NO165554B - Frem. til fremst. av krystallinsk alkoholoksydase fra mikroorganismer av slekten pichia, krystallinsk alkoholoksydase fra pichia pastoris og bruk av den fremstilte alkoholoksydase for bestemmelse av alkoholinnhold i vaeskeproever - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av krystallinsk alkoholoksydase. En annen side ved oppfinnelsen angår en krystallinsk alkoholoksydase. Nok en side ved oppfinnelsen angår anvendelse av slike alkoholoksydaser for bestemmelse av alkoholinnhold i væskeprøver.

Det er kjent at alkoholoksydaser kan fremstilles ved forskjellige mikroorganismer som dyrkes på metanol, skjønt ikke på etanol. Disse alkoholoksydaser katalyserer reaksjonen

hvor R er hydrogen eller et lavere alkyl, generelt valgt fra H-, C<H>3-, CH^CH^-r og C<H>^Cf^^-' Alkoholoksydaser kan anvendes

til oppsamling eller fjerning av oksygen fra forenlige oppløs-ninger samt til fremstilling av aldehyder og hydrogenperoksyd.

I kombinasjon med en egnet målesonde kan alkoholoksydase-enzymet anvendes til å bestemme konsentrasjonen av alkohol, særlig av alkoholer såsom metanol og etanol. Slike enzymer er derfor nyttige i anvendelser som f.eks. måling av alkoholnivåer i biologiske fluider, f.eks. blod, o.l.

Enkelte anvendelser av disse enzymer er blitt hindret

på grunn av at det rene enzym ikke har vært tilgjengelig i handelen i rimelige mengder for de foreslåtte anvendelser.

Et av problemene i forbindelse med de tidligere kjente alkohol-oksydasetyper er at de, i likhet med mange enzymer, er vanske-

lige å isolere i relativt rent tilstand, f.eks. i en form som stort sett er fri for katalaseaktivitet. En rekke teknikker f.eks. fraksjonert utfelling ved bruk av materialer såsom ammoniumsulfat, alkohol eller polyetenglykol, eller kolonnekromato-grafi under anvendelse av ionebytte-harpikser eller gel- mole-kylarsiktmedia har vært benyttet for fremstilling av det rensede enzym. Isolering av relativt ren alkoholoksydase ved bruk av slike teknikker er vanskelig og material- og tidkrevende, og er årsak til en stor del av omkostningene forbundet med det i handelen tilgjengelige enzym. Den resulterende høye pris på relativt rene alkoholoksydaser fører til begrenset bruk av disse enzymer og oppmuntrer ikke til potensiell bruk av enzymet i anvendelser som krever store mengder av enzymet,

samtidig som det motvirker letingen etter nye anvendelser.

Videre vil, slik det er kjent innen faget, stabiliteten av

de tidligere kjente alkoholoksydase-enzymer overfor temperatur og PH-verdi, deres spesifisitet overfor spesielle substrater og deres tendens til å hindres av disse og andre forbindelser, samt hastigheten av den katalyserte reaksjon, også virke inn på de potensielle formål som slike enzymer på. en mest effektiv og virksom måte kan anvendes til.

Det er nå funnet en ny alkoholoksydase som oppviser tildels forskjellige egenskaper sammenlignet med kjente alkoholoksydaser, særlig med hensyn til den letthet hvormed den kan krystalliseres i gjenvinningsoperasjoner, f.eks. dialyse.

Den nye alkoholoksydase skaffes fra metanol-forbrukende mikroorganismer av slekten Pichia.

I henhold til én side ved oppfinnelsen blir der fremstilt en ny type krystallinsk alkoholoksydase. 1 henhold til andre sider ved oppfinnelsen er der skaffet fremgangsmåter til fremstilling av slike nye enzymer.

I henhold til én side ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten å fremstille en vandig fluidum-suspensjon av celler av en metanol-forbrukende mikroorganisme av Pichia-typen. Det vandige fluidum som inneholder en suspensjon av celler homogeniseres for fremstilling av et homogenat. Suspenderte faststoffer fjernes fra homogenatet for fremstilling av en rå-oppløsning med nyttig enzymaktivitet, inneholdende alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen som en oppløselig alkoholoksydase. Metoden omfatter å fremstille alkoholoksydasen i krystallinsk form, hvilket er særlig ønskelig for industrielle anvendelser. Den krystallinske form fås ved at den således fremstilte oppløsning dialyseres mot et dialysemedium gjennom en membran som er ugjennomtrengelig for alkoholoksydasen, men gjennomtrengelig for vann og eventuelle buffermolekyler, for oppnåelse av en effektiv celletetthet som er virksom for krystallisering av alkoholoksydase, i en gjenvinningsområde-oppløsning med en molar ionestyrke på 0,01-0,05 M og en pH-verdi på 5,7 5-6,75 på enzymsiden av membranen, hvorved der fås krystallinsk alkoholoksydase .

Oppfinnelsen omfatter også den således fremstilte alkoholoksydase. Videre omfatter oppfinnelsen anvendelsen av den nevnte alkoholoksydase for bestemmelse av konsentrasjonen av kortkjedet alkohol i utvalgte prøver.

Alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen fremstilles av gjærarter av slekten Pichia.

To eksempler på egnede stammer av gjærsorter av arten Pichia pastoris er deponert i United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service, Northern Regional Research Laboratories of Peoria, Illinois, og er gitt betegnel-sene NRRL Y-11430, resp. Y-11431.

Ifølge oppfinnelsen blir en utvalgt art metanol-kompe-tent gjærsort av Pichia-typen dyrket under aerobe, vandige gjæringsbetingelser under anvendelse av metanol som karbon-

og energikilde. Metanolen tilføres fortrinnsvis under slike betingelser at metanol er den vekst-begrensende faktor. De ved metanol begrensede betingelser er for oppfinnelsens formål definert som den minste metanolkonsentrasjon som vil gi en maksimal vekstrate for et gitt sett dyrkningsbetingelser for gjærkulturen. Gjæringen utføres fortrinnsvis ved høy celletetthet, dvs. en celletetthet på 100 g eller mer regnet på tørrvekt pr. liter gjæringssubstrat. Den valgte gjærsort dyrkes i en

satsvis eller kontinuerlig prosess i nærvær av oksygen, metanol og en assimilerbar nitrogenkilde. En rekke kjente gjæringspro-sesser og -apparater kan anvendes. F.eks. kan der anvendes en skumtype-fermentor slik et er beskrevet i US-PS 3 982 998, eller et annet egnet gjæringsapparat kan anvendes.

