SE460480B - Foerfarande foer isomerisering av glukos - Google Patents

Description

460 480 och Takasaki, "Fructose Production by Glucose Isomerase“, Chem. Abstracts, vol. 81, (1974), Abs. No. 76474a. Dessutom finns otaliga patent avseende glukosisomerisering bland vilka 0.8. patenten nr 3 616 221; Reissue 28 885 (ursprungligen 3 623 953); 3 694 314; 3 708 397; 3 715 276; 3 788 945; 3 826 714; 3 843 442; 3 909 354; 3 960 663; 4 l44 127 och 4 308 349 är representativa. z De halter av fruktos, vilka kan uppnås geno isomeriseringen av glukos med glukosisomeras, begränsas av isaneriseringsreak- tionens jämvikt. Vid 6506 står reaktionens jämvikt vid ungefär 51% fruktos beräknat på vikten från ett utgångssubstrat av ren dextros. När raffinerad glukoslösning användes so substrat (innehållande upp till cirka 6% icke-monosackarider beräknat på vikten) och en rimlig uppehâllstid i enzymreaktorn medges, har en 48 till 52% fruktossirap den högsta fruktoshalt, sm kan erhållas (beräknat på torr basis) enligt de angivna, tidigare kända förfarandena. För att uppnå sirap med högre fruktoshalt måste fraktioneringssystem användas, vilka starkt ökar slut- produktens kostnad. vid högre temperaturer blir emellertid jäm- vikten mer gynnsam. Ett enzymatiskt glukosisomerasförfarande, som kan arbeta vid temperaturer från cirka 90 till l40°C, kan exempelvis användas för att direkt tillhandahålla majssirap med hög fruktoshalt (HFCS) innehållande 53 till 60 viktprocent fruktos, beräknat på torr basis, varigenom behovet för frak- tionering och återcykling elimineras. Tendensen hos kända glu- kosisomerassystem att undergâ termisk denaturering med en sam- manhängande skarp minskning i aktiviteten har sålunda starkt hejdat försök_att använda högre temperaturer i syfte att tvinga ismeriseringens jämvikt ytterligare i fruktosens favör. Dess- utum är glukos och särskilt fruktos känsliga, reducerande sockerarter med en uttalad tendens att bilda icke önskade bi- produkter, sâsom psikos, färgade produkter, färgprekursorer, fruktosdianhydrider, mannos, tagatos och syror, vid uppvärmning till temperaturerna nödvändiga för att isomerisera enligt före- gliggande uppfinning. .för att uppnå en sluthalt i lösningen av minst cirka 53 till 460, 480 Det har nu överraskande upptäckts att genom att genomföra ett glukosismeriseringsförfarande inm vissa kritiska gränser för pH och uppehållstid i en enzymreaktor, som anges härefter, kan isomeriseringstemperaturer från cirka 90°C till cirka l40°C effektivt användas för att direkt tillhandahålla HFCS-sirap med hög kvalitet (d.v.s. med godtagbar biprodukt-bildning) innehållande från cirka 52 till cirka 60 viktprocent fruktos, varigenom behovet för kostnadskrävande och driftsmässigt kom- plexa fraktionerings- och återcyklingssteg, vilka kräves enligt kända glukosisomeriseringsförfaranden för att uppnå nämnda intervall för fruktoshalten, elimineras.

Enligt föreliggande uppfinning isomeriseras glukos till fruktos enligt förfarandet, vilket innefattar att man bringar en glu- koshaltig lösning till kontakt med kemiskt stabiliserat glukos- isomeras vid en temperatur från cirka 90°C till cirka l40°C vid ett pH från cirka 3 till cirka 8 och en tillräcklig kontakttid cirka 60 viktprocent fruktos beräknat på den totala kolhydrat- halten utan väsentlig bildning av psikos och/eller icke-fruk- tos-, icke-glukossockerarter.

Glukosen, som isomeriseras till fruktos enligt föreliggane uppfinning, kan härledas från vilken som helst av de kända källorna för denna sockerart. Av ekonomiska skäl härleds glu- kosen vanligen från hydrolysen av cellulosa eller stärkelse användande syra och/eller enzym, företrädesvis det senare, i enlighet med kända förfaranden. Glukoshaltiga lösningar er- hållna på detta sätt innehåller typiskt smärre mängder poly- sackarider, sockeroligomerer etc., beroende på den använda kolhydratkällan och nyttjad hydrolysmetod. Spannmål såsom majs, milo, vete, râg och liknande samt stärkelsehaltiga rötter och knölar såsom potatis, jams, morötter, kassava (maniok) och liknande utgör utmärkta källor för stärkelse att omvandlas :in giukosungåagauatariaie: enligt föreliggande uppfinning.

I USA är majsstärkelse särskilt föredragen på grund av dess förhållandevis låga kostnad och lätta tillgänglighet. Eftersom 460 480 framställningen av glukos av födoämneskvalitet gynnar använd- ningen av enzymatiska stärkelsehydrolysförfaranden, föredrages sådana förfaranden häri. Enzymhydrolysmetoder beskrives i U.S. patent nr 4 Ol7 363, 3 912 590; 3 922 196, 3 922 197-2ul och 4 284 722, vilkas innehåll härmed upptages i föreliggande text.

Glukosisomeraset använt h¿r_ såsom källa för enzym för kemisk stabilisering kan isoleras av vilken som helst av de kända glukosisomeras-alstrande mikroorganismerna inkluderande >Streptomyces flavorirens, Streptomyces achromogenes, Strepto- myces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeochromogenes, Streptomyces bobiliae, Strepto- myces olivochromogenes, Streptómyces venezuelae, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae, Bacillus coggulans, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Brevibacterium pentaamino- acidiu, Escherichia'intermedia, Leuconostoc mesenteroides och Paracolobactrum aerogenoides. Dessutom kan glukosisomera- ser utvecklade av släktena Nocardia, Micromonospora, Micro- bispora, Microellobospora och Arthrobacter användas. Strepto- myces art ATCC 21 175 utgör en utmärkt källa för glukos- isomeras att användas i förfarandet enligt föreliggande upp- finning. Som tidigare angivits kan det vara fördelaktigt att använda glukosisomeras med stabilitet vid de tämligen höga isomeriseringstemperaturerna använda häri, t.ex. glukosisomeras alstrat av Bacillus stearothermopgilus, särskilt stannar ut- valda bland Bacillus stearothermophilus ATCC 21 365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 och š%RL B-3682 beskrivet i U.S. patent nr 3 826 714; glukosisomeras framställd av mikroorganismer av släktet ëgpgllariella såsom Ampullariella digitata, Ampullariella lobata, Ampullariella campanulata och Ampuiiarielia regniaris (u.s. patent nr 4 zos 349); glukos- isaeras framställd av Bacillus licheniformis (europa-patent- ansökan 4l213);» och glukosisomeras alstrad av termofiler av ~släktena beskrivna i japansk patentpublikation 74 305588.

Förutom de tidigare nämnda mikroorganismerna innefattar före- liggande uppfinning användningen av mutanter med väsentligen 460 480 samma egenskaper som de nämnda mikroorganismerna härledda från dessa genom införing av muterade glukosisomerasgener i andra mikroorganismer, inkluderande mesofila och termofila mikroorganismer. De muterade glukosisomerasgenerna utvalda för sådan användning är de, vilka tillhandahåller glukosiso- meras, som är stabil vid förhöjda temperaturer, särskilt över- stigande 90°C och företrädesvis upp till cirka l40°C. Sådana gener kan beredas enligt vanliga tekniker använda för mute- ring av mikroorganismer såsom bestrålning eller genom kemiska mutagener. Alternativt kan isolerade glukosisomerasgener, vilka bildar glukosisomeras med moderat termisk stabilitet, exempel- vis bildade av vissa Streptomyces-stammar, muteras in vitro.

Val av de lämpligt muterade generna åstadkmmes genom återin- föring av den muterade genen i antingen moder- eller annan organism, åtföljt av tillväxt och replikering av organismen och test av det resulterande glukosismerasets termiska stabi- litet. Ävenså innefattas användningen av rekombinerande DNA-tekniker för att tillhandahålla glukosisomeras med förbättrad termisk stabilitet lämpligt för kemisk stabilisering och användning enligt föreliggande uppfinning. Argos, et al. (Biochemistry l8(25):S698-5703 (1979) visar att vissa ersättningar av glycyl, seryl, valyl och lysyl med alanyl i enzymer från mesofila orga- nismer återfinnes i motsvarande enzymer från termofila organis- mer. Perutz (Science, 201, 1187-91 (1978)) anger att enzymerna av termofila bakterier till största delen har sin extra stabi- litet tack vare ytterligare saltbryggor på proteinytan. Zuber- (i “Biochemistry of Thermophily', Freidman, S.M., ed. sid 267- 285, Academic Press, N.Y. 1978) ger ytterligare information om de termostabila.enzymernas struktur. Om sålunda aminosyrasekvens och tredimensionell (tertiär) struktur hos ett glukosisomeras är kända, är det möjligt att utveckla förbättrad stabilitet med njfäip av iägëšsfiêaífíka safatíefiëf i išasefasqafiea för att ltillhandahâlla enzy er uppbyggda (engineered) för att inne_ hålla ökade mängder av de aminosyror, vilka ger stabilare strukturer. Ear DHA-sekvensen hos glukosisomeraset har bestämts “S1 -. f ÉWYWHrv-avrnmvr f~~ .- f" 'rv-www " .-,-v-,.~=-~.~~,-«.»»~\,-~-4._.^.,,,.,,¶,,, , . ' . -, - - .~ V _' -' * i "_' v '> ~-' ~ f- v ~».~ ~ gsanfwrø-rw-ff-zf. fl-m ,~-.»,~_--. ..-«-.-.,~~ , , . . ___. y 4 \_ _ . ¿ _ i nog m' _Vf_.-».VN, wwa?.anna-v-svwmmmmwwwnwwvfuwvmwvwrwpï_ 460 480 kan en gen-synthesizer användas för att alstra nya sekvensen, varigenom termostabiliteten hos glukosisomeraset, framställt av sådana “man-made' gener ökas. Sådana uppbyggda enzymer synes särskilt värdefulla vid genomförandet av föreliggande uppfinning.

