HU199562B

HU199562B - Improved process for isomerizing glycose

Info

Publication number: HU199562B
Application number: HU843954A
Authority: HU
Inventors: Norman E Llody
Original assignee: Nabisco Brands Inc
Priority date: 1983-10-24
Filing date: 1984-10-23
Publication date: 1990-02-28
Also published as: FI79558B; FI79558C; DE3438960C2; SE8405301D0; NZ209945A; FR2553790B1; IT8423297A1; AU3457284A; ES8506807A1; PT79391B; AU587566B2; GB2148298B; FR2553790A1; PT79391A; DE3438960A1; FI844180L; HUT36179A; GB8426861D0; US4567142A; YU181684A

Description

A találmány tárgya javított enzimes eljárás glükóznak (dextróz) fruktózzá (levulóz) történő izomerizálására.

Az élelmiszer-minőségű glükóz nagy része kukoricakeményítő enzimes hidrolizátuma, vagyis kereskedelmi kukoricaszirup alakjában kerül forgalomba. A glükóz általában 60—80%-nyira közelíti meg a szacharóz édességét, ennek megfelelő arányban olcsóbb is. Régen ismeretes a glükóznak fruktózzá (a szacharóznál is édesebb cukorrá) történő átalakítása izomeráz enzim alkalmazásával, mely előnyösen inért hordozó anyagon — pl. dietil-amino-etil-cellulózon, porózus üvegen vagy kitinen — van megkötve.

A glükóznak gltíkóz-izomeráz enzim segítségével fruktózzá történő átalakítására vonatkozó részletes leírások találhatók az alábbi közleményekben: Hamilton és munkatársai: „Glucose Isomerase a Gase Study of Enyme-Catalysed Process Technology (Glükóz-izomeráz; egy enzimmel katalizált technológiai folyamat esettanulmánya): Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes (Hordozóanyagon megkötött enzimek élelmiszeripari és mikrobiológiai eljárásokban) Oison és munkatársai, Plenum Press. New York, (1974), pp. 94—106, 112, 115— 137; Antrim és munkatársai: „Glucose Izomerase Production of High-Fructose Syrups (Nagy fruktóztartalmú szirupok előállítása glükóz-izomerázzal), Applied Biochemistry and Bioengineering, 2 kötet, Academic Pess (1979); Chen és munkatársai „Glucose Isomerase (Áttekintés), Process Biochem., (1980), pp. 36—41; Nordahl és munkatársai „Fructose Manufacture from Glucose by Immobiled Glucose Isomerase (Fruktóz előállítása glükózból megkötött glükóz-izomeráz* zal), Chem. Abstracts, 82 kötet, (1975), 110316h számú referátum; Takasaki „Fructose Production Glucose Isomerase (Fruktózgyártás glükóz-izomerázzal), Chem. Abstracts, 82. kötet (1975), 110316h számú referátum; valamint Takasaki, „Fructose Production by Glucose Isomerase (Fruktózgyártás glükóz-izomerázzal), Chem. Abstracts, 81. kötet, (1974), 76464 számú referátum. Ezen kívül számos szabadalmi leírás foglalkozik a glükóz izomerizálásával, melyek közül a 3,616,221; 3,623,953 (újra kiadva 28,885 számon); 3,694,314; 3,708,397;

3,715,276; 3,788,945; 3,826,714; 3,843,442; 3,909,354; 3,960,663; 4,1444,127 és a 4,308,349 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást emeljük ki.

Az izomerizálási reakció egyensúlya korlátozza a glükóznak glükóz-izomeráz enzimmel végzett izomerizálásával kapható fruktóz-koncentrációt. Ha tiszta dextróz szubsztrátból indulunk ki, akkor 65°C-on körülbelül 51 tömeg% fruktóztartalomnál áll be az egyensúly. Ha táptalajként finomított glükóz-oidatot használunk (mely legfeljebb 6 tömeg% nem-monoszacharidot tartalmaz), és ésszerű tartózkodási időt alkalmazunk az en2 zim-reaktorban, akkor a fenti eljárással legfeljebb 48—52 t% töménységű fruktóz-szi· rupot kaphatunk (szárazanyagra számítva). Nagyobb fruktóztartalmú szirupok előállításához frakcionáló rendszereket kell alkalmazni, ez pedig jelentősen megnöveli a végtermék előállítási költségeit. Nagyobb hőmérsékleten viszont kedvező irányban tolódik el az egyensúly. Pl. olyan enzimes glükóz-izomerizálási eljárással, mely körülbelül 90— 140°C-on is működőképes, közvetlenül is előállíthatunk nagy fruktóztartalmú kukoricaszirupokat (HFCS), amelyek a szárazanyagra számítva 53—60 tömeg% fruktózt tartalmaznak, s így nem lesz szükség frakcionálásra vagy visszavezetésre. Az ismert giükőz-izomeráz rendszerek hajlamosak arra, hogy hő hatására denaturálódjanak, s ezzel egyidejűleg hatásuk meredeken csökken. Ez az a tényező, mely mindeddig meghiúsította az olyan kísérleteket, melyek magasabb hőmérséklet alkalmazásával próbálták az egyensúlyt eltolni a fruktóz képződés szempontjából kedvező irányba. Továbbá a glükóz, és különösen a fruktóz érzékeny redukáló cukrok, melyek — a találmány szerinti izomerizáláshoz szükséges hőmérsékletre melegítve — erősen hajlamosak nem kívánt melléktermékek, például pszikóz, színes termékek, színezőanyagok közbenső termékei, fruktóz-diarihidridek, mannóz, tagatóz és savak képzésére.

Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy ha a glükóz izomerizálását a későbbiekben megadott pH- és az enzimreaktor-beli tartózkodási idő-határok között végezzük, akkor 90°C-tól I25°C-ig terjedő izomerizálási hőmérsékletek is alkalmazhatók jó minőségű (tehát elfogadható mennyiségű mellékterméket tartalmazó) HFCS-szirupok közvetlen előállítására. Az így kapott szirup körülbelül 60 tömeg% fruktózt tartalmaz, itt tehát feleslegessé válik azoknak a költséges és technológiailag bonyolult frakcionálási és visszavezetési műveleteknek az alkalmazása, melyek az ismert glükóz-izomerizálási eljárásoknál a fenti fruktóztartalom eléréséhez szükségesek.

A találmány szerinti eljárásnál egy glükóztartalmú folyadékot 90—125°C hőmérsékleten, 5,5—7,5 pH-értéken annyi ideig hozunk érintkezésbe egy kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz enzimmel, amennyi szükséges ahhoz, hogy a folyadék fruktóztartalma az összes szénhidráttartalomra számítva legalább 53— 60 tőmeg% legyen, és a bomlási időt úgy állítjuk be, hogy az egyenlő vagy kisebb legyen az alábbiakban ismertetett (1) egyenletből számított értéknél azért, hogy ne képződjék jelentős mennyiségű melléktermék.

A találmány szerinti eljárással fruktózzá izomerizálandó glükóz származhat e cukor bármely ismert forrásából. Gazdasági okokból a' glükózt általában cellulóz vagy keményítő savas és/vagy enzimes, előnyösen enzimes hidrolízisével állítjuk elő az ismert eljárások szerint. Az ily módon előállított

-2HU 199562 Β glükóztartalmú folyadékok az alkalmazott szénhidrát-forrástól és a hidrolízis módjától függően általában tartalmaznak kis mennyiségű poliszacharidot, cukor-oligomereket, stb. A találmány szerinti glükóz-konverzióhoz kiváló keményítő-források a gabonamagvak, mint például a kukorica, cirok, búza, rozs, és a többi, valamint a keményítőtartalmú gumók és gyökerek, mint a burgonya, jamgyökér, répafélék, manióka, és a többi. Az egyesült államokban különösen kedvelt a viszonylag olcsó és könnyen beszerezhető-kukoricakeményítő. Minthogy az élelmiszer-minőségű glükóz előálításához kedvezően alkalmazható az enzimes keményítőhidrolízálás, ez az eljárás itt is előnyösen használható. Enzimes hidrolízálási módszerek leírása megtalálható például a 4,017,363, 3,912,590, .3,922,196, 3,922,197-201 és a 4,284,722 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban, melyeknek megállapításaira itt hivatkozunk.

Az itt kémiai stabilizálással alkalmazott glükóz-izomeráz enzimet izolálhatjuk bármely ismert, glükóz izomerázt termelő mikroorganizmusból, mint például Streptomyces flavorirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiltae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Eschericia intermedia. Leucoriostoc mesenteriodes és Paracolobactrum aerogenoides. Ezen kívül felhasználhatunk Nocardia, Micromonospora, Microbispora Microellobospora vagy Arthrobacter fajták által termelt glükóz-izomeráz enzimeket is. Mint említettük, előnyös az olyan glükóz-izomerázok használata, melyek az itt alkalmazott viszonylag magas izomerizálási hőmérsékleten stabilak maradnak. Ilyen például a Bacillus streatőtermophilus, különösen pedig az ATCC 21,365, az NRRL B-3680, az NRRL B-3681 vagy az NRRL B-3682 jelű Bacillus streao-termophilus törzsek által termelt glükóz-izomeráz, amint az a 3,826,714 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban megtalálható; az Ampullariella mikroorganizmus-félékhez tartozó Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata és Ampullariella reguláris által termelt glükóz-izomeráz (4,308,349 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), a Bacillus licheniformis által termelt glükóz-izomeráz (41213 számú Európa-szabadalmi leírás); valamint a 74 30588 számú japán szabadalmi leírásban ismertetett thermophiles nemzetség által termelt glükóz -izomeráz.

A fent felsorolt mikroorganizmusokon kívül a találmány szerinti eljárásban felhasználhatók azok mutánsai és variánsai, vala4 'mint az azokból genetikai átalakítással származtatott mikroorganizmusok, amely genetikai átalakítás abból áll, hogy mutáció útján kapott glükóz-izomeráz géneket más, például mezofil Vagy termofil mikroorganizmusokba ültetnek be. A találmány céljára az olyan mutált glükóz-izomeráz gének megfelelőek, melyek magas hőmérsékleten — előnyösen 90°C felett, még előnyösebben 125°C-ig — stabil glükóz-izomeráz enzimet termelnek. Ilyen gének előállíthatók a mikroorganizmusok mutációjához szokásosan alkalmazott módszerekkel, például besugárzással vagy kémiai mutagénekkel. Egy másik eljárás, hogy olyan izolált glükóz-izomeráz géneken, melyek mérsékelt hőstabilitású glűkóz-izomerázt termelnek (ilyen például az egyes Streptomyces törzsek által termelt glükóz-izomeráz), in vitro mutációt hajtanak végre. A megfelelően mutált gének kiválasztása úgy történik, hogy a mutált gént vagy a termelő vagy pedig más organizmusba ültetjük be, az organizmust továbbszaporítjuk és vizsgáljuk a kapott glükóz-izomeráz hőstabilitását.

