0» 3 <r n· mgr* n · .. # <m o h tn >-3 —' in m § > o

61 S I

H SS

.J co 1-3 η a a Η Η a s Μ I a o

to Ö VO

CJ «·

0 CN

σ> ο h

C f" H

•A Ό 01 W 1-1 1-1

01 <0 ·Η H

Ο ® Λ Λ Η 01 _ _ ft 1-1 Ό Ό ff U H u ω <ΰ (ΰ Ο 5 « « ö ο μ Μ Η 01 Η Η Η «Η Μ Μ « ' « Ο Ο ο ο I δ c οο «J 4J 01 01 j3 ι « Η Η « -Η « ® CQ C θ' θ' - 840 323 1 -38- Μ

7 V

De resultaten tonen aan, dat 55,4% fructos'B werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,2-gew.% op droge stof en de kleur beneden 9 (CIRFxlOO) bleef.

VOORBEELD VI

5 Dit voorbeeld, geeft, èen directe isomerisatie weer van een glucosehoudende oplossing hoofdzakelijk bestaande uit een geraffineerd maïszetmeel hydrèlysaat met een laag zoutgehalte en wel tot een gehalte . - met 54,8 % fructose op droge basis met een bijzonder laag psicosegehalte (minder dan 0,1%) en een bijzonder geringe kleur.(minder 10 dan 2 CIRFxlOO), waarbij een tweetrapsisomerisatieprocede werd toegepast.

De eerste (lage temperatuur) reactor werd gehouden op ,70°C en de twee (hoge temperatuur) reactor op 105,8°C.De chemisch gestabiliseerde isomerase, die werd gebruikt in de hoge temperatuursreactie was er een, waarin het enzym covalent was gebonden aan een oplosbaar polymeer 15 volgens een multipunt aanhechting, en vervolgens onoplosbaar was gemaakt tot een geïmmobiliseerde katalysator.

Het substraat en zijn omzetting in de eerste trapsreactor bij 70°C is beschreven? in voorbeeld V..

De geïmmobiliseerde katalysator, toegepast in de hoge temperatuurs; -20 zeactor bij 105,8°C was eveneens dezelfde als beschreven in voorbeeld V.

De reactor van 105,8°C werd als volgt ingesteld: Een hoeveelheid van 5,63 g katalysator werd gesuspendeerd in het substraat en onder een laboratoriumvacuum 60 minuten bij kamertemperatuur ontlucht«, De ontluchte suspensie werd gebruikt voor het bereiden van een 1,0 x 32 cm bed en 25 wel in. een glazen mantelkolom. Het gecompacteerde bed bevatte 4521 IGIU.

Een substraat, verkregen uit de eerste trap van 70°C werd op pH 6,5 gebracht en met gedemineraliseerd water verdund tot een gehalte van 42,0% droge stof, waarbij de zoutconcentratie werd verlaagd op 2,1 mM wat betreft MgS04 en 2,1 mM wat betreft NaHSO^.

30 Dit substraat werd vervolgens door de hoge-temperatuurskolom gepompt onder een druk van 0,7 barr overdruk en met een stroomsnelheid van

O

8 cm /min en wel gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 60,0°C.

De temperatuur binnen de kolom werd gemeten met een thermometer die direct boven het bed was aangebracht en was omgeven door zand tot aan 35 het begin van de temperatuurs schaal en wel om het dode volume zo klein mogelijk te houden. De kolomtemperatuur werd snel verhoogd door een 840 323 1 -39- olie uit.een gethermogestatiseerd. bad van ca 107°C door de mantel te laten circuleren.

Het effluent uit de kolom werd gemeten met een schrijvende polari-meter gecalibreerd voor het aflezen van 50-58% fructose. Nadat de 5 kolomtemperatuur de 105,3°C had bereikt en het fructosegehalte van het effluent op de gewenste waarde was gekomen werd het effluent opgevangen. De pH werd onmiddellijk op 4,90 gébracht door een toevoeging van 1 M citroenzuur.

De gelsomeriseerde oplossingen uit de reactoren van 70°C en 10 105,8°C werden geanalyseerd op koolhydraatsamenstelling enkJeur en de resultaten werden vergeleken met een overeenkomstige analyse van de niet-gelsomeriseerde substraatoplossing, zoals is weergegeven in de volgende tabel* 840 323 1 ? ·> -40- ω * k « o o Η

3 M O

<u 2 o

1-4 W H

W U X

£ Ό i4 54 3 •s o

«J

3 h r* oo >, - · ·

Η CO CM CM

a o — IQ fii g i4 H 0> 3 a c «* o g h ff 3

Η H O

03 1-4-3 0 OJ O 0» i4 i-4 o O ff 0 3 J* ff. O' 3 >4 O» O O o o< ca ff O'

Q * 3 V

£4 ift S © 3 sfi O aS m 3

« t-4 3 i-4 O

2 ff ff. O 03 03 fO

H- ff 3 > 3

03 3 ff 3 H ff tn CM

S 54 ff O' 03 4f ir U ¥ ~ 03 0 >* 0* O ff 0 3 H Mr- H 3 > Q- 0*0 1-3 q · ff j g Η ώ S- ü

H § EQ 3 3 H <3· CO

03 > 0» 54 ...

3« q ~ ff o -4 rr 61 s § x/ Λ 10 HM x q ca M 5

13 I

z o S w ,,

S H U

3 M 03 o 03 p - 3 u ® 3 0 03

3 O O

o P* r4 Η Ό CU 54 τη τι

0 o f4 H

3 ff ff 0» 3 fi H <0 <0 f4 M 54 54 r4 3 3 3 3 £33 Ό 0 3 3 C 3 f4 f4 3 H 54 54 ff 3 3 3

3 O' S S

ffl 0 0 4-13 3

3 Μ H

f4 3 3 C O' O' 840 323 1 η ' " * -41-

De resultaten tonen aan, dat een gehalte tan 54,8% fructose werd bereikt terwijl het psicosegehalte beneden 0,1 gew.% op droge basis en.de kleur beneden 2 werd gehouden.