Då glukosisomeras framställes intracellulärt av dessa och andra _ mikroorganismer kan en källa av glukosisomeras tillhandahållas ä genom att helt enkelt skörda cellerna, och enzymet kan skiljas "í från cellerna enligt tekniker kända på orådet, t.ex. cellauto- lys, ljudsönderdelning, och användas i en enzymreaktor av känd' och sedvanlig utformning. Det kemiskt stabiliserade glukos- isomeraset kan företrädesvis immobiliseras på en inert bärare enligt kända och sedvanliga förfaranden om det inte insolubi-- liseras som en följd av kemisk stabilisering. Material och för- faranden använda för imobiliseringen av enzymer är välkända och beskrives i ett flertal publikationer inkluderande Wang, et al., Fermentation & Enzyme Technology, John Wiley & Sons, Inc., new verk (1979), sia 318-338 aan kuk-owner, Eugen»- pedia of Chemical TechnolO9Y, 3rd Ed., John Wiley 5 Sons, Inc., New York (1980) vol. 9 sid 148-172, vilkas innehåll härmed upp- tages i föreliggande text. Närvaron av ringa mängder av kobolt-, mangan- och magnesiumkatjon och/eller vattenlösligt salt av svavelsyrlighet såsu natriumsulfit, natriumbisulfit, magne- siumsulfit och/eller magnesiumbisulfit, som beskrives i U.S.

Reissue patent nr 28 885, för att reducera eller inhibera de- naturering av glukosisomeraset under förfarandets gång, note- ras även.

Det är nödvändigt att kolhydratkoncentrationen i den glukos- A å haltiga matarlösningen (feed liguor) ligger inom intervallet Ä från cirka 20 till cirka 85, och företrädesvis från cirka 30 till cirka 50, viktprocent m de önskade resultaten skall uppnås.

Det är också nödvändigt att isdmeriseringen genomföras vid ett pH inom intervallet från cirka 3 till cirka 8, mer föredraget inom intervallet från cirka 4 till cirka 7 och mest föredraget É _ .vmmw-vffc-w-:wwmwflwwfvw-»v-...aw-”mw-.fiwm___._ t. ,.,.__.._..,....~._..~.-.mf ., . ., 460 480 mellan 5 och 6,§. Isomeriseringens genomförande avsevärt under eller över nämnda pH-intervall leder till bildningen av över- drivna mängder oönskade biprodukter såsom psikos, organiska syror, färgade produkter, färgprekursorer, fruktosdianhydrider och liknande.

Det har upptäckts att pH för glukosisomeras optimala aktivitet påtagligt sjunker vid höga temperaturer. För glukosisomeras från Streptomyces rubigenosus är sålunda aktivitetsoptimum pa 8.6 - 9,2 vid 2s°c, pa 6,9 4 7.5 vid 7s°c och 5,6 - 6,2 vid l25°C. När sålunda isomeriseringstemperaturen höjes kan isome- riseringens pH sänkas för att bibehålla maximal enzymaktivitet och dessutom undvika otillbörlig biproduktbildning.

Ytterligare ett nödvändigt krav enligt föreliggande uppfinning ligger i längden av kontakt mellan den glukoshaltiga matar- lösningen och det kemiskt stabiliserade glukosisomeraset.

Sådan kontakt måste upprätthållas inom intervallet från cirka 1 sekund till cirka 5 timmar, företrädesvis från cirka 30 sekun- der till cirka l timme och mest föredraget från cirka 2 minuter till cirka 30 minuter för att tillhandahålla fruktossirap av godtagbar kvalitet.

Den föredragna kdntakttiden mellan det kemiskt stabiliserade glukosisomeraset och den glukoshaltiga lösningen beror i stor utsträckning på det pH, vid vilket isomeriseringsreaktionen genomföras. I pâ-intervallets undre del kan längre kontakt- »tider tolereras utan att orsaka otillbörlig sönderdelning av glukos och truktos geno bildning av psikos och andra icke önskade sönderdelningsprodukter. I intervallets övre del är kortare kontakttid nödvädig för att undvika psikos- och färg- bildning. I praktiken räknas den totala tid vid vilken denmil V glukoshaltiga sirapen är vid eller nära den slutliga reak- tionstemperaturen son nedbrytningstiden (ta), eftersom socker- nedbrytningsreaktionerna som sker är icke-enzymatíska och äger rum oberoende av om vätskan är i kontakt med glukosisomeraset.

Nedbrvtningstiden (td) innefattar den verkliga kontakttiden Ä' 460 480 (Ta), under vilken enzymet och substratet är i kontakt plus eventuell hanteringstid, t.ex. inströmnings- eller utström- ningstid ur reaktorn, vid vilken substratet är vid eller nära reaktionstemperaturen. Den verkliga kontakttiden (ta) är den » tid under vilken enzymet är reaktivt i kontakt med substratet, dvs. den direkta kontakten mellan substrat och enzym. Vid isomerisering över 90°C är det följaktligen viktigt att mini- mera den tid, som erfordras för att bringa glukoslösningen till den önskade isomeriseringstemperaturen (exempelvis genom att blanda lösningen med ånga just före eller under kontakten med isomeraset), och när den önskade fruktosnivån uppnåtts därefter snabbt avskilja lösningen från eventuellt aktivt isomeras och sedan kyla lösningen så snabbt som möjligt till lägre än 90°C och företrädesvis lägre än 70°C.

För att få sirapsprodukter med acceptabla egenskaper utan onödig nedbrytning av fruktos eller glukos skall nedbrytnings- tiden kontrolleras enligt följande ekvation: td = a log (4300/(T+273)-pH-3,23) (1) vari td är nedbrytningstemperaturen i minuter; T är reaktions- temperaturen i °C och pH är reaktionsblandníngens pH-värde under den tid blandningen har reaktionstemperatur. E Ovan angivna ekvation visar att kortare effektiva kontakttider erfordras vid högre temperaturer och/eller högre pH-värden.

»Det pH som skall användas för reaktionen ligger i allmänhet vid eller nära det optimala pH-värdet för det utvalda isoera-A i 'set- Temperaturen (T) kan justeras enligt substratkompositío-i :nen och den önskade fruktoshalten såsom diskuteras nedan.

'I 'Dessa förhållanden ges exempelvis i ekvationerna 5, 6 och 1. iïtterligare kontroll av kontakttiden kan åstadkommas med §användning av förhållandet som framgår av ekvation 4, som- Évisar att kontakttiden är omvänt proportionell till enzymakti-^ šviteten. För ett isoeras med ett optimalt pH av 6,0 och en ._ ..,-tr..w.~,r.,,.. M... rlwnww.- 460 480 reaktionstemperatur av ll0°C skall nedbrytningstiden kontrol- leras vara ungefär 100 minuter eller därunder.

Om en löslig form av kemiskt stabiliserat glukosisomeras användes, är det nödvändigt att inaktivera detta (som t.ex. genom pH-reduktion till ett område som inaktiverar isomeraset) före kylningssteget för att undvika eventuell återomvandling till glukos av den fruktos som bildats under högtemperatur- isomeriseringssteget, eftersom isomeriseringsreaktionen naturligtvis är reversibel.

Den maximala omvandlingsgraden glukos till fruktos, som kan uppnås, styres av den termodynamiska jämvikten mellan glukos och fruktos, som i sin tur är beroende av temperaturen vid vilken isomeriseringen genomföres. Mycket noggrann analys av jämviktsblandningar av glukos och fruktos har fastlagt följande förhållande.

F = 1oo x/(xu) (2) lux = - 3-53 +2,3oo5 _ (a) T+273 där F är % fruktos vid jämvikt baserat på total vikt av glukos och fruktos, T är temperaturen (OC) vid vilken isomeriseringen genomföras och K = glukos över fruktos-jämviktskonstant.

Den verkliga kontakttiden mellan den glukoshaltiga sirapen och isomeraset i en reaktor kan i allmänhet beräknas med hänvisning till följande formel när en reaktor innehållande en immobili- serad form av isomeras användes. e seras vid hög temperatur i en andra reaktor. Vid användning av g till kontakt med glukosisoeras vid en temperatur från cirka . v. 'fj-r-w-f--V-fq-"f _ . 460 480 10 e = cv ln ---- <4) där t = den verkliga kontakttiden C = koncentration av glukos och fruktos V = den fria volymen~av vätska i den packade bädden (bäddens volym minus volymen upptagen av de im- mobiliserade enzympartiklarna) F = fraktion av fruktos i glukos/fruktos-blandningen vid jämvikt vid isomeriseringstemperaturen F >= fraktion av fruktos (baserad på G + F) vid in- gången till den packade bädden F = fraktion av fruktos (baserad pâ G + F) i lösningen utgående från den packade bädden k = fraktionshastighetskonstant för isomerisering vid É isomeriseringsbetingelserna V j A = isomerasets aktivitet i den packade bädden Värden på k för immobiliserat ismeras framställt enligt föl- jande exempel ligger i intervallet från cirka 0,07 till cirka s g t1m'l 1c1à'1~via temperaturer från 9o°c till 14o°c respek- tive. Detta förhâllande visar behovet för att nedbringa kon- takttiden till ett minimum vid hög temperatur genom användning av packade bäddar med hög aktivitet per volymenhet. Packade bäddar beredda enligt förfarandena i följande utförinsexempel kan innehålla upp till 200 IGIU/ml, som kan resultera i att man uppnår 99,5% av jämvikts-fruktoshalten på mindre an 1 mi- nut i en högtemperaturreaktor, då stegvisa reaktorer användes vid olika temperaturer een dee till en förste reaktor tiliförae materialet isomeriseras vid låg temperatur innan det isoeri- ett stegvis reaktorsystem är det föredraget att använda ett förfarande för att enzymatiskt omvandla glukos till fruktos, vilket innefattar att man bringar en glukoshaltig natarlösning, innehållande från eirxe zo till cirka as vixeproeent glukos, _ ,~,_..~,1~=<-,,,e_@¿ ._ 4¿o 4so. ll 2000 till cirka 80°C, vid ett pH av cirka 6,0 till 9,0 och en* kontakttid av cirka 0,5 till cirka 2 timmar för att omvandla från 40 till cirka 45 viktprocent av glukosen närvarande i lös- ningen till fruktos, ökar temperaturen hos isomeriseringsmediet till från cirka 90°C till cirka l40°C, reglerar pH för isomeri- serinqsmadiet 'enligt behov inom intervallet från cirka 3 till cirka 8, bringar den fruktoshaltiga lösningen till kontakt med Vglukosisomeraset under en ytterligare period från cirka 1 se- kund till cirka 5 timar för att öka omvandlingsgraden från cirka 53 till cirka 60 viktprocent av glukosen närvarande i den ursprungliga glukoshaltiga matarlösningen, varvid inte nå- gon väsentlig bildning av psikos eller andra icke-fruktos-, icke-glukossockerarter sker. Sålunda kan användningen av packa- de bäddar med hög kapacitet leda till mycket korta, effektiva kontakttider, vilket i sin tur minimerar fruktossönderdelningen, som sker vid de höga temperaturerna behövliga enligt förelig- gande uppfinning.