A rekombinációs DNA-eljárások ugyancsak alkalmazhatók jobb hőstabilitású glükózizomeráz előállítására, mely kémiai stabilizálás után a találmány céljaira felhasználható. Argos és munkatársai (Biochemistry 18/25/:5698-5703 (1979)) kimutatták, hogy termofil organizmusokból származó enzimekben a megfelelő mezofil organizmusokból szárma-zó enzimek egyes alanincsoportjai glicil-, szeril-, valil-, illetve lizilcsoportokkal vannak helyettesítve. Perutz (Sciene, 201, 1187-91 (1978) megállapította, hogy a termofil baktériumok főleg a protein felületén található addíciós sókötéseknek köszönhetik rendkívüli hőstabilitásukat. Zuber („Biochemistry of Thermophily, Freidman, S.M. kiadás, 267—285, Academic Press, N.Y., 1978) további adalékokat szolgáltat a nagy hőstabilitású enzimek szerkezetéhez. Ha ismerjük a glükóz-izomeráz enzim aminósav-szekvenciáját és térbeli (tercier) szerkezetét, akkor az izomeráz génben végrehajtott hely-specifikus mutációkkal fokozhatjuk a hőstabilitást oly módon, hogy olyan enzimeket állítunk elő, melyek nagyobb mennyiségben tartalmazzák a szerkezet stabilitását biztosító aminosavakat. A glükóz-izomeráz DNA-szekvenciájának meghatározása után génszintezátort használhatunk új szekvenciák kidolgozására, melyek az ilyen mesterséges gének által előállított glükóz izomeráz hőstabilitásának növelésére szolgálnak. Az ily módon megtervezett enzimek különösen hasznosak lehetnek e találmány gyakorlati megvalósításához.

Minthogy az említett és egyéb mikroorganizmusok a glükóz-izomerázt a sejten belül termelik, a glükóz-izomeráz egyik forrása, hogy a sejteket egyszerűen összegyűjtjük, és a technikában ismert módszerek valamelyikével — például a sejtek autolízi3 sével vagy ultrahangos roncsoiással — kiválasztjuk belőlük az enzimet, melyet azután az ismert és hagyományos szerkezetű enzimreaktorban használunk fel. Ha a glükóz-izomeráz a kémiai stabilizálás következtében nem válik oldhatatlanná, akkor előnyösen valamely inért hordozóanyagon köthetjük meg az ismert és hagyományos eljárásokkal. Az enzimek megkötéséhez használatos anyagok és eljárások jól ismertek, leírásuk egy sor közleményben megtalálható, többek között: Wang és munkatársai Fermentation and Enzyme Technology (Erjesztéses és enzimes eljárások), John Wiley and Sons, Inc., New York (1979), pp. 318— 338, valamint Kirk Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. kiadás John Wiley and Sons. Inc., New York (1980) 9. kötet, pp. 148—172. A 28,885 számú, újra kiadott egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint kis mennyiségű kobalt-, mangán- vagy magnézium-kation és/vagy a kénessav vízoldható sói — például nátrium-szulfit, nátrium-biszulfit, magnézium-szulfit és/vagy magnézium-szulfit és/vagy magnézium-biszulfit — jelenléte csökkenti vagy megakadályozza a glükóz-izomeráz enzim denaturálódását a művelet során.

Jó ererdmények eléréséhez az szükséges, hogy a glükóztartalmú kiindulási oldat szénhidrogén-koncentrációja körülbelül 20 és 85 tömeg% között, előnyösen 30 és 50 tömeg% között legyen.

Az izomerizálási olyan pH-értéken kell végezni, mely 5,5-7,5, előnyösen 5 és 6,5 közé esik. Ha az izomerizálást a fent megadottaknál lényegesen alacsonyabb vagy magasabb pH-értéken végezzük, akkor nagy mennyiségű nemkívánatos melléktermék — például pszikóz, szerves savak, színes termékek, színezék közbenső termékek, fruktóz-dianhidridek, és a többi — képződik.

Megállapítottuk, hogy magas hőmérsékleten a glükóz izomeráz enzim hatása szempontjából optimális pH érték lényegesen alacsonyabbá válik. Például a Streptomyces rubigenosus-ból nyert glükóz-izomeráz hatás-optimuma 25°C-on pH=8,6 és 9,2 75°C-on pH=6,9 és 7,5, 125°C-on pedig pH=5,6 és 6,2 közé esik. Thát az izomerizálási hőmérséklet növelésével párhuzamosan csökkenthetjük a közeg pH-ját, hogy fenntartsuk az enzim maximális hatásosságát és elkerüljük a nemkívánt melléktermékek képződését.

A találmány szerinti eljárásnak egy további követelménye a glükóztartalmú nyers oldat és a kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz érintkezési idejére vonatkozik. Ahhoz, hogy elfogadható minőségű fruktóz szirupot kapjunk, ezt az időtartamot körülbelül 1 másodperc és 5 óra, előnyösebben körülbelül 30 másodperc és 1 óra, a legelőnyösebben pedig 2 perc és 30 perc közötti értékre kell beállítani.

A kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz és a glükóztartalmű nyers oldat közötti érint4 kezési idő előnyös értéke erősen függ attól, hogy az izomerizálást milyen pH-értéken végezzük. A megadott pH-tartomány alsó határa közelében hosszabb tartózkodási időt engedhetünk meg anélkül, hogy a glükóz és fruktóz — pszikóz és egyéb nemkívánatos bomlástermékek képződése közben — elbomlana. A tartomány felső határán az érintkezési időnek rövidebbnek kell lennie, hogy elkerüljük a pszikóz és a színezőanyagok képződését. A gyakorlatban azt a teljes időtartamot, amit a glükóztartalmú szirup á reakció véghőmérsékletén vagy ahhoz közeli hőmérsékleten tölt el, bomlási időnek (tj) tekintjük, minthogy az itt végbemenő cukor bomlási reakciók nem enzimes természetűek, és ezek lejátszódása független attól, hogy a szirup érintkezik-e glükóz-izomerázzai. A bomlási idő (id) tartalmazza az enzim és a szubsztrát tényleges érintkezésének időtartamát (t_e), valamint mindazt a kezelési időt, melyet a tápoldat a reakcióhőmérsékleten vagy annak közelében tölt el, például a reaktorban történő bevezetés, illetve az abból való eltávolítás időtartamát. A tényleges érintkezési idő (ta) az az időtartam, melynek eltelte alatt az enzim reakciókapcsolatban áll a szubsztráttal, vagyis az enzim és a szubsztrát közvetlenül érintkezik egymással. Ezért, ha az izomerizálást 90°C felett végezzük, fontos, hogy minimálisra csökkentsük a glükóztartalmú oldatnak az izomerizálási hőmérsékletre való felmelegítéséhez szükséges időt (például úgy, hogy az oldatot közvetlenül az izomerázzal történő érintkezés előtt vagy annak folyamán gőzzel keverjük), és amint a kívánt fruktóztartalmat elértük, gyorsan válasszuk el az oldatot az aktív izomeráztól, majd pedig a lehető leggyorsabban hűtsük 90°C alatti, előnyösen 70°C alatti hőmérsékletre.

Hogy elfogadható szirup-termékeket kapjunk, a fruktóz vagy a glükóz nemkívánatos lebomlása nélkül a bomlási időt az alábbi egyenlet szerinti értékre, vagy annál kisebbre kell beállítani:

t_d=antilog [4300/ (T-j-273) -pH-3,23J, ahol t_d a bomlási idő percben; T a reakcióhőmérséklet °C-ban; pH pedig a reakciókeverék pH-ja azon idő alatt, amit a keverék a reakcióhőmérsékleten tölt el.

A fenti egyenlet, azt mutatja, hogy a-tényleges érintkezési idő annál rövidebb lehet, minél magasabb a hőmérséklet és/vagy minél nagyobb a pH-érték. A reakcióhoz rendszerint olyan pH-értéket alkalmazunk, mely a választott izomeráz-enzim számára optimális, vagy annak közelében van.

Ha például az enzim számára az optimális pH=6, és a reakcióhőmérséklet 110°C, akkor a bomlási időt (mely magában foglalja az érintkezési időt) 100 perc körüli, vagy kisebb értékre kell beállítani.

A hőmérsékletet (T) a szubsztrát összetétele és az elérendő fruktóztartalom szerint

-4HU 199562 Β állíthatjuk be, amint azt a fentiekben ismertettük. Az összefüggések az 5., 6. és 7. számú egyenletekből láthatók.

Az érintkezési idő további szabályozásának lehetőségét nyújtja a 4. egyenlet, mely azt mutatja, hogy ezen idő fordítottan arányos az enzim aktivitásával.

Ha a kémiailag stabilizált glükóz-izomerázt oldható alakban használjuk, akkor a lehűtés előtt inaktiválni kell (például úgy, hogy a pH-t olyan értékre csökkentjük, melynél az izomeráz inaktiválódik), hogy elkerüljük a magas hőmérsékletű izomerizáiás során képződött fruktóz visszaalakulását glükózzá, hiszen az izomerizációs reakció természetesen megfordítható.

A fruktózzá történő átalakulás maximális mértékét a glükóz és a fruktóz közötti termodinamikai egyensúly határozza meg, az viszont az izomerizáiás hőmérsékletétől függ. Egyensúlyi glükóz-fruktóz keverékek igen. gondos elemzésével jutottunk a következő összefüggésekhez:

F=100K/(K+l) (2)

In K — ψΊ* 2.3005 (3), ahol F a fruktóz tömegszázalékos aránya egyensúlyi állapotban a glükóz és fruktóz összes tömegéhez viszonyítva, T az izomerizálási hőmérséklet (°C), és K= a glükóz/fruktóz egyensúlyi állandó.

Ha az izomerázt megkötött formában alkalmazzuk, a glűkóztartalmú szirup és az izomeráz közötti tényleges érintkezési időt általában az alábbi egyenlet alapján számíthatjuk:

t« = CVlr

F_e — F_c ]

LFe-F

TA(4) ahol t_a = a tényleges érintkezési idő,

C = a glükóz és a fruktóz koncentrációja, V = a folyadék nettó térfogata a reaktorban (a reakciókeverék térfogata mínusz a megkötött enzimrészecskék által elfoglalt térfogat),

Fe = a fruktóz egyensúlyi törtje a glükóz/fruktóz keverékben az izomerizálási hőmérsékleten,

F_o= a fruktóz aránya (a glükóz és fruktóz együttes mennyiségéhez viszonyítva) a reakciókeverékbe történő belépéskor,

F = a fruktóz aránya (a glükóz és a fruktóz együttes mennyiségéhez viszonyítva) a reakciókeverékből történő kilépéskor, k = az izomerizáiás reakciósebességi állandója az izomerizálási körülmények között és

A = az izomeráz aktivitása a reakciókeverékben.