Oksygen kan tilføres fermentoren i ren form eller

i form av oksygenanriket luft, med et trykk i området 9,8 kPa-9,8 MPa, slik det er kjent i faget. Den assimilerbare nitrogenkilde for gjæringen kan være en hvilken som helst

organisk eller uorganisk nitrogenholdig forbindelse som skaf-fer nitrogen i en form som er egnet til metabolsk anvendelse av mikroorganismene. Egnede organiske nitrogenkilder omfatter f.eks. proteiner, aminosyrer, urea og lignende. Egnede uorganiske nitrogenkilder omfatter f.eks. ammoniakk, ammoniumhydroksyd, ammoniumnitrat og lignende. De for tiden foretrukkede nitrogenkilder omfatter ammoniakk og ammoniumhydroksyd på

grunn av deres anvendelighet og tilgjengelighet.

pH-verdien av det vandige mikrobielle gjæringsstoff

bør ligge i området 3-7, fortrinnsvis og mer vanlig 3,5-5,5. Det pH-område som foretrekkes av visse mikroorganismer avhenger til en viss grad av det medium og den spesielle mikroorganisme som anvendes, og kan således forandre seg noe med mediet, hvilket lett kan bestemmes av fagfolk.

En tilstrekkelig mengde vann opprettholdes i fermentoren for å imøtekomme de spesielle behov til den mikroorganisme som anvendes, og for å skaffe et bærerfluidum for de vannoppløselige næringsstoffer. Mineraler, vekststoffer, vita-miner o.l. tilsettes vanligvis i mengder som varierer i henhold til den anvendte mikroorganisme-stamme og de valgte dyrkningsbetingelser, og er kjent eller kan med letthet bestemmes av fagfolk. Et typisk næringsmedium er angitt nedenfor i innled-ningen til eksemplene.

Mikroorganismens vekst er følsom overfor driftstempera-turen av fermentoren, og hver enkelt mikroorganisme-stamme har en optimal veksttemperatur. Eksempelvis ligger gjæringstemperaturene i området 20-65°C. Den temperatur som velges avhenger i alminnelighet av den mikroorganisme som anvendes i prosessen da der for hver enkelt mikroorganisme vil være en noe forskjellig sammenheng mellom temperatur og vekstrate.

Gjæringstrykkene ligger generelt i området 9,8 kPa-9,8 MPa, vanligvis 98 kPa-2,9 MPa, og fortrinnsvis 9,8-49 kPa, da de høyere trykk resulterer i et høyere nivå av oppløst oksygen i det vandige medium og vanligvis i høyere celleproduktivi-teter.

Ved isoleringen av alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen blir der produsert et fluidum som er en vandig suspensjon inneholdende celler av den utvalgte mikroorganisme. Det vandige fluidum kan være en utløpsstrøm fra fermentoren som kan anvendes direkte eller fortrinnsvis etter justering av pH-verdien som beskrevet nedenfor. Alternativt kan de suspenderte mikroorganisme-celler opprinnelig separeres fra gjærings-mediet, f.eks. ved sentr i fuger ing eller filtrering gjennom filtere med en porestørrelse som er mindre enn størrelsen av de enkelte celler, og deretter re-suspenderes i en passende mengde vann eller egnet buffer, f.eks. KH2PO^/Na2HPO^-buffer på 0,2 M. Det er funnet at celletettheten i den vandige suspensjon må være større enn minimums-krystallisasjonstettheten. Tilfredsstillende resultater oppnås hvis celletettheten i fluidet er større enn ca. 75 g pr. 1 fluidum regnet på tørr-vekten. Det er funnet at tilfredsstillende resultater oppnås hvis utløpsstrømmen fra fermentoren dersom denne skal anvendes som fluidumet, først justeres på en pH-verdi på ca.

7,5 ved tilsetning av en base, f.eks. ammoniumhydroksyd, natrium-hydroksyd o.l. pH-verdien anses imidlertid ikke å "være kritisk, og pH-verdien av den vandige suspensjon behøver ikke justeres før homogeniseringen. Det er imidlertid ansett som gunstig å foreta en grov justering av pH-verdien innen området 6-9

da enzymet er aktivt og stabilt i dette område.

Det celleholdige fluidum homogeniseres ved egnede kjente metoder. For eksempel kan en utløpsstrøm fra fermentoren inneholdende gjærsorter som er dyrket på metanol justeres på en pH-verdi på ca. 7,5 og homogeniseres med høy celletetthet-konsentrasjon, f.eks. 100-120 g biomasse (tørrvekt) pr. 1,

ved bruk av en "Dynomill" modell KDL med en 0,6 liters beholder under kontinuerlig drift ved 5-30°C og anvendelse av en nr.

3 beltekombinasjon og en strøm på 20-30 ml/h. Hombgenat-faststoffene skilles fra homogenatet for fremstilling av en rå-opp-løsning som inneholder alkoholoksydasen som en oppløselig bestanddel. Homogenat-faststoffene kan f.eks. fjernes ved sentrifugering for frembringelse av en cellefri fraseparert væske. Alternativt kan faststoffene fjernes ved filtrering gjennom filtere med egnet porestørrelse etterfulgt av justering av pH-verdien om ønskelig. Dersom det er ønskelig kan pH-verdien, for ytterligere rensetrinn, f.eks. gjenvinning av krystallinsk alkoholoksydase, justeres på en verdi av 5,75-6,75.

Rå-oppløsningen som Inneholder alkoholoksydasen har virksom enzymaktivitet og finner nyttige anvendelser i denne form. Alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen, isolert ved krystallisasjon, har imidlertid spesielle egenskaper som angitt nedenfor.

Rå-oppløsningen inneholdende den oppløselige alkoholoksydase kan behandles for gjenvinning av alkoholoksydasen i den kraftige krystallinske form som oppviser den høyeste aktivitet, ved at oppløsningen behandles under dialyse-betingelser enten ved vanlige dialysemetoder eller ved ultrafiltrering, for økning av gjenvinningshastigheten.