Vid valet av imobiliseringstekniker för glukosisomeras är det föredraget att använda metoder med förmåga att ge små, i huvud- sak icke-kampressibla, porösa katalysatorpartiklar så att inhi- bering av isomeriseringshastighetens diffusionseffekter ned- bringas till ett minimum. Alternativt kan isomeraset imobili- seras i porerna hos ett membran genom vilket glukoslösningen tvingas under högtemperaturisomerisering so ett medel för att främja god kontakt mellan enzym och substrat, och därigenom minimera diffusionella begränsningar. Den för immobilisering använda bäraren är företrädesvis helt olöslig och inert för att undvika otillbörlig förorening eller sönderdelning av glukos/fruktos-komponenterna i substratlösningarna. ' Vid komersiell utövning framställes emellertid inte fruktos- haltiga sirap av ren glukos. I stället användes stärkelse- hydrolysater (sâso framställes enligt ovan nämnda referenser) som glukoskällan och dessa innehåller alltid icke-glukos- och icke-fruktossackarider (i det följande hänvisade till såsom , pclysackarider) härledda från ofullständig hydrolys av stär- 460 480 12' kelse, och reversionen av glukos. Typiskt utgör dessa från 3% till 8% av den totala torra vikten som saokariderna härledda genom stärkelsehydrolys. Vid beräkning av den temperatur, vid vilken isomeriseringen skall genomföras, är det sålunda nöd- vändigt att tillåta eventuell polysackarid innehållen i glu- koslösningen såväl som andra faktorer, såsom fruktoshalten som skall uppnås, beräknat på total torr basis, bildning av psikos och andra icke-glukos- och icke-fruktosprodukter under den effektiva kontakttiden mellan glukoslösningen och isome- raset. Förhållanden för beräkning av isomeriseringstemperatu- ren visas nedan. __ _ 5 f' T “ zfloos-lnx 273 ( ) ~ f - ___? » i s ~ K “ loø-f- ( ) g F = _19_._°_<_>9__ Q(loo-P) ' T = isomeriseringstemperatur (OC) ' F = jämviktens fruktoshalt (% baserat på _ total glukos + fruktos) vid tempera- turen T I M = % fruktos, torr basis, erforderlig i den isomeriserade produkten C = % psikos + andra sönderdelningsprodukter bildade under den effektiva isomerise- ringskontakttiden * Q = % jämvikt uppnâdd under isomeriserings- r reaktionen P = % polysackaridhalt i glukoslösningen.» Typiskt bildas mindre än 1% och företrädesvis mindre än 0,5% äpsikos och andra sönderdelningsprodukter och 99,5% jämvikt kan nås. För att sålunda bereda sirap med 55,5% fruktos (torr -basis) kräves följande isomeriseringstemperaturer för glukos- lösningar med de angivna polysackaridhalterna. 46Ö 480 13 V Polysackarid i Isomeriserings- glukoslösningen temperatur (% torr basis) §°c) o 95,1 1 ' 99,1 2 104,3 3 108,9 4 ll3,8 6 124,3 8 136,1 Den godtagna komersiella produkten innehåller i genomsnitt 55,S% fruktos beräknat på torr basis. Detta beror på att vid denna fruktoshalt har majssiran med hög fruktoshalt (HFCS) lika sötma som sackaros beräknat på en vikt för vikt torr « basis. HECS med 55,5% fruktoshalt har dessuto starkt etable~ rat sig som den kommersiella produkt, vilken användes omväx- lande som total eller partiell ersättning för sackaros i många födoämnesprodukter och särskilt i kolsyrade läskedrycker (soft drinks). Konsumtion av denna typ av HPCS i USA upp- skattas till l,3 millioner ton (2,9 billion pounds) för 1982 med en ökning till 1,8 millioner ton (4,o billion pounds) un- der l983. Pâ grund av svårigheterna sammanhânande med leve- rans, lagring, uppmätning och beredning av HFCS till födo- V g ämnesprodukter, föreligger ett universiellt behov för likfor- ¿ mighet hos produkten från en HFCS-tillverkare till en annan så att produkter från olika källor kan användas utbytbart och samtidigt. Sålunda har en fruktoshalt av 55 till 56% på torr basis fått särskild betydelse som en mål-halt inom teknologin förbunden med HFCS-framställning. _ g _ Enligt föreliggande förfarande tillhandahållas fruktoshalter av minst 53%, företrädesvis minst 54% och mest föredraget åt- minstone 55%.

Aâllteeâteraâeskam¿âæ<fiei;nckså;mäjligi¿ar:.antände;en.l§sning av'gTu2os, varvid dei av"gía&oseæ redan fsnserfserzts riff 460 480 i14 fruktos, i stället för att använda en lösning innehållande en- dast glukos som substratet för föreliggande förfarande. Så kan exempelvis en lösning av isomeriserad glukos innehållande upp till 50% fruktos behandlas enligt föreliggande förfarande för att öka fruktoskoncentrationen till de mer önskade halterna överstigande 50%, och de föredragna halterna av 55 till 56% och högre. V V ' Lösningar av glukos innehållande fruktos i mängder mindre än S0 viktprocent av kolhydratmängden kan framställas enligt för- faranden kända ino tekniken på området.

Beaktande de föregående kraven på glukoskoncentratitn, pä och kontakttid kan kända glukosisomeriseringsförfaranden lämpligt avpassas till att arbeta vid från cirka 90° till cirka l40°C, företrädesvis mellan cirka l0O°C och cirka llO°C, för att tillhandahålla hög glukos-fruktossirap enligt föreliggande uppfinning.

Glukosisomerasets termostabilitet kan ökas avsevärt genom en eller fler kemiska behandlingar, varvid enzymet fortfarande kvarhâller en uppskattningsbar aktivitet, som diskuteras ne- dan. Så behandlat enzym benämnes 'kemiskt stabiliserat ise- ras' för föreliggande beskrivnings_ändamâl.

Kemisk stabilisering av isomeras åstadkommas genom ett flertal olika metoder, vilka kan resultera i ökad termisk stabilitet.

Grundinriktningen är att införa strukturella element i enzym- molekylen på sådant, att enzymet motstår utbredning (un- folding) vid uppvärmning över dess normala termiska denature-- ringspunkt. En föredragen metod för att åstadkomma detta är att modifiera enzymet genom kemisk substitution därpå av en- heter innehållande polymeriserbara vinylgrupper, så att de senare stadigt fästes till enzymolexyiens yta v1a.f1era stal- len. Därefter blandas det modifierade enzymet med en eller d.flera*polymeriserbara vinylföreningar i vattenbaserad lösning V och blandningen sampaiymeriseras för att bilda det kemiskt 460 480 15 ¿ stabiliserade enzymet, varvid enzymet är stadigt bundet vid g flera ställen till en tredimensionell polymergrundmassa, som Å bildar en struktur vars form är komplementär till enzymets. i Exempel på denna typ av stabilisering beskrivas av Martinek W en al. 1 siocnem. ßiopnys. Acta 485, 1-12 (1977) och av ¿ ~xu1ys et ai. 1 Biokhimiya, 42, No. 3, 453-59 (1978). g vid genomförandet av ovanstående reaktioner är det väsentligt att betingelser; som kan leda till isomerasets denaturering med sammanhängande aktivitetsförlust, undvikes. Så måste exem- pelvis extrema värden för pH och temperatur undvikas under några eller samtliga de steg, som är nödvändiga för att geno- föra ovanstående reaktioner.

Exempel på använda reagenser för att modifiera isomeras i syfte att substituera polymeriserbara vinylgrupper därpå är akryloylklorid, metakryloylklorid, akrolein, krotonaldehyd, maleinsyraanhydrid, 3,4-epoxibuten, akrylsyra-2,3-epoxipropyl- ester, akrylsyra-2,3-tioglycidylester, l-allyloxi-3-(N- etylenamín)-2-propanol, akrylsyra-O-succinamidester, klor- maleinsyraanhydrid, maleinsyraazid, 3-brompropen och allyl- isotiocyanat. Sådana föreningar kan reagera med isomerasets fria aminogrupper, t.ex. epsilon-aminogruppen i lysin-enhe- tefflä .

Ytterligare andra föreningar med förmåga att reagera med iso- merasets fria karboxylsyragrupper kan användas för att sub- stituera lätt polymeriserbara vinyl-enheter därpå såsom fram- igår för fackmannen på omrâdet.

Exempel på vinylföreningar som kan sampolymeriseras med det modifierade isomeraset är natriumakrylat, natriumetakrylat, a akrylamid, hydroxietylmetakrylat, akryloylpiperidin-4-spiro- É 2'-Il',3'-dioxakrylopentan), 1-akryloyl-4-piperidon och l 7 akryloylmetoxiamin. I allmänhet föredrages vattenlösliga mono- merer eller monumerblandningar, som resulterar i vattenlös- 460 480 16 liga polymerer (om polymeriseringen sker i frånvaro av brygg- bildare).

Typiskt inkluderas difunktionella vinylföreningar i monomer- blandningen (0,1 - 5% av total monomer) för att ge bryggbild- ningslägen, som leder till ett tredimensionellt polymernätverk.

Lämpliga föreningar är N,N'-metylen-bis-akrylamid och etylen- glykoldimetakrylati När dessa användes bildar den polymeri- serade blandningen en olöslig gel, som resulterar i immobili- sering av isomeraset¿ Vanligen använda initieringssystem för vinylpolymerisationer är lämpliga såsom ammoniumpersulfat plus natriumbisulfit, väteperoxid plus ferrosulfat, kaliusulfat plus N,N,N',N'- tetrametyletylendiamin och riboflavin (plus ljus). V Alternativt kan icke-kovalent bindning till den tredimensio- nella polymergrundmassan vara tillräcklig för att förläna iso- merasmolekylen önskad styvhet och därigenom åstadkomma en avse- värt ökad termostabilitet. Detta kan ske när isomeras mekaniskt infångas i en tvärbunden polymergel. I detta fall är det inte nödvändigt att isomeraset modifieras genm att en vinylförening fästes därtill innan polymerisationssteget sker. Koncentra- tionen av gelen måste emellertid vara högre än cirka 30 vikt- procent innan avsevärd stabilisering sker och geler med cirka 50% koncentration föredrages. Monomerer med förmåga att ge polvmergeler, vilka kan bilda elektrostatiska och vätebindnin- gar med isomeraset kräves som t.ex. natriumakrylat, natrium- metakrylat, akrylamid och hydroxietylmetakrylat.

Exempel på stabilisering genom införlivning i geler ges av nartinek ef; al. i aiocnem. siopnys. Acta 435, 13-28 (1911) och av Kulys et al. i J. Solid Phase Biochem., 3, 95-105 (1978). '_En tredje metod för att förstyva isomeras är intramolekylär “ bryggbildning, som kan förläna ökad termostabilitet.A 460 480 17 Exempel på sådan stabilisering diskuteras av Torzhilin et al. i Biochem. Biophys. Acta, 522, 277-283 (1978), Martinek et al. 1 J. solid Phase aiøchem. 2, 343-85 (1977) och av 'rarcnilin et al. i Biochem. Biophys. Acta, 568, l-10 (1979).

Lämpliga bryggbildare för användning°i föreliggande uppfinning inkluderar difunktioneila föreningar, som kan reagera med vid- hängande funktionella grupper på enzymolekylen. Vanligast ut- göres sådana funktionella grupper av aminogrupper, i allmän-' het primära aminogrupper, som kan reagera med en stor mångfald funktionella grupper såsom karboxylsyra, sulfonylhalogenid, aldehyder, isocyanater, propiolater och liknande.

Bryggbildarna inkluderar sålunda dikarboxylsyraanhydrider så- som bärnstensyraanhydrid och adipinsyraanhydrid; motsvarande dialdehyder såsom glyoxal, succinaldehyd och glutaraldehyd; omättade föreningar såsom akrolein och krotonaldehyd, diol- propiolater såsom etylenglykolbispropiolat, propylenglykol- bispropiolat och hexametylenglykolbispropiolat och disulfonyl- halogenider_såsom bensen-l,3-disulfonylklorid; naftalen-l,5- disulfonylklorid och tolyl-2,4-disulfonylklorid.

Då enzymet innehåller eller kan förmås innehålla syragrupper reaktiva med aminer kan dessutom difunktionella aminer använ-l das som bryggbildare enligt föreliggande uppfinning. Dessa in~ .kluderar t.ex. diaminer innehållande upp till 12 kolatoer, såsom fenylendiamin, butylendiamin, hexylendiamin, oktylen- diamin, pentylendiamin, etylendiamin och dodecylendiamin.

Mängden bryggbildare kan variera stort, varvid förhållandet tenzym till bryggbildare ligger i intervallet från cirka 0,1 till cirka 0,000l. Metoden för att åstadkomma erforderlig bindning bestämmas i viss grad av beskaffenheten hos den valda bryggbildaren och enzymet. I allmänhet löses reagenserna i ett lämpligt inert lösningsmedelsmedium-och reaktionen bör fort- skrida vid tämligen låga temperaturer i syfte att undvika manliga verkningar på enzymet, som kan vara känsligt för höga 4so 4so 18 temperaturer. Vanligen föredrages reaktioner vid eller nära rustemperatur och vatten eller vattenbaserade lösningsmedel användes som reaktionsmedium.

Förutom att substituera polymeriserbara vinylgrupper på enzym- molekylen och därefter polymerisera enligt de tidigare beskrivna metoderna, innefattar en ytterligare utföringsform kondensering av en förformad polymer med isomeraset genom bildning av intra- molekylära kovalenta bindningar för att forma en stabiliserad molekyl. Så kan exempelvis polypeptider, såsom naturligt före- kommande proteiner och hydrolysprodukter därav, reageras med I användning av kända tekniker för peptidlänkbildning med glukos- isomeras för att bilda stabiliserat enzym. De så framställda produkterna kan vara vattenlösliga men kan göras vattenolös- ~ liga med användning av bryggbildare såsom glutaraldehyd och det resulterande tvärbundna enzymsystemet är vanligen än mer stabilt. Peptidbildningsreaktionerna åstadkommas enligt kända metoder, t.ex. med användning av karbodiimider- Allt efter önskan kan det ursprungliga enzymet derivatiseras för att införa önskad funktionalitet i molekylen för syftet att kondensera med den förformade molekylen. För karboxi- funktionalitet kan sålunda,ett fri-amino-haltigt enzym reageras med en dikarboxylsyra för att omvandla till ett karboxihal- tigt enzym.

De förformade polymererna, vilka användes i föregående ut- föringsform, kan vara vilka som helst innehållande erforderlig typ och mängd av funktionella grupper, t.ex. amino eller kar- boxi, för de avsedda reaktionerna. Föredragna är polypeptider såsom naturliga proteiner, t.ex. kitosan, jästprotein och liknande, såväl som blandningar; och amino-haltiga polymerer såsom polyetylenimin. Den föredragna förformade polymeren bil- ldar vanligen vattenlösliga produkter och det är föredraget att Iègöra dessa olösliga genom reaktion med bryggbildare, t.ex.

I glntaraldehyd och andra som tidigare beskrivits. .genas och flera andra proteiner har stabiliserats (se Tuengler, al08833 (1980).

.Aktiviteten hos den lösliga isomerasberedningen bestämdes å v... :a - .man-vzwa-»fimafa-fïøpwfiwmwwm, > m_nr__________f_ _ W """*"'”"“""'"“ _ M _ _ i4eo 4sn I samtliga tidigare nämnda metoder för att modifiera enzymet är det väsentligt att säkerställa_att tillräcklig kemisk funk- tionalitet, t.ex. amino- eller karboxigrupper, föreligger för att uppnå en betydelsefull nivå av det önskade resultatet. vid val av den förformade polymeren, som skall reagera med enzymet, kräves exempelvis att polymeren innehåller grupper reaktiva med de tillgängliga grupperna på enzymmolekylen. Ett protein med vidhängande karboxigrupper kan sålunda väljas för reaktion med vidhängande aminogrupper på enzymet. Dessutom bör "ett rimligt antal reaktiva grupper finnas på de valda reaktan- terna för att säkerställa flerpunkts-fäste av reaktanterna i syfte att åstadkomma betydelsefull stabilisering. Bestämningen av beskaffenhet och antal av sådana reaktiva grupper för respektive reagens är naturligtvis välkänd inom tekniken pâ området.

Enligt ytterligare en metod för att öka enzymernas termostabi- litet ändras ytstrukturen kemiskt utan märkbar aktivitetsför- lust. Sålunda kan yt-aminogrupper amidineras (Ludwig, M.L. and Hunter, M.J., ggtg. Enzygol. ll, S95-604 (1967) eller guani- dineras (Kimmel, J.R., ggtg. Engymol. ll, 584-589 (1967) för att bilda substituenter nära liknande arginin. Mjölkdehydro- F. and Pfleiderer, G., Biochem. Biophys. Acta, 284, l-8, (l977); Minotani, N., et al., Biochem. Biphys. Acta, 581, 334- 241 (1979) aan capa, p;, at a1., g. 3101. cnam., 255, 10828- aa11gt beskrivning av Lloyd at a1. i,caraa1 cnaaistry; 49, No. 5, sid 544-553 (l972). En IGIU är den mängd isomeras, som pdmvandlar en mikromol glukos till fruktos per minut i en lös- ; ning innehållande 2 mol glukos per liter, 0,02 mol MgS04 per ,_1itar aan 1,001 mel cøclz par litar vid att pa av 6,85 (0,2 M - Üinatriumaleat) och en temperatur av 60qC, bestämt enligt ovan- stående metod. 460 480 " 20 Följande exempel illustrerar ytterligare förfarandet enligt föreliggande uppfinning. " lExemgel 1 Detta exempel demonstrerar direkt isomerisering av en glukos- haltig lösning huvudsakligen innefattande ett raffinerat majs- stärkelsehydrolysat för att uppnå en komposition av 5S,5% fruktos på torr basis, varvid ett tvåstegs isomeriserings- förfarande användes. En lågtemperaturisomerisering vid 70°C genomfördes först, varvid produkten från denna reaktion använ- des som matarlösning till en andra högtemperaturreaktor á (l05.2°C) innehållande ett kemiskt stabiliserat isomeras. Det Ä kemiskt stabiliserade isomeraset är ett vari enzymet är kova- Q lent bundet till en löslig polymer och därefter gjorts olös- ligt för att bilda en immobiliserad katalysator.