A következő példák szerint előállított, megkötött izomerázenzimre 90 és 125°C közötti hőmérsékleten a k értéke 0,07 és körülbelül 5 ghr~‘IGIU^-1 között változik. Ez az össze5 függés azt mutatja, hogy magas hőmérsékleten — egységnyi térfogatra vonatkoztatva nagy aktivitású tömör ágyak alkalmazásával — minimalizálni kell az érintkezési időt. A következő példákban ismertetett el10 járások szerint kialakított tömör ágyak milliliterenként max. 2000 IGIU-t tartalmazhatnak, amivel magas hőmérsékletű reaktorban 1 percnél rövidebb idő alatt 99,5% egyensúlyi glűkóz-fruktóztartalmat érhetünk el, ha különböző hőmérsékleten működő, többfázisú reaktor-rendszert alkalmazunk, és az első reaktorba betáplált anyagot alacsony hőmérsékleten izomerizáljuk, mielőtt a második reaktorban végrehajtanánk a magas hőmér20 sékletű izomerizálási. Többfázisú reaktor-rendszer használata esetén a glükóznak fruktózzá történő enzimes átalakításához előnyösen olyan eljárást alkalmazunk, mely abból áll, hogy 20—80°c-os hőmérsékleten, 6,0—7,5-ös pH-értéken 0,5—2 óra érintkezési idő alatt egy 20—85 tömeg% a glükóztartalmú nyers oldat eredeti glükóztartalmából körülbelül 40—45 tömeg%-nyi mennyiséget fruktózzá alakítunk át oly módon, hogy az izomerizációs

3Q közeg hőmérsékletét 90°C-ról 125°C-ra emeljük, pH-ját 7—7,5-re növeljük, majd a fruktóztartalmú oldatot további 1 másodperctől 5 óráig terjedő időszakra érintkezésbe hozzuk a glükóz-izomerázzal, hogy az átalakulási fokot a kiindulási glükóz-oldatban jelenlévő glükóztartalomra vonatkoztatva 53-ról 60 tőmeg%-ra növeljük, miközben sem jelentős mennyiségű pszikóz, sem pedig egyéb nem-fruktóz, nem-glükóz cukor nem képződik.

₄Q így nagy hatásfokú tömör ágyak alkalmazásával a tényleges érintkezési időket kicsire csökkenthetjük, ezáltal pedig minimálisra csökken a jruktóznak a találmány szerinti eljárás, által igényelt magas hőmérsékleten történő lebomlása.

A glükóz-izomeráz megkötésére előnyösen olyan módszert választunk, mely kisméretű, lényegében összenyomhatatlan katalizátor-részecskéket ad, melyeknek használatával az _5Q izomerizálási sebességet csökkentő diffúziós hatások minimalizálhatók.

Egy másik módszer szerint az izomerázt megköthetjük egy membrán pórusaiban, majd ezen átnyomatva a glükózoldatot végbemegy a magas hőmérsékletű izomerizáiás. Ez a ⁵⁵ módszer jó érintkezést biztosít az enzim és a táptalaj között, s így minimálisra csökkenti a diffúziós korlátokat. Az enzim megkötéséhez előnyösen teljesen oldhatatlan és inért hordozóanyagot használunk, hogy elkeθθ rü-ljük a tápoldatok glükóz/fruktóz-tartalmának szennyeződését, illetve bomlását.

Az ipari gyakorlatban azonban a fruktóztartalmú szirupokat nem tiszta glükózból állítják elő. Glükózforrásként inkább (a fen5

-5HU 199562 Β ti módszerekkel előállított) keményítőhidrolizátumokat használnak, s ezek mindig tartalmaznak a keményítő tökéletlen hidrolíziséből és a glükóz reverziójából származó nem-giükóz és nem-fruktóz szacharidokat (a továbbiakban: poliszacharidok). Ezek a keményítő hidrolíziséből származó szacharidoknak általában 3—8 tömeg%-át teszik ki (a szárazanyagíartalomra számítva). Ezért az izomerizálási hőmérséklet meghatározásakor figyelembe kell venni a glükózoldat poliszacharidtartalmát, valamint egyéb olyan tényezőket, mint például a szárazanyagtartalomra számított elérendő fruktóztartalom, pszikóz és egyéb nem-glükóz, nem-fruktóz képződése a glükózoldat es az izomeráz tényleges érintkezési ideje alatt. Az izomerizációs hőmérséklet számításához az alábbi összefüggéseket használjuk:

755

T=	073 2,3005—lnk	(5)
	F
i\ -	100—F	(6)
F=	lOOOO(M-j-C)	(7)

Q(100—P)

T= izomerizációs hőmérséklet (°C)

F= egyensúlyi fruktóztartalom (t%, a glükóz és fruktóz együtes súlyára vonatokztatva) T hőmérsékleten

M= az izomerizált termékben elérendő fruktóz t%, szárazanyagtartalomra vonatkoztatva

C = a tényleges izomerizációs érintkezési idő alatt képződő pszikóz és egyéb bomlástermékek mennyisége, t%

Q =az izomerizációs reakcióban elérendő egyensúlayi %

P = a glükózoldat poliszacharid-tartalma, t%.

Általában 1 t%, előnyösen 0,5 t% pszikóz és egyéb bomlástermék keletkezik. Az adott poliszacharid-tartaimú glükóz-oldatokból kiindulva az alábbi hőmérsékleteket kell alkalmazni ahhoz, hogy szárazanyagra számítva

55,5 t% fruktóztartalmú szirupot kapjunk:

A glükóz-oldat poli- Izomerizálási hőszacharidtartalma mérséklet (°C) (t%, szárazanyagra)

99,1

104,3

108,9

113,8

124,3

136,1

A kereskedelmileg elfogadott termékek át? lagosan 55,5 t% fruktózt tartalmaznak szárazanyagra számítva. Ennek az az oka, hogy a nagy fruktóztartalmú kukoricaszirupok (HCFS) azonos szárazanyagtartalom mellett ilyen fruktóztartalom esetén adnak a szacharózzal azonos édességet. Továbbá az 55,5 t% fruktóztartalmú HCFS jól bevált kereskedelmi cikk, melyet sokféle élelmiszeripari termékben, különösen szénsavas üdítőitalokban használnak a szacharóz teljes vagy részleges helyettesítésére. Az ilyen típusú HCFS felhasználását az Egyesült Államokban 1982-ben 2,9 milliárd fontra becsülték, és ez az érték 1983-ra várhatóan 4,0 milliárd fontra növekszik. A HCFS szállításának, tárolásának, mérésének és élelmiszertermékekbe történő bekeverésének bonyolultsága miatt általános követelmény, hogy a különböző gyártók HCFS termékei egységesek legyenek, hogy a különböző forrásokból eredő HCFS termékeket egymással felcserélhetően és egyidejűleg lehessen alkalmazni. Ezért a szárazanyagra számított 55—56 t%-os fruktóztartalom, mint elérendő végkoncentráció, speciális jelentőséget nyert a HCFS-gyártás technológiájában.

A találmány szerinti eljárás legalább 53 t%-os, előnyösen 54 t%-os, a legelőnyösebben pedig 55 t%-os fruktóztartalmat biztosít.

Kívánt esetben a találmány szerinti eljáráshoz olyan oldat helyett, mely kizárólag glükózt tartalmaz, szubsztrátként olyan oldatot is használhatunk, melyben a glükóztartalom egy része már fruktózzá izomerizálódott. Például a találmány szerinti eljáráshoz használhatunk olan izomerizált glükózoldatot, mely legfeljebb 50 t% fruktózt is tartalmaz, hogy a fruktóz koncentrációját az előnyösebb, 50 t% feletti, vagy a még előnyösebb, 55—56 t%-os vagy még magasabb értékre növeljük.

A szérihidráttartaiomra számított 50 tömeg%-nál kevesebb fruktózt tartalmazó glükózoldatokat a szakmában ismeretes módszerekkel állíthatunk elő.

A glükóztartalomra, a pH-ra és az érintkezési időre a fentiekben megadott követelmények figyelembe vételével az ismert glükóz-izomerizálási eljárások adaptálhatók 90— 125°C közötti, előnyösen 100 és 110°C közötti hőmérsékletre, a találmány szerinti eljárásnak megfelelő, nagy glűkóz-fruktóztartalmú szirupok előállítása céljából.

A glükóz-izomeráz hőstabilitását jelentősen megnöveljük egy vagy több kémiai kezeléssel, melynek során az enzim aktivitásának nagyrészét megőrzi, amint azt a későbbiekben tárgyalni fogjuk. Az így kezelt enzimet ezen leírásban „kémiailag stabilizált izomeráz“-nak nevezzük.

Az izomeráz kémiai stabilizálását különböző módszerekkel végezzük, melyek az enzim hőstabilitását is megnövelhetik. Az alapvető megközelítés az, hogy olyan szerkeze-6HU 199562 Β

1.1 'ti elemeket viszünk be az enzimmolekulába, melyek azt a normál denaturálási hőmérséklet fölé melegítve is ellenálóvá teszik a lebomlással szemben. Ennek egyik előnyös módszere, hogy kémiai szubsztitúcióval polimerizálható vinilcsoportokat tartalmazó molekularészeket visszük be az enzimbe, úgy, hogy ezek több ponton szilárdan kötődjenek az enzim felületéhez. Ezután az enzimet egy vagy több polimerizálható vinilvegyület vizes oldatával keverjük és a keveréket kopolimerizáljuk, hogy kémiailag stabilizált enzim képződjék, .ahol az enzim több ponton szilárdan kötődik egy háromdimenziós polimer-mátrixhoz, mely az enzimhez képest kiegészítő (komplementer) alakot vesz fel.

Ilyen típusú stabilizálásra példák találhatók a következő helyeken: Martinék és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 485, 1 —12 (1977)), valamint Kulys és munkatársai (Biokhimiya, 42, No. 3. 453—59 (1978)).

A fenti reakciók végrehajtásakor alapvetően fontos, hogy elkerüljük az olyan körülményeket, melyek az izomeráz denaturálásához, s ezáltal aktivitásának csökkentéséhez vezethetnek: Például a fenti reakció minden egyes lépésében kerülni kell a szélsőséges pH-értékeket és hőmérsékleteket.