Ved dialyse blir rå-oppløsningen inneholdende den oppløse-lige alkoholoksydase dialysert mot et dialysemedium gjennom en membran som er ugjennomtrengelig for alkoholoksydase, men gjennomtrengelig for vann, buffer og uorganiske molekyler. Rå-oppløsningen fremstilles ved homogenisering av et vandig fluidum med en celletetthet som er virksom for krystalliser ing av alkoholoksydase når oppløsningen når et område med gjenvin-ningsbetingelser som angitt. Tilfredsstillende krystalliser ing er blitt observert for en effektiv celletetthet på ca. 75 g

(regnet på tørrvekt) pr. 1 vandig fluidum. Krystalliser ing ventes også å finne sted selv ved lavere effektive celletettheter, skjønt mengden av gjenvunnet krystallinsk alkoholoksydase er mindre. Under en minste-celletetthet som bestemmes empirisk (minste-krystallisasjonstetthet) blir der så å si ikke utvunnet noe krystallinsk alkoholoksydase. Den membran-

type som anvendes er ikke kritisk og en hvilken som helst egnet membran kan anvendes. For eksempel kan i handelen tilgjengelige hylser av celleuloseacetat anvendes for fremstilling av dialyseposer o.l., eller dialyseceller av hulfiber kan brukes. Oppløsningen som inneholder alkoholoksydase dialyseres mot et dialysemedium, f.eks. vann eller en bufferoppløs-ning for oppnåelse av en oppløsning med et gjenvinningsområde på enzymsiden av membranen med en ionestyrke i området 0.05-0,01 M hvilket bevirker utfelling av en elektroforetisk, homogen, krystallinsk oksydase.

Dialysemediet kan være et hvilket som helst medium forut-satt at den raolare ionestyrke av oppløsningen på enzymsiden av membranen passerer gjennom i det minste et parti av gjenvinningsområdet. Hvis f.eks. rå-oppløsningen inneholdende alkoholoksydase har en molar ionestyrke på 0,2 M kan dialysemediet være et passende volum destillert vann. Volumet av fluidum som enzymet dialyseres mot anses ikke som kritisk, så sant ionestyrken på enzymsiden av membranen passerer gjennom i det minste en del av gjenvinningsområdet.

Under dialysen bør pH-verdien av den alkoholoksydase-holdige oppløsning holdes innen området 5,75-6,75 ved bruk av et egnet buffersystem. Et egnet buffersystem omfatter f.eks. kaliumdihydrogenfosfat og dinatriumhydrogenfosfat. pH-verdien ligger fortrinnsvis i området 6.0-6,5 for gjenvinning av maksimale mengder krystallinsk alkoholoksydase. Som vist i eksemplene nedenfor er god krystallisasjon av alkoholoksydase observert innen et vidt pH-område, og det smale område representerer bare et for tiden foretrukket område av pH-verdien for oppnåelse av minimal oppløsning av enzymet.

Alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen er funnet å ha

den minste oppløselighet under disse betingelser i oppløsninger med en ionestyrke på 0,02 M og pH-verdi på 6,0-6,25. Følgelig oppnås optimal krystallisasjon ved at dialysen planlegges for oppnåelse av disse betingelser. God krystallisasjon kan oppnås ved utstrakt dialyse av den enzymholdige oppløsning mot store mengder buffere som oppfyller de ovenfor angitte betingelser. Alternativt kan dialysesystemet konstrueres for oppnåelse av optimale krystallisasjonsbetingelser enten når

det er i likevekt eller på et punkt som i tid ligger noe etter starten av dialysen. For eksempel kan en rå-enzymoppløsning med ionestyrke på 0,2 M og pH-verdi på 6,25 dialyseres mot et nidobbelt overskudd av destillert vann (i forhold til volumet av rå-enzymoppløsning). Ved innstilling av likevekt vil ionestyrken av rå-enzymoppløsningen være 0,02 M og krystallisasjon vil finne sted. En slik metode har den ulempe at det tar relativt lang tid før likevekt innstilles.

Hvis derimot rå-enzymoppløsningen har en molar ionestyrke på f.eks. 0,05 M, vil dialyse mot et nidobbelt overskudd av destillert vann (i forhold til volumet av rå-enzymoppløsningen) inntil likevekt innstilles resultere i en oppløsning med en ionestyrke på 0,005 M og de krystaller som dannes vil være tilbøyelige til å oppløses igjen da likevekts-ionestyrken ligger utenfor gjenvinningsområdet. Krystallene vil imidlertid dannes etter en relativt kortere dialysetid og kan deretter fjernes og gjenvinnes før likevekt av systemet og rå-oppløsning inntreffer. Denne siste dialysemetode foretrekkes for tiden på grunn av reduksjonen i den tid som medgår til å gjenvinne krystallinsk alkoholoksydase.

Dialysen kan trygt utføres ved temperaturer i området 4-40°C. Der må sørges for tilstrekkelig tid, generelt mer enn 1 h, fortrinnsvis 18 h eller mer, for at krystallisasjon skal finne sted.

Ved dialysens slutt foreligger alkoholoksydasen i dialyseposen som et krystallinsk faststoff. Den krystallinske alkoholoksydase kan lett separeres fra dialysemediet, f.eks. ved dekantering av væsken i dialyseposen fra de faste krystaller. De fuktige krystaller kan viderebehandles etter ønske for lagring. For eksempel kan krystallvellingen fryses og deretter lyofiliseres for dannelse av et tørt pulver, eller den kan løses opp i vann eller helst i en fosfatbuffer. Stabiliserende forbindelser som er kjent for å stabilisere enzymoppløsninger mot denaturering og tap av enzymaktivitet kan tilsettes, f.eks. sakkarose og glycerol. Det foretrekkes å lagre det fremstilte enzym ved temperaturer på 4-40°C. Enzymet lagres fortrinnsvis ved temperaturer på ca. 4-24°C. Den mest foretrukkede lagrings-temperatur for enzymet er ca. 4°C. Det er funnet at tapet

av aktivitet er minimalt når enzymet lagres ved 4°C i 0,1

M fosfatbuffer ved en pH-verdi på 7,5 og med 0,02 % natriumazid for å hindre vekst av mikroorganismer. Alkoholoksydasen kan imidlertid også lagres i frossen tilstand uten nevneverdig tap av enzymaktivitet.

I prosessen til fremstilling av oksydase fra Pichia-mikroorganismer ifølge oppfinnelsen, blir der dannet et fast krystallinsk stoff under dialysen av rå-enzymoppløsningen og ingen ytterligere rensetrinn er funnet å være nødvendige. Den krystallinske alkoholoksydase ifølge oppfinnelsen er lett

å fremstille og er en relativt billig alkoholoksydase som er tilgjengelig for anvendelser som ellers ikke er økonomisk attraktive.

Et typisk eksempel på den alkoholoksydase som isoleres fra mikroorganismer av Pichia-typen er gitt ved den alkoholoksydase som isoleres fra Pichia pastoris. En "Pichia"-alkoholoksydase ifølge oppfinnelsen er homogen å dømme etter natrium-dodecylsulfat(SDS) -gelelektroforese. Svært lite om overhodet noe av den opprinnelige katalaseaktivitet av cellene forblir forbundet med den krystallinske alkoholoksydase ifølge oppfinnelsen. Alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen anslås å omfatte 6 eller flere subenheter med en anslått molekylvekt på 72 000 pr. subenhet, som bestemt ved SDS-gelelektroforese og et grovt anslag av alkoholoksydasens molekylvekt. Enzymet ifølge oppfinnelsen er et flavoprotein med FAD (flavinadenin-dinukleotid) som et koenzym og omfattende ca. én molekylandel FAD pr. enzym-subenhet. Den tilsynelatende (apparent) Michaelis-kon-stant, Km, for metanol er ca. 4mM. Elektroforese-analyse tyder på at molekylvekten av Pichia-enzymet ifølge oppfinnelsen er større enn den av en alkoholoksydase som isoleres fra Candida boidinii. Pichia-enzymet skiller seg fra en alkoholoksydase som er blitt isolert fra Hansenula polymorpha i den utstrekning den binder natriumazid, og ved sin evne til å danne krystaller i 0,02 M natriumfosfat ved en pH-verdi på 6,5.

Karakteristiske egenskaper for Pichia-enzymet er blitt bestemt og er vist i tabell I. Reaktivitet overfor forskjellige substrater er vist som normaliserte størrelser med referanse til metanol som er satt lik 100%.

Pichia-alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen skiller

seg fra andre omtalte alkoholoksydaser på en rekke måter. Spesielt er alkoholoksydasen fra Pichia pastoris reaktiv overfor de lavere alkoholer og formaldehyd, men ikke reaktiv overfor acetaldehyd og organiske syrer. Denne mangel på reaktivitet overfor acetaldehyd og organiske syrer er en avgjort fordel, f.eks. ved bruken av den Pichia-avledede alkoholoksydase ifølge oppfinnelsen i fremgangsmåter til bestemmelse av alkoholkonsentrasjonen i organiske fluider såsom blod, fordi forstyrrelser som skyldes nærvær av aldehyder og materiale fra organiske syrer unngås.

Alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen katalyserer den følgende reaksjon:

hvor R er hydrogen eller lavere alkyl, generelt valgt fra H-, CH3-, CH3CH2<-> og CH3(CH2)2-.

Enzymet ifølge oppfinnelsen kan følgelig anvendes til fremstilling av aldehyder og hydrogenperoksyd samt til fjerning av oksygen fra enzym-forenlige fluider hvor nærværet av oksygen er uønsket.

Da der dessuten i løpet av reaksjonen forbrukes oksygen og produseres aldehyder og hydrogenperoksyd, kan enzymet ifølge oppfinnelsen anvendes til å bestemme konsentrasjonene av kortkjedede alkoholer RCE^OH i en fluidumprøve under betingelser som er forenlige med enzymaktivitet. Således kan f.eks. enzymet brukes til å bestemme konsentrasjonen av lavere al kol oler i biologiske fluider, f.eks. konsentrasjonen av metanol i en gjæringsprosess eller konsentrasjonen av etanol i kropps-væsker såsom blod.

En særlig bekvem måte å bestemme slike alkoholkonsentra-sjoner på er å immobilisere alkoholoksydasen på spissen av en polarografisk oppløst-oksygen-elektrode. En rekke slike polarografiske oppløst-oksygen-elektroder er tilgjengelige i handelen og er egnet til bruk ved alkoholoksydase- enzymet ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan der anvendes en oppløst-oksygen-elektrode av typen Clark eller Beckman.

Alkoholoksydasen kan immobiliseres på elektrodespissen ved en hvilken som helst egnet metode. For eksempel kan enzymet blandes med egnede bærermaterialer for dannelse av en pasta som holdes som en tynn film på elektrodespissen ved hjelp av en membran som er gjennomtrengelig for den forbindelse for hvilken konsentrasjonen skal bestemmes, men ugjennomtrengelig for selve enzymet. Bærermaterialet kan f.eks. være DEAE Sephadex, en polysakkarid ionebytter- harpiks.

For etanol- bestemmelser er en film

av celluloseacetat en egnet membran gjennom hvilken etanol har en tilfredsstillende mobilitet. Enzymet kan selvsagt også bindes kovalent til en passende elektrodemembran eller det kan innlemmes fysisk i en egnet polymerfilm.

Betingelser som er forenlige med enzymaktivitet omfatter en pH-verdi av fluidumprøven på ca. 6-9, fortrinnsvis 8,0

for maksimal følsomhet, og en temperatur i området 25-45°C, fortrinnsvis ca. 25° for letthets skyld. pH-verdien av prøven kan justeres med oppløsningen av ammoniumhydroksyd eller fortynnet saltsyre etter behov.

Der blir fortrinnsvis fremstilt en kalibreringskurve

ved anvendelse av en serie kjente konsentrasjoner av den forbindelse som skal bestemmes og konsentrasjonen av forbindelsen i fluidumprøven bestemmes fra denne slik det er kjent i faget.