Hydrolysatet bereddes av majsstärkelse enligt förfaranden be- skrivna i U.S. patent 3 644 126 (smältning) och U.S. 3 280 006 (sackarifiering). Den sackarifierade lösningen raffinerades enligt U.S. patent 3 834 940 för att ge en produkt innehållande 95,3% glukos torr basis. Tillräcklig mängd kristallin glukos tillsattes för att bringa den totala glukoshalten till 97,6% beräknat på torr basis. Den resulterande lösningen hade föl- jande komposition: Total torr substans (%) 50,2 A 1 Glukos (% torr basis) _97,6 ÄÉ Fruktos (% torr basis) 0,0. Ä V Polysackarid (% torr basis) 2,4 å gPsikos (% torr basis) 0,0 E Nanso3 (mm V v 5o.o MQSO4 (mM) 510 ä 'CoCl2 (mM) ” 0,1 § _PH 6-8 qdïermentationvgenofördes under aseptiska betingelser vid 30°C ,. _ ar _ ' ' 460 480 2li Isomeriseringen vid låg temperatur genomfördes vid 7000 genom att pumpa ovanstående substratlösning genom lågtemperatur- reaktorn vid en flödeshastighet av 3,2 ml/minut. Lâgtemperatur- (70°C)-isomerasreaktorn konstruerades genom att packa isomeras imobiliserad på DEAE-cellulosa (beredd enligt 0.8. patent 3 788 945) i en glaskolonn med diametern 2,5 cm (1 tum) för- sedd med inlopp och utlopp och med en mantel för cirkulering av vatten från en termostat. Utrymmet ovanför packningen inne- håller en termometer och är för övrigt fylld med glaskulor för att minimera dödutrymmet i möjligaste mån. Reaktorn innehåller tillräcklig mängd imobiliserat isomeras för att tillhandcxålla 20 000 IGIU och den packade bädden är cirka 15 cm hög. Den första mängden av 1000 ml utgående från reaktorn bortkastades.

Den därefter utgående effluenten uppsamlades för användning i den andra högtemperaturisomeriseringen.

I 'N Den kemiskt stabiliserade katalysatorn använd i högtemperatur- reaktorn bereddes på följande sätt.

En art av Stregtomyces rubigenosus härledd från §. rubin- genosus¶ATCC 21175 odlades genom nedsänkt aerob fermentation på ett medium med följande komposition: viktgrocent * Dextros 9.0 l Majsstöplösning (fasta bestånds- f Dianmoniumfosfat 0 ,08 i Mangansulfat Ä* 0,06 3 Skuxudâmpande medel (Pluronic® _ PL-Gl) 0,003 Mediet steriliserådes vid l2l°C i 45 minuter, kyldes och in- Iställdes nå pH 6,8 till 7,0. Det inockulerades med 14% (volyml volyml av ett inockula innefattande innehâllen från en ympf fermentor!preparerad med §, rubigenosusåvarianten nämnd ovan. i cirkaf60 timmar med luftning vid 0,65 vvm. §. rubigenosus 460 480 22 ATCC 21175 kan också användas för inockulering och framställ- ning av iseras, varvid media med följande komposition an- vändes. viktprocent Dextros 5 ' 0,24 Majsstöplösning (fasta bestånds- delar) 1,5 sarbicol I _ 1,6 Kobolt(II)klorid 0,02 Diammoniumfosfat 0,56 Xylos ' 1,0 Glukosisomeras extraherades från §. rubigenosus genom tillsats av 0,35% Maquat MC 1412 (Mason Chemical Co.), och 10 ppm lyso- zym från hönsägg och omröring 1,5 timmar vid 40°C, pH 6,3 - 6,6. Blandningen filtrerades därefter för att ge en lösning av rått, orenat glukosisomeras. A V 2 Det råa isomeraset renades genom adsorption på DEAE-cellulosa (framställt enligt U.S. 3 823 133), filtrering och tvättning av den adsorberade produkten med 0,1 M NaCl-lösning för att avlägsna föroreningar och därefter desorbera isomeraset geno kontakt med 0,45 M NaCl-lösning. Samtliga lösningars pH hölls vid 7,5 under reningsstegen. Lösningen av delvis renat isme- ras erhâllen därvid blandades med 3 volymer 95% etanol vid OOC för att utfälla isomeraset. Perlite filterhjälp tillsattes, de fasta beståndsdelarna utvanns genom filtrering och luft- torkades för att tillhandahålla en löslig isomerasberedning innehållande 2500 IGIU/g.

Det renade isomeraset löstes i l mM MnCl2 för att ge en lösning innehållande 10 mg isoeras per ml vid rumstemperatur och bland- ningen filtrerades för att avlägsna filterhjälpen. Denna bered- nings specifika aktivitet var 37,3 IGIU/mg protein; f En lösning av en löslig polyaminpolymer erhölls genom att lösa 460 480 23 ~39,0 g kitosan (Kytex från Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) i 13 1 0,08 N HCl. När kitosanlösningen väl lösts gjor- des den 0,5 M i NaCl genom tillsats av 380 g NaCl och den re- sulterande lösningen justerades till pH 6,15 med 8 N Na0H.

Slutligen filtrerades kitosanlösningen genom ett Whatman#3 pappersfilter för att avlägsna olösligt material. Till dessa 13 l 0,3% kitosan i 0,5 M NaCl vid pH 6,15 sattes följande: 100 ml lösligt isomeras innehållande 100 000 IGIU aktivitet, 197,6 g xylitol (från Sigma Chemical Co.) och 0,619 g CoCl2- 6H2 3-dimetylaminopropylkarbodiimid (från Sigma Chemical Co.) tillsattes för att kovalent binda på flerpunkt-satt isoera- Û sets karboxylgrupper till kitosans aminogrupper. Efter 2 E timmar vid rustemperatur sattes 15,6 ml av en 50% (vikt/vikt) glutaraldehydlösning (frân Eastman Kodak), justerad till pH 6,0 med 8 N Na0H, till reaktionen för att insolubilisera det 0. Denna lösning omrördes 2 timmar, varefter 6,24 g l-etyl- kovalent bundna isomeras-kitosankomplexet. Efter 15 minuter tillsattes 2 liter l M fosfatlösning vid pH 8,0 för att under- lätta frakturering av gelen som bildats geno glutaraldehyd- tillsatsen. Resulterande insolubiliserad isomeras-kitosan tvättades med avjoniserat vatten på ett Buchner-vakuufilter.

Denna beredning fick sedan lufttorka över natten vid rums- temperatur, och maldes samt siktades till intervallet 12 - 60 mesh. Den torra katalysatorn hade en uttalad aktivitet av 384 IGIU/g.

Reaktorn med temperatur lO5,2?C preparerades på följande sätt., En mängd av 13 g katalysator suspenderades i substrat och av- luftades under laboratorievakuum vid rumstemperatur i 60 minu- ter. Den avluftade uppslamningen användes för att bereda en 1,5 x 20 cm bädd i en mantelförsedd glaskolonn. Den packade bädåen innehöll 4992 IGIU.

' Substrat berett från det första stegets 70°C isomerisering justerades till pH 6,75 och utspäddes till 42,0% torr substans. __ Detta substrat pumpades sedan genom högtemperatur-reaktor- i kaipnnçnllfiunaer ett' absolut tryck av 0,7 kp/cmz (10 nsig) och _ ' _ .på den otïnerfiänade 4so 4so 24 vid en flödeshastighet av l,96 ml/minut vid 60°C i 30 minuter.

Temperaturen inom kolonnen avkändes med en termometer belägen direkt ovanför bädden och omgiven av 0,5 cm glaskulor för att minimera dödvolymen så långt som möjligt. Kolonntemperaturen ökades därefter snabbt genom att cirkulera olja från ett lO6°C cermostatförsett bad genom manteln.

Effluenten från kolonnen mättes med en regístrerande polari- meter kalibrerad att avläsa från SO till 58% fruktos. När kolonntemperaturen hade nått l05,2°C och fruktoshalten 1 effluenten uppgick till önskad nivå, uppsamlades effluenten och kyldes omedelbart i ett isbad. pH justerades till 4,90 genom tillsats av l M citronsyra. Effluent uppsamlades till dess att den synbara fruktoshalten sjönk under 55%.

Isomeriserade lösningar erhållna från 70°C- och l05,2°C-reak- torerna analyserades med avseende på kolhydratkomposition och färg och resultaten jämfördes med liknande analys genomförd substratlösningen såsom visas i följande tabell. 460 480 ~.wfi 25 ß_o m.o ^oo~x mmfiuv m~w@ må m.o wÃw mfim uomåoflflfif ømummflumëomn m_~ 0 v_ww m.am oooß ø«> øøummflnmeomn «_~ o m_>m o flmuomflnmsomflo ««~flxu@m>flo@ floxflmm moxøflø mouxnum wmwdøcøßmp m=uw=«=mnq ^m«mmn uuou _«u«xmm wa uncxmumn »cmuouu»x«>.. cøflvflmomeoxnmuøanflox uc~_moH :oo uooß ø«> wnøummflnosomfi ummcflcmafiumuumnsm >æ cofluflmomaox H Hflmnmfi .ff - ~wf"'ï~'~"' 460 480 _26 Resultaten visar att 55,S% fruktos erhölls under det att psikos'hölls lägre än 0,4 viktprocent beräknat på torr basis och färg < 20 (CIRFXIOO) .

Exempel 2 Detta exempel illustrerar den direkta isomeriseringen av en glukoshaltig lösning (innefattande ett raffinerat majsstärkelse- hydrolysat plus kristallin glukos) vid hög temperatur för att uppnå en komposition innehållande 55,2% fruktos på en torr basis, varvid en tvåstegs-isomerisering användes dar det andra steget nyttjar ett kemiskt stabiliserat isomeras bestående av glukos- isomeras komplexbildat med polyetylenimin, varvid komplexet gjorts olösligt genom behandling med glutaraldehyd.

“Framställning av stabilíserat isomeras Ett lösligt glukosisomeras framställdes enligt beskrivningen i exempel l. Det renade isomeraset löstes i 1 mM MnCl2 för att tillhandahålla en lösning innehålladde 9 mg isomeras per ml vid rumstemperatur och blandningen filtrerades för att av- lägsna filterhjälp. 60 ml 10% (vikt/volym) PEI-6 (p0lyetylen- >imin, molvikt 600, pH 8) (Dow Chemical Co.) och 3 g xylitolp sattes till 300 ml av enzymlösningen och den resulterande lös- ningen amrördes i 15 minuter. 10 ml 2,5 M glutaraldehyd till- sattes och blandningen orördes vid rumstemperatur i 2 timmar.

Det insolubiliserade enzymet âtervanns genom filtrering, tvâttades med vatten samt torkades över natten i en konvek- tionsugn vid 37°C. 12,8 g immobiliserat isomeras innehållande cirka 775 IGIU/g utvanns efter torkning. 12 g av det imobi- liserade enzymet suspenderades i substratet, avluftades under vakuum i 60 minuter vid rumstemperatur samt användes för att bereda en högteperaturreaktor med diameter 1,5 cm.

Substratet för reaktorn bereddes i det första steget av två- stegs-isomeriseringen beskriven i exempel l. Detta substrat hane följande kampqsition= “ *""hr'~wvnuunnn~wfi 'w 27 Total torr substans (%) _ 42,6 Glukos (% torr basis) I 46,4 'Fruktos (% torr basis) 51.3 Polysackaríd (% torr basis) 2,3 Psikos (% torr basis) 0,0 NaHSO3 (MM) O MgSO4 (mM) 50 C0Cl2 (mM) 0,1 pH 6,75 I Substratet pumpades genom reaktorn vid 60°C i 45 minuter vid cirka s zur/minut. mxenntemperanuren ökades sedan un 1o1,a°c oæh ílödeshaetiqheten reàecereaes till 2 ml/minut, Ett mot- tryck av 0,8 kp/cmz (12 psi) anbringades kolonnen för att för- hindra subetratecß kokning. Kífluenten kontrollerades med en registrerande polarimeter kalibrerad för att avläsa från 50% till 56% ffuhmfi. Effluant överstigande 5% fraktas uppäamla» des 1 ett isbad och justerades till pä 4,0 med 1,0 M citron- syra.

Effluenten från högtemperaturreaktorn, substratet från det första stegets reaktor och den ursprungliga glukoshaltiga lös- ningen använd som sübstrat för det första stegets reaktor ana- lyserades med avseende på kolhydratkomposition och färg. Resul- taten sammanställes § följande tabell. ' 28 ß_«m ß.o m.o ^oø~x mmfiu. mumm ß.w O H.~v m_mm uow.flOfl ø«> flmnmmflumfiomfl m\~ _ o «.@« m_~m oooß m«> ouummflumeomfl «_~ o @.>m o uøuwmflumeouflo mfluøxommæflom moxflmm moxsflø møuxzum wcflfiucøsæn mcmmcflnaæn ^w«mmn uuo» .fiuwxmm nu umcxmuwa u=woouauxfi>. co«»«moQEox»auwm:flox a:«nwm«uweo@« mnwmmum muøcm :oo muuunu :mmm ummcficmæfl >ß uwcofludmcmaox N afimnma 'Hvnnflu-uw w--w-s-unn-w w 'ss .f v» ...V-v 460 4so 29 Resultaten visar att S5,2% fruktos uppnåddes samtidigt som psikos hölls lägre än 0,2 viktprocent, beräknat på torr basis.

Bxemgel 3 Detta exempel demonstrerar direkt isomerisering av glukos till 57,2% fruktos enligt ett tvåstegs-isomeriseringsförfarande, vari den förses reaktorn hölls vid 7o°c och den andra (hög- tsmpsrssur-)rssk:orn hölls vid llo,4°c. net kemisk: stabili- .serade isomeraset använt i högtemperaturreaktorn är ett, vari enzymet är kovalent bundet till en löslig polymer och sedan gjorts olösligt för att bilda en immobiliserad katalysator.

Substratet och dess konversion i förstastegs-reaktorn vid 70°C har beskrivits i exempel 1.

Den immobiliserade katalysatorn använd i bögtemperaturreaktorn vid llO,4°C har ävenså beskrivits i exempel 1.

Reaktorn med temperatur llO,4°C bereddes på följande sätt.

En mängd om 28,4 g av katalysatorn suspenderades i substratet och avluftades under laboratorievakuum vid rumstemberatur i 60 minuter. Den avluftade uppslamningen användes för att be- reda en 2,5 x l2,4 cm bädd i en mantelförsedd glaskolonn. Den packade bädden innehöll 10 885 IGIU, ,Substrat berett från det första stegets 70°C isomerisering justerades till pä 6,47 och utspäddes till 42,0% torr substans.

Detta substrat pumpades sedan genom högtemperaturreaktor- kolonnen under ett tryck av 0,8 kp/cmz (12 psi) och vid en flödeshastighet av 3,38 ml/minut, varvid temperaturen hölls vid 60°C i 30 minuter. Temperaturen inom kolonnen avkändes med termometer belägen direkt ovanför bädden och omgiven av 0,3 cm glaskulor för att minimera dödvolymen så mycket som möjligt.

Kolonntemperaturen ökades därefter snabbt genom att cirkulera ss sljs från ett hsa, tsrmsstatlsscällt på ll1°c,-via msncsln. »i ~Gwír -.....__......_..._._______ i i- 4eof48o 30 Effluenten från kolonnen reglerades med en registrerande polari- meter kalibrerad att avläsa från 50 till 58% fruktos. När kolonntenperaturen nått ll0,4°C och när fruktoshalten 1 effluen- ten uppnått önskad nivå, uppsamlades effluenten och kyldes omedelbart i ett isbad. pH justerades till 4,0 genom tillsats avßl M citronsyra.

Isomeriserade lösningar erhållna från 70°C- och ll0,4°C+reak- torerna analyserades med avseende på kolhydratkmposition och färg och resultaten jämfördes med liknande analys genomförd på den oisomeriserade substratlösningen såsom visas i följande tabell. rr 71 “vmff--n- .. ïøfiïwwuw. _, “wq-f-üfwvv 460 480 31 wwmfi >.o_ m.O AOOHX mmfiuv mumw \. . s ß _ . , o H m.o m.Hw. ~.>m uo«.oHd ¶«>.æwnmm«umEomH. \ u m o o m.@« m.~m oooß w«> øøuwmfluusonfi ~ _ _ w_o_ o ~.mm o wflummfinweomfiø wflumxummæfiom moxfimm moxsflø mouxsum wcflfincøzmn mcmunficmna ^m«mmn uno» .fluwxmm am uæcxwumn ucmo0nmux«>v cofiuflmomëoxumunænfloa uo«.oHH :oo uooß fl«> mumummfiumfiomfl umwcflcmnflumuumnsm >m uwcoflufimomeøx ~_aH@nma Qp, 460 4so 32 Resultaten visar att S7,2% fruktos uppnâddes samtidigt som psikos hölls lägre än 0,4 viktprocent, torr basis, och färg (crnrxlob) lägre än 20.

Exempel 4 Detta exempel demonstrerar direkt isomerisering av en glukos- haltig lösning huvudsakligen innefattande ett raffinerat majs- stärkelsehydrolysat för,att uppnå en komposition av 56,3% fruk- tos, beräknat på torr basis, varvid ett tvåstegs-isomer1serings- förfarande användes. En lågtemperaturisomerisering vid 70°C genomfördes först, varvid produkten från denna reaktion använ- des som tillfört material till en andra högtemperaturreaktor (l03,3°C) innehållande ett kemiskt stabiliserat isomeras. Det kemiskt stabiliserade isomeraset är ett, vari enzymet sam- reagerats med ett skyddande protein (såsom det härlett från jäst).

Lågtemperatur-isomeriseringssteget, inkluderande en beskriv- ning över substrat och experimentella betingelser, presente- ras i exempel l.V Det kemiskt stabiliserade glukosisomerasenzymet använt i hög- temperaturreaktorn framställdes på följande sätt. Lösligt _glukosisomeras för kemisk stabilisering bereddes och renadesl enligt metoden beskriven i exempel l. Denna berednings speci- fika aktivitet var cirka 40 IGIU/mg protein. Ett skyddande protein erhölls från bagerijâst enligt följande förfarande. f Till 1229 g bagerijäst, våt kaka, sattes 1000 g vatten och 4-500 g toluen. Blandningen omrördes vid rumstemperatur över natten, uppvärmdes sedan till 85°C och hölls vid denna tempe- piratur i cirka 30 minuter. Blandningen filtrerades på en Buchner- _ ,Ûtratt. Nära hela mängden toluen kvarstod i det olösliga cell- iQ§avfallet, samtidigt som det vattenbaserade filtratet innehöll 'lösligt-jästextrakt. Det vattenbaserade filtratet reducerades ïeigveiyr till 276 g (retererae iraunetere, 4o°c), varefter ¿4i g trikierättikeyre tillsattes under errörring. net utfällde jästproteinet uppsamlades, återlöstes sedan i 0,l M natrium- 'fosfatbuffert (pH 7,0). Efter klarning genom filtrering, be- handlades lösningen med 900 ml (cirka 3 volymer) aceton. Fäll- ningen uppsamlades, löstes i 0,01 M natriumfosfatbuffert (pH 7,0), och den resulterande lösningen dialyserades mot 0,01 M natriumfosfatbuffert. Den resulterande produkten (150 ml) var märkt, skyddande protein erhållet från bagerijäst. En 0,6% kitosan-lösning bereddes genom att lösa 24 g kitosan (Kytex från Hercules Inc., Wilmington, Delaware) i 4 liter 0,08 N H01. Lösningen justerades till pH 6,2 med 8 N Na0H, filtrerades genom Whatman #3 filter-papper, dialyserades sedan mot 16 liter avjoniserat vatten. I ett dekanterglas med volym 400 ml place- rades cirka 100 000 IGIU av lösligt glukosisomerasenzym (blan- dad med fiicernjäip), i 9 xylitol och 1oo mi (2/3) av det skyddande proteinet erhållet från bagerijäst. Till denna bland- ning sattes 2,4 mg MgS04.7H20 och 24(mikroliter molar kobalt- kloridlösning. Blandningen filtrerades för att avlägsna fil- terhjälp, varefter lösningen koncentrerades (roterande in- dunstare,*~« 40°C) till nära torrhet i en“2 liters rundbottnad kolv. Till kolven sattes därefter 800 ml kitosan (pH 6,2).

Blandningen koncentrerades sedan (roterande incunstare, «~»4o°c) :iii nära torrnec och e4o mikrøliter soz-ig gifitar- aldehydlösning (pä-justerad till 6,5) tillsattes. Blandningen lagrades i ett kallt ru över natten. Gelen uttogs sedan ur kolven och tvingades genom en sikt U.S. #30 mesh och ugnstor- kades vid f-'31°c. nen tørkaae enzymbereaningen siktaaes för att avlägsna fina partiklar (ILLSQ-sikt ß 80 mesh), och använ- des dârefter (8,9 g av slutprodukten) för högtemperatur- isomerisering.

Reaktorn.med temperatur l03,3°C bereddes på följande sätt.

Ovan nämnda glukosisomerasberedning (8,9 g) suspenderades i substrat_och avluftades under laboratorievakuum vid rumstem- vuperatàr i cirka 30 minuter. Den avluftade üppslamningen an- ¿'vanaes för att bereda en 1,5 X 29 cm bada 1 en manceiförseaa *f,glasko1onn.¥, 0 'H -_'~.\'!. a, ,_...,.,_,VE,,¿...

""T“"*"'”'*.~"f*:-v--1w~m'~':~vm-rw~1~~--w-, f» ~~ VÅSÛ 480 34 Substratet berett i det första stegets 70°C isomerisering juste- rades till pH 6,75 och utspäddes till 42,0% torr substans.

Detta substrat pümpades sedan genom högtemperatur-reaktor- kolonnen vid en flödeshastighet av cirka 1 1/2 ml/minut, med temperaturen vid 60°C i 30 minuter. Temperaturen inuti kolonnen avkändes med en termometer belägen direkt ovanför bädden, och omgiven av glaskulor (diameter 0,5 cm) för att minimera död- volym. kolonntemperaturen ökades därefter snabbt genom cirkule- ring av en olja från ett på l04°C termostatinställt bad via manteln.

Effluenten från kolonnen reglerades med en registrerande pola- rimeter kalibrerad att avläsa från SO till 58% fruktos. Frak- tioner (cirka S ml) uppsamlades till dess att 55% eller högre fruktoshalt framställdes, och vid denna punkt avslutades för- söket. Under provuppsamling kyldes effluenten omedelbart i ett isbad och pH justerades till ~«4,0 genom tillsats av molar citronsyra (0,1 ml) âtföljt av utspädd HCl.

~Isomeriserade lösningar erhållna från 70°C- och lO3,3°C- reaktorerna analyserades med avseende på kolhydratkoposition och färg. Resultaten jämfördes med liknande analys genomförd på den oisomeriserade substratlösningen såsom visas i följande tabe1l._ **\="""=.o'.w ffs. ._ - . ...f-- - 460 480 O.wm ß.O 35 m.O ^OOfix ÉHB muwm ~.~ ~.o m.~« m.wm uon.nofi øfl> uuuømflumfiomu m.~ o . w.wv L m.~m _ uno» øfl> uøummflumeowfi w.~ o w.>m o _ ømummflumsouflo øfiumxommæfiom moxflmm moxnflo. mouxsum Amflmmn uuou _«u«xmø wa uncxwumn »cmooumux«>. =o«u«momeoxumuø>:Hox \ uom.mofi :oo uooß m«> mømuwmfluwëomfi ummcficmnflumuumnsm >m umcofluflmomeox _ v afimnßß .l H 4 aok-d 4 kaio 1"' *'“ "W i .wßnrwwuwwnwørmme-fflwwtwwv_w__w___r MW" . _ ,, ,_..-ï-.w~ m-»mwmuunwmm- wfl-fldwfii-. dö Resultaten visar att 56,3% fruktos uppnåddes samtidigt som psikos hölls lägre än 0,2 viktprocent, beräknat på torr basis.

Exemgel 5 Detta exempel demonstrerar direkt isomerisering av en glukos- haltig lösning, huvudsakligen innefattande ett raffinerat majsstärkelsehydrolysat med låg saltkoncentration för att upp- nå en komposition av 55,4% fruktos, beräknat på torr basis, varvid ett tvåstegs-isomeriseringsförfarande användes. En låg- temperaturisomerisering vid 70°C genomfördes först och produk- ten från denna reaktion användes som tillfört material i en andra högtemperaturreaktor (ll2,6°C) innehållande ett kemiskt stabiliserat isomeras. Det kemiskt stabiliserade isomeraset är ett, vari enzymet är kovalent bundet till en löslig poly- mer på sätt med flerpunkts-fäste, och sedan gjorts olösligt för att bilda en imobiliserad katalysator.

Hydrolysatet framställdes av majsstärkelse t.ex. enligt för- faranden beskrivna i U.S. patent 3 644 l26 (smältning) och U.S. patent 3 280 006 (sackarisering). Den sackariserade lös- ningen nnïhrxakß enligt U.S. patent 3 834 940 för att ge en produkt innehållande 93,8t glukos, torr basis. Tillräcklig mängd kristallin glukos tillsattes för att bringa den totala glukoshalten till 96,9%, beräknat på torr basis. Den resulte- rande lösningen hade följande sammansättning: Total torr substans (%) 50,3 Glukos (% torr basis) s 96,9 Fruktos (% torr basis) 0,1 Polysackarid (% torr basis) 3,1 Psikos (% torr basis) 0,0 nanso3 (m) 2,5 jngsoå (nu) 2,5 cocx. (nu) - . 0,1 . 2 fjpfl _ _ 6,8 460 480 37 Lågtemperaturisoeriseringen genomfördes vid 70øC genom att pumpa ovan nämnda substratlösning genom lågtemperaturreaktorn, beskriven i exempel l, vid en flödeshastighet av 2,5 ml/minut.

Den första mängden om 1000 ml utgående från reaktorn kastades bort. Den därefter utgående effluenten uppsamlades för använd- ning i den andra högtemperaturisomeriseringen.

Den kemiskt stabiliserade katalysatorn använd i högtemperatur- reaktorn framställdes på följande sätt. Lösligt glukosisome- ras bereddes och renades enligt metoden beskriven i exempel l.

Denna berednings specifika aktivitet var cirka 40 IGIU/mg protein. En lösning av löslig polymer, en polyamin, erhölls genom att lösa 48,4 g kitosan (Kytex från Hercules Inc., Wilmington, Delaware 19899) i 15 l 0,08 N HCl. När den väl lösts, gjordes kitosanlösningen 0,5 M med avseende på NaCl genom tillsats av 438 g NaCl och den resulterande lösningen justerades till pH 6,1 med 8 N NaOH. Kitosanlösningen filtre- rades sedan genom ett Whatman #=3 pappersfilter för att av- lägsna olösligt material. Till l5 liter 0,3% kitosan i 0,5 H V NaCl vid pH 6,1 sattes följande: 520 ml lösligt isomeras inne- hållande cirka 602 000 IGIU aktivitet, 236 g xylitol (från Sigma Chemical Co.) och 3,07 g MnCl2.4H20. Denna lösning o- rördes i 2 timmar, varefter 7,44 g l-etyl-3-dimetylamino- propylkarbodiimid (frân Sigma Chemical Co.) tillsattes för att _kovalent binda isomerasets karboxylgrupper på flerpunkt-sätt ¿ till aminogrupperna i kitosanen. Efter 2 timmar vid rumstem- š “peratur sattes 15,5 ml av en 50% (vikt/vikt) glutaraldehydë 7 lösning (från Eastman Kodak Chem. Co), justerad till pH 6,0 med 8 H Na0H, till reaktionen för att insolubilisera det kovalent bundna isomeras-kitosan-komplexat. Efter 15 minuter blandades 4 liter 1 M fosfatlösning vid pH 8,0 in i nämnda olösliga isomeras-kitosan. Immobiliserad isomeras-kitosan 'tvättades med avjoniserat vatten på ett Buchner-vakuumfilter ; innehållande Whatman f 3 filterpapper. Beredningen luft- ; 0 M utorkades,_maldes och siktades till intervallet 12 - 60 mesh. _ in ibenftorrarkatalysatorn hade en uttalad aktivitet av 803 ' a46o 4ao 38 Reaktorn med temperatur ll2,6°C preparerades på följande sätt.

En mängd av 7,0 g katalysator suspenderades i substrat och av- lluftades under laboratorievakuum vid rumstemperatur i 60 minu- ter. Den avluftade uppslamningen användes för att bereda en - 1,0 x 40 cm bädd i en mantelförsedd glaskolonn. Den packade bädden innehöll 5621 IGIU.

Substrat berett från det första stegets 70°C isomerisering justerades till pH 6,55 och utspäddes med avjoniserat vatten till 42,08 torr substans, vilket också sänkte saltkoncentra- tionerna till 2,1 mM för NaHSO3 och 2,1 mn för MQSO4. Detta substrat pumpades sedan genom högtemperatur-reaktorkolonnen under ett absolut tryck av 0,8 kp/cmz (12 psig) i 10 minuter vid en flödeshastighet av 8 ml/minut med temperaturen vid 60,0°C. Temperaturen i kolonnen uppmäïtes med en termometer belägen direkt ovanför bädden, och omgiven av sand upp till temperaturskalan för att minimera dödvolym så långt som möj- ligt. Kolonntemperaturen ökades därefter snabbt genom att cirkulera en olja från ett termostatinställt bad vid cirka ll4°C. Kolonntemperaturen ökades till ll2,6°C och flödes- hastigheten minskade till 1,89 ml/minute Effluenten från kolonnen reglerades med en avläsande poleri- meter kalibrerad att avläsa från 50 till 58% fruktos. När kolonntemperaturen nått ll2,6°C och fruktoshalten i effluenten uppvisade önskad nivå, uppsamlades effluenten. pH justerades "omedelbart till 4,0 genom tillsats av 1 M citronsyra. Effluen- ten uppsamlades till det att den synbara fruktoshalten sjönk under 55%. Q Isomeriserade lösningar erhållna från 70°C- och ll2,6°C-reak- Üftorerna analyserades med avseende på kolhydratkomposition och dfärg och resultaten jämfördes med liknande analys genomförd på oisomeriserad substratlösning som visas i följande tabell.

W fiU W 8 nu W n W. . .

W f W . ß .

W w \ _ _ . > _ m m m m N ._10 O_Nv ímm _ U0w_N._Ä Ofl> Uønflmfiumšømfi Å Q >_~ 0 m.m« «_Hm uooß @fi> wfluwmflumeowfl M o H_m , . 0 m_wm o . uønmufiumeomfln. ß , ,: f_ W .oofix _ uflumxummæflom moxflmm moxsflø mouxsum mc«Hocm:mnÅmcøu:«:mnA, W ||z| > _ >. L n mmuoví fimfiwma uuou .flumxmm mm umcxmnwn ucwuoum»x«>v , muwm , coflåmømëoxumuøanflox uow.-H :un.uooß w«> wumnwmfiuweomfid ummcflcmnfiwnuvmnsm >m uwcoflufimomëox, A W Hdwnflw 460 480 40 Resultaten visar att 55,4% fruktos erhölls samtidigt som psikos hölls lägre än 0,2%, beräknat på vikt och torr basis, och färg <9 (CIRFxlOO)- ^ Exemgel 6 Detta exempel demonstrerar direkt isomerisering av en glukos- haltig lösning, huvudsakligen bestående av ett raffinerat majs- stärkelsehydrolysat med låga salthalter för att uppnå en kompo- sition av S4,8% fruktos, beräknat på torr basis, med extremt låg psikos [< stegs-isomeriseringsförfarande användes. Den första (lågtem- peratur-) reaktorn hölls vid 70°C och den andra (högtempera- tur) reaktorn höns vid 1os,a°c. ne: kemisk: suabiliserade isomeraset använt i högtemperaturreaktorn är ett, vari enzymet är kovalent bundet till en löslig polymer på flerpunkt-sätt och sedan gjorts olösligt för att bilda en imobiliserad kata- lysator.

Substratet och dess omvandling genom första stegets reaktor vid 70°C beskrives i exempel 5.

Den immobiliserade katalysatorn använd i högtemperaturreaktorn vid lOS,8°C beskrives i exempel 5. 105.800-reaktorn preparerades på följande sätt. En mängd av 5,63 g katalysator suspenderades i substrat och avluftades under laboratorievakuum vid rumstemperatur i 60 minuter. Den I avluftade uppslamningen användes för att bereda en 1,0 x 32 cm bädd i en mantelförsedd glaskolonn. Den packade bädden inne- höll 4521 IGIU. - Substrat berett från det första stegets 70°C isomerisering justerades till pH 6,5 och utspäddes med avjoniserat vatten ,ti1l.42,0% torr substans, som också sänkte saltkoncentrationen l ttill 2.1 mn för MgSO¿ och 2,1 mn för NaBS03. Detta substrat t.Hpumpades sedan genom bögtemperatur-reaktorkolonnen under ett 460 480 41 absolut tryck av Ö,7 kp/cmz (10 psig) och vid en flödeshastig- het av 8 ml/minut i 10 minuter med temperaturen vid 60,0°C.

Temperatfiren inuti kolonnen mättes med en termometer belägen direkt ovanför bädden och omgiven av sand upp till temperatur- skalans början för att minimera dödvolymen så långt sm möj- ligt. Kolonntemperaturen ökades därefter snabbt genm att cirkulera en olja från ett termostatförsett bad vid cirka l07°C via manteln.

Effluenten från kolonnen avkändes med en registrerande polari- meter kalibrerad för att avläsa från S0 till-58% fruktos. När kolonntemperaturen nått lOS,8°C och effluentens fruktoshalt uppvisade den önskade nivån, uppsamlades effluenten. pH juste- rades omedelbart till 4,90 genom tillsats av IVM citronsyra.

Isomeriserade lösningar från 70°C- och l05,8°C-reaktorerna analyserades med avseende på kolhydratkomposition och färg 'och resultaten jämfördes med liknande analys genaförd på den oisomeriserade substratlösningen såsom visas i följande tabell. ß\ W m.~ H.ov. m.~« æ.vm oom.mofi fl«> uøuamfluuëoufl Å o >.~ o m.m« v_~m uooß.fl«> ømummfluwecmfi o .Én o v f: To .V unummflumsomfio W oofix m¶mmmmmmNmmM_ uox«umV moxsflu mouxsum wcflflwcøsan mcmmcflcman mmfiuv .mfimmn uno» _«u«xmm mm uacxwumn »:øuou@»x«>. wuwß :o«u«moasox»@uw>:~ox 460 4so uø@_mofl =u0.u0oß ««> wwmhmwfluweømfl umwcflcmæfiumuuwnsm >m umcofluflmomaox w.Hfi@@ß@ 460 480 43 Resultaten visar att 54,8% fruktcs uppnâddes samtidigt svom psikos hölls lägre än 0,125, beräknat på vikten och torr basis, och färgèn (crarxloo) wgre än 2.

Claims (5)

1. 46o 4so 9% PATENTKRAV l. Förfarande för isomerisering av glukos till fruktos, vilket innefattar att man bringar en glukoshaltig matarlösníng inne- hållande från ungefär 20 till ungefär 65 viktprocent glukos i kontakt med glukosisomeras vid en temperatur av från ungefär 90 till ungefär l40°C vid ett pH av från ungefär 3 till unge- fär 8, vid en verklig kontakttíd av från ungefär l sekund till ungefär S timmar, för att åstadkomma en sluthalt i nämnda lösning av minst ungefär 53 till 60 viktprocent fruktos, be~ räknat på den totala kolhydrathalten, k ä n n e t e c k n a t därav, att glukosisomeraset är kemiskt stabiliserat och att nedbrytníngstiden kontrolleras till ett värde som är mindre än det värde som beräknas med formeln: td = a log (4300/(T+273) - pH - 3,23) (l) vari T är reaktionstemperaturen i °C; pH är reaktionsblandnin- gens pH; och td är nedbrytningstiden i minuter; för att und- vika väsentlig bildning av psikos och/eller andra icke-fruk- tos-, icke-glukos-sockerarter.

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att den glukoshaltiga lösningen erhålles från hydrolys av majsstärkelse.

3. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t Vdärav, att den glukoshaltiga matarlösningen erhålles genom isomerisering av ett majsstärkelsehydrolysat till en fruktos- han; upp :in cirka 52% beräkna: på aan den totala xçlnyarat- halten.

4. Förfarande enligt något av patentkraven l till 3, k ä n - 'n ett e c k n a t därav, att källan för glukosisomeraset är _enlmikroorganism utvald bland Streptomxces-arter. »fm ~* ÖJ 'f HW, H vmfl~~ av wïïqw, __ .. .___ .__ ...~-«-«- -~- ~~v-.....<..,,, ,,__,,,._,,.... w _ , , _ \ - 460 480 êš” S. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 3, k ä n - ' n e t e c k n a t därav, att källan för glukosisomeraset är en mikroorganism utvald bland Stregtomxces §E¿ ATCC 21175- 6. Förfarande enligt något av patentkraven l till 3, k ä n + n e t e c k n a t därav, att källan för glukosisomeraset är ' - V en mikroorganism i vilken en muterad glukosísomerasgen in- förts, vilken muterade gen tillhandahåller glukosisomeras med hög termisk stabilitet. 7. Fdrfarande enligt något av patentkraven 1 till 3, k ä n - n e t e c k n a t därav, att glukosisomeraset är ett termískt lstabilt glukosisomeras. : ÅS. Förfarande enligt patentkravet 6 eller 7, k ä n n e - ,t e c k n a t därav, att det termiskt stabila glukosisome- raset erhållits från Bacillus stearothermophilus. 9. Förfarande enligt något av patentkraven l till 8, k ä n - n e t e c k n a t därav, att en enzym-denatureringsinhibe- grande mängd av ett vattenlösligt salt av svavelsyrlighet före~ èligger i isomeriseringsmediet. E10. Förfarande enligt något av patentkraven l till 9, k ä n - än e t e c k n a t därav. att den glukoshaltiga matarlösningen. Éinnenäiier från cirka 30 till cirka so viktprocent kolhydrat. dill. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 10, k ä n -l Q än e t e c k n a t därav, att den glukoshaltiga matarlösningen¿ Ébringas till kontakt med kemiskt stabilisert glukosisomeras švia cirka 1oo°c till cirka 11o°c. lll-ewa.,- É V_lÉ12. V tån ett etc k n a t därav, att pH för isomeriseríngsmediet ähålles vid cirka 5 till cirka 6,$. gl3.gFöríarande enligt något av patentkraven l till 12, k ä n -. Än e t efc R n a t därav, att kontakttiden utgör från cirka 2 L, pdnuter till cirka 30 minuter. a-“ßmwwawllul-.aww 460 V4so n, -14; Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 13, k ä n - Än egt e c k n a t därav, att det kemiskt stabiliserade íglukosisomeraset användes i immobiliserad form. ådärav, att det kemiskt stabiliserade glukosisomeraset immobi- Éliseras på dietylaminoetylcellulosa. %l6. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 15, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar den glukos- .haltiga matarlösningen innehållande från cirka 20 till cirka §6S viktprocent glukos i kontakt med glukosisomeras vid en Étemperatur av från cirka 20°C till 80°C vid ett pñ av cirka 6 till 9 och under en kontakttid, som är tillräcklig för att uppnå en sluthalt i nämnda lösning av åtminstone cirka 40 till 50 viktprocent fruktos, beräknat på total kolhydrathalt; ökar isomeriseringsmediets temperatur till från cirka 90°C till ïcirka l30°C: justerar isomeriseringsmediets pH efter behov ftill ett intervall från cirka 3 till cirka 8; bringar den Éfruktoshaltiga lösningen i kontakt med kemiskt stabiliserat glukosisomeras under en verklig kontakttid som är tíllräcklíg¿ _ :.íör att uppnå en sluthalt S3 till 60 viktprocent fruktos, beräknat på total kolhydrat- ihalt, varvid nedbrytningstiden kontrolleras ligga vid ett ivärde lika med eller under värdet beräknat enligt formeln o td a lag (43oo/-r+213) - pn - 3,23) (1) _ qvari T är reaktíonstemperaturen i °C; pH är reaktionsbland- lningens pH och t¿ är nedbrytningstíden i minuter; för att ~undvika väsentlig bildning av psikos och/eller andra icke- vvrfruktos-, ickeeglukos-sockerarter. .äV"n¿e't_e.c_k*n a tr därav, att produkten fruktos~glukos~sirap- ïkyles till en temperatur lägre än cirka 80°C. ii-iVlÜÅkFörfarande enligt något av patentkraven 1 till 16, k ä n - 1

5. Förfarande enligt patentkravet 14, k ä n n e t e c k n a_t nämnda lösning av åtminstone cirka i F, 1 9 x «..-<«,v;..re~..“aw. ~ ~ -» g x 4? 460 480 18. Förfarande enligt något"av patentkraven 1 till 17, k ä n - n e t e c k n a t därav, att isomeríseríngsblandningen kyles till en.temperatur från cirka 20 till cirka 80°C när: enzymet bringats ur kontakt med isomeriseringsblandningen. i i _ : i