Többek között az alábi reagenseket használhatjuk arra, hogy polimerizálható vinilcsoportok bevitelével módosítsuk az izomeráz enzimet: akriloil-klorid, metakriloil-klorid, akrolein, krotonaldehid, maleinsavanhidrid, 3,4-epoxi-butén, akrilsav-2,3-epoxi-propilészter, akrilsav-2,3-tioglicidilészter, 1 -alliloxi-3-(N-etilénimin)-2-propanol, akrilsav-O-szukcinamidészter, klór-maleinsavanhidrid, maleinsavazid, 3-bróm-propén, allil-izocianát. Ezek a vegyületek reagálni tudnak az izomeráz szabad aminocsoportjaival, például a lizinrészek epszilon-amino-csoportjáival.

Az izomeráznak könnyen polimerizálható vinilcsoportokkal történő szubsztituálására egyéb olyan vegyületeket is alkalmazhatunk, melyek az izomeráz szabad karboxilcsoportjaival reakcióba tudnak lépni.

Példák olyan vinilvegyületekre, melyek a módosított izomerázzal kopolimerizálhatók: nátrium-akrilát, nátrium-metakrilát, akril -amid, hidroxi-etil-metakrilát, akriloil-piperidin-4-spiro-2’- (1 ’,3’-dioxakrilo-pentán), 1 -akriloil-4-piperidon és akriloil-metoxi-amin. Általában előnyösek a vízoldható monomerek vagy monomer keverékek, melyek térhálósítószer .nélkül polimerizálva vízoldható polimereket képeznek.

A monomer keverék általában tartalmaz (az összes monomer tömegére számítva 0,1 — 5 t%) vinilvegyületet térhálósítási pontok kialakítása céljából, melyek háromdimenziós polimer térhálóhoz vezetnek.

Álatalában megfelelőek a vinilpolimerizációhoz használatos iniciáló rendszerek, mint például ammónium-perszulfát + nátrium12 biszulfit, hidrogénperoxid+ferro-szulfát, kálium-szulf át+N,N, Ν’, N’-tetrametil-etilén-diamin és a riboflavin (fény jelenlétében).

Egy másik módszer szerint valamely nem- kovalens kötés is megadhatja az izomeráz molekulának a kívánt merevséget, s ezáltal a hőstabilitás jelentős mértékű növekedését. Ez történik például, ha az izomerázt mechanikusan beágyazzuk egy térhálós polimer gélbe. Ez esetben nem szükséges, hogy a polimerizálás előtt az izomerázt vinilvegyület bevitelével módosítsuk. A gél koncentrációjának azonban 30 tömeg%-nál nagyobbnak kell lennie, mielőtt jelentős mértékű stabilizálás következnék be; előnyösek a körülbelül 50 t% koncentrációjú gélek. Polimer gélek kialakításához olyan monomereket kell alkalmazni, melyek az izomerázzal elektrosztatikus és hidrogénkötéseket tudnak képezni, mint például: nátrium-akrilát, nátrium-metakrilát, akril-amid- vagy hidroxi-etil-metakrilát.

A gélekbe történő beépítéssel végzett stabilizálásra példák találhatók a következő forrásokban: Martinék és munkatársai, Biophys, Acta 485, 13—28 (1977); Kulys és munkatársai, J. Soiid Phase Biochem., 3, 95— 105 (1978).

Az izomeráz kimerevítésének harmadik módszere az intramolekuláris térhálósítás, ami kellőképpen megnövelheti a hőstabilitást.

Ilyen stabilizálásra példák találhatók a következő leírásokban: Torchilin és munkatársai (Biophys. Acta, 522, 277—283 (1978)), Martinék és munkatársai (J. Solid Phase Biochem, 2, 343—85 (1977)), valamint Torchilin és munkatársai (Biophys. Acta, 568, 1 — 10 (1979)).

A találmány szerinti eljáráshoz megfelelő térhálósítószerek az olyan bifunkciós vegyületek, melyek reagálni képesek az enzimmolekulá felületén elhelyezkedő funkciós csoportokkal. Ezek a funkciós csoportok többnyire aminocsoportok, mégpedig általában olyan primer aminocsoportok, melyek reak* dóba léphetnek egy sor olyan funkciós csoporttal, mint például karboxilsav, szulfonil-halogenid, aldehidek, izocianátok, propiolátok, stb.

A térhálósítószerek tehát lehetnek dikarboxilsavanhidridek, mint például szukcinsavanhidrid vagy adipinsavanhidrid; a megfelelő dialdehidek, mint például glioxál, szukcinaldehid vagy glutáraldehid; telítetlen vegyületek, mint például akrolein vagy krotonaldehid, diol-propiolátok, mint például etilén-glikol-biszpropiolát, propilén-glikol-biszpropiolát, vagy hexametilénglikol-biszpropiolát; továbbá diszulfonil-halogenidek, mint például benzol-1,3-diszulfonil-klorid, naftalin-1,5-diszulfonil-klorid vagy tolil-2,4-diszulfonil-klorid.

Továbbá, minthogy az enzim tartalmazhat aminokkal szemben reakcióképes savas csoportokat — vagy átalakíthatjuk oly mó7

-713 dón, hogy ilyeneket tartalmazzon — bifunkciós aminok is alkalmazhatók térhálósítószerként a találmány szerinti eljárásban. Ezek lehetnek például legfeljebb 12 szénatomot tartartalmazó diaminok, például fenilén-diamin, butilén-diamin, oktilén-diamin, pentilén-diamin, etilén-diamin vagy dodecilén-diamin.

A térhálósítószer mennyisége széles határok között változhat: az enzim és a térhálósítószer aránya körülbelül 0,1-től körülbelül 0,0001-ig terjedhet. A szükséges kötés kialakításának módját bizonyos mértékig meghatározza' a választott térhálósítószer és az enzim minősége. A reagenseket általában valamely inért oldószerben oldjuk, és a reakciót célszerűen alacsony hőmérsékleten hajtjuk végre, hogy elkerüljük az esetleg hőérzékeny enzimre gyakorolt káros hatásokat. Általában előnyösek a szobahőmérsékleten vagy annak közelében lejátszódó reakciók, reakcióközegként pedig vizet vagy víztartalmú oldószereket alkalmazunk.

Amellett, hogy az enzimmolekulára polimerizálható vinilcsoportokat szubsztituálunk, majd a fent leírt módszerekkel polimerizáljuk, a molekula stabilizálásának egy másik módszere abból áll, hogy. valamely előre kialakított (preformált) polimert kondenzálunk az izomerázzal, intermolekuláris kovalens kötések kialakítása útján. Az enzim stabilizálását biztosító peptidkötések kialakításához az izomerázt például polipeptidekkel — mint például a természetben előforduló fehérjék vagy azok hidrolízistermékei — reagáltathatjuk az ismert módszerek alkalmazásával. Az így előállított termékek lehetnek vízoldhatók, de térhálósítószerekkel, például glutáraldehiddel vízben oldhatatlanná tehetjük őket, s az így kapott térhálósított enzimrendszer általában még stabilabb. A peptidképző reakciókat ismert módszerekkel, például karbodiimidek alkalmazásával hajtjuk végre.

Kívánt esetben az eredeti enzim átalakítható az előzetesen előállított (preformált) molekulával való kondenzálás céljára oly módon, hogy az ehhez szükséges funkciós csoportot bevisszük az enzimmolekulába. Például karboxicsoportot úgy vihetünk be egy szabad aminocsoportot tartalmazó enzimbe, hogy azt valamely dikarbonsavval reagáltatjuk, s így karboxicsoportot tartalmazó enzimmé alakítjuk át.

A fenti módszerhez előre kialakított polimerként felhasználhatunk bármely olyan polimert, mely az elvégzendő reakcióhoz megfelelő mennyiségű és minőségű funkciós csoportot — például amino- vagy karboxicsoportot — tartalmaz. Előnyösen alkalmazhatók a polipeptidek, például a természetes fehérjék — mint például citozán, élesztő-fehérje, stb. — valamint ezek keverékei, továbbá az aminocsoportot tartalmazó polimerek, például a polietilén-imin. Az előnyösen alkalmazható előre kialakított polimerek rendszerint vízoldható termékeket képeznek, ezeket előnyösen oldhatatlanná alakítjuk át oly 8 módon, hogy .például glutáraldehiddel vagy a fent leírt egyéb térhálósítószerek valamelyikével reagáltatjuk.

Az enzim módosítására fent leírt módszerek mindegyikében alapvetően fontos, hogy biztosítsuk a megfelelő eredmény eléréséhez szükséges mennyiségű funkciós csoport — például amno- vagy karboxicsoport — jelenlétét.

Mikor kiválasztjuk az előre kialakítandó polimert, melyet az enzimmel reagáltatni fogunk, szükséges, hogy az tartalmazzon olyan csoportokat, melyek az enzimmolekulában található csoportokkal reakcióba lépnek. Ha például az enzimre szabad aminocsoportok találhatók, akkor olyan proteint választunk, mely szabad karboxicsoportokat tartalmaz. Továbbá a választott reagensek sok reakcióképes csoportot kell tartalmaznia, hogy az enzimmolekulához több ponton kapcsolódva jelentős mértékben növelje a stabilitást. A technikában jól ismertek a különböző reagensek reakcióképes csoportjainak mennyiségi és minőségi meghatározására szolgáló módszerek.

Még egy módszert említünk az enzim hőstabilitásának növelésére, mely abból áll, hogy a felületet kémiailag megváltoztatjuk az aktivitás észlelhető csökkenése nélkül. Például a felületi aminocsoportok amidinezésével (Ludwig, M.L. és Hunter.M.J. Meth. Enymol. 11, 595—604 (1967)) vagy guanidinezésével (Kimmel, J.R., Meth. Enzytnol. 11, 584—589 (1967)) az arginihez nagyon hasonló szubsztituenseket állíthatunk elő. Tej-dehidrogenáz és más fehérjék stabilizálásának leírása megtalálható az alábbi közleményekben: Tuengler, F. és Pfleiderer, G., Biochem Biophys. Acta, 284, 1—8 (1977); Minotani, N. és munkatársai Biochim. Biophys. Acta, 581, 334—341 (1979); valamint Cupo, P. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 225,10828—10833 (1980).

Az oldható izomeráz készítmény aktivitását a Lloyd és munkatársai (Cereal Chemistry, 49, No. 5, pp. 544—553 (1972)) által leírt módszer alapján határoztuk meg. Egy IGIU az izomeráznak az a mennyisége, mely pH=6,85-őn (0,2 M nátriüm-maleát), 60°C-on, percenként 1 mikromól glükózt alakít át fruktózzá egy olyan oldatban, mely literenként 2 mól glükózt, 0,02 mól magnézium-szulfátot és 0,001 mól kobalt-kloridot tartalmaz.

Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás illusztrálására szolgálnak.

1. Példa

Ez a példa egy glükóztartalmú oldat — lényegében kukoricakeményítő-hidrolizátum — közvetlen izomerizálását mutatja be, melyben kétfázisú izomerizációs eljárást alkalmazunk szárazanyagra számítva 55,5 t% fruktózt tartalmazó készítmény előállítása céljából. Először alacsony hőmérsékletű izomerizálást hajtunk végre 70°C-on, majd a reakció terméket bevezetjük egy második, magas hő-8HU 199562 Β mérsékletű reaktorba (105,2°C), mely kémiailag stabilizált izomerázt tartalmaz. Az izomerázt úgy stabilizáljuk, hogy kovalens kötéssel egy oldható polimerhez kapcsoljuk, majd oldhatatlanná alakítjuk, hogy rögzített katalizátort kapjuk.

A hidrolizátumot kukoricakeményítőből állítjuk elő a 3,644,126 és a 3,280,006 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint (elfolyósítás illetve elcukrosítás). Az elcukrosított folyadékot a 3,834,940 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint finomítva, szárazanyagra számítva 95,3 t% glükóztartalmú terméket kapunk. Ehhez annyi kristályos glükózt adunk, hogy a glükóztartalom szárazanyagra számítva

97,6 t%-ra növekedjék, fgy az alábbi összetételű oldatot kapjuk:

összes szárazanyag (t%)

Glükóz (t%, szárazanyagra)

Fruktóz (t% szárazanyagra)

Poliszacharid (t% szárazanyagra)

Pszikóz (t% szárazanyagra)

Nátrium-hidrogénszulfát (mM) Magnézium-szulfát (mM)

Kobalt-klorid (mM)

PH

Az alacsony hőmérsékletű izomerizálást 70°-on végezzük oly módon, hogy a fenti tápoldatot 3,2 ml/perc sebességgel vezetjük át az alacsony hőmérsékletű reaktoron. Az alacsony hőmérsékletű (70°C-os) izomeráz-reaktort úgy állítjuk össze, hogy egy 2,5 cm átmérőjű, be- és kivezető nyílással, valamint a termosztátból jövő víz cirkuláltatására szolgáló köpennyel felszerelt üvegcsövet megtöltünk DEAE-cellulózon megkötött izomerázzal, melyet a 3,788,945 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint állítunk élő.

50,2

97,6

0,0

2,4

0,0

50,0

5,0

0,1

6,8

A töltés feletti üreg egy hőmérőt tartalmaz, ezen kívül pedig — amennyiben ez célszerű — üveggyönggyel töltjük ki, hogy a holtteret minimálisra csökkentsük. A reaktor 20 000 IGIU-nak megfelelő kötött izomerázt tartalmaz, a töltet 15 cm hosszúságú. A reaktorból távozó első 1 000 ml-t elöntjük. Az ezután távozó folyadékot összegyűjtjük a második, magas hőmérsékletű izomerizálási szakaszhoz.

A magas hőmérsékletű reaktorhoz a kémiailag stabilizált katalizátort a következőképpen állítjuk elő:

Egy, az S. rubigenosus ATCC 21175-ből származó Streptomyces rubigenosus fajt tenyésztünk víz alatti aerob fermentálással, az alábbi táptalajon:

dextróz kukorica-csávalé diammónium-foszfát magnézium-szulfát tömeg^

1,6 (szárazanyag) 0,08 0,06 habzásgátló (Pluronic PL-61) 0,003

A közeget 121’C-on 45 percig sterilizáljuk, majd lehűtjük, és a pH-ját 6,8—7,0-re állítjuk be. Ezután beoltjuk egy 14 térfogatszázalékos oltóanyaggal, melyet a fent említett S. rubigenous változatból oltóanyag-fermentorban állítottunk elő. Az erjesztést aszeptikus körülmények között 30°C-on, körülbelül 60 órán át végezük 0,65 térf/térf/perc szellőztetéssel. Az S. rubigenosust felhasználhatjuk oltásra és izomeráz előállítására is, ez esetben az alábbi összetételű közeget alkalmazzuk:

tömeg% dextróz kukorica-csávalé szorbitol kobalt-klorid diammónium-foszfát xilóz

0,24

1,5 (szárazanyag) 1,6

0,02

0,56

1,0

A glükóz-izomerázt úgy extraháljuk az S. rubigenosus ból, hogy 0,35 i% . Maquat MC 1412 jelű kationos felületaktív-szert (Mason Chemical Co.) és 10 ppm tyúktojás-lizozim enzimet adunk hozzá, majd 5 órán át, 40°C-on, pH=6,3—6,6-os értéken keverjük. A keveréket leszűrve megkapjuk a nyers, tisztítatlan izomeráz enzimet.

A nyers izomerázt úgy tisztítjuk, hogy (a 3,823,133 számú, egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint előállított) DEAE-cellulózon adszorbeáljuk, leszűrjük, a szennyezések eltávolítása céljából 0,1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd 0,45 mólos nátrium-klorid-oldattal deszorbeáljuk. A tisztítási lépések során minden oldat pH-ját 7,5-es értéken tartjuk. Az így kapott, részlegesen megtisztított izomeráz-oldatot 0°C-on 3 térfogatrésznyi 95 t%-os etanollal kezeljük, így kicsapódik az izomeráz. A szűrés elősegítésére perlitet adunk hozzá, a szilárd anyagot szűréssel és levegőn történő szárítással nyerjük ki, így megkapjuk a vízoldható izomeráz-készítményt, mely 2500 IGIU/g hatóanyagot tartalmaz.

A tisztított izomerázt 1 mM töménységű mangán-klorid-oldatban, szobahőmérsékleten feloldva 10 mg/ml izomerázt tartalmazó oldatot kapunk, majd ezt a szűrési segédanyag eltávolítása céljából leszűrjük. A készítmény specifikus hatóanyag-koncentrációja 37,3 IGÍU/mg protein.

Az oldható poliamin oldatát úgy kapjuk, hogy 39,0 g citozánt (Kytex, a Hercules Inc. cégtől, Wilmington, Delaware 19899) 13 liter 0,08 N sósavban oltfunk. A citozán feloldása után az oldatot 380 g nátrium-klorid hozzáadásával nátrium-kloridra nézve 0,5 mólossá tesszük, majd 8 N nátrium-hidroxiddal beállítjuk a pH-ját 6,15-re. Végül a citozánoldatot Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük a nem oldódó anyagok eltávolítása céljából.

-9nu 133ÜUZ D

A 13 liter, 6,15-ös pH-jú, 0,5 M nátrium-klorid mellett 0,3 t% citozánt tartalmazó oldathoz a következőő anyagokat adjuk: 100 ml,

100 0000 IGIU aktivitású oldható izomeráz,

197,6 g xilitol (a Sigma Chemical Co. terméke) és 0,619 g CoC1₂«6H₂O. Az így kapott oldatot 2 órán át keverjük, majd 6,24 g 1-etil-3-dimetil-amino-propil-karbodiimidet (sigma Chemical Co.) adunk hozzá, hogy a citozán aminocsoportjai és az izomeráz karboxilcsoportjai között több ponton kovalens kötés jöjjön létre. A keveréket szobahőmérsékleten 2-órán át állni hagyjuk, majd 15,6 ml 50 tömeg%-os glutáraldehidoldatot (Eastman Kodak) — melynek pH-ját 8 N nátrium-hidroxiddal 6,0-ra állítottuk be — adunk hozzá, hogy lejátszódjék az a reakció, mely a kovalens kötésű izomeráz-citozán-komplexet oldhatatlanná alakítja. 15 perc múlva 2 liter 1 M-os, pH=8-as foszfátoldatot adunk hozzá, hogy megkönnyítsük a glutáraldehid hozzáadásával kialakított gél megtörését. A kapott oldhatatlan izomeráz-citozánt Büchner-vákuumszűrőn ionmentesített vízzel átmossuk. Ez a készítmény azután egy éjszakán át levegőn, szobahőmérsékleten állni hagyjuk, és az 1,41 mm és 0,25 mm lyukbőségű sziták közötti mérettartományt elválasztjuk belőle. A száraz katalizátor aktivitása 384 IGIU/g.

A 105',2°C-os reaktort a következő módon készítjük: A katalizátorból 13 g-ot szuszpendálunk a szubsztrátumban, és laboratóriumi vákuummal szobahőmérsékleten 60 perc alatt légtelenítjük. A légtelenített szuszpenzióból 1,5X20 cm méretű töltetet készítünk egy

1. Táblázat köpennyel ellátott üvegcsőben. A megtöltött üvegcső 4992 IGIU aktivitású katalizátort tartalmaz.

A 70°C-on első fázisú izomerizálással ka5 pott szubsztrátum pH-ját 6,75-re állítjuk be, és 42,0 t% szárazanyagtartalmúra hígítjuk. Ezt a szubsztrátumot azután 60°C-os hőmérsékleten 7· 10* Pa túlnyomással és 1,96 ml/ /perc sebességgel 30 percen át keringtetjük a magas hőmérsékletű reaktoroszlopban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet felett elhelyezett — hőmérő mutatja, melyet 0,5 cm-es üveggyöngyökkel veszünk körül, hogy a holtteret a lehető legkisebbre ₁₅ csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét ezután gyorsan növeljük a köpenyben cirkuláltatott olajjal, melyet 106°C-os fürdőben termosztálunk.

Az oszlopból elvezetett folyadékot regiszt20 ráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58 t% közötti fruktóztartalomra van beállítva. Miután az oszlop hőmérséklete elérte a 105,2°Cot, és mikor az elvezetett folyadék fruktóztartalma elérte a kívánt szintet, a folyadékot összegyűjtjük, és jégfürdőben azonnal lehűtjük. A pH-t 1 mólos citromsavval 4,90-re állítjuk be. Az elvezetett folyadékot addig gyűjtjük, míg a fruktóztartalom 55 t% alá nem csökken.

3q A 70°C-os és á 105,2°C-os reaktorban kapott izomerizált oldatokat szénhidrát-összetétel és szín szempontjából elemezzük, és az eredményeket összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldatokon végzett hasonló elemzések eredményeivel. A kapott értékek az alábbi (1.) táblázatban láthatók.

A 70 °C-on és 105 °C-on izomerizált tápoldatok összetétele

Szénhidrát-összetétel Szín (tönieg% hamumentes szárazanyagra számítva)

Az oldat kezelése Fruktóz Glükóz Pszikóz Poliszacharid (CIRFxlOO)

Izomerizálatlan	0	97,6	0	2,4	0,5
70 °C-on izomerizált	51,3	46,4	0	2,3	0,7
105 °C-on izomerizált	55,5	41,6	0,3	2,6	14,1

Az eredmények azt mutatják, hogy 55,51%os fruktóztartalmat értünk el, miközben a pszikóztartalom szárazanyagra számítva 0,4 tömeg% alatt maradt, az elszíneződés pedig kisebb, mint 2 (CIRFX100).

A szénhidrát-tartalmat az E-61, a szint pedig az F-14 módszerrel (Standard Analytical Methods of the Member Companies and the Corn Refiners Association, Corn Re⁶⁵ finers Association Inc.; 1001 Connecticut

-10HU 199562 Β

Avenue, Washington, D.C. 20036) határoztuk meg. Az F-14-gyel kapott színérték százszorosa adja a CIRFX100 értéket.

2. Példa ₅

Ez a példa egy finomított kukoricakeményítő-hidrolizátumból és kristályos glükózból álló oldat magas hőmérsékleten végzett közvetlen izomerizálását mutatja be, melynek célja a szárazanyagra számítva 55,2 t% fruk- 10 tózt tartalmazó készítmény előállítása. Kétfázisú eljárással dolgozunk, úgy, hogy az izomerizálás .második fázisában kémiailag stabilizált glükózt alkalmazunk, mely glükóz-izomeráznak és polietilén-iminnek glutáraldehides kezeléssel oldhatatlanná tett komplexéből áll.

A stabilizált izomeráz előállítása

Oldható glükóz-izomerázt készítünk az 1. 20 példában leírt módon. A tisztított izomerázt szobahőmérsékleten annyi 1 mM mangán-klorid-oidatban oldjuk, hogy milliméterenként 9 mg izomerázt tartalmazó oldatot kapjunk, majd a keveréket a szűrési segédanyag el- 25 távolítása céljából leszűrjük. Az enzim oldatának 300 ml-éhez 60 ml 10 tömeg/térf.%-os ΡΕΙ-6-ot (polietilén-imin, mólsúlya 66, pH =8, a Dow Chemical Co. terméke) és 3 g xilitolt adunk, majd az oldatot 15 percen át keverjük. Az oldhatatlanná tett enzimet le- ⁴⁰szűrjük, vízzel mossuk és egy éjszakán át 37°C-os légcirkulációs szárítószekrényben szárítjuk. Szárítás után 12,8 g kötött izomerázt kapunk, melynek aktivitása 775 IöIU/ /g. A kötött enzimből 12 g-ot szuszpendálunk a tápoldatban, ezt vákuummal 60 perc alatt légtelenítjük szobahőmérsékleten, majd felhasználjuk egy 1,5 cm átmérőjű magas hőmérsékletű reaktor elkészítéséhez.

2. Tábláz

A tápoldatot a kétfázisú izomerizálás első fázisú reaktorában készítjük el az 1. példában leírt módon. A tápoldat összetétele itt a következő:

összes szárazanyag (t%) 42,6

Glükóz (t%, a szárazanyagra) 46,4

Fruktóz (t%, a szárazanyagra) 51,3

Poliszacharid (t%, a szárazanyagra) 2,3

Pszikóz (t%, a szárazanyagra) 0,0

Nátrium-hidrogénszulfát (mM) 0,0

Magnézium-szulfát (mM) 50,0

Kobalt-klorid (mM) 0,1 pH 6.75

A tápoldatot 60°C-on, körülbelül 5 ml/ /perc sebességgel 45 percig keringetjük a reaktorban. Ezután az oszlop hőmérsékletét 101,6°C-ra emeljük, az áramlási sebességet pedig 2 ml/percre csökkentjük. A szubsztrát felforrásának megakadályozására 8,4· 10⁴ Pa túlnyomást alkalmazunk. Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58 t% közötti fruktóztartalomra van beállítva. Az elvezetett folyadéknak azt a részét, melyben a fruktóztartalom meghaladja az 55 t%-ot, jégfürdőben összegyűjtjük, pH-ját 1,0 mólos citromsavoldattal 4,0-ra állítjuk be.

A magas hőmérsékletű és az első fázisú reaktorból elvezetett oldatokat, valamint az eredeti, glükóztartalmú oldatot szénhidrát-összetétel és szín szempontjából elemezzük. Az eredmények az alábbi 2. táblázatban láthatók:

Az első és második fázisú izomerizálásfeal kapott oldatok összetétele

Szénhidrát-összetétel Szín , 105)59¾ hamumentes szárazanyagra

Az*oldat kezelése	számítva/	/CIRP X100/
Fruktóz	Glükóz	Pszikóz	Poliszaehartd
Izomerizálatlan	0	97,6	0	2,4	0,5
70 °C-on izomerizált	51,3	46,4	0	2,3	0,7
101,6 °C-on izomert-
zált	55,2	42,1	0	2,7	51,7

nu 133ÜUÍ υ

Az eredmények azt mutatják, hogy 55,21% os fruktóztartalmat érünk el, miközben a pszikóztartalom szárazanyagra számítva 0,2 tömeg% alatt marad.

3. Példa

Ez a példa 57,2 t% fruktóztartalom eléréséig végzett közvetlen glükóz-izomerizálást miftat be, kétfázisú eljárással, ahol az első reaktor 70°C-on, a második (magas hőmérsékletű) reaktor pedig 110,4°C-on működik. A magas hőmérsékletű reaktorban olyan, kémiailag stabilizált enzimet alkalmazunk, melyet kovalens kötéssel egy oldható polimerhez kapcsoltunk, majd rögzített katalizátor előállítása céljából oldhatatlanná alakítottunk.

A tápoldat összetételének és az első fázisú reaktorban 70°C-on végzett átalakításának leírása megtalálható az 1. példában.

A magas hőmérsékletű reaktorban, 11,4°Con alkalmazott rögzített katalizátort ugyancsak az 1. példában ismertettük.

A 110,4°C-os reaktort a következő módon készítjük: a katalizátorból 24 g-ot szuszpendálunk a tápoldatban, majd a szuszpenziót laboratóriumi vákuummal szobahőmérsékleten 60 perc alatt légtelenítjük. A légtelenített szuszpenzióból 2,5 X 12,4 cm-es töltetet készítünk egy köpennyel ellátott üvegcsőben. A töltet 10,885 IGIU aktivitású.

Az első fázisú, 70°C-es izomerizálással előkészített táptalaj pH-ját 6,47-re állítjuk be, majd 42,0 t% szárazanyagtartalomra hígítjuk. Ezt a táptalajt 60°C-on 8,4 · 10⁴ Pa túlnyomással, 3,38 ml/perc sebességgel 30 percen át keringetjük a magas hőmérsékletű reaktorban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet felett elhelyezett — hőmérő mutatja, melyet 0,3 cm-es üveg10 gyönggyel veszünk körül, hogy a holtteret a lehető legkisebbre csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét ezután gyorsan növeljük a köpenyben cirkuláltatott olajjal, melyet 11 l°C-os fürdőben termosztálunk.

Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58 t% közötti fruktóztartalomra van beállítva. Miután az oszlop hőmérséklete elérte a 110,4*C-ot, és az elvezetett folyadék fruktóz20 tartalma elérte a kívánt szintet, a folyadékot összegyűjtjük, és jégfürdőben azonnal lehűtjük. A pH-t 1 mólos citromsavval 4,0-ra állítjuk be.

A 70°C-os és a 110,4°C-os reaktorban kapott izomerizált oldatokat szénhidrát-összetétel és szín szempontjából elemezzük, és az eredményeket összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldaton végzett hasonló elemzések

3q eredményeivel, amint az a 3. táblázatban látható.

3. Táblázat

A 70 °C-on és a 110,4 °C-on izomerizált tápoldatok összetétele

Szénhidrát összetétel Szín

	törne9’/° hamumentes szárazanyagra	/CIHP
számítva/
Az oldat kezelése	Pruktóz	Glükóz	Pszikóz	Polisza-	X100/
				charid
Izomerizálatlan	0	99,2	0	0,8	0,6
70 °C~on izomerizált	52,3	46,9	0	0,8	0,7
110,4 °C-on izomerizált	57,2	41,5	0,3	1,0	19,8

Az eredmények azt mutatják, hogy 57,2 t%os fruktóztartalmat értünk el, miközben a szárazanyagra számított pszikóztartalom 0,4 tömeg% alatt maradt, az elszíneződés pedig kisebb, mint 20 (CIRFX100).

4. Példa

Ez a példa egy lényegében finomított kukoricakeményítő-hidrolizátumból álló glükóz12 tartalmú oldat közvetlen izomerizálását muθθ tatja be, melynek során kétfázisú izomerizálással (szárazanyagra számítva) 56,3 t%.os fruktóztartalmú készítményt állítunk elő. Először alacsony hőmérsékletű izomerizálást hajtunk végre 70°C-on, majd e reakció termékét bevezetjük egy második, magás hő®⁵ mérsékletű (103,3°C-os) reaktorba, mely ké-12HU 199562 Β· miailag stabilizált izomerázt tartalmaz. A kémiailag stabilizált izomerázt úgy állítjuk elő, hogy az enzimet valamilyen (például élesztőből származó) védőfehérjével reagáltatjuk.

Az alacsony hőmérsékletű izomerizálási lépést — beleértve a tápoldat és a kísérleti körülmények leírását is — az 1. példában ismertettük.

A magas hőmérsékletű reaktorban alkalmazott, kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz enzimet a következő módon állítjuk elő: A kémiai stabilizáláshoz az oldható glükóz-izomeráz enzimet az 1. példában leírt módon állítjuk elő és tisztítjuk. E készítmény aktivitása körülbelül 40 IGIU/mg protein. A védőfehérjét sütőélesztőből állítjuk elő a következőképpen: 1229 g nedves sütőélesztő-masszához 1000 g vizet és 500 g toluolt adunk. A keveréket egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 85°C-ra melegítjük, és körülbelül 30 percen át ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután a keveréket Büchner-tölcséren leszűrjük. A toluol csaknem teljes mennyiségben visszamarad az oldhatatlan sejttörmelékben, és a vizes szűrlet tartalmazza az oldható élesztő-extraktumot. A vizes szűrletet forgó bepárlóban, 40°-on 267 g-nyira pároljuk be, majd keverés közben 41 g triklór-ecetsavat adunk hozzá. A kicsapódott élesztőfehérjét összegyűjtjük, majd 0,1 mólos (pH=7,0) nátrium-foszfát pufferoldatban ismét feloldjuk. Az oldatot szűréssel történő tisztítás után 900 ml (kb. 3-szoros térfogatú) acetonnal kezeljük. A csapadékot összegyűjtjük, 0,01 mólos (pH=7,0) nátrium-foszfát pufferoldatban oldjuk, majd a kapott oldatot 0,01 mólos nátrium-foszfát pufferoldattal dializáljuk. Az így kapott terméket (150 ml) sűtőélesztőből előállított védőproteinnek nevezzük. 0,6 t%-os citozánoldatot készítünk úgy, hogy 24 g citozánt (Kytex, a Hercules Inc. cégtől, Wilmington, Delaware) 41iter 0,08 N sósavban oldunk. Az oldat pH-ját 8 N nátrium-hidroxiddal beállítjuk 6,2-re, Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük, majd 16 liter ionmentesített vízzel dializáljuk. 400 ml-es főzőpohárba körülbelül 100 000 IGIU oldott (szűrési segédanyaggal kevert) glükóz-izomeráz enzimet, 1 g xilitolt és 100 ml (2/3), sütőélesztőből előállított védőfehérjét teszünk. Hozzáadunk még 2,4 mg MgSO₄-7H₂O-t és 24 mikroliter moláris kobalt-klorid-oldatot. A keveréket a szűrési segédanyag eltávolítása céljából leszűrjük, 2 literes lombikban 40°C-on, forgó bepárlóban csaknem szárazra pároljuk, majd pH=6,5-re beállított glutáraldehid-ol5 datból 640 mikrolitert adunk hozzá. A keveréket egy éjszakán át hideg helyen tároljuk. Ezután a gélt eltávolítjuk a lombikból, 0,55 mm lyukbőségű szitán átnyomjuk, majd szárítószekrényben körülbelül 37°G-on meg10 szárítjuk. A száraz enzimkészítmény poros részét 0,177 mm lyukbőségű szitával eltávolíjuk, a kapott 8,9 g végterméket használjuk a magas hőmérsékletű izomerizáláshoz.

A 103,3°C-os reaktort a következőképpen készítjük: A fenti (8,9 g) glükóz-izomeráz készítményt tápoldatban szuszpendáljuk, majd laboratóriumi vákuummal, szobahőmérsékleten 30 percen át légtelenítjük. A légte20 lenített szuszpenzióból 1,5X29 cm-es töltetet készítünk egy köpennyel ellátott üvegcsőben.

A 70°C-os első fázisú izomerizálással kapott tápoldat pH-ját 6,75-re állítjuk be, majd 42,0 t% szárazanyagtartalomra hígítjuk.

Ezt a táptalajt azután 60°C-on, körülbelül 1,5 ml/perc sebességgel 30 percen át,keringetjük a magas hőmérsékletű reaktoroszlopban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet felett elhelyezett — hőmérő mutatja, melyet 0,5 cm-es üveggyöngyökkel veszünk körül, hogy a holtteret a lehető legkisebbre csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét ezután gyorsan növeljük a köpenyben cirkuláltatott olajjal, melyet 104°C-os fürdő35 ben termosztálunk.

Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58% közötti fruktóztartalomra van beállítva. A körülbelül 5 ml-es frakciókat addig gyűjtjük, míg a fruktóztartalom eléri vagy meghaladja az 55 t%-ot, és ezen a ponton a kísérletet befejezzük. A minták gyűjtése során az elvezetett folyadékot jégfürdőben azonnal lehűtjük, és 0,1 moláris citromsav, majd pedig híg sósavoldat hozzáadásával 4,0-re állít4$ juk be a pH-ját.

A 70°C-os és a 103,3°C-os reaktorban kapott izomérizált oldatokat szénhidrát-összetételre és színre elemezzük, és az eredmé₅₀ nyékét összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldatban végzett hasonló elemzések eredményeivel, amint az az alábbi 4. táblázatból látható.

-1325 nu lyyooz o

4« Táblázat

A 70 °C-on és a 103,3 °C-on izomériáéit tápoldatok összetétele

Szénhidrát összetétel	Szín /CIRP X100/
Az oldat kezelése	tömeg.% hamumentes szárazanyagra számítva/
Fruktóz	Glükóz	Pszikóz Poliszacharid
Izoraerizálatlan	0	97,6	0 2,4	0,5
70 °C-én izomerizált	51,3	46,4	0 2,3	0,7
103,3 °C-oh izomert-
zált	56,3	41,5	0,1 2,2	34,0

Az eredmények azt mutatják, hogy £6,3 t% fruktóztartalmat értünk el, miközben a pszikóztartalom — szárazanyagra számítva — 0,2 tömeg% alatt maradt.

5. Példa

Ez a példa egy lényegében kukoricakeményítő-hidrolizátumból álló, glükóztartalmú, alacsony sókoncentrációjú oldat közvetlen izomerizálását mutatja be kétfázisú eljárással, szárazanyagra számítva 55,4 t% fruktóztartalmú készítmény előállítása céljából. Először 70°C-on alacsony hőmérsékletű izomerizálást hajtunk végre, majd e reakció termékét bevezetjük a második, magas hőmérsékletű reaktorba (112,6°C), mely kémiailag stabilizált izomerázt tartalmaz. A kémiailag stabilizált izomerázt úgy állítjuk elő, hogy az enzimet több ponton, kovalens kötésekkel egy oldható polimerhez kapcsoljuk, majd oldhatatlanná alakítjuk, hogy megkapjuk a kötött katalizátort.

A hidrolizátumot kukoricakeményítőből állítjuk elő a 3,644,126 és 3,280,006 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett módszerekkel (elfolyósítás, illetve elcukrosítás). Az elcukrosított folyadékot a 3,843,940 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint finomítva olyan terméket kapunk, mely szárazanyagra számítva 93,8 t% glükózt tartalmaz. Megfelelő menynyiségű kristályos glükóz hozzáadásával az összes glükóztartalmat (szárazanyagra számítva) 96,9 t%-ra növeljük. Az így kapott oldat összetétele a következő lesz:

összes szárazanyag (t%) 50,3

Glükóz (t%, szárazanyagra) 96,9

Fruktóz (t%, szárazanyagra) 0,1

Poliszacharid (t% szárazanyagra) 3,1

Pszikóz (t%, szárazanyagra) 0,0

Nátrium-hidroszulfát (raM) 2,5

Magnézium-szulfát (mM) 2,5

Kobalt-klorid (mM) 0,1 pH 6,8

Az alacsony hőmérsékletű izomerizálást 70°C-on végezzük oly módon, hogy a fenti tápoldatot 2,5 ml/perc sebességgel keringetjük az alacsony hőmérsékletű reaktorban az 1. példában leírt módon. A reaktorból távozó első 1000 ml folyadékot elöntjük. Az ezután távozó folyadékot összegyűjtjük a második, magas hőmérsékletű izomerizáláshoz.

A magas hőmérsékletű reaktorban használt, kémiailag stabilizált katalizátort a következőképpen készítjük: Az oldható izome40 rázt az első példában leírt módon állítjuk elő és tisztítjuk. E készítmény aktivitása körülbelül 40 IGIU/mg. Az oldható polimer oldatát úgy készítjük, hogy 48,4 g citozánt (poliamin, Kytex, a Hercules Inc. cég termé4₅ ke, Wilmi-ngton Delavare 198999) 15 liter 0,08 N sósavban oldunk. 438 g nátrium-klorid hozzáadásával a citozánoldatot nátrium-kloridra nézve 0,5 mólossá tesszük, majd 6,1-re állítjuk be a .pH-ját 8 N nátrium-hid50 roxid-oldat hozzáadásával. Ezután a nem oldódó anyagok eltávolítása céljából az oldatot Whatman 3-as szűrőpapíron leszűrjük. A citozánra 0,3 t%-os, nátrium-kloridra 0,5 mólos, 6,1 pH-jú oldathoz a következő anya55 gokat adjuk: 520 ml oldható izomeráz, mely körülbelül 602 000 IGIU aktív anyagot tartalmaz, 236 g xilitol (Sigma Chemical Co.) és 3,07 g MnCl₂-4H₂O. Ezt az oldatot 2 órán át keverjük, majd 7,44 g l-etil-3-dimetil-amÍqq no-propil-karbodiimidet (Sigma Chemical Co.) adunk hozzá, hogy az izomeráz karboxilcsoportiai és a citozán aminocsoportjai között több ponton kovalens kötések alakuljanak ki. 2 óra elteltével szobahőmérsékleten 15,5 ml 50 tömeg%-os glutáraldehid-ol⁶⁵ datot (Eastman Kodak Chemical Co.) adunk

-14HU 199562 Β hozzá, melynek pH-ját 8 N nátrium-hidroxiddal 6,0-ra állítottuk. Ezzel a kovalens kötésű izomeráz-citozán komplexet oldhatatlanná tesszük. 15 perc múlva 4 liter 1 mólos pH= =8-as foszfátoldatot keverünk az oldhatatlan izomeráz-citozán komplexhez. A megkötött izomeráz-citozánt Whatman 3-as szűrőpapírt tartalmazó Büchner vákuumtölcséren ionmentesített vízzel mossuk. A készítményt levegőn megszárítjuk, megőröljük, majd kiválasztjuk Belőle az 1,41 és 0,25 mm lyukbőségű sziták közé eső mérettartományt. A száraz - katalizátor aktivitása 803 IGIU/g.

A 112,6°C-os reaktort a következőképpen készítjük: a katalizátorból 7 g-ot a tápoldatban szuszpendálunk, majd laboratóriumi vákuummal szobahőmérsékleten 60 percen át légtelenítjük. A légtelenített szuszpenzióból 1,0 X 40 cm-es töltetet készítünk egy köpennyel ellátott üvegcsőben. A töltet aktivitása 5621i IGIU.

Az első, 70°C-os izomerizálással előkészített táptalaj pH-ját 6,55-re állítjuk be, majd ionmentes vízzel 42,0 t% szárazanyagtartalomra hígítjuk. Ennek következtében a nátrium-hidroszulfát koncentrációja 2,1 mM-ra, a magnézium-szulfát pedig ugyancsak 2,1 mMra csökken. Ezt a táptalajt azután 60°C-os hőmérsékleten 7-10⁴ Pa túlnyomással és ml/perc sebességgel 10 percen át keringetjük a magas hőmérsékletű reaktor-oszlopban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet felett elhelyezett — hőmérő mutatja, ₅ melyet a beosztásig homokba ágyazunk, hogy a holtteret a lehető legkisebbre csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét ezután gyorsan növeljük a köpenyben cirkuláltatott olajjal, melyet körülbelül 114°C-on termosztálunk. Az oszlop hőmérsékletét 112,6°C-ra emeljük, az áramlási sebességet pedig 1,89 ml/percre csökkentjük.

Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58% közötti íruktóztartalomra van beállítva. Miután az oszlop hőmérséklete elérte a 112,6°Cot, az elvezetett folyadék fruktóztartalma pedig a kívánt szintet, a folyadékot összegyűjtjük, és 1 mólos citromsav hozzáadásá20 val a pH-ját azonnal beállítjuk 4,0-re. Az elvezetett folyadékot addig gyűjtjük, míg fruktóztartalma 55 t% alá nem csökken.

A 70°C-os és a 112,6°C-os reaktorban kapott izomerizált oldatokat szénhidra t-ősszeté25 tel re és szinre elemezzük, és az eredményeket összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldaton végzett hasonló elemzések eredményeivel, amint az az alábbi 5 táblázatban látható.

Σι táblázat

A 70 °C-os és a 112_t6a^oC~oe Izomerizálással kapott tápoldatok összetétele

Szénhidrát összetétel Szín tötnegft>hamumentes szárazanyagra

Az oldat kezelése	Fruktóz	számítva/	/0I5F X100>
Glükóz	Pszikóz Poliszeharid
Izomerizálatlan	0	96,9	0	3,1	O
70 °C-on izomerizált	51,4	45,9	0	2,7	0
112,6 °C-on izomerizált	55,4	42,0	0,1	2,5	8,5

Az eredmények azt mutatják, hogy 55,41%~ os fruktóztartalmat értünk el, miközben a pszikóztartalom szárazanyagra számítva 0,2 tömeg% alatt maradt, az elszíneződés pedig kisebb, mint 9 (CIRFXIOO).

6. Példa

Ez a példa egy lényegében finomított, kis sótartalmú kukoricakeményítő-hidroíizátumból álló oldat közvetlen izomerizáiását mutatja be. szárazanyagra számítva 54.8 t% fruktóztartalmú és igen alacsony (0,1 t%-nál kisebb) pszikóztartalmú szirup előállítása céljából, melynek színezése kisebb, mint 2 CIRFXIOO. Kétfázisú izomerizálási eljárást alkalmazunk, ahol az első (alacsony hőmér^w sékletü) reaktor 70°C-on, a második (magas hőmérsékletű) reaktor pedig 105,8°C-on működik. A magas hőmérsékletű reaktorban olyan stabilizált izomerázt használunk, melyet kovalens kötésekkel több ponton egy old⁰⁵ ható polimerhez kapcsoltunk, majd a megkö15

-15ttU 1»»OOZ D tött katalizátor előállítása céljából oldhatatlanná tettük.

A szubsztrátot és annak az első fázisú reaktorban, 70°C-on végzett konvertálását az 5. példában ismertettük.

A magas hőmérsékletű reaktorban, 105,8°Con az 5. példában leírt kötött katalizátort alkalmazzuk.

A 105,8°C-os reaktort a következőképpen készítjük: 5,63 g katalizátort tápoldatban szuszpendálunk, és laboratóriumi vákuummal szobahőmérsékleten 60 percen át légtelenítjük. A - légtelenített szuszpenzióból 1,0 X X32 cm-es töltetet készítünk egy köpennyel ellátott üvegcsőben. A töltet 4521 IGIU aktivitású.

Az első fázisú, 70°C-os izomerizálással előkészített tápoldat pH-ját beállítjuk 6,5-re, majd ionmentes vízzel 42,0 t% szárazanyagtartalomra hígítjuk, aminek következtében a magnézium-szulfát koncentrációja 2,1 mMra, a nátrium-hidroszulfáté pedig ugyancsak 2,1 mM-ra csökken. Ezt a tápoldatot azután 60°C-on, 0,68 atm túlnyomással és 8 ml/perc áramlási sebességgel 10 percen át keringet30 jük a magas hőmérsékletű reaktorban. Az oszlop hőmérsékletét egy — közvetlenül a töltet fölött elhelyezett — hőmérővel mérjük, melyet a beosztásig homokra süllyesztünk, hogy a holtteret a lehető legkisebbre csökkentsük. Az oszlop hőmérsékletét gyorsan növeljük a köpenyben cirkul áltatott olajjal, melyet olajfürdőben körülbelül I07°C-on temperálunk.

Az oszlopból elvezetett folyadékot regisztráló polariméterrel figyeljük, mely 50 és 58 t% közötti fruktóztartalomra van beállítva. Miután az oszlop hőmérséklete elérte a 105,8°Cot, az elvezetett folyadék fruktóztartalma pedig elérte a kívánt szintet, a folyadékot összegyűjtjük. A pH-t 1 mólos citromsavoldattal azonnal beállítjuk 4,90-re.

A 70°C-os és a 105,8°C-os reaktorból szár20 mázó izomerizált oldatokat szénhidrát-összetételre és színre elemezzük, és az eredményeket összehasonlítjuk az izomerizálatlan tápoldaton végzett hasonló elemzések eredményeivel, amint az az alábbi 6. táblázatban lát25 ható.

6. Táblázat

A 70 °C-on és a 105,8 °0-on izomerizált tápoldatok összetétele

Szénhidrát összetétel Szín tömeg*/, hamumente s szárazanyagra számítva/ /CIRF

Az oldat kezelése Fruktóz	Glükóz	Fszikóz	Poliszaoharid	X100,
Izomerizálatlan 0,1	96,9	0	3,1	0
70 °0—on izomerizált 51,4	45,9	0	2,7	0
105,8 °G~on izomerizált 54,8	42,3	0,1	2,8	1,8

Az eredmények azt mutatják, hogy 54,8 t% fruktóztartalmat értünk el, miközben a pszikóztartalom (szárazanyagra számítva) (0,1 t% alatt maradt, a színezés pedig (CIRFX100) kisebb 2-nél.

Az alábbi táblázat a b=antilog(4300/ 50 /T+273)-pH-3,23) egyenlet alapján számított és a példákban leírt eljárások során mért bomlási időket, valamint ezek kiszámításához szükséges egyéb adatokat tartalmazza.

Példaszám	1	2	3	4	5	6
Stabilizált izomeráz az oszlopon (s)	13,0	12,0	28,4	8,9	7,0	5,63
Oszlop átmérője (cm)	1,5	1,5	2,5	1,5	1,0	1,0
Oszlop magassága (cm)	20,0	12,4	29,0	40,0	32,0

-1631

HU 199562 Β

(folytatás)	4	5	6 -
Példaszám	1	2	3
Össztérfogat (ml)	35,3	kb.35	60,9	51,2	31,4	25,1
Enzimet nem-tartalmazó töltet térfogata (ml)	22,3	kb.23	32,5	42,3	24,4	19,5
Átfolyási sebesség (ml/perc)	1,96	2,0	3,38	1,5	8,n	8,0
Oszlop (reakció)hőmérséklete(°C)	105,2	101,6	110,4	103,3	112,6	105,8
Reakcióelegy pH-ja	6,75	6,75	6,47	6,75	6,55	6,50
Igénypont szerinti egyenletből kiszámítható maximális bomlási idő (perc)	24,5	31,5	32,8	28,0	23,5	41,8
A példák szerinti eljárásnál mért bomlási idő (perc)	11,4	11,5		28,2	3,0	2,4

Az enzimet nem tartalmazó töltet térfogatát az izomeráz tömegéből és a töltet dimenzióiból számoltuk ki. A „maximális bomlási idő“-t az oszlop pH és hőmérséklet értékeinek a fenti egyenletbe való behelyettesítésével, a „mért bomlási idő“-t pedig az átfolyási sebesség- és az enzimet nem tartalmazó töltet térfogat-értékéből számoltuk ki. A táblázat adatai mutatják, hogy a mért bomlási idő az 1—3., 5. és 6. példánál kisebb, a

4. példánál (mely eljárás során szintén megfelelő, azaz kismennyiségű szennyeződést tartalmazó szirupot állítottunk elő) azonos volt a maximális (számított) bomlási idővel. Következésképpen, a találmány szerinti eljárás során a számítottnál kisebb, bizonyos reakciókörülmények között azonos bomlási idő alkalmazásával megfelelő termék állítható elő.

Claims

1. Eljárás glükóznak az összeá szénhidráttartalomra számítva 53—60 t% fruktóztartalomig történő izomerizálására oly módon, hogy egy glükóztartalmú, előnyösen 30— 50 t% szubsztrátot 90—125°C hőmérsékleten, 5,5—7,5 pH értéken olyan glükóz-izomerá^zál hozunk érintkezésbe, mely kémiailag stabilizált, egy vagy több kémiai kezeléssel jelentős mértékben megnövelt termostabilitással rendelkezik, azzal jellemezve, hogy a bomlási időt — mely a. glükóz-izomeráz enzim és a szubsztrát érintkezési idejét, valamint mindazt a kezelési időt foglalja magába, melyet a szubsztrát a reakció hőmérsékletén tölt el — úgy választjuk meg, hogy az egyenlő vagy kisebb legyen a t_rf = antilog [4300/ (T-f-273) -pH-3,23[ (1) összefüggésből számított értéknél, ahol T reakcióhőmérsékletet °C-ban; pH a szubsztrát kémhatását; t_d a bomlási időt (percben) jelenti.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

25 jellemezve, hogy a Streptomyces fajhoz tartozó mikroorganizmus által termelt glűkóz-izomerázt alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces sp. ATCC

30 21175 mikroorganizmus, vagy annak mutánsai, variánsai, illetve genetikai módosulatai által termelt glükóz-izomerázt alkalmazunk.

4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glükóz 35 tartalmú tápoldatot a kémiailag stabilizált glükóz-izomeráz enzimmel 100—110°C közötti hőmérsékleten hozzuk érintkezésbe.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike sze40 rinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az izomerizáláshoz alkalmazott közeg pH-ját 6—6,5 közötti értéken tartjuk^

6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érintkezési idő 2—30 perc közötti érték.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás glükóznak az összes szénhidráttartalomra számítva 53—57 t% fruktóztartalomig történő izo5q merizálására, melynél 40—50 t% glükózt tartalmazó szubsztrátot 60—70°C hőmérsékleten, 6—8 pH-értéken hozunk érintkezésbe a glükóz-izomeráz enzimmel; az izomerizáláshoz alkalmazott közeg hőmérsékletét 90°C-ról ₅_ 120°C-ra emeljük; a közeg pH-ját 6—7 közöt^ö ti értékre állítjuk be, majd a fruktóztartalmú oldatot kémiailag stabilizált glükóz-izómerázzal hozzuk érintkezésbe, azzal jellemezve, hogy a bomlási időt úgy választjuk meg, hogy az egyenlő vagy kisebb legyen ⁶⁰ t_d = antilog [4300/ (T+273) -pH-3,23 j (1) összefüggésből számított értéknél, ahol T, pH és U jelentése az 1. igénypontban megadott.