For å bestemme alkoholkonsentrasjonen blir prøveelek-troden nedsenket i en andel av det således fremstilte fluidum som skal undersøkes. Substratalkoholen diffunderer gjennom membranen og reagerer i nærvær av oksygen slik at der produseres et aldehydprodukt og hydrogenperoksyd. Reaksjonen følges ved observasjon av den hastighet som oksygenkonsentrasjonen i prøven forandrer seg med. Da den katalyserte reaksjon er støkiometrisk, kan konsentrasjonen av alkoholen RCr^OH bestemmes fra den hastighet som oksygenkonsentrasjonen forandrer seg med, slik det er kjent i faget. Alternativt kan reaksjonen følges polarografisk med hensyn til det hydrogenperoksyd som produseres. I nok en anvendelse kan reaksjonen følges galvano-metrisk.

Anvendelsen av alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen

for bestemmelse av alkoholkonsentrasjonen i biologiske fluider, f.eks. bestemmelse av etanolkonsentrasjonen i en blodprøve eller konsentrasjonen av kortkjedede alkoholer i gjæringsvæsker, er særlig fordelaktig i betraktning av den relativt lave reaktivitet av den øyeblikkelig foreliggende oksydase overfor aldehyder og organiske syrer og er derfor ikke så utsatt for forstyrrelser fra slike forbindelser som kan foreligge i biologiske fluider såsom blod.

Oppfinnelsen skal nå belyses nærmere ved hjelp av de følgende eksempler.

Den følgende fermenteringsprosess er typisk for de fermen-teringer som ble utført for å skaffe utløpsstrømmen til isolering av alkoholoksydasen.

I en kontinuerlig aerob fermenteringsprosess ble metanol og et vandig mineralsalt-medium i et volumforhold på ca. 40 resp. 60 matet hver for seg til en fermentor, som var in-okulert med gjærarten Pichia pastoris NRRL Y-11430, med en slik hastighet at metanol var den vekstbegrensende faktor. Fermentoren var en 150 0 ls skumfylt fermentor

med et væskevolum på ca. 610 1 med automatisk regulering av pH-verdien, temperaturen og væskenivået. Omrøring ble utført av to vanlige skovlturbiner som ble drevet med en hastighet av 1000 omdreininger pr. min. Luft ble tilført med en hastighet av ca. 4 volumdeler luft (ved et overtrykk på ca. 262 kPa

og en temperatur på ca. 25°C) pr. volumdel medium i fermentoren pr. min. Vannfri ammoniakk ble tilsatt med en hastighet som var tilstrekkelig til å holde pH-verdien av gjæringsblandingen på ca. 3,5.

Det vandige mineralsaltmedium ble fremstilt ved at der for hver 1 springvann ble blandet inn 15,86 ml 75 prosents H3P04, 9,53 g K2S04, 7,8 g MgS04.7H20, 0,6 g CaCl2.2H20 og 2,6 g 85 prosents KOH. Spormineraloppløsningen pluss biotin ble matet inn separat via metanolstrømmen med en hastighet av 10 ml pr. 1 metanol. Spormineraloppløsningen pluss biotin ble fremstilt ved blanding av 780 ml spormineraloppløsning med 20 ml vann, 200 ml metanol og 0,032 g biotin.

Spormineraloppløsningen ble fremstilt ved at der for hver liter oppløsning ble blandet inn 65 g FeS04.7H20, 20 g ZnS04.7H20, 3,0 g MnS04.H20, 6,0 g CuS04.5H20, 5,0 ml konsen-trert H2S04 og tilstrekkelig mengde avionisert vann til å bringe oppløsningen på 1 liter.

Det vandige mineralsaltmedium ble matet inn med en hastighet på 31,5 l/h og metanol ble matet inn med en hastighet på 21 l/h.

Gjæringen ble utført ved ca. 30°C og et overtrykk på 262 kPa med en oppholdstid på 11,6 h.

For analyse ble de resulterende gjærceller separert

fra utløpsstrømmen fra fermentoren ved sentrifugering, vasket ved suspendering i vann og re-sentrifugering, tørket over natten ved 100°C og veid. Regnet på tørrvekt var det typiske utbytte av gjærceller ca. 40,6 g pr. 100 g tilført metanol. Celletettheten var typisk ca. 128,4 g celler pr. 1 utløpsstrøm fra fermentoren. Det samlede faststoffinn-hold av mediet i fermentoren var typisk ca. 134,7 g/l, regnet som celler pluss oppløste faststoffer. En porsjon av utløps-strømmen fra fermentoren ble frosset og lagret.

I eksemplene I, IX og X ble alkoholoksydase-aktiviten for reaksjonen med metanol bestemt ved følgende anlaysemetode (Metode A): En fargestoff/buffer-blanding ble fremstilt ved blanding av 0,1 ml o-dianisidin-oppløsning (1 vektprosent o-dianisidin i vann) med 12 ml gjennomluftet 0,1 M natriumfos-fatbuffer (pH-verdi 7,5). Analyseblandingen ble fremstilt med 2,5 ml fargestoff/buffer-blanding, 50 pl metanol, 10 ul peroksydase-oppløsning (lmg pepperot-peroksydase, type II) og 25 ul av alkoholoksydase-oppløsningen. Analyseblandin-gen ble holdt på 25°C i en 4x1x1 ems beholder og økningen i fargestoffets absorpsjonsevne ved 460 nm ble notert i 2-4 min. Enzymaktiviteten ble beregnet ved:

hvor 11,5 er en faktor basert på en standardkurve som er fremstilt ved kjente andeler av ^ 2°2 °^ ^A er f or anc^r ingen * absorpsjonsevne i det eksperimentelle intervall. ;I eksemplene III og IV ble der anvendt en annen analysemetode (Metode B). En MBTH utgangsoppløsning ble fremstilt med 0,04 g MBTH (3-metyl-benzotiazolin-hydrazon) ;pr. 100 ml 0,05 M fosfatbuffer (pH-verdi 7,5). ;En ferriklorid-utgangsoppløsning ble fremstilt fra 0,2 g ferriklorid pr. 100 ml 0,1 NHC1. En 1-mls porsjon av MBTH-oppløsningen ble tilsatt og blandet med 25 ;pl av alkoholen. En 25 uls oppløsning av alkoholoksydase-oppløs-ningen ble tilsatt og blandingen ble inkubert i 10 min. ved 25°C. En 4 mis prøve av ferriklorid- oppløsningen ble satt til blandingen og den resulterende blanding ble tillatt å ;stå i 1 time på den ønskede temperatur. Fargestoffets absorpsjonsevne ved 625 nm ble registrert på et kolorimeter under anvendelse av en prøvebeholder med banelengde på 1 cm. Aktiviteten av. prøven er angitt som den maksimale absorpsjonsevne. ;Eksempel 1 ;Gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble utført ved ;en metode som typisk er angitt ovenfor. En porsjon av utløps-strømmen fra fermentoren ble fjernet og justert på en pH-verdi av 7,5 med ammoniumhydroksyd og homogenisert på en "Dynomill" modell KDL med en 0,6 liters beholder, under kontinuerlig drift ved 30°C, anvendelse av nr. 3 beltekombinasjon og en strøm på 20-30 ml/h. Perlene i møllen var blyfrie glass-perler med en diameter på 0,3-0,5 mm. Det resulterende homogenat ble sentrifugert ved 5°C og 20 000 <*> g i 30 min for å

gi en cellefri supernatant. Enzymaktiviteten av den cellefrie supernatant (ved fremgangsmåte A) var ca.

330 U/ml. Supernatanten ble lagret i frossen tilstand for senere bruk.

Seks 130 mis porsjoner av supernatanten ble

plassert i dialyseposer av celluloseacetat og dialysert ved 5°C mot ca. 8 1 destillert vann. Etter 4 dager ble den vandige fase av hver pose dekantert. Faststoffene som ble tilbake i posene bestod av to typer. Det tynne, øvre, hvite lag ble omhyggelig fjernet og kastet. Det underliggende faststoff var brun-gult og utgjorde alkoholoksydasen. En porsjon av alkoholoksydasen ble oppløst i destillert vann (ca. 10 ganger så stort volum som faststoffet) og ved en analyse ifølge fremgangsmåte A var aktiviteten 94 U/ml. Den spesifikke aktivitet av alkoholoksydasen var 10,4 U/mg protein.

Eh prøve av den faste alkoholoksydase ble undersøkt

ved SDS-gelelektroforese og et enkelt bånd ble observert, hvilket tydet på et homogent rent enzym. En sammenligning av elektroforetisk mobilitet med den for proteiner med kjent molekylvekt tydet på en subenhet-molekylvekt på ca. 72 000.

Resultatene fra dette eksempel viser fremgangsmåten

ifølge oppfinnelsen for fremstilling og isolering av ren krystallinsk alkoholoksydase fra Pichia pastoris.

Eksempel II

En porsjon av den frosne supernatant som var

fremstilt som beskrevet i ekempel I ble tint opp og sentrifugert for klaring av oppløsningen. Seks dialyseposer inneholdende 1 ml av den klarede supernatant ble

dialysert over natten mot 500 ml vandige oppløsninger inneholdende fosfatbuffer av forskjellig ionestyrke (alle på pH-verdi=7,5). I dialysene 1, 2 og 3 med henholdsvis 0,5 M, 0,1

M og 0,05 M fosfat ble der ikke observert noen utfelling.

Den største mengde utfelling ble observert i dialyse 4 med

0,02 M fosfat. Dialysene 5 og 6 med henholdsvis 0,01 og 0,005

M fosfat inneholdt mindre utfelling enn dialyse 4. I dialysene

5 og 6 ble imidlertid noe av den tidligere dannede bunnfelling gjenoppløst.

Resultatene av disse forsøk viser at utfelling av alkoholoksydase under dialyse finner sted ved fosfatbuffer- nivå på under ca. 0,05 M. Alkoholoksydasen synes å være minst opplø-selig ved 0,02 M fosfat. Ved buffernivåer på ca. 0,01 M og lavere kan dialyse utover den tid som er nødvendig for maksimal utfelling resultere i gjenoppløsning av de krystallinske faststoffer.

Eksempel III

En rekke analyser ifølge metode B ble utført under anvendelse av forskjellige pH-verdier for å bestemme de relative aktiviteter av alkoholoksydasen (som den cellefrie supernatant fra homogenisering) ved forskjellige pH-verdier. pH-verdien av hver prøveoppløsning ble variert ved tilsetning av HC1 og NaOH. Den relative aktivitet for hver pH-verdi er angitt som absorpsjonsevnen ved 625 nm.

Resultatene tyder på at den optimale pH-verdi er ca.

8 og det praktiske område er ca. 6-9.

Eksempel IV

En annen analyseserie ifølge fremgangsmåte B ble utført ved bruk av forskjellige analysetemperaturer for å bestemme virkningen av analysetemperaturen på den relative aktivitet. Prøver av alkoholoksydase fra Pichia pastoris ble oppløst

i 0,05 M fosfatbuffer (pH=7,5). Prøvene ble utprøvet ved forskjellige prøvetemperaturer og de relative aktiviteter angitt som absorpsjonsevnen ved 625 nm.

Resultatene viser at den optimale temperatur for aktiviteten av alkoholoksydase fra Pichia pastoris er ca. 45°C og at det praktiske område er ca. 35-45°C.

Eksempel V

I et sammenligningsforsøk ble alkoholoksydase fra Hansenula polymorpha dialysert ifølge oppfinnelsens metode for å vise at en alkoholoksydase fra en annen slekt enn Pichia ikke danner et rent krystallinsk faststoff, slik oppfinnelsen angir. Kontinuerlig aerob vandig gjæring ble utført idet en gjærsort av slekten Hansenula polymorpha (NRRL Y-11170) ble dyrket på metanol under vandige gjæringsbetingelser. En porsjon av utløps-strømmen fra fermentoren ble homogenisert og sentrifugert som beskrevet i eksempel I. Den cellefrie supernatant ble dialysert ved 0°C mot en 0,005 M fosfatbuffer i en rekke dialyser med pH-verdier fra 5,5 til 7,75 med intervaller på 0,25. Ikke i noen av dialysene ble der dannet noen utfelling i dialyseposen etter 20 timer.

I en serie sammenligningsdialyser som ble utført samtidig under anvendelse av den alkoholoksydase som ble skaffet fra Pichia pastoris NRRL Y-11430, fant utfelling av krystallinsk alkoholoksydase sted ved pH-verdier på mellom 5,75 og 6,75.

Den største mengde utfelling ble dannet ved pH-verdier på

6,0 og 6,25.

Resultatene av disse forsøk viser at alkoholoksydasen

fra Hansenula polymorpha ikke krystalliserer under dialysen under betingelser som er virksomme for krystallisering av alkoholoksydasen fra Pichia pastoris. Denne forskjell med hensyn til krystallisering er bemerkelsesverdig. Den viser den betydelige fordel som er forbundet med alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen fra Pichia pastoris på grunn av den hurtige og relativt billige fremgangsmåte for gjenvinning av rent krystallinsk enzym.

Eksempel VI

Alkoholoksydasen isolert fra Pichia pastoris ble immobilisert på spissen av en oppløst-oksygen-elektrode for anvendelse i bestemmelsen av mengden av etanol i prøver. Den faste alkoholoksydase og DEAE "Sephadex" (i et vektforhold på ca. 1:1)

ble blandet og påført teflonmembranen på spissen av en Beckman oppløst-oksygen-sonde. En dialysemembran av celluloseacetat ble brukt til å holde blandingen av alkoholoksydase og DEAE Sephadex på elektrodespissen. Elektroden var festet til en analog-differensiator som angav analyseresultatene i form av en maksimumshøyde som var proporsjonal med alkoholkonsentrasjonen i prøven. Elektroden ble kalibrert med en serie standard-etanoloppløsninger. I hvert tilfelle ble prøven ført inn i elektrodekammeret som inneholdt 3,3 ml 0,05 M fosfatbuffer (pH=7,5) ved 25°C. Kalibreringskurven for maksimalhøyde versus alkoholkonsentrasjon var lineær inntil en sluttkonsentrasjon på 0,1 volumprosent alkohol (1000 ppm) på spissen av alkoholoksydase-elektroden. Denne, slik den var konstruert, virket effektivt for alkoholbestemmelser over et tidsrom på minst en måned. Elektroden gav hurtig respons (analysetid på ca. 15 sekunder) og var følsom overfor konsentrasjoner av etanol så lave som 0,2 ppm regnet på volum.

Eksempel VII

Alkoholoksydase-elektroden som beskrevet i eksempel

VI ble brukt til å bestemme den relative reaktivitet av alkoholoksydase overfor forskjellige substrater. I hver bestemmelse ble en 1-10 pl oppløsning av substratet i vann (1 volumprosent) satt til et volum på 3,3 ml fosfatbuffer (pH=7,5) i elektrodekammeret, og maksimumshøyden ble registrert. Resultatene er angitt nedenfor idet de relative reaktiviteter er korrigert for størrelsen av prøven og normalisert med verdien for metanol satt lik 100.

2-propanol, 2-metyl-l-propanol, 1-pentanol, acetaldehyd og etenglykol hadde relative reaktiviteter på mindre enn 1. Natriumformat, natriumacetat, cykloheksanol og 1,4-butandiol var ialt vesentlig inaktive.

Resultatene fra dette eksempel viser at alkoholoksydase-elektroden ifølge oppfinnelsen har høy spesifisitet for kortkjedede alkoholer og formaldehyd. Forskjellene i reaktiviteter mellom det enzym som ble observert i dette eksempel og de som ble observert i eksempel XII antas delvis å skyldes de forskjellige mobiliteter av substratmolekylene gjennom celluloseacetat-membranen som ble anvendt i dette forsøk. Forskjellene kan også delvis skyldes forskjellene i renhet

av den fremstilte alkoholoksydase.

Eksempel VIII

En serie prøver av blodserum fra mennesker ble blandet med kjente mengder absolutt etanol og en serie prøver av 0,05 M fosfatbuffer ble også blandet med kjente mengder absolutt etanol. I begge serier var etanolnivåene 0, 0,01, 0,02, 0,05 og 0,10 volumprosent etanol. Prøver på 50 pl fra hver oppløs-ning ble analysert ved bruk av den alkoholoksydase-elektrode som er beskrevet i eksempel VI.

En plotting av maksimumshøyder versus etanolnivå ble utført og gav lineære og nesten identiske fremstillinger for begge prøveserier. Resultatene viser at andre bestanddeler, f.eks. aldehyder og organiske syrer i blodserum ikke virker forstyr-rende på bestemmelsen av alkoholkonsentrasjonen ved bruk av en alkoholfølsom elektrode inneholdende alkoholoksydasen fra en Pichia-type mikroorganisme.

Eksempel IX

En serie prøver inneholdende alkoholoksydase isolert som det rene krystallinske faststoff ved dialyse fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble holdt på 40°C i inntil to uker for å bestemme den termiske stabilitet. Alkoholoksydasen ble satt til en 0,5 M fosfatbuffer (pH=7,5) ved en konsentrasjon på 2,2 mg protein pr. ml. En annen prøve alkoholoksydase ble oppløst i 50 volumprosents vandig glycerol. Nok en prøve alkoholoksydase ble lyofilisert. De tre prøver ble analysert ved fremgangsmåte A fra tid til annen i løpet av prøveperioden på to uker. Resultatene er angitt nedenfor.

Resultatene av disse forsøk viser at aktiviteten av alkoholoksydasen ifølge oppfinnelsen i bufferoppløsningen var stort settt uforandret etter to uker ved 40°C. Aktiviteten av alkoholoksydasen i 50 prosents glycerol var uendret etter en uke men noe nedsatt etter 2 uker på 40°C. De frysetørkede faststoffer mistet det meste av sin aktivitet i løpet av varme-forsøket. Den lyofiliserte alkoholoksydase hadde imidlertid utmerket stabilitet ved 4°C.

Eksempel X

En undersøkelse ble utført for å bestemme stabiliteten

av den fra Pichia pastoris oppnådde alkoholoksydase ved forskjellige temperaturer. Utløpsstrømmen fra fermentoren

fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430

ble homogenisert og sentrifugert som beskrevet i eksempel I. Den cellefrie supernatant ble fraksjonert felt

med ammoniumsulfat. Det resulterende enzym ble på grunnlag av dets enzymaktivitet anslått å være mindre enn 50% rent.

Den således delvis rensede alkoholoksydase (0,1 ml)

ble satt til 10 mis prøver av destillert vann inneholdende 0,02 vektprosent natriumazid (heretter betegnet som natriumazid-oppløsning) og til 10 mis prøver av 0,1 M fosfatbuffer (pH=7,5) inneholdende 0,02 vektprosent natriumazid (heretter betegnet som natriumazid/buffer-oppløsning). Oppløsningene ble holdt på henholdsvis 4, 24, 30 eller 40°C i en måned, idet andeler periodevis ble analysert for aktivitet ved fremgangsmåte A.

De natriumazid- og natriumazid/buffer-oppløsninger som ble

holdt på 4°C oppviste intet tap av aktivitet i løpet av prøve-perioden. De natriumazid- og natriumazid/buffer- oppløsninger som ble holdt på 24°C ble ved ekstrapolering av forsøksdataene anslått å ha mistet ca. halvparten av sin aktivitet (halveringstid) i løpet av 40 dager. Ved 30°C hadde natriumazid/buffer-opp-løsningen en halveringstid på ca. 30 dager og natriumazid-opp-løsningen hadde en halveringstid på ca. 10 dager. Ved 40°C

hadde natriumazid/buffer- oppløsningen en halveringstid på

ca. 15 dager og natriumazid- oppløsningen en halveringstid på bare 3 dager.

Eksempel XI

En prøve av frossen, cellefri supernatant skaffet

ved Pichia pastoris NRRL Y-11430 ved homogenisering og sentrifugering som beskrevet i eksempel I ble klaret ved sentrifugering og justert på en pH-verdi av 6,5 med saltsyre. Supernatanten ble deretter dialysert i 5,5 timer mot destillert vann (volum-forholdet mellom supernatanten og vann var 1:10). Den resulterende krystallinske alkoholoksydase ble fjernet ved dekantering av den ovenpåflytende dialysevæske fra det faste enzym. Katalaseaktiviteten, ble bestemt i henhold til en metode beskrevet av R.F. Beers og I.W. Sizer i J. Biol Chem., 195,

133 (1952) oq var 6973U/ml for den opprinnelige cellefrie supernatant og 6697 U/ml for supernatanten etter dialysen. Over 90% av den opprinnelige katalaseaktivitet av den cellefrie supernatant forblir derfor i supernatanten fra dialysen etter at dialysen er blitt fullført.

Eksempel XII

Reaktiviteten av alkoholoksydasen fra Pichia pastoris overfor forskjellige substrater ble bestemt ved den tidligere beskrevne analysemetode A. Utløpsstrømmen fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 på samme måte som beskrevet før eksempel I ble homogenisert og sentrifugert. Den cellefrie supernatant ble underkastet fraksjonert utfelling med ammoniumsulfat for å gi en delvis renset alkoholoksydase. Analysemetode A ble brukt idet metanol ble erstattet med de forskjellige substrater.

Resultatene er angitt nedenfor idet de relative reaktiviteter er normalisert med verdien for metanol satt lik 100.

Resultatene tyder på at denne spesielle rensede alkoholoksydase fra Pichia pastoris er reaktiv overfor de lavere, rettkjedede primæralkoholer.

Eksempel XIII

Et forsøk ble utført for å bestemme virkningen av enzym-konsentrasjonen på dannelsen av ren, krystallinsk alkoholoksydase under dialyse i henhold til renseprosessen for alkoholoksydase ifølge oppfinnelsen. En aerob gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble utført ved en celletetthet på ca. 150 g (tørr-vekt) pr. 1. Utløpsstrømmen fra fermentoren ble homogeni sert og sentrifugert for å gi en cellefri supernatant.

En serie prøver ble fremstilt fra den cellefrie supernatant

ved at den ble fortynnet en rekke ganger med vann. Fem

av prøvene (2 ml hver) ble dialysert mot 100 ml 0,01 M fosfatbuffer (pH=6,5) i 4-5 h. Prøve nr. 6 var et duplikat av prøve nr. 5 og ble ikke dialysert. Ved fullførelsen av dialysene ble væskene i de 5 dialyseposer og den ikke-dialyserte prøve analysert for enzymaktivitet ved metode A. Dersom utfellinger var blitt dannet under dialysen, ble faststoffet isolert ved dekantering av væsken og så oppløst i 2 ml fosfatbuffer for analyse i henhold til fremgangsmåte A. Resultatene er angitt nedenfor.

a) Celletetthet av utløpsstrømmen fra fermentoren repre-sentert ved den fortynnede prøve, angitt som g (tørrvekt)

pr. 1.

b) Anslått aktivitet før dialysen er beregnet fra aktiviteten av prøve 5 etter dialyse under antagelse av at der ikke finner

sted noen forandring i aktiviteten under dialysen, og fra aktiviteten av ikke-dialysert prøve 6.

c) Aktivitet av væsken i dialyseposen etter dialyse.

d) Bestemt ved å løse opp den faste utfelling i 2 ml 0,5 M

fosfatbuffer (pH=7,5) for analysen.

e) Intet bunnfall ble dannet under dialysen

f) Denne prøve ble ikke dialysert.

Bunnfellinger ble dannet under dialyse av prøvene 1

og 2 som var henholdsvis den ufortynnede supernatant (med celletetthet på 150 g (tørrvekt) pr. 1) og en prøve som var blitt fortynnet 2 ganger (med en virksom celletetthet på ca. 75 g (tørr) pr. 1). Utfellinger ble ikke dannet i prøver med høyere grad av fortynning, hvilket svarer til utløpsstrømmer fra fermentoren med virksomme celletettheter på ca.

37,5 g (tørr) pr. 1 og lavere. Dette tyder på at utløpsstrømmer fra fermentoren med celletettheter på under ca. 40 g/l (tørrvekt) pr. 1 næringssubstrat ikke er egnet til gjenvinning av krystallinsk alkoholoksydase. Utløpsstrømmene fra slike gjæringsoperasjoner med lav celletetthet kan imidlertid konsen-treres ved teknikker såsom ultrafiltrering, salt- eller oppløs-ningsmiddelutfelling og lignende for å skaffe materialer som er egnet til isolering av alkoholoksydasen ved dialyseprosess-en ifølge oppfinnelsen.

I den foreliggende beskrivelse er der gitt detaljerte utførelsesformer og eksempler på oppfinnelsen. Det skal imidlertid forstås at andre utførelsesformer enn de som her er angitt er mulige og at de spesielle detaljