FI79558B - Foerfarande foer isomerisering av glukos till fruktos. - Google Patents

Description

1 79558

Menetelmä glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi

Keksinnön kohteena on entsymaattinen menetelmä glukoosin (dekstroosin) muuttamiseksi fruktoosiksi (levuloo-5 siksi), eli menetelmä glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi, jossa glukoosia sisältävä syöttöliuos, jossa on n. 20 - n. 65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen S-treptomyces rubigenosus-kannasta johdetun glukoosi-isome-raasin kanssa lämpötilassa n. 100eC - n. 112,6eC ja pH:ssa 10 n. 4 - n. 7, riittävän pitkäksi kosketusajaksi, jotta fruktoosin lopulliseksi pitoisuudeksi liuoksessa saadaan vähintäin n. 53-60 paino-% hiilihydraattien kokonaismäärästä laskettuna.

Suurin osa elintarvikelaatuisesta glukoosista saa-15 daan maissitärkkelyksen entsymaattisena hydrolysaattina, ts. kaupallisena maissisiirappina. Glukoosin arvioidaan yleensä olevan 60-80 % niin makeata kuin sakkaroosi ja sentähden sitä myydään vastaavasti alemmalla hinnalla. On kauan ollut tunnettua isomeroida glukoosi fruktoosiksi 20 (joka on jopa makeampaa kuin sakkaroosi) käyttäen entsyymiä, jolla on glukoosi-isomeraasiaktiivisuus, edullisesti entsyymiä, joka on tehty liikkumattomaksi inertillä kantajalla kuten dietyyliaminoetyyliselluloosalla, huokoisella lasilla ja kitiinillä. Yksityiskohtaisia selostuksia 25 glukoosin entsymaattisesta muuttamisesta fruktoosiksi käyttäen glukoosi-isomeraasia, voidaan löytää Hamilton'in, et ai. kirjoituksesta "Glucose Isomerase a Case Study of Enzyme Catalysed Process Technology", julkaisussa Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes, Olson et 30 al., Plenum Press, New York, (1974), sivut 94-106, 112, 115-137; Antrim'in et ai., kirjoituksessa "Glucose Isomerase Production of High-Fructose Syrups", julkaisussa Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2, Academic Press (1979); Chen'in, et ai., kirjoituksessa "Glucose 35 Isomerase (a Review)", julkaisussa Process Biochem., 2 79558 (1980), sivut 30-35; Chen'in, et ai., kirjoituksesta "Glucose Isomerase (a Review)" julkaisussa Process Biochem., (1980), sivut 36-41; Nordahl'in et ai., kirjoituksesta "Fructose Manufacture from Glucose by Immobilized 5 Glucose Isomerase", julkaisussa Chem. Abstracts, Vol. 82, (1975), Abs. No. 110316h; ja Takasaki'n kirjoituksesta "Fructose Production By Glucose Isomerase", julkaisussa Chem. Abstracts, Vol. 82, (1975), Abs. No. 110316h; ja Takasaki'n kirjoituksesta "Fructose Production by Glucose 10 Isomerase", julkaisussa Chem. Abstracts, Vol. 81, (1974), Abs, No. 76474a. Lisäksi on olemassa lukuisia patentteja, joiden kohteena on glukoosi-isomerointi ja joista ovat edustavia US-patentit no 3 616 221; uusintapainos 28 885 (alunperin 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 15 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 144 127; ja 4 308 349.

Fruktoosi-tasoja, jotka voidaan saavuttaa isomero!-maila glukoosia glukoosi-isomeraasilla, rajoittaa isome-roimisreaktion tasapaino. 65°C:ssa reaktion tasapaino on 20 n. 51 %:ssa fruktoosia laskettuna puhtaan dekstroosi-läh-tösubstraatin painosta. Kun puhdistettua glukoosi-liuosta käytetään substraattina (joka sisältää n. 6 paino-% ei-monosakkarideja) ja annetaan olla kohtuullisen viipymis-ajan entsyymireaktorissa, on 48-52 % fruktoosisiirappia 25 suurin fruktoosi-pitoisuus, joka voidaan saavuttaa (kuiva-aineesta laskettuna) aikaisemmilla menetelmillä, joihin viitattiin. Siirappien saamiseksi, joilla on suurempi fruktoosi-pitoisuus, täytyy käyttää fraktiointisystee-mejä, jotka nostavat suuresti lopullisen tuotteen hintaa. 30 Korkeammissa lämpötiloissa tasapainosta tulee kuitenkin edullisempi. Esimerkiksi, entsymaattista glukoosi-isome-raasiprosessia, jota pystytään käyttämään n. 90-140°C;n lämpötiloissa, voitaisiin käyttää antamaan suoraan runsaasti fruktoosia sisältäviä maissisiirappeja (HFCS), jot-35 ka sisältävät 53-60 paino-% fruktoosia, kuiva-aineesta 3 79558 laskettuna, poistaen siten fraktioinnin ja palauttamisen tarpeen. Tunnettujen glukoosi-isomeraasisysteemien taipumus joutua alttiiksi termiselle denaturoinnille, johon liittyy jyrkkä aktiivisuuden pieneneminen, on tähän asti 5 tehnyt tyhjäksi yritykset käyttää hyväksi korkeampia lämpötila-alueita isomeroimistasapainon siirtämiseksi edelleen fruktoosin eduksi. Lisäksi glukoosi ja varsinkin fruktoosi ovat herkkiä pelkistäviä sokereita, joilla on merkittävä taipumus muodostaa ei-toivottuja sivutuotteita, 10 kuten psikoosia, värillisiä tuotteita, väriprekursoreja, fruktoosidianhydridejä, mannoosia, tagatoosia ja happoja, kuumennettaessa lämpötiloihin, jotka ovat tarpeen isome-rointiin tämän keksinnön mukaisesti.

Nyt on yllättäen keksitty, että toteuttamalla glu-15 koosi-isomeroimismenetelmä tietyin kriittisin pH-rajoin ja tietyllä viipymisajalla entsyymireaktorissa, kuten jäljempänä määritellään, voidaan tehokkaasti käyttää isome-roimislämpötiloja n. 100°C - n. 112,6°C:seen korkealaatuisten HFCS-siirappien suoraan valmistamiseksi, (ts. hy-20 väksyttävällä sivutuotteen muodostumisella), jotka sisältävät n. 53 - n. 60 paino-% fruktoosia, poistaen siten kalliin ja käytön kannalta monimutkaisen fraktioinnin ja palautustyövaiheiden tarpeen, joita tunnetut glukoosi-iso-meroimisprosessit vaativat edellä mainitun fruktoosipitoi-25 suusalueen saavuttamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisesti glukoosi isomeroidaan fruktoosiksi menetelmällä, jonka mukaisesti glukoosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen glukoosi-isomeraasin kanssa n. 100°C:n - n. 112,6°C:n lämpötilassa pH:ssa vä-30 liitä n. 4 - n. 7 ja kosketusajaksi, joka on riittävä lop-pupitoisuuden liuoksessa saavuttamiseksi, joka on vähintään n. 53 - n. 60 paino-% fruktoosia laskettuna kokonais-hiilihydraattipitoisuudesta. Menetelmälle on tunnusomaista, että glukoosi-isomeraasi on kemiallisesti stabiloitu 35 ja että hajoamisaika säädetään arvoon, joka on yhtä , 79558 4 suuri tai pienempi kuin arvo, joka lasketaan kaavalla td * log (4300/(T + 273) - pH - 3,23) (1), 5 jossa T on reaktiolämpötila °C:ssa; pH on reaktioseoksen pH; ja td on hajoamisaika minuuteissa, psikoosin ja/tai muiden ei-fruktoosi-, ei-glukoosisokereiden olennaisen muodostumisen estämiseksi, jolloin kemiallinen stabilointi käsittää molekyylin sisäisten ristisidosten muodostamisen 10 silloitusaineen avulla ja/tai sekapolymeroinnin polymeeri-matriisin.

Glukoosi, joka isomeroidaan fruktoosiksi tämän keksinnön mukaisesti, voi olla peräisin tämän sokerin mistä tahansa tunnetuista lähteistä. Taloudellisista syistä glu-15 koosi johdetaan tavallisesti selluloosan tai tärkkelyksen hydrolyysistä käyttäen happoa ja/tai entsyymiä, edullisesti jälkimmäistä, tunnettujen menetelmien mukaisesti. Tällä tavalla saadut glukoosia sisältävät liuokset sisältävät tyypillisesti pieniä määriä polysakkarideja, sokerioligo-20 meerejä Jne., riippuen käytetystä hiilihydraattilähteestä ja käytetystä hydrolyysimenetelmästä. Viljarouheet, kuten maissi, durra, vehnä, ruis yms. ja tärkkelyspitoiset juuret sekä juurimukulat, kuten perunat, jamssit, porkkanat, kassava (maniokki) yms. ovat erinomaisia tärkkelyslähtei-25 tä muutettaviksi tämän keksinnön glukoosi-lähtöaineiksi. Yhdysvalloissa maissitärkkelys on erityisen edullinen, mikä johtuu sen verraten alhaisesta hinnasta ja helposta saatavuudesta. Koska elintarvikeasteisen glukoosin tuotanto suosii entsymaattisten tärkkelyshydrolyysimenetelmien 30 käyttöä, pidetään tässä tällaisia menetelmiä edullisina. Entsyymihydrolyysimenetelmä on selostettu US-patenteissa nro 4 017 363, 3 912 590, 3 922 196, 3 922 197-201 ja 4 282 722, jotka esitetään tässä viitteinä.

Streptomyces sp. ATCC 21 175 on erinomainen lähde 35 glukoosi-isomeraasille käytettäväksi tämän keksinnön mene- 5 79558 telmässä. Kuten aikaisemmin todettiin, saattaa olla edullista käyttää glukoosi-isomeraasia, joka on pysyvä tässä käytetyissä suhteellisen korkeissa isomeroimislämpötilois-sa.

5 Koska mikro-organismit tuottavat glukoosi-isomeraa sia solunsisäisesti, voidaan saada glukoosi-isomeraasi lähde yksinkertaisesti kokoamalla solut ja entsyymi voidaan erottaa soluista alalla tunnetuin menetelmin esim. solu-autolyysillä, sonikoimalla, ja niitä voidaan käyttää 10 tunnetussa ja tavanomaisesti muotoillussa entsyymireakto-rissa. Kemiallisesti stabiloitu glukoosi-isomeraasi voidaan edullisesti imroobilisoida inerttiin kantajaan tunnettujen ja tavanomaisten menetelmien mukaisesti, ellei se ole tullut liukenemattomaksi seurauksena kemiallisesta 15 stabiloinnista. Ainekset ja menetelmät, joita käytetään entsyymien immobilisoimiseen, ovat hyvin tunnettuja ja niitä on selostettu joukossa julkaisuja, kuten julkaisuissa Wang, et ai., Fermentation & Enzyme Technology,

John Wiley & Sons, Inc., New York (1979), sivut 318-338, 20 ja julkaisussa Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical

Technology, 3. painos, John Wiley & Sons, Inc., New York (1980) Vol. 9, sivut 148-172, joihin tässä viitataan. Pienten määrien koboltti-, mangaani- ja magnesiumkationia ja/tai rikkihapokkeen vesiliukoisen suolan, kuten nat-25 riumsulfiitin, natriumbisulfiitin ja/tai magnesiumbisul-fIitin, kuten on esitetty US-uusintapainospatentissa nro 28 885, läsnäoloa glukoosi-isomeraasin denaturoitumi-sen vähentämiseksi tai estämiseksi prosessin käytön aikana on suunniteltu.

30 On välttämätöntä, että hiilihydraatin pitoisuus glukoosia sisältävässä syöttöliuoksessa on alueella n.

20 - n. 65 ja edullisesti alueella n. 30 - n. 50 paino-%, jos halutut tulokset on saavutettava.

Isomerointi toteutetaan pH:ssa alueella n. 4:sta n. 35 7:ään, edullisemmin alueella välillä 5-6,5. Isomeroinnin 6 79558 toteuttaminen merkittävästi edellä mainitun pH-alueen alapuolella tai yläpuolella johtaa liiallisten määrien ei-toivottuja sivutuotteita, kuten psikoosin, orgaanisten happojen, värillisten tuotteiden, väri-prekursorien, fruk-5 toosidianhydridien yms. muodostumiseen.

On havaittu, että pH glukoosi-isomeraasin optimi-aktiivisuutta varten pienenee merkitsevästi korkeissa lämpötiloissa. Siten Streptomyces rubigenosus-lajista, peräisin olevan glukoosi-isomeraasin aktiivisuus-optimi on 10 pH 8,6-9,2 25°C:ssa, pH 6,9-7,5 75°C:ssa ja 5,6-6,2 125°C:ssa. Siten, kun isomeroimislämpötilaa nostetaan, voidaan isomeroimis-pH-arvoa pienentää maksimi-entsyymi-aktiivisuuden ylläpitämiseksi ja lisäksi liiallisen sivu-tuotemuodostumisen välttämiseksi.

15 Vielä eräs tämän keksinnön tärkeä vaatimus on glu koosia sisältävän syöttöliuoksen ja kemiallisesti stabiloidun glukoosi-isomeraasin kosketuksessaolon kestoaika. Tällaisen kosketuksen tulee kestää n. 1 sekunnista n. 5 tuntiin, edullisesti n. 30 sekunnista n. 1 tuntiin ja 20 edullisimmin n. 2 minuutista n. 30 minuuttiin antaakseen laadultaan hyväksyttävää fruktoosisiirappia.

Edullinen kosketusaika kemiallisesti stabiloidun glukoosi-isomeraasin ja glukoosia sisältävän nesteen välillä riippuu suuressa määrin pH:sta, jossa isomeroimis-25 reaktio saatetaan tapahtumaan. pH-alueen alapäässä voidaan sietää pitempi kosketusaika aiheuttamatta liiallista glukoosin ja fruktoosin hajoamista psikoosin ja muiden ei-toivottujen hajoamistuotteiden muodostumisen vaikutuksesta. Alueen yläpäässä on lyhyempi kosketusaika tarpeen psi-30 koosin ja värin muodostumisen estämiseksi. Käytännössä kokonaisaika, jonka glukoosia sisältävä siirappi on lopullisessa reaktiolämpötilassa tai lähellä sitä, lasketaan hajaantumisajaksi (td), koska sokerin hajoamisreaktiot, jotka tapahtuvat, ovat ei-entsymaattisia ja tapahtuvat, 35 olipa liuos kosketuksessa glukoosi-isomeraasin kanssa tai 7 79558 ei. Hajoamisaika (td ) käsittää todellisen kosketusajan (ta ), jona entsyymi ja substraatti ovat kosketuksessa, plus kaiken käsittelyäjän, esim. reaktoriin tulo ja siltä poistuminen, jonka ajan substraatti on reaktlolämpötilassa 5 tai lähellä sitä. Todellinen kosketusaika (ta) on aika, jonka entsyymi on reaktiivisesti kosketuksessa substraatin kanssa, ts. substraatin suorassa kosketuksessa entsyymin kanssa. Sentähden toteutettaessa isomerointeja 90°C:n yläpuolella on tärkeätä lyhentää aikaa, joka vaaditaan glu-10 koosi-liuoksen saattamiseen haluttuun isomerolmislämpötilaan (kuten esimerkiksi sekoittamalla liuosta höyryn kanssa juuri ennen kosketusta isomeraasin kanssa tai sen aikana) ja kun haluttu fruktoosi-taso on saavutettu, sen jälkeen nopeasti erottaa liuos kaikesta aktiivisesta isome-15 raasista ja sitten jäähdyttää liuos niin nopeasti kuin mahdollista alle 90°C:seen ja edullisesti alle 70°C:seen.

Siten, siirappi-tuotteiden saamiseksi, joilla on hyväksyttävät ominaisuudet ilman liiallista fruktoosin tai glukoosin hajoamista, tulisi hajaantumisaikaa säätää seu-20 raavan yhtälön mukaisesti: td - log (4300/(T+273)-pH-3,23), jossa td on hajoamisaika minuuteissa; T on reaktiolämpöti-25 la Celsiusasteissa; ja pH on reaktloseoksen pH-arvo jakson aikana, jonka seos on reaktiolämpötilassa.

Edellä esitetty yhtälö osoittaa, että korkeammissa lämpötiloissa vaaditaan lyhyempiä tehokkaita kosketusaiko-ja ja/tal korkeampia pH-arvoja. pH, jota reaktiolle on 30 käytettävä, on yleensä optimi pH:ssa valikoitua isomeraa-sia varten tai lähellä sitä. Lämpötila (T) voidaan asettaa substraatin koostumuksen ja halutun fruktoosi-pitoisuuden mukaan, kuten jäljempänä selostetaan. Nämä suhteet on annettu esimerkiksi yhtälöissä 5, 6 ja 7.

35 Kosketusajan lisäkontrollia voidaan aikaansaada käyttämällä yhtälössä 4 esitettyä suhdetta, joka osoittaa, 8 79558 että kosketusaika on kääntäen verrannollinen entsyymiaktiivisuuteen. Sentähden isomeraasille, jonka optimi pH on 6,0 ja reaktiolämpötila 110°C, tulisi hajoamisaika säätää n. 100 minuutiksi tai lyhyemmäksi.

5 Jos käytetään kemiallisesti stabiloidun glukoosi- isomeraasin liukoista muotoa, on tarpeen inaktivoida tällainen (kuten esimerkiksi alentamalla pH alueelle, joka inaktivoi isomeraasin) ennen jäähdytysvaihetta korkealäm-pötilaisessa isomeroimisvaiheessa muodostuneen fruktoosin 10 takaisinmuuttumisen glukoosiksi välttämiseksi, koska iso-meroimisreaktio, tietenkin, on palautuva.

Glukoosin korkein saavutettava konversioaste fruktoosiksi määräytyy termodynaamisesta tasapainosta glukoosin ja fruktoosin välillä, joka tasapaino vuorostaan riip-15 puu lämpötilasta, jossa isomerointi toteutetaan. Glukoosin ja fruktoosin tasapainoseosten erittäin huolellinen analyysi on vahvistanut seuraavan suhteen.

F = 100 K/(K+1) (2) 20 η_τ, _ 755

InK--+ 2,300 5 (3) T+273 jossa F on fruktoosi-% tasapainossa laskettuna glukoosin ja fruktoosin kokonaispainosta, T on lämpötila (°C), jossa 25 isomerointi toteutetaan, ja K = glukoosi/fruktoosi-tasa-painovakio.

Todellinen kosketusaika glukoosia sisältävän siirapin ja isomeraasin välillä reaktorissa voidaan yleisesti laskea seuraavaan kaavaan viitaten, kun käytetään reakto-30 ria, joka sisältää isomeraasin immobilisoidun muodon.

ta - CVln \~t] (4)

35 kA

9 79558 jossa ta - todellinen kosketusaika C - glukoosin ja fruktoosin pitoisuus V - nesteen vapaa tilavuus reaktorissa (reaktio-seoksen tilavuus miinus immobilisoitujen entsyymiosasten 5 täyttämä tilavuus) F, fruktoosi-fraktio glukoosi/fruktoosi-seoksessa tasapainossa, kun ne ovat isomeroimislämpötilassa

Fo fruktoosi-fraktio (laskettuna G + F:stä) sisääntulo kohdassa reaktioseokseen 10 F - fruktoosi-fraktio (laskettuna G + F:stä) liuok sessa, joka poistuu reaktioseoksesta k * reaktionopeusvakio isomeroinnille isomeroimis-olosuhteissa A - isomeraasin aktiivisuus reaktioseoksessa.

15 k:n arvot immobilisoidulle isomeraasille, joka on valmistettu seuraavien esimerkkien mukaisesti, vaihtelevat n. 0,07:stä n. 5 g h*1 IGIU'1 lämpötiloissa alueelta 90°C -140°C, vastaavasti. Tämä suhde osoittaa tarpeen minimoida kosketusaika korkeassa lämpötilassa käyttämällä täytepat-20 joja, joilla on suuri aktiivisuus tilavuusyksikköä kohti. Täytepatjat, jotka on muodostettu menetelmien mukaisesti seuraavissa esimerkeissä, voivat sisältää korkeintaan 2000 IGIU/ml, mistä voi olla seurauksena, että saavutetaan 99,5 % tasapainon fruktoosipitoisuudesta lyhyemmässä ajas-25 sa kuin 1 minuutti suurlämpötilaisessa reaktorissa, kun käytetään porrastettuja reaktoreita eri lämpötiloissa ja syöttö ensimmäiseen reaktoriin isomeroidaan alhaisessa lämpötilassa ennen isomerointia korkeassa lämpötilassa toisessa reaktorissa. Kun käytetään porrastettua reaktori-30 systeemiä glukoosin entsymaattista muuttamista varten fruktoosiksi on edullista käyttää menetelmää, jonka mukaisesti glukoosia sisältävä syöttöliuos, joka sisältää n.

20 - n. 65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen glu-koosi-isomeraasin kanssa lämpötilassa alueella n. 20°C -35 n. 80°C pH:ssa n. 6,0-9,0 ja kosketusajaksi n. 0,5 - n. 2 tuntia 40 - n. 45 paino-%:n liuoksessa läsnäolevasta glu- 10 79558 kooslsta muuttamiseksi fruktoosiksi, isomeroimisväliaineen lämpötila nostetaan n. 100 - n. 112,6°C:seen, Isomeroimisväliaineen pH asetetaan tarpeen mukaan alueelle n. 4:sta n. 7:ään, fruktoosia sisältävä neste saatetaan kosketuk-5 seen glukoosi-isomeraasin kanssa ylimääräiseksi ajaksi n.

1 sekunnista n. 5 tuntiin konversio-tason nostamiseksi n. 53 - n. 60 paino-%:iin glukoosista, joka oli läsnä alkuperäisessä glukoosia sisältävässä syöttöliuoksessa, jolloin ei tapahdu psikoosin tai muiden ei-fruktoosi- eikä 10 ei-glukoosisokereiden olennaista muodostumista. Siten suuritehoisten täytepatjojen käyttö voi johtaa hyvin lyhyisiin tehokkaisiin kosketusaikoihin, mikä vuorostaan minimoi fruktoosin hajoamisen, jota tapahtuu tässä keksinnössä vaadituissa korkeissa lämpötiloissa.

15 Valittaessa glukoosi-isomeraasin immobilisointime- netelmiä on edullista, että käytetään menetelmiä, jotka pystyvät tuottamaan pieniä, pääasiallisesti kokoonpuris-tumattomia, huokoisia katalyytti-osasia, niin että diffuusion vaikutus isomeroimisnopeuteen minimoituu. Vaihtoeh-20 toisesti isomeraasi voidaan immobilisoida membraanin huokosissa, jonka membraanin läpi glukoosi-liuos pakotetaan korkealämpötilaisen isomeroinnin aikana keinona hyvän kosketuksen edistämiseksi entsyymin ja substraatin välillä minimoiden diffuusiosta aiheutuvat rajoitukset. Liikkumat-25 tomaksi tekemistä varten käytettävä kantaja on edullisesti kokonaan liukenematon ja inertti substraattiliuosten glukoosi/ fruktoosi-komponenttien liiallisen saastumisen tai hajoamisen välttämiseksi.

Kaupallisissa sovellutuksissa fruktoosia sisältäviä 30 siirappeja ei kuitenkaan valmisteta puhtaasta glukoosista. Mieluummin käytetään glukoosilähteenä tärkkelys-hydroly-saatteja (valmistettuina kuten edellä mainituissa kirjallisuusviitteissä) ja nämä sisältävät poikkeuksetta ei-glu-koosi- ja ei-fruktoosisakkarideja (joita tämän jälkeen 35 nimitetään polysakkarideiksi), jotka ovat peräisin tärkkelyksen epätäydellisestä hydrolyysistä ja glukoosin kon- 11 79558 densaatiosta isomaltoosiksi. Tyypillisesti näiden osuus on 3 % ja 8 % tärkkelys-hydrolyysistä johdettujen sakkari-dien kokonaiskuivapainosta. Sentähden on välttämätöntä arvioitaessa lämpötila, jossa isomerointi on toteutettava, 5 sallia kaikelle glukoosi-liuoksen sisältämälle polysakkaridille sekä myös muita tekijöitä kuten saavutettavaa fruktoosi-pitoisuutta varten laskettuna kokonaiskuivapainosta, psikoosin ja muiden ei-glukoosi- ja ei-fruktoosi-tuotteiden muodostuminen glukoosi-liuoksen ja isomeraasin 10 tehokkaan kosketusajan aikana. Suhteet isomerolmislämpö-tilan laskemiseksi esitetään seuraavassa.

T = 255_ (5)

2,3005-lnK

15 K = <6>

100-F

20 10 000 (M+C) (7) Q(100-P) T - isomerolmislämpötila (°C) 25 F - tasapaino-fruktoosi-pitoisuus (% laskettuna

glukoosista + fruktoosista yhteensä) lämpötilassa T

M - fruktoosi-%, laskettuna kuiva-aineesta, joka vaaditaan isomeroituun tuotteeseen.

30 C % psikoosia + multa hajoamistuotteita, joita muodostuu tehokkaan isomeroimis-kosketusajan aikana.

Q - tasapaino-%, joka saavutetaan isomeroimisreak-tion aikana.

35 P - glukoosi-liuoksen polysakkaridi-pitoisuus-%.

12 79558

Tyypillisesti muodostuu vähemmän kuin 1 % ja edullisesti vähemmän kuin 0,5 % psikoosia ja muita hajoamistuotteita ja 99,5 %:n tasapaino voidaan saavuttaa. Siten, siirappien valmistamiseksi, jotka sisältävät 55,5 % fruk-5 toosia (kuivaaineesta laskettuna), vaaditaan seuraavat isomeroimislämpötilat glukoosi-liuoksille, joilla on esitetyt polysakkaridi-pitoisuudet.

Isomeroimi s-1ämpöti1a Polysakkaridia glukoosi- (°C) 10 liuoksessa (%, kuiva-aineesta) 0 95,7 1 99,1 2 104,3 15 3 108,9 4 113,8 6 124,3 8 136,1 20 Hyväksytty kaupallinen tuote sisältää keskimäärin 55,5 % fruktoosia kuiva-aineesta laskettuna. Näin on, koska tällä maissisiirappi fruktoosi-tasolla runsaasti fruktoosia sisältävä (HFCS) saavuttaa yhtä suuren makeuden sakkaroosin kanssa yhtä suurilla kuiva-ainepainoilla. Li-25 säksi HFCS, jonka fruktoosipitoisuus on 55,5 %, on kiinteästi vahvistettu kaupalliseksi tuotteeksi, jota käytetään erotuksetta kokonais- tai osittainkorvaajana sakkaroosille monissa elintarviketuotteissa ja erityisesti hii-lihapotetuissa alkoholittomissa juomissa. Tämäntyyppisen 30 HFCS:n kulutuksen odotetaan Yhdysvalloissa 1982 olevan 2,9 miljardia naulaa * 1,317 miljardia kg, kasvaen 4,0 miljardiin naulaan 1,816 miljardiin kg:aan vuonna 1983. Johtuen monimutkaisuuksista, jotka ovat luontaisia HFCS:n toimituksille, varastoinnille, annostukselle ja muodosta-35 miselle elintarviketuotteiksi, on olemassa yleinen vaati- 13 79558 mus tuotteen tasaiselle laadulle yhdeltä HFCS:n valmistajalta toiselle, niin että tuotetta eri hankintalähteistä voidaan käyttää erotuksetta ja samanaikaisesti. Sentähden 55-56 %:n fruktoosi-taso, kuiva-aineesta laskettuna, on 5 saavuttanut erikoismerkityksen tavoitetasona HFCS:n valmistukseen liittyvässä teknologiassa.

Tämän keksinnön menetelmä antaa vähintäin 53 %:n, edullisesti vähintäin 54 %:n ja edullisimmin vähintäin 55 %:n fruktoosi-tasoja.

10 Haluttaessa on myös liuoksen, joka sisältää ainoas taan glukoosia, käyttämisen asemesta substraattina tätä menetelmää varten, mahdollista käyttää glukoosi-liuosta, jossa osa glukoosista on jo isomeroitu fruktoosiksi. Esimerkiksi, isomeroidun glukoosin liuosta, joka sisältää 15 korkeintaan 50 % fruktoosia, voidaan käsitellä tämän menetelmän mukaisesti fruktoosin pitoisuuden nostamiseksi enemmän toivotuille tasoille 50 %:n yläpuolelle ja edullisesti 55-56 %:n ja korkeammille tasoille.

Glukoosi-liuoksia, jotka sisältävät fruktoosia alle 20 50 % hiilihydraatin painosta, voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin.

Edellä esitetyt vaatimukset glukoosin pitoisuudesta, pH:sta ja kosketusajasta mielessä voidaan tunnettuja glukoosin isomeroimisprosesseja sopivasti sovittaa toimi-25 maan alueella välillä n. 100°C - n. 112,6°C, antamaan tämän keksinnön mukaisesti runsaasti glukoosia ja fruktoosia sisältäviä siirappeja.

Glukoosi-isomeraasin lämpöstabiiliutta voidaan merkittävästi lisätä yhdellä tai useammalla kemiallisella 30 käsittelyllä, jolloin entsyymi vielä säilyttää huomattavan aktiivisuuden, kuten jäljempänä selostetaan. Näin käsiteltyä entsyymiä nimitetään "kemiallisesti stabiloiduksi iso-meraasiksi" tämän esityksen tarkoituksia varten.

Isomeraasin kemiallinen stabilointi suoritetaan 35 joukolla erilaisia menetelmiä, joista voi olla seurauksena 14 79558 lisääntynyt lämpöstabiilius. Peruslähestymistapa on tuoda rakenne-elementtejä entsyymimolekyyliin sillä tavalla, että entsyymi kestää purkautumisen, kun se kuumennetaan yli normaalin termisen denaturoitumispisteensä. Eräs edul-5 linen menetelmä tämän toteuttamiseksi on modifioida entsyymi substituoimalla kemiallisesti sille osia, jotka sisältävät polymeroituvia vinyyli-ryhmiä, niin että viimemainitut ovat lujasti kiinnittyneet entsyymimolekyylin pintaan useissa kohdissa. Senjälkeen modifioitu entsyymi 10 sekoitetaan yhden tai useamman polymeroituvan vinyyli-yhdisteen kanssa vesipitoisessa liuoksessa ja seos kopoly-meroidaan muodostamaan kemiallisesti stabiloitu entsyymi, jossa entsyymi on lujasti sidottu lukuisissa pisteissä kolmiulotteiseen polymeerimatriisiin, joka on muodostanut 15 rakenteen, joka on muodoltaan täydentävä entsyymin rakenteelle.

Esimerkkejä tämäntyyppisestä stabiloinnista ovat selostaneet Martinek et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Acta 485, 1-12 (1977) ja Kulys et ai. julkaisussa Biokhi-20 miya, 42, No. 3, 453-59 (1978).

Edellä esitettyjä reaktioita toteutettaessa on olennaista, että vältetään olosuhteita, jotka voivat johtaa isomeraasin denaturointiin sitä seuraavine aktiivisuuden menetyksineen. Esimerkiksi, pH:n ja lämpötilan äärim-25 mäisyyksiä täytyy välttää joidenkin ja kaikkien käsittelyjen aikana, jotka ovat tarpeen edellä esitettyjen reaktioiden toteuttamiseksi.

Esimerkkejä reagensseista, joita käytetään modifioimaan isomeraasi sillä olevien polymeroituvien vinyyli-30 ryhmien substituoimiseksi, ovat akryloyylikloridi, metak-ryloyylikloridi, akroleiini, krotonaldehydi, maleiinihapon anhydridi, 3,4-epoksibuteeni, akryylihappo-2,3-epoksipro-pyyliesteri, akryylihappo-2,3-tioglysidyyliesteri, 1-al-lyylioksi-3-(N-etyleeni-imiini)-2-propanoli, akryylihappo-35 O-sukkiiniamidiesteri, kloorimaleiinihapon anhydridi, ma- is 79558 leiinlhappoatsidi, 3-brotnipropeeni sekä allyyli-isotiosya-naattl. Tällaiset yhdisteet pystyvät reagoimaan Isomeerien vapaiden amino-ryhmien kanssa, esimerkiksi lysllnioslen epsllon-amlnoryhmän kanssa.

5 Vielä multa yhdisteitä, jotka pystyvät reagoimaan isomeraasin vapaiden karboksyylihapporyhmien kanssa, voidaan käyttää niillä olevien helposti polymeroituvien vinyyli-osien substltuoimiseksi, kuten alaan perehtyneelle työn suorittajalle on selvää.

10 Esimerkkejä vinyyli-yhdisteistä, joita voidaan ko- polymeroida modifioidun isomeraasin kanssa, ovat natrium-akrylaatti, natriummetakrylaatti, akryyliamidi, hydroksi-etyylimetakrylaatti, akryolyylipiperidiini-4-spiro-2f-(1',3'-dioksakryylipentaanl), l-akryloyyli-4-piperidoni 15 sekä akryloyylimetoksiamiini. Yleensä ovat edullisia vesiliukoiset monomeerit tai monomeeriseokset, jotka antavat vesiliukoisia polymeerejä (jos polymerointi tapahtuu silloittavien aineiden poissaollessa).

Tyypillisesti sisällytetään monomeeri-seokseen di-20 funktionaalisia vinyyli-yhdisteitä (0,1-5 % kokonaismono-meeristä) aikaansaamaan silloituspaikkoja, jotka johtavat kolmiulotteiseen polymeeriverkkoon. Sopivia yhdisteitä ovat N,N'-metyleenibis-akryyliamidi ja etyleeniglykolidi-metakrylaatti. Kun näitä käytetään, polymeroitu seos muo-25 dostaa liukenemattoman geelin, mistä on tuloksena isomeraasin immobilisointi.

Sellaiset alullepanosysteemit, Joita yleisesti käytetään vinyylipolymeroinneissa, ovat sopivia kuten ammo-niumpersulfaatti plus natriumbisulfaatti, vetyperoksidi 30 plus ferrosulfaatti, kaliumsulfaatti plus N,N,N’,N’-tetra-metyyli-etyleenidiamiini ja riboflaviini (plus valo).

Vaihtoehtoisesti ei-kovalenttinen sitoutuminen kolmiulotteiseen polymeerimatriisiin voi olla riittävä antamaan halutun jäykkyyden isomeraasimolekyylille ja siten 35 aikaansaamaan merkittävä lisäys lämpöstabiilisuuteen. Tämä ie 79558 voi tapahtua, kun lsomeraasl loukutetaan mekaanisesti verkkoutetun polymeerlgeelin sisään. Tässä tapauksessa el ole tarpeen, että lsomeraasl on modifioitu liittämällä siihen vinyyli-yhdiste ennen polymeroimisvaihetta. Geelin 5 pitoisuuden täytyy kuitenkin olla suurempi kuin n. 30 pai-no-% ennenkuin merkittävää stabiloitumista tapahtuu ja geelit, joiden pitoisuus on n. 50 %, ovat edullisia. Tarvitaan monomeerejä, jotka pystyvät antamaan polymeerigee-lejä, jotka voivat muodostaa sähköstaattisia ja vetysidok-10 siä isomeraasin kanssa, kuten esimerkiksi natriumakrylaat-ti, natriummetakrylaatti, akryyliamidi ja hydroksietyyli-metakrylaatti.

Esimerkkejä stabiloinnista geeleihin yhdistämällä antavat Martinek et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Acta 15 485, 13-28 (1977) ja Kulys et ai. julkaisussa J. Solid

Phase Biochem., 3, 95-105 (1978).

Kolmas menetelmä isomeraasin jäykistämiseksi on molekyylinsisäinen verkkouttaminen, joka pystyy antamaan 1i sääntyneen 1ämpöstabii1isuuden.

20 Esimerkkejä tällaisesta stabiloinnista ovat esit täneet Torchilin et ai. julkaisussa Biochem. Biophys.

Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek et ai. julkaisussa J. Solid Phase Biochem., 2, 343-85 (1977) ja Torchilin et ai. julkaisussa Biochem. Biophys. Acta, 568, 1-10 (1979).

25 Sopivia verkkoutusaineita käytettäviksi tässä kek sinnössä ovat difunktionaaliset yhdisteet, jotka pystyvät reagoimaan riippuvien funktionaalisten ryhmien kanssa ent-syymimolekyylillä. Useimmiten tällaiset funktionaaliset ryhmät ovat amino-ryhmiä, yleensä primaarisia amino-ryh-30 miä, jotka voivat reagoida laajan joukon kanssa erilaisia funktionaalisia ryhmiä, kuten karboksyylihapon, sulfonyy-lihalidin, aldehydien, isosyanaattien, propiolaattien tms. kanssa.

Siten verkkoutusaineet käsittävät dikarboksyyliha-35 pon anhydridejä kuten sukkiinihapon anhydridin ja adipii- i7 79558 nihapon anhydridin; vastaavia dialdehydejä kuten glyoksaa-lin, sukkiinialdehydin ja glutaraldehydin; tyydyttämättömiä yhdisteitä kuten akroleiinin ja krotonaldehydin, dio-lipropiolaatteja, kuten etyleeniglykolibispropiolaatin, 5 propyleeniglykolibispropiolaatin ja heksametyleeniglykoli-bispropiolaatin; sekä disulfonyylihalideja kuten bentsee-ni-l,3-disulfonyylikloridin; naftaleeni-1,5-disulfonyyli-kloridin Ja tolyyli-2,4-disulfonyylikloridin.

Lisäksi, koska entsyymi sisältää tai on voitu saat-10 taa sisältämään happoryhmiä, jotka reagoivat amiinien kanssa, silloin voidaan käyttää difunktionaalisia amiineja verkkoutuSaineina tätä keksintöä varten. Nämä ovat, esimerkiksi, diamiineja, jotka sisältävät korkeintaan 12 hiiliatomia, esim. fenyleenldiamiini, butyleenidiamiini, hek-15 syleenidiamiini, oktyleenidiamiini, pentyleenidiamiini, etyleenidiamiini ja dodekyleenidiamiini.

Verkkoutusaineen määrä voi vaihdella huomattavasti, jolloin entsyymin suhde verkkoutusaineeseen vaihtelee n. 0,l:stä n. 0,0001:een. Menetelmän tarvittavan sitomisen 20 aikaansaamiseksi määrää tietyssä määrässä valitun verkkoutusaineen ja entsyymin luonne. Yleensä reagenssit liuotetaan sopivaan inerttiin liuotinväliaineeseen ja reaktion tulisi tapahtua suhteellisen matalissa lämpötiloissa, jolloin vältetään haitalliset vaikutukset entsyymiin, joka 25 voi olla herkkä korkeille lämpötiloille. Yleensä reaktiot huoneen lämpötilassa tai lähellä sitä ovat edullisia ja vettä tai vesipitoisia liuottimia käytetään reaktloväliai-neena.

Polymeroituvien vinyyli-ryhmien substituoimisen 30 entsyymimolekyylillä ja senjälkeen polymeroinnin edellä kuvatuin menetelmin lisäksi eräs lisäsuoritusmuoto käsittää ennalta muodostetun polymeerin kondensaation isomeraasin kanssa muodostamalla molekyylinsisäisiä kovalenttisia sidoksia stabiloidun molekyylin muodostamiseksi. Esimer-35 kiksi polypeptidejä, kuten luonnossa esiintyviä proteiineja ja niiden hydrolyysi-tuotteita voidaan saattaa reagoi- 18 79558 maan käyttäen tunnettuja menetelmiä peptidi-sidoksen muodostamista varten glukoosi-isomeraasin kanssa stabiloidun entsyymin muodostamiseksi. Näin valmistetut tuotteet voivat olla vesiliukoisia, mutta voidaan tehdä veteen liuke-5 nemattomiksi käyttäen verkkoutusaineita, kuten glutaral-dehydiä, ja syntynyt verkkoutettu entsyymisysteemi on tavallisesti jopa pysyvämpi. Peptidin muodostusreaktiot toteutetaan tunnetuin menetelmin, esim. käyttämällä karbo-di-imidejä.

10 Haluttaessa aloitusentsyymi voidaan johtaa inser- toimaan haluttu funktionaalisuus molekyyliin tarkoituksena kondensaatio ennalta muodostetun molekyylin kanssa. Siten karboksifunktionaalisuutta varten voidaan vapaata aminoa sisältävä entsyymi saattaa reagoimaan dikarboksyylihapon 15 kanssa entsyymin muuttamiseksi karboksia sisältäväksi entsyymiksi .

Ennalta muodostettuja polymeerejä käytettäviksi edellä esitetyssä suoritusmuodossa voivat olla sellaiset polymeerit, jotka sisältävät funktionaalisten ryhmien tar-20 vittavaa tyyppiä ja määrän, esim. aminoa tai karboksia, aiottuja reaktioita varten. Edullisia ovat polypeptidit, kuten luonnon proteiinit, esim. kitosaani, hiivaproteiini yms., sekä myös seokset sekä aminoa sisältävät polymeerit, kuten polyetyleeni-imiini. Tavallisesti edullinen ennalta 25 muodostettu polymeeri muodostaa vesiliukoisia tuotteita ja on edullista tehdä nämä liukenemattomiksi reaktiolla verkkoutusaineiden, esim. glutaraldehydin ja muiden kanssa, kuten aikaisemmin selostettiin.

Kaikissa edellä esitetyissä entsyymin modifioimis-30 menetelmissä on olennaista varmistaa, että riittävästi kemiallista funktionaalisuutta, esim. amino- tai karbok-siryhmiä, on läsnä halutun tuloksen merkitsevän tason saavuttamiseksi.

Esimerkiksi, kun valitaan ennalta muodostettu poly-35 meeri reagoimaan entsyymin kanssa, vaaditaan, että poly- 19 79558 meeri sisältää ryhmiä, jotka ovat reaktiivisia entsyymi-molekyylillä käytettävissä olevien ryhmien kanssa. Siten proteiini, jolla on riippuvia karboksi-ryhmiä, valittaisiin reagoimaan entsyymin riippuvien amino-ryhmien kanssa.

5 Lisäksi tulisi läsnä olla kohtuullinen määrä reaktiivisia ryhmiä valituilla reagoivilla aineilla takaamaan reagoivien aineiden monipisteisen kiinnittymisen merkittävän stabiloinnin toteuttamiseksi. Tällaisten reaktiivisten ryhmien luonteen ja lukumäärän määrittäminen vastaavia 10 reagensseja varten on tietenkin alalla hyvin tunnettua.

Vielä eräs menetelmä, jolla entsyymien lämpöstabii-liutta voidaan lisätä, on muuttaa pintarakennetta kemiallisesti aiheuttamatta huomattavaa aktiivisuuden menetystä. Siten pinta-aminoryhmiä voidaan amidinoida (Ludwig, M. L. 15 ja Hunter, M. J., Meth. Enzymol. 11, 595-604 (1967)) tai guanidinoida (Kimmel, J. R., Meth. Enzymol. 11. 584-589 (1967)) substituenttien muodostamiseksi, jotka läheisesti muistuttivat arginiinia. Maito-dehydrogenaasia ja useita muita proteiineja on stabiloitu (ks. Tuengler, F. ja 20 Pfleiderer, G., Biochem. Biophys. Acta, 284, 1-8 (1977)); Minotani, N., et ai., Biochim. Biophys. Acta, 581, 334-341 (1979) ja Cupo, P., et ai., J. Biol. Chem., 255, 10828-10833 (1980)).

Liukoisen isomeraasipreparaatin aktiivisuus määri-25 tettiin kuten Lloyd et ai. ovat selostaneet julkaisussa Cereal Chemistry, 49, No. 5, sivut 544-553 (1972). Yksi IGIU on isomeraasi-määrä, joka muuttaa 1 mikromoolin glukoosia fruktoosiksi minuutissa liuoksessa, joka sisältää 2 moolia glukoosia/1, 0,02 moolia MgS04/1 ja 0,001 moolia 30 CoCl2/1 pH 6,85:ssä (0,2 M natriummaleaatti) ja 60°C;n lämpötilassa edellä mainitulla menetelmällä määritettynä.

Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen tämän keksinnön menetelmää.

Esimerkki 1 35 Tämä esimerkki esittää glukoosia sisältävän liuok sen, joka koostuu vallitsevasti puhdistetusta maissitärk- 20 7 9 5 5 8 kelys-hydrolysaatista, suoran isomeroinnin 55,5 % fruktoosia kuiva-aineesta laskettuna sisältävän koostumuksen saamiseksi, jolloin käytettiin kaksivaiheista isomeroimispro-sessla. Matalalämpötila-isomerointi 70°C:ssa toteutettiin 5 ensin tämän reaktion tuotteella, jota käytettiin syöttönä toiseen korkealämpötilaiseen reaktoriin (105,2°C), joka sisälsi kemiallisesti stabiloitua isomeraasia. Kemiallisesti stabiloitu isomeraasi on isomeraasi, jossa entsyymi on kovalenttisesti sidottu liukoiseen polymeeriin ja tehty 10 sitten liukenemattomaksi immobilisoidun katalyytin muodostamiseksi.

Hydrolysaatti valmistettiin maissitärkkelyksestä menetelmin, jotka on selostettu US-patentissa 3 644 126 (nesteyttäminen) ja US-patentissa 3 280 006 (sokeriksi 15 muuttaminen). Sokeriksi muutettu neste puhdistettiin US- patentin 3 834 940 mukaisesti antamaan tuote, joka sisälsi 95,3 % glukoosia kuiva-aineesta laskettuna. Lisättiin riittävästi kiteistä glukoosia kokonaisglukoosi-pitoisuu-den saattamiseksi 97,6 %:ksi, kuiva-aineesta laskettuna.

20 Syntyneellä liuoksella oli seuraava koostumus: kuiva-ainetta yhteensä (%) 50,2 glukoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 97,6 fruktoosia (% kuiva-aineesta laskettuna) 0,0 25 polysakkaridia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 2,4 psikoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 0,0

NaHS03(mM) 50,0

MgS04 (mM) 5,0

CoCl2(mM) 0,1 30 pH 6,8

Isomerointi matalassa lämpötilassa toteutettiin 70°C:ssa pumppaamalla edellä mainittu substraatti-liuos matalalämpötilaisen reaktorin läpi virtausnopeudella 3,2 35 ml/min. Matalalämpötilainen (70°C) isomeraasireaktori oli rakennettu sullomalla isomeraasia, joka oli immobilisoitu 21 79558 DEAE-selluloosaan (valmistettu US-patentin 3 788 945 mukaisesti) 1 tuuman läpimittaiseen lasipylvääseen, joka oli varustettu sisääntulolla ja ulosmenolla ja vaipalla veden kierrättämistä varten termostaatista. Ylätila täytteen 5 yläpuolella sisältää lämpömittarin ja on muutoin täytetty laeihelmillä kuolleen tilan minimoimiseksi niin pitkälle kuin on käytännöllistä. Reaktori sisältää riittävästi im-mobilisoitua isomeraasia antaakseen 20 000 IGIU ja täyte-patjan korkeus on n. 15 cm. Ensimmäiset 1000 ml, jotka 10 poistuivat reaktorista, hylättiin. Senjälkeen poistuva ulosvirtaus koottiin käytettäväksi toisessa korkealämpöti-lalsessa isomeroinnissa.

Kemiallisesti stabiloitu katalyytti, jota käytettiin korkealämpötilaisessa reaktorissa, valmistettiin seu-15 raavalla tavalla.

Streptomyces rubigenosus-lajia, joka oli johdettu S. rubigenosus ATCC 21175:stä, viljeltiin upotetulla aerobisella fermentoinnilla alustassa, jolla oli seuraava koostumus: 20 paino-% dekstroosia 9,0 maissin liotusnestettä (kuiva-ainetta) 1,6 diammoniumfosfaattia 0,08 mangaanisulfaattia 0,06 25 vaahtoamisenestoainetta (Pluronic PL-61) 0,003

Alusta steriloitiin 121°C:ssa 45 minuuttia, jäähdytettiin ja asetettiin pH 6,8-7,0:aan. Se siirrostettiin 14 tilavuus-%:11a siirrosta, joka käsitti siemenkäymisas-30 tian sisällön, joka oli valmistettu edellä mainitulla S. rubigenosus-muunnoksella. Käyminen saatettiin tapahtumaan aseptisissa olosuhteissa 30°C:ssa n. 60 tunnin ajan ilmastaen 0,65 wm:ssä. Siirrostukseen ja isomeraasin tuotantoon voidaan käyttää myös kantaa S. rubigenosus ATCC 35 21175, jossa tapauksessa käytetään alustaa, jolla on seu raava koostumus.

22 79558

Paino-% dekstroosia 0,24 maissin liotusnestettä (kuiva-ainetta) 1,5 sorbitolia 1,6 5 koboltti(2)kloridia 0,02 dianunoniumfosfaattia 0,56 ksyloosia 1,0

Glukoosi-isomeraasia uutettiin S. rubigenosuksesta lisäämällä 0,35 % Maquat MC 1412 (Mason Chemical Co.) ja 10 10 ppm kananmunan lysotsyymiä ja sekoittamalla 5 tuntia 40°C:ssa, pH 6,3-6,6. Seos suodatettiin sitten antamaan raa'an, puhdistamattoman glukoosi-isomeraasin liuos.

Raaka isomeraasi puhdistettiin adsorboimalla DEAE-selluloosalle (valmistettu US-patentin 3 823 133 mukaises-15 ti), suodattamalla ja pesemällä adsorboitu tuote 0,01 M NaCl-liuoksella epäpuhtauksien poistamiseki ja desorboi-malla isomeraasi sitten saattamalla se kosketukseen 0,45 M NaCl-liuoksen kanssa. Kaikkien liuosten pH pidettiin 7,5:ssä puhdistusvaiheiden aikana. Niillä saadun osittain 20 puhdistetun isomeraasin liuos sekoitettiin kolmen tilavuuden kanssa 95-%:sta etanolia 0°C:ssa isomeraasin saostami-seksi. Käytettiin Periite-suodatusapuainetta, sakkautet-tiin talteen suodattamalla ja ilmakuivattiin antamaan liukoinen isomeraasi-valmiste, joka sisälsi 2500 IGIU/g.

25 Puhdistettu isomeraasi liuotettiin 1 mM MnCl2reen antamaan liuos, joka sisälsi 10 mg isomeraasia/ml, huoneen lämpötilassa ja seos suodatettiin suodatusapuaineen poistamiseksi. Tämän valmisteen ominaisaktiivisuus oli 37,3 IGIU/mg proteiinia.

30 Liukoisen polyamiinipolymeerin liuos saatiin liuot tamalla 39,0 g kitosaania (Kytex firmasta Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) 13 litraan 0,08 N HC1. Liukenemisen jälkeen kitosaani-liuos tehtiin 0,5 M:ksi NaClrn suhteen lisäämällä 380 g NaCl ja syntynyt liuos asetettiin 35 pH-arvoon 6,15 8 N NaOHrlla. Lopuksi kitosaani-liuos suodatettiin Whatman No. 3 suodatinpaperin läpi liukenemat- 23 79558 toman aineksen poistamiseksi. 13 l:aan 0,3-%:sta kitosaa-nia 0,5 M NaCl:ssa pH:ssa 6,15, lisättiin seuraavaa: 100 ml liukenevaa isomeraasia, joka sisälsi aktiivisuutta 100 000 IGIU, 197,6 g ksylitolia (valmistaja Sigma Chemi-5 cal Co.), ja 0,619 g CoC12.6H20. Tätä liuosta sekoitettiin 2 h, minkä jälkeen lisättiin 6,24 g l-etyyli-3-dimetyyli-aminopropyylikarbodi-imidiä (valmistaja Sigma Chemical Co.) isomeraasin karboksyyli-ryhmien kovalenttiseksi sitomiseksi monipisteisellä tavalla kitosaanin amino-ryh-10 miin. 2 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa lisättiin 15,6 ml 50 paino-%:sta glutaraldehydi-liuosta (valmistaja Eastman Kodak), joka oli asetettu pH 6,0:aan 8 N Na0H:lla, reaktioseokseen kovalenttisesti sidotun isomeraasi-kito-saanikompleksin tekemiseksi liukenemattomaksi. 15 minuutin 15 kuluttua lisättiin 2 1 1 M fosfaatti-liuosta pH 8,0:ssa helpottamaan geelin murtumista sen muodostumisen jälkeen glutaraldehydi-lisäyksellä. Syntynyt liukenemattomaksi tehty isomeraasi-kitosaani pestiin deionoidulla vedellä sen ollessa Btichner-imusuodattimella. Tämän valmisteen 20 annettiin sitten kuivua ilmassa yli yön huoneen lämpötilassa ja jauhettiin ja seulottiin seulaluvun 12-60 mesh alueelle. Kuivan katalyytin selvä aktiivisuus oli 384 IGIU/g.

105,2°C:n reaktori valmistettiin seuraavalla taval-25 la. 13 g:n annos katalyyttiä suspendoitiin substraattiin ja ilmaa poistettiin laboratoriotyhjössä huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. Liete, josta ilma oli poistettu, käytettiin 1,5 x 20 cm:n patjan valmistamiseksi vaipalla varustettuun lasipylvääseen. Sullottu patja sisälsi 4992 30 IGIU.

Substraatti, joka oli valmistettu ensimmäisen vaiheen 70°C:n isomeroinnissa asetettiin pH-arvoon 6,75 ja laimennettiin 42,0-%:seen kuiva-ainepitoisuuteen. Tätä substraattia pumpattiin sitten korkealämpötilaisen reak-35 tori-pylvään läpi 10 psig:n - 68947 Pa:n paineessa ja virtausnopeudella 1,96 ml/min 60°C:ssa 30 minuutin ajan. Läm- 24 7 9 5 5 8 pötilaa pylväässä tarkkailtiin lämpömittarilla, joka oli sijoitettu suoraan patjan yläpuolelle ja jota ympäröi 0,5 cm:n lasihelmet kuolleen tilavuuden minimoimiseksi niin pitkälle kuin mahdollista. Pylvään lämpötila nostet-5 tiin sitten nopeasti kierrättämällä öljyä 106°C:n termos-taattikylvystä vaipan läpi.

Pylväästä tulevaa poistovirtausta tarkkailtiin muistiinmerkitsevällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosia 50 %:sta 58 %:iin. Senjälkeen kun pyl-10 vään lämpötila oli saavuttanut 105,2 ja kun poistovirtauk-sen fruktoosi-pitoisuus oli saavuttanut halutun tason, poistovirtausta koottiin ja jäähdytettiin välittömästi jäähauteessa. pH asetettiin 4,90:aan lisäämällä 1 M sitruunahappoa. Poistovirtausta koottiin kunnes nähtävissä 15 oleva fruktoosi-taso laski alle 55 %:n.

Isomeroituja liuoksia, jotka oli saatu 70°C:n ja 105,2°C:n reaktoreista, analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen ja tuloksia verrattiin samanlaisiin analyyseihin, jotka oli suoritettu isomeroimattomalla 20 substraatti-liuoksella kuten seuraavassa taulukossa esitetään.

25 79558 n ϋ 3 -H t*4 ^ P M Bi o m r- τα) «o h o *· *· * O > u »- o o «a< O ^ X «- A!

C

d> -H

-P T3

tfl -H

0 — P

3 ns «3 •h -p a: rH ma: 1 <1) to •h <u en m vd -p m e > ·

-p 3 "H iH fS ΓΜ fM

<o g to o to 3 i Cm p +» to P ra > ta o -h -h Λ o 3 m 3 Äj A! O m

M -S O

•P to o o o C +> -P -H

0) to <a tn

-o to t0 CD

3 P t0 P Ό Oi •H <0 Ή f-O x: > Dl tD Ifl P -H (0 O *· -

Od) rH X o t~~ & k e -ρχίΛί^·^^ X O -H 3 3 3 tn te -P <h pH Ή 3 <#>

to to I

E-t tn o -h tn e en ho mm U ÄO ' ' O (¾ -P o T- tn es ^ M m m 3 ιΛ p 3 m 4— f0 n (0 tö tn tn tn oi to ·· ·· tn o U «o

O ·· <N

o u » r- >4 O m i—I C o o <U O t-

•P -P

•P (0 3 3

H g -P -P

tn -H -H -H

:t0 O O O

A! P P P

tn 0) Cl) o

O E E E

3 0 0 0

•rt M M M

l3 H I—I H

26 79558

Tulokset osoittavat, että saavutettiin 55,5 %:n fruktoosi-taso, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,4 paino-%:n kuiva-aineesta laskettuna, alapuolella ja väri < 20 (CIRFX100).

Esimerkki 2 5 Tämä esimerkki kuvaa glukoosia sisältävän liuoksen (joka koostuu puhdistetusta maissitärkkelys-hydrolysaatista plus kiteisestä glukoosista) suoraa isomerointia korkeassa lämpötilassa koostumuksen saamiseksi, joka sisältää 55,2 % fruktoosia kuiva-aineesta laskettuna ja jolloin käytetään kaksivai-10 heistä isomerointia toisen vaiheen käyttäessä kemiallisesti stabiloitua isomeraasia, joka koostuu glukoosi-isomeraasista, josta on muodostettu kompleksi polyetyleeni-imiinin kanssa ja kompleksi tehty liukenemattomaksi käsittelemällä glutaarialde-hydillä.

15 Stabiloidun isomeraasin valmistus

Liukoinen glukoosi-isomeraasi valmistettiin kuten esimerkissä 1 selostettiin. Puhdistettu isomeraasi liuotettiin 1 mM MnC^^een antamaan liuos, joka sisälsi 9 mg isomeraasia/ml, huoneen lämpötilassa ja seos suodatettiin suodatusapuaineen 20 poistamiseksi. 60 ml 10-%:sta (paino/tilav.) PEI-6 (polyetyleeni-imiiniä, mp. 600, pH 8) (Dow Chemical Co.) ja 3 g ksylitolia lisättiin 300 mlraan entsyymi-liuosta ja syntynyttä liuosta sekoitettiin 15 minuuttia. Lisättiin 10 ml 2,5 M glutaarialde-hydiä ja seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia.

25 Liukenemattomaksi tehty entsyymi otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin yli yön konvektiouunissa 37°C:ssa.

12,8 g liikkumattomaksi tehtyä isomeraasia, joka sisälsi n.

775 IGIU/g, otettiin talteen kuivaamisen jälkeen. 12 g liikkumattomaksi tehtyä entsyymiä suspendoitiin substraattiin, pois-30 tettiin ilma tyhjössä 60 minuutin aikana huoneen lämpötilassa ja käytettiin 1,5 cm:n läpimittaisen korkealämpötila-reaktorin valmistukseen.

Substraatti reaktoria varten valmistettiin kaksivaihei-sen isomeroinnin ensimmäisessä vaiheessa kuten esimerkissä 1 35 selostettiin. Tällä substraatilla oli seuraava koostumus: 27 7 9 5 5 8 kuiva-ainetta yhteensä (%) 42,6 glukoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 46,4 fruktoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 51,3 polysakkaridia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 2,3 5 psikoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 0,0

NaHS03 (mM) 0

MgSC»4 (mM) 50

CoCl2 (mM) 0,1 pH 6,75 10 Substraattia pumpattiin reaktorin läpi 60uC:ssa 45 mi nuutin ajan nopeudella n. 5 ml/min. Pylvään lämpötila nostettiin sitten 101,6°C:seen ja virtausnopeus alennettiin 2 ml:ksi/ min. Pylväälle asetettiin 12 psi:n = 82,74 kPa:n vastapaine estämään substraatin kiehuminen. Poistovirtausta tarkkailtiin 15 muistiinmerkitsevällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosi-tasot 50 %:sta 58 %:iin. Poistovirtaus, joka sisälsi yli 55 % fruktoosia, koottiin jäähauteeseen ja asetettiin pH 4,0:aan 1,0 M sitruunahapolla.

Ulosvirtaus korkealämpötilaisesta reaktorista, substraat-20 ti ensimmäisen vaiheen reaktorista ja alkuperäinen glukoosia sisältävä liuos, jota käytettiin substraattina ensimmäisen vaiheen reaktoria varten, analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon.

28 79558

H h —M

M PS o in r-· r~ HO H O ' > U O O i- ^ X in (0 H|

•P P

in to a» as in M *3* m r- •H r0 *“ - *

O in fN (M N

-P <0 >1

in 4J H

(0 3 tn 0 •n g Φ a 3 0)

HO (0 -PC

P p in -h in in o io

0) 0) o i H

in o) ,κ O tn H £ i > o

HO *H -H H O

flO P 0 X O O O

> P X H

•h in <0 in in in ή io (0 a cg p -p O Φ -h Ό tn

JS O >1 ro -H

as p p £ ie in ιο*3·ι- ρφφ h a o -

H 10 g HIOO Γ* ID IN

3 as o h ί> as 01*3*^* (0 3 tn -hi0 3

E-r g H K AS H

3 Δ O' P 3

tn P

O h O c*° in m in AS I O - - O O o i- in C C -P m in

Φ H AS

P 10 3

in a P

O ^ p : 3

-H fO

Pl tn tn <0 ·· tn u tn o ·· o u H o <-

H e o O

Q) O t~~ i—

P P

P (0 3 3

-h g P P

. in -H -H -H

: :<01 o o o a; p p p * tn φ <d <u ogee

3 O O O

•h in tn tn

l3 H H H

29 79558

Tulokset osoittavat, että saavutettiin 55,2 %:n fruktoosi-taso, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,2 paino-%:n, kuiva-aineesta laskettuna, alapuolella.

Esimerkki 3 5 Tämä esimerkki esittää glukoosin suoran isomeroinnin 57,2 %:n fruktoosi-tasolle kaksivaiheisella isomerointiproses-silla, jossa ensimmäinen reaktori on 70°C:ssa ja toinen (kor-kealämpötilainen) reaktori oli 110,4°C:ssa. Kemiallisesti stabiloitu isomeraasi, jota käytettiin korkealämpötilaisessa 10 reaktiossa, on isomeraasi, jossa entsyymi on kovalenttisesti sidottu liukoiseen polymeeriin ja tehty sitten liukenemattomaksi liikkumattomaksi tehdyn katalyytin muodostamiseksi.

Substraatti ja sen muuttaminen ensimmäisen vaiheen reaktorilla 70°C;ssa, on selostettu esimerkissä 1. Immobilisoitu 15 katalyytti, jota käytettiin korkealämpötilaisessa reaktorissa 100,4°C:ssa, on myös selostettu esimerkissä 1.

110,4^C:n reaktori valmistettiin seuraavalla tavalla.

28,4 g:n annos katalyyttiä suspendoitiin substraattiin ja ilmaa poistettiin laboratoriotyhjössä huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. 20 Liete, josta ilma oli poistettu, käytettiin 2,5 x 12,4 cm:n patjan valmistamiseksi vaipalla varustettuun lasipylvääseen. Sullottu patja sisälsi 10.885 IGIU.

Substraatti, joka valmistettiin ensimmäisen vaiheen 70°C:n isomeroinnista, asetettiin pH-arvoon 6,47 ja laimennet-25 tiin 42,0 %:n kuiva-ainepitoisuuteen. Tämä substraatti pumpattiin sitten korkealämpötilaisen reaktoripylvään läpi 12 psi:n = 82,74 kPa:n paineen alaisena ja virtausnopeudella 3,38 ml/min lämpötilassa 60°C 30 minuutin ajan. Lämpötilaa pylvään sisällä tarkkailtiin lämpömittarilla, joka oli sijoitettu suoraan patjan 30 yläpuolelle ja jota ympäröi 0,3 cm:n lasihelmiä kuolleen tilavuuden minimoimiseksi niin pitkälle kuin mahdollista. Pylvään lämpötila nostettiin sitten nopeasti kierrättämällä öljyä 111° C:sesta termostaatilla varustetusta kylvystä vaipan läpi.

Poistovirtausta pylväästä tarkkailtiin muistiinmerkit- 35 sevällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosi- 30 79558 tasoja väliltä 50-58 %. senjälkeen kun pylvään lämpötila oli saavuttanut 110,4°c ja kun poistovirtauksen fruktoosi-pitoisuus oli saavuttanut halutun tason, poistovirtaus koottiin ja jäähdytettiin välittömästi jäähauteessa. pH asetettiin 4,0:aan 5 lisäämällä 1 M sitruunahappoa.

Isomeroidut liuokset, jotka oli saatu 70°C:n ja 110,4°C:n reaktoreista, analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen ja tuloksia verrattiin samanlaiseen analyysiin, joka oli suoritettu isomeroimattomalla substraatti-liuoksella kuten 10 seuraavassa taulukossa on esitetty.

31 79558 •I-I Cij — c S o :π3 m o vo r~ oo > U *- — X ο ο σ> r— Ή Ό

•H

U

3

X

3 M oo oo O

4J 3| m W| ο ο τ

ο X

Φ rH|

C CO

<U M Ή ÖJ

•n 3 <T5 c e i

P 3 3 -H

•h +j +j > m o 0) w Ή o ro CM 0 3 0

Q) X O X M O O O

e 3 λ: -h

O E -H (fl M

M3 -P -P CU

ro I -H +j -P M

M (0 (0 -H I

Oi 3 0 3 3 M| *l MO C CU O (N ^ tn M X Ό30 - ' - 3 ·· X>rK!<7'VOr- rH UC X333 Oh rr

3 O ω ·Η Λί rH

3 TJ* +> .H Ä tr H *· M -H 3

O O -H +J

Γ- 3 k -H ro (N

r- -H de en - » rH 10 O (N Γ~ 3 1 0 0 in in

•n -H β -P

P ·Η X

3 -P 3 3

M3 CU C

M3 '—in .. ^

UP

M 3

O Λ M

0 3 M

Γ" M 3 ··

M U

M 0

M

u

>1 o O

r-l C O ι- Ο) 0 Γ" <-

P -P

-P 3 3 3

•H E -P -P

M H -H H

:3 0 0 0

X M C C

M <D Q) d)

0 E E E

3 0 0 0

-H M M M

l3 H H H

32 79558

Tulokset osoittavat, että 57,2 %:n fruktoosi-taso saavutettiin, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,4 paino-%:n, kuiva-aineesta laskettuna, alapuolella ja väri (CIRFX100) 20:n alapuolella.

5 Esimerkki 4 Tämä esimerkki esittää glukoosia sisältävän liuoksen, joka koostuu vallitsevasta puhdistetusta maissitärkkelys-hydrolysaatista, suoran isomeroinnin 56,3 % fruktoosia sisältävän koostumuksen saamiseksi kuiva-aineesta laskettuna, jolloin 10 käytettiin kaksivaiheista isomeroimisprosessia. Matalalämpö-tilainen isomerointi toteutettiin ensin 70°C:ssa ja tämän reaktion tuote käytettiin syöttönä toiseen korkealämpötilai-seen reaktoriin (103,3°C), joka sisälsi kemiallisesti stabiloitua isomeraasia. Kemiallisesti stabiloitu isomeraasi on iso-15 meraasi, jossa entsyymi on saatettu myötäreagoimaan suojapro-teiinin kanssa (kuten hiivasta johdetun kanssa).

Matalalämpötilainen isomeroimisvaihe, substraatin ja koeolosuhteiden selostaminen mukaanlukien, on esitetty esimerkissä 1.

20 Kemiallisesti stabiloitu glukoosi-isomeraasientsyymi, jota käytettiin korkealämpötilaisessa reaktorissa, valmistet-: tiin seuraavalla tavalla. Liukoista glukoosi-isomeraasia kemial lista stabilointia varten valmistettiin ja puhdistettiin esimerkissä 1 selostetulla menetelmällä. Tämän valmisteen ominais-25 aktiivisuus oli n. 40 IGIU/mg proteiinia. Suojaproteiini saa-[' tiin leipomohiivasta seuraavalla menettelyllä. 1229 g:aan kos- teata leipomohiivakakkua lisättiin 1000 g vettä ja 500 g toluee-nia. Seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yli yön, kuumennettiin 85°C:seen ja pidettiin tässä lämpötilassa n. 30 minuuttia. 30 Seos suodatettiin Buchner-suppilossa. Lähes kaikki tolueeni jäi liukenemattomaan solujätteeseen, kun taas vesipitoinen suodos sisälsi liukoista hiivauutetta. Vesipitoisen suodoksen tilavuus pienennettiin 276 g:ksi (pyörivä haihdutin, 40°C) ja sit-.· ten lisättiin 41 g trikloorietikkahappoa sekoittaen. Saostunut 35 hiivaproteiini koottiin ja liuotettiin uudelleen 0,1 M natrium- 33 79558

fosfaatti-puskuriin (pH 7,0) . Suodattamalla suoritetun selkeyttämisen jälkeen liuosta käsiteltiin 900 ml: 11a (n. 3 tilavuudella) asetonia. Sakka koottiin, liuotettiin 0,01 M natriumfosfaatti-puskuriin (pH 7,0) ja syntynyt liuos dialysoitiin 0,01 M nat-5 riurofosfaatti-puskuria vastaan. Syntynyt tuote (150 ml) oli leimattua suojaproteiinia, joka oli saatu leipomohiivasta. Valmistettiin 0,6-%:nen kitosaani-liuos liuottamalla 24 g kitosaania (Kytex, valmista ja Hercules Inc., Wilmington, Delaware) 4 Iraan 0,08 N HC1. Liuos asetettiin pH 6,2 reen 8 N 10 NaOHrlla, suodatettiin Whatman nro 3 suodatinpaperin läpi ja dialysoitiin sitten 16 1 vastaan deionoitua vettä. 400 ml m keittolasiin pantiin n. 100.000 IGIU liukoista glukoosi-iso-meraasientsyymiä (sekoitettu suodatusapuaineen kanssa), 1 g ksylitolia ja 100 ml (2/3) suojaproteiinia, joka oli saatu 15 leipomohiivasta. Tähän seokseen lisättiin 2,4 mg MgSO^^^O

ja 24 mikrolitraa moolista kobolttikloridi-liuosta. seos suodatettiin suodatusapuaineen poistamiseksi ja liuos haihdutettiin sitten (pyörivä haihdutin, n. 40°C) lähes kuiviin 2 lm pyöreä-pohjäisessä pullossa. Pulloon lisättiin sitten 800 ml kitosaa-20 nia (pH 6,2). Seos väkevöitiin tyhjössä (pyörivä haihdutin, n. 40°C) lähes kuiviin ja lisättiin 640 mikrolitraa 50-%rsta ; glutaraldehydi-liuosta (pH asetettu 6,5reen). Seosta varas toitiin kylmässä tilassa yli yön. Geeli poistettiin pullosta ja pakotettiin US-seulaluvun nro 30 mesh seulan läpi ja uuni-25 kuivattiin n. 37°C:ssa. Kuivattu entsyymi-valmiste seulottiin hienojakeen poistamiseksi (US-seulaluvun nro 80 mesh seulalla) ja käytettiin (8,9 g lopputuotetta) korkealämpötilaiseen isomerointiin.

103,3°C:n reaktori valmistettiin seuraavalla tavalla.

30 Edellä mainittua glukoosi-isomeraasi-valmistetta (8,9 g) sus-pendoitiin substraattiin ja poistettiin ilmaa laboratoriotyh-jössä huoneen lämpötilassa n. 30 minuuttia. Liete, josta ilma oli poistettu, käytettiin valmistamaan 1,5 x 29 cmrn patja vaipalla varustettuun lasipylvääseen.

34 79558

Substraatti, joka oli valmistettu ensimmäisen vaiheen 70°C:n isomeroinnissa, asetettiin pH 6,75:een ja laimennettiin 42,0 %:n kuiva-ainepitoisuuteen. Tämä substraatti pumpattiin sitten korkealämpötilaisen reaktoripylvään läpi virtausnopeu-5 della n. 1,5 ml/min 60°C:n lämpötilassa 30 minuutin ajan.

Lämpötilaa pylvään sisällä tarkkailtiin lämpömittarilla, joka oli sijoitettu suoraan patjan yläpuolelle ja jota ympäröivät lasihelmet (0,5 cm läpimitaltaan) kuolleen tilavuuden minimoimiseksi. Pylvään lämpötila nostettiin sitten nopeasti kierrät-10 tämällä öljyä 104°C:sesta termostaatti-kylvystä vaipan läpi.

Ulosvirtausta pylväästä tarkkailtiin muistiinmerkitse-vällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosi-tasoja 50 %:sta 58 %iiin. Jakeita (n. 5 ml) kootiin kunnes 55 %:n tai korkeampia fruktoosi-tasoja alkoi syntyä, missä pistees-15 sä koe lopetettiin. Näytteiden kokoamisen aikana poistovirtaus jäähdytettiin välittömästi jäähauteessa ja pH asetettiin n. 4,0:aan lisäämällä molaarista sitruunahappoa (0,1 ml) ja sitten laimeata HC1.

70°C:n ja 103,3°C:n reaktoreista saadut isomeroidut 20 liuokset analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen. Tuloksia verrattiin samanlaiseen analyysiin, joka oli tehty isomeroimattomalla substraatti-liuoksella kuten seuraa-vassa taulukossa on esitetty.

35 79558 •H ft —

(_l 0¾ O

:rt h o uo r1 o > O r- · ·> 1 X O O ·Ί· ro

G

0)

4J -H

tn Ό

0 -H

3 M

•H rt rH Ai

1 X ro tN

•H (0 1 1· 1 +> —tn oj cn rg P «ö >i

10 P P

tO tn o

p H) ÖJ

p 0)

to G

JQ -H

3 (0 1rl to i tn T- 10 O - ci tn > O o o o <I> 3 p Ai

•r-i £ P -H

3 3 Ai tn P P oj p to to

O OP

>-l P O to

φ <u Ai rt P

n- g tn i rt tn vo p m

O X P CU O

O tn 3 p rt o r-~ vo «- Λί P £ P > a! σν 'T 'tf

X p rt rt G

p rt p rt x p h n tn m a σ>

O to o Ό P

rt ·· O >i P En U X X -H

o P <#> (0 n P I O mm *· P O O 1 1> ro H G P o «- vo o Λ P X in in

T- rt G

ft U

rt —· p •o rt to rt tn to rt ·· tn tn u ·· to o CJ ·· ro O o o > O m t" P G o o fl> O r" «-

P P

P rt 3 3

•H g P P

to P P P

a0 O O O

X U P P

tn a) φ φ o g g g 3 0 0 0 p tn to tn

»3 H H H

36 79558

Tulokset osoittavat, että 56,3 %:n fruktoosi-taso saavutettiin, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,2 paino-%:n, kuiva-aineesta laskettuna, alapuolella.

Esimerkki 5 5 Tämä esimerkki esittää glukoosia sisältävän liuoksen, joka koostuu vallitsevasti puhdistetusta maissitärkkelys-hydrolysaatista, jolla on alhainen suolapitoisuus, suoran iso-meroinnin koostumuksen saamiseksi, joka sisältää 55,4 % fruktoosia kuiva-aineesta laskettuna, jolloin käytettiin kaksivai-10 heistä isomerointiprosessia. 70°C:ssa suoritettiin ensin mata-lalämpötilainen isomeroiminen ja tuote tästä reaktiosta syötettiin toiseen korkealämpötilaiseen reaktoriin (112,6°C), joka sisälsi kemiallisesti stabiloitua isomeraasia. Kemiallisesti stabiloitu isomeraasi on isoraeraasi, jossa entsyymi on kovalent-15 tisesti sidottu liukoiseen polymeeriin monipisteisellä kiinnitys-tavalla ja tehty sitten liukenemattomaksi liikkumattomaksi tehdyn katalyytin muodostamiseksi.

Hydrolysaatti valmistettiin maissitärkkelyksestä menetelmällä, joka on kuvattu US-patentissa 3.644.126 (nesteyttämi-20 nen) ja US-patentissa 3.280.006 (sokeriksi muuttaminen). Soke-.··. riksi muutettu liuos puhdistettiin US-patentin 3.834.940 mu- kaisesti antamaan tuote, joka sisälsi 93,8 % glukoosia kuiva-aineesta. Lisättiin riittävästi kiteistä glukoosia kokonais-glukoosipitoisuuden saattamiseksi 96,9 %:iin kuiva-aineesta ··· 25 laskettuna. Syntyneellä liuoksella oli seuraava koostumus: -··: kuiva-ainetta yhteensä (%) 50,3 glukoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 96,9 fruktoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 0,1 polysakkaridia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 3,1 30 psikoosia (%, kuiva-aineesta laskettuna) 0,0

NaHS03 (nM) 2,5

MgS04 (mM) 2,5 [·[· CoCl2 (mM) 0,1 pH 6,8 • · · 1

II

· 37 79558

Isomerointi matalassa lämpötilassa suoritettiin 70°C:ssa pumppaamalla edellä esitettyä substraatti-liuosta matalaläm-pötilaisen reaktorin läpi, joka selostettiin esimerkissä 1, virtausnopeudella 2,5 ml/min. Reaktorista poistuvat ensimmäi-5 set 1000 ml hylättiin. Senjälkeen ulostuleva virtaus koottiin käytettäväksi toisessa korkealämpötilaisessa isomeroinnissa.

Korkealämpötilaisessa reaktorissa käytetty kemiallisesti stabiloitu katalyytti valmistettiin seuraavalla tavalla.

Liukoista glukoosi-isomeraasia valmistettiin ja puhdis-10 tettiin esimerkissä 1 selostetulla menetelmällä. Tämän valmisteen ominaisaktiivisuus oli n. 40 IGIU/mg proteiinia. Liukoisen polymeerin, polyamiinin, liuos saatiin liuottamalla 48,4 g kitosaania (Kytex firmasta Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) 15 l:aan 0,08 N HC1. Liukenemisen jälkeen kitosaani-15 liuos tehtiin 0,5 M:ksi NaCl:n suhteen lisäämällä 438 g NaCl ja syntynyt liuos asetettiin pH 6,1 reen 8 N NaOHrlla. Kitosaani-liuos suodatettiin sitten Whatman nro 3 suodatinpaperin läpi liukenemattoman aineksen poistamiseksi. 15 l:aan 0,3-%:sta kitosaania 0,5 M NaCl:ssa pH 6,1:ssä lisättiin seuraavaa: 520 ml 20 liukenevaa isomeraasia, joka sisälsi n. 602.000 IGIU aktiivisuutta, 236 g ksylitolia (firmasta Sigma Chemical Co.) ja 3,07 g MnCl2*4H20. Tätä liuosta sekoitettiin 2 tuntia, minkä jälkeen lisättiin 7,44 g 1-etyyli-3-dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidiä (firmasta Sigma Chemical Co.) isomeraasin karboksyyli-ryhmien 25 kovalenttisesti sitomiseksi monipisteisellä tavalla kitosaanin amino-ryhmiin. Kahden tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa reak-tioseokseen lisättiin 15,5 ml 50-%:sta (paino/paino) glutaral-dehydi-liuosta (valmistaja Eastman Kodak Chem. Co.), joka oli asetettu pH 6,0:aan 8 N NaOH:lla kovalenttisesti sidotun isome-30 raasi-kitosaani-kompleksin tekemiseksi liukenemattomaksi. 15 minuutin kuluttua sekoitettiin liukenemattomaan isomeraasi-kitosaaniin 4 1 1 M fosfaatti-liuosta pH 8,0:ssa. Liikkumattomaksi tehty isomeraasi-kitosaani pestiin deionisoidulla vedellä sen ollessa Buchner imusuodattimella, jossa oli Whatman nro 35 3 suodatinpaperi. Valmiste ilmakuivattiin, jauhettiin ja seu- 38 79558 lottiin seulaluvun 12-60 mesh alueelle. Kuivan katalyytin näennäinen aktiivisuus oli 803 IGIU/g.

112,6°C:n reaktori valmistettiin seuraavalla tavalla.

7,0 g:n annos katalyyttiä suspendoitiin substraattiin ja il-5 maa poistettiin laboratoriotyhjössä huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. Liete, josta ilma oli poistettu, käytettiin 1,0 x 40 cm:n patjan valmistamiseen vaipalla varustettuun lasipyl-vääseen. Sullottu patja sisälsi 5621 IGIU.

Ensimmäisen vaiheen 70°C:n isomeroinnissa valmistettu 10 substraatti asetettiin pH 6,55:een ja laimennettiin deponoidulla vedellä 42,0 %:n kuiva-ainepitoisuuteen, mikä myös alensi suolapitoisuudet 2,1 mM:ksi NaHS0^:lle ja 2,1 mM:ksi MgSO^:lle. Tätä substraattia pumpattiin sitten korkealämpö-tilaisen reaktoripylvään läpi 12 psig:n = 82,74 kPa:n paineen 15 alaisena 10 minuuttia virtausnopeudella 8 ml/min, lämpötilan ollessa 60,0°C. Lämpötilaa pylväässä tarkkailtiin lämpömittarilla, joka oli sijoitettu suoraan patjan yläpuolelle ja ympäröity hiekalla lämpötila-asteikolle asti kuolleen tilavuuden minimoimiseksi niin pitkälle kuin mahdollista. Pylvään lämpö-20 tila nostettiin sitten nopeasti kierrättämällä öljyä n. 114°C: sesta termostaatti-kylvystä. Pylvään lämpötila nostettiin 112,6° ! C:seen ja virtausnopeus pienennettiin 1,89 ml:ksi/min.

Ulosvirtausta pylväästä tarkkailtiin muistiinmerkitse-vällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosi-: 25 tasoja 50 %:sta 58 %:iin. Senjälkeen kun pylvään lämpötila oli : saavuttanut 112,6°C ja kun poistovirtauksen fruktoosi-pitoi suus oli saavuttanut halutun tason, poistovirtaus koottiin. pH asetettiin välittömästi 4,0:aan lisäämällä 1 M sitruuna-happoa. Poistovirtausta koottiin kunnes näennäinen fruktoosi-30 taso putosi alle 55 %:n.

70°C:n ja 112,6°C:n reaktoreista saadut isomeroidut liuokset analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen ja tuloksia verrattiin samanlaiseen analyysiin, joka suoritettiin isomeroimattomalla substraatti-liuoksella kuten 35 seuraavassa taulukossa on esitetty.

39 79558

Pm -—- m

-H PS O

l-l H O O O 00

Jfl U T-

> ~ X

•H

Ό

H

P

ed i a; •H M <— r-~ m +) ed ed *> *· *

p p tn Γ0 CN CM

ed ω >1 (0 Oi r—»

P Φ O

p e a en -h λ (d S3 i -h en ed en >0 <-

C -HO

<u en S3 x o o o n 0 X -h S3 E en p p 3 m aj -h eu -P p O w tn en p x O td -h eu s) o ed tn m £ £ a: a O σ σ o o 3 i ed o - * *· otnP -h > λ; to m cm ^ -H tn p id s σι ^ rr a: o p a; r-i d <d O to λ tr -h tn Ai ed 3 d tn p p

ed ·· G X) -H

E-e U 0) >i do tn OP Λ I o

to tn -h o O

- O iH c -P •'Τ'Τ (N S3 -H -H a; - -

r- -H -H rd S3 O t— LO

r— r—i tn Qj p in m — ep ed ro <d tn ed tn tn tn U ed O tn u o tn o r-- ·· l£>

U

H o tN

rH C O ΤΟ o i" t-

P P

p td S3 3

•H E P P

tn -H ·Η ·Η

:ed O O O

a; p p p tn o cu d)

O E E E

S3 O O O

-h tn tn tn

μ} H H H

40 7 9 5 5 8

Tulokset osoittavat, että saavutettiin 55,4 %:n fruktoosi-taso, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,2 paino-%:n alapuolella kuiva-aineesta laskettuna ja väri < 9 (CIRFxIOO).

Esimerkki 6 5 Tämä esimerkki esittää glukoosia sisältävän liuoksen, joka koostuu vallitsevasti puhdistetusta maissitärkkelys-hydro-lysaatista, jolla on alhaiset suolapitoisuudet, suoran isome-roinnin 54,8 % fruktoosia, kuiva-aineesta laskettuna, sisältävän koostumuksen saamiseksi, jossa psikoosi-pitoisuus on äärim-10 maisen pieni [ < 0,1 % ja väri ( < 2 CIRFx100)J, jolloin käytettiin kaksivaiheista isomeroimisprosessia. Ensimmäisen (matalalämpötilainen) reaktori oli 70°C:ssa ja toinen (korkea-lämpötilainen) reaktori oli 105,8°C:ssa. Korkealämpötilaisessa reaktorissa käytetty kemiallisesti stabiloitu isomeraasi on 15 isomeraasi, jossa entsyymi on kovalenttisesti sidottu liukoiseen polymeeriin monipisteisellä kiinnitystavalla ja tehty sitten liukenemattomaksi liikkumattomaksi tehdyn katalyytin muodostamiseksi.

Substraatti ja sen muuttaminen ensimmäisen vaiheen reak-20 torilla 70°C:ssa oli kuten esimerkissä 5 selostettiin.

Korkealämpötilaisessa reaktorissa 105,8°C:ssa käytetty liikkumattomaksi tehty katalyytti oli kuten esimerkissä 5 selostettiin.

105,8°C:n reaktori valmistettiin seuraavalla tavalla.

25 5,63 g:n annos katalyyttiä suspendoitiin substraattiin ja pois tettiin ilmaa laboratoriotyhjössä huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. Liete, josta ilma oli poistettu, käytettiin 1,0 x 32 cm:n patjan valmistamiseen vaipalla varustettuun lasipyl-vääseen. Sullottu patja sisälsi 4521 IGIU.

30 Ensimmäisen vaiheen 70°C:n isomeroinnissa valmistettu substraatti asetettiin pH 6,5reen ja laimennettiin deponoidulla vedellä 42,0 %:n kuiva-ainepitoisuuteen, mikä alensi myös suolapitoisuuden 2,1 mMrksi MgSO^rlle ja 2,1 mMrksi NaHSO^slle. Tätä substraattia pumpattiin sitten korkealämpötilaisen reak-35 toripylvään läpi 10 psigrn = 68,94 kParn paineen alaisena vir- 79558 tausnopeudella 8 ml/min 10 minuuttia lämpötilan ollessa 60,0°C. Lämpötilaa pylvään sisällä tarkkailtiin lämpömittaril-11a, joka oli sijoitettu suoraan patjan yläpuolella ja ympäröity hiekalla lämpötila-asteikon alkamiseen asti kuolleen tila-5 vuuden minimoimiseksi niin pitkälle kuin mahdollista. Pylvään lämpötila nostettiin sitten nopeasti kierrättämällä öljyä n. 107°C:sesta termostaatti-kylvystä vaipan läpi.

Ulosvirtausta pylväästä tarkkailtiin muistiinmerkitse-vällä polarimetrillä, joka oli kalibroitu lukemaan fruktoosi-10 tasoja 50 %:sta 58 %:iin. Sen jälkeen kun pylvään lämpötila oli saavuttanut 105,8°C ja kun ulosvirtauksen fruktoosi-pitoisuus oli saavuttanut halutun tason, ulosvirtaus koottiin. pH asetettiin välittömästi 4,90:een lisäämällä 1 M sitruunahappoa.

Isomeroituja liuoksia 70°C:n ja 105,8°C:n reaktoreista 15 analysoitiin hiilihydraatti-koostumuksen ja värin suhteen ja tuloksia verrattiin samanlaiseen analyysiin, joka suoritettiin isomeroimattomalla substraatti-liuoksella, kuten on esitetty seuraavassa taulukossa.

42 79558

•H Jju .— CO

P 2 O

:<0 H O O O r- > u *-

•H

35

-H

M

3 λ: — Αί T- r~ oo (0 (0 *· - - 4-> 3 m cm cm ω >i

CL) iH

<U O

c qJ

•H

3 I -H T- C id tn Φ >0ooo

•n ·ιΗ O

3 3 M v

-P -P tn Ai -H

•H (1) 3 tn o w ε m a

p a: 3 -P

<D 3 -P tn H £ tn id -h 0 3 o m tn vo W-Ρ O CL Ο o οί ro •H tn Ai 3 O - » - O O I > X vo m cm a; 3 0 -H 33 o ^

a; ui X +J A «H

3 3 -P 42 en >H ·* C 3 3 3 o <u td -p

3 o -P P -H

En oo en Ό & tn

- 0 >i I O

m 3 Λ O O

O -H -H C -p T— 00 ' (—I i—Ι·Η,Α *- *· * I -H 3 3 O T- *d< 3 -P -A Qj p LT) m

•0 4-) K — M4 V

-P

3 3 3 3

3 P

.. 4J

U 3 O Λ 3 0 3 3 f" 3 3 3 ·· 3 u 3 o ·· 00 u >1 O in

rP e o O

Ο O Γ" r- 4-) 4-) 4->3 3 3 H Ε 4J 4-)

3 -H *P -P

:3 O O O

a; p p p

3 φ φ <U

O £ £ £ 3 0 0 0 H 3 3 3

|3 H H M

43 79558

Tulokset osoittavat/ että 54,8 %:n fruktoosi-taso saavutettiin, samalla kun psikoosi-taso pidettiin 0,1 paino-%:n alapuolella kuiva-aineesta laskettuna ja väri (CIRFxIOO) alle 2 :n

Claims (14)

1. Menetelmä glukoosin isomeroimiseksi fruktoosiksi, jossa glukoosia sisältävä syöttöliuos, jossa on n. 5 20-65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen Strep- tomyces rubigenosus-kannasta johdetun glukoosi-isomeraasin kanssa lämpötilassa n. 100eC - 112,6°C ja pH:ssa n. 4-7, riittävän pitkäksi kosketusajaksi, jotta fruktoosin lopulliseksi pitoisuudeksi liuoksessa saadaan vähintään 10 n. 53-60 paino-% hiilihydraattien kokonaismäärästä laskettuna, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasi on kemiallisesti stabiloitu ja että hajoamisaika säädetään arvoon, joka on yhtä suuri tai pienempi kuin arvo, joka lasketaan kaavalla 15 td = log (4300/(T + 273) - pH - 3,23) (1), jossa T on reaktiolämpötila °C:ssa, pH on reaktioseoksen pH, ja td on hajoamisaika minuuteissa, psikoosin ja/tai 20 muiden ei-fruktoosi-, ei-glukoosisokereiden olennaisen muodostumisen estämiseksi, jolloin kemiallinen stabilointi käsittää molekyylin sisäisten ristisidosten muodostamisen silloitusaineen avulla ja/tai sekapolymeroinnin polymeeri-matriisin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosia sisältävä liuos saadaan maissitärkkelyksen hydrolyysistä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosia sisältävä syöttö- 30 liuos saadaan isomeroimalla maissitärkkelys-hydrolysaatti korkeintaan n. 52 %:n fruktoosi-pitoisuuteen, laskettuna kokonaishiilihydraattipitoisuudesta.

4. Jonkun patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasin läh- 35 de on Streptomyce3 sp. ATCC 21175. 45 79558

5. Jonkun patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosi-isomeraasi on lämpöstabiili glukoosi-isomeraasi.

6. Jonkun patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetel-5 mä, tunnettu siitä, että entsyymin denaturoitumista estävä määrä rikkihapokkeen vesiliukoista suolaa on läsnä isomeroitumisväliaineessa.

7. Jonkun patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukoosia sisältävä syöt- 10 töliuos sisältää n. 30 - 50 paino-% hiilihydraattia.

8. Jonkun patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isomeroimisväliaineen pH pidetään n. 5 - 6,5:ssä.

9. Jonkun patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetel-15 mä, tunnettu siitä, että kosketusaika on n. 2 minuutista 30 minuuttiin.

10. Jonkun patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemiallisesti stabiloitua glukoosi-isomeraasia käytetään immobilisoidussa 20 muodossa.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemiallisesti stabiloitu glukoosi-isomeraasi immobilisoidaan dietyyliaminoetyylisel-luloosalla.

12. Jonkun patenttivaatimuksen 1-11 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että glukoosia sisältävä syöttöliuos, joka sisältää n. 20 - 65 paino-% glukoosia, saatetaan kosketukseen Streptomyces rubigenosus-kannasta johdetun glukoosi-isomeraasin kanssa lämpötilassa väliltä 30 n. 20eC -80°C pH:ssa n. 6-9 ja kosketusajaksi, joka on riittävä vähintäin n. 40-50 paino-%:n fruktoosia, koko-naishiilihydraattipitoisuudesta laskettuna, loppupitoisuu-den saavuttamiseksi tässä liuoksessa; isomeroimisväliaineen lämpötila nostetaan n. 100 - 112,6eC:een; isomeroi-35 misväliaineen pH asetetaan tarpeen mukaan alueelle väliltä 46 79558 π. 4 - 7, fruktoosia sisältävä liuos saatetaan kosketukseen kemiallisesti stabiloidun glukoosi-isomeraasin kanssa todelliseksi kosketusajaksi, joka on riittävä vähintäin n. 53-60 paino-%:n fruktoosia, laskettuna kokonaishiili-5 hydraatti-pitoisuudesta, lopullisen pitoisuuden saavuttamiseksi tässä liuoksessa, samalla kun hajoamisaika säädetään arvoon, joka on yhtä suuri tai pienempi kuin arvo, joka lasketaan kaavalla 10 td = log (4300/(T + 273) - pH - 3,23) (1), jossa T on reaktiolämpötila °C:ssa, pH on reaktioseoksen pH, ja td on hajoamisaika minuuteissa, psikoosin ja/tai muiden ei-fruktoosi-, ei-glukoosi-sokereiden olennaisen 15 muodostumisen estämiseksi.

13. Jonkun patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fruktoosi-glukoosi-siirappi jäähdytetään alle n. 80eC:n lämpötilaan.

14. Jonkun patenttivaatimuksen 1-13 mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että isomeroimisseos jäähdytetään lämpötilaan väliltä n. 20eC - 80eC entsyymin poistamisen jälkeen kosketuksesta isomeroimisseoksen kanssa. 47 7 9 5 5 8