840 323 1

Claims (18)

1. Werkwijze voor het isomeriseren van glucose tot fructose, door een glucose-houdende voedingsvloeistof met een chemisch gestabiliseerde glucose isomerase bij een temperatuur tussen 90 en ca 140°C bij een pH tussen ca 3 en 8 gedurende een eigenlijke contacttijd in contact te 5 brengen, welke voldoende is om een uiteindelijk gehalte in de vloeistof van ten minste ca 53 - 60 gew.% fructose berekend op het totaal kool-hydraatgehalte tot stand te brengen, waarbij de ontledingstijd wordt geregeld tot een waarde gelijk of minder dan de waarde berekend met de formule 10 td - a log (4300/(T+273) - pH - 3.23) (1) waarin T de reactie temperatuur in °C, pH de pH van het reactiemengsel en de ontledingstijd in minuten voorstellen; waardoor een aanmerkelijke. vorming van psicose en/of andere niet-fructose, niet-glucose suikers wordt verhinderd. 15

2* Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat* de glucose-houdende vloeistof wordt verkregen door een hydrolyse van maïszetmeel.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de glucose-houdende voedingsvloeistof wordt verkregen door een isomerisatie van een maïszetmeel hydro lysaat tot een fructosegehalte tot ten hoogste 20 52%, berekend op het totale -koolhydraatgehalte··

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de glucose— isomerasebron een microorganisme is geselecteerd uit. Streptomyces-soorten, mutanten, varianten of genetische modificaties daarvan.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de * 25 glucose isomerasebron een microorganisme is geselecteerd uit Streptomyces sp. ATCC 21175, mutanten, varianten, en genetische modificaties daarvan.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de gekozen isomerasebron een microorganisme is, waarin een gemuteerd 30 glucose isomerase gen ingevoerd is, welk gemuteerd gen een glucose isomerase oplevert met een hoge thermische stabiliteit.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de glucose isomerase een thermische stabiele glucose isomerase is. 8403231 -43- t 9

8. Werkwijze volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat de thermisch stabiele glucose isomerase wordt verkregen uit Bacillus Stearothermophilus.

9. Werkwijze volgens conclusies 1-8, met het kenmerk., dat een 5 enzym denatufcering remmende hoeveelheid van een in water oplosbaar zout van zwaveligzuur in het isomerisatiemedium aanwezig is.

10. Werkwijze volgens conclusies 1-9, met het kenmerk, dat de glucose houdende voedingsvloeistof ca 30 tot ca 50 gew.% koolhydraat bevat.

11. Werkwijze volgens conclusies 1-10, met het kenmerk, dat de glucose-houdende vloedingsvloeistof in contact wordt gebracht met chemisch gestabiliseerde glucose isomerase en wel bij ca 100-110°C.

12. Werkwijze volgens conclusies 1-11, met het kenmerk, dat de pH van het isomerisatiemedium tussen 5 en ca 6,5 wordt gehouden.

13. Werkwijze volgens conclusies 1-12, met het kenmerk, dat de con- tactduur gelegen is tussen 2 minuten en ca 30 minuten.

14. Werkwijze volgens conclusies 1-13, met het kenmerk, dat de chemisch gestabiliseerde glucose isomerase wordt toegepast in een geïmmobiliseerde vorm.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de chemisch gestabiliseerde glucose isomerase is geïmmobiliseerd op diethylaminoethyl cellulose.

16. Werkwijze volgens conclusies 1-15, met het kenmerk, dat de glucose-houdende voedingsvloeistof met daarin 20-65 gew.% glucose 25 in contact wordt gebracht met glucose isomerase en wel bij een temperatuur tussen 20 en 30°C en een pH tussen 6 en 9 waarbij een contacttijd wordt aangehouden die voldoende is om het uiteindelijke gehalte in deze vloeistof op ten minste 40-50 gew.% fructose te brengen, berekend op het totale koolhydraatgehalte; de temperatuur van het isomerisatie-30 medium vervolgens op een waarde tussen 90 en 130° wordt gebracht, de pH van het isomerisatiemedium naar behoefte binnen het traject tussen ca 3 en ca 8 wordt ingesteld, dé' fructoser-houdende vloeistof met chemisch gestabiliseerde glucose-isomerase in contact wordt gebracht en wel gedurende een eigenlijke contacttijd die voldoende is om een 35 uiteindelijk gehalte in de vloeistof van ten minste ca 53-60 gew% fructose, berekend op totaal koolhydraatgehalte te doen ontstaan, 840 323 1 V .w -44- waéLrbij de ontledingstijd wordt geregeld op een. waarde die gelijk of minder is dan de waarde berekend uit de formule t= a log (4300/T+273) - pH-3.23) (1) α waarin T de reactie temperatuur in °C, pH de pH van. de reactiemengsel en 5 t^ de ontledingstijd _ in minuten voorstellen, waardoor een aanmerkelijke vorming van psicose en/of andere niet-fructose, niet-glucose-suikers wordt vermeden.

17. Werkwijze volgens conclusies 1-16, met het kenmerk, dat het produkt in de vorm van een fructose-glucosestroop wordt afgekoeld op 10 een temperatuur beneden ca 80°c.

18. Werkwijze volgens conclusies 1-17, met het kenmerk, dat het isomerisatiemengsel wordt afgekoeld op een temperatuur tussen ca 20 en 80°C na verwijdering van het enzym uit het isomerisatiemengsel. s 8403231 • «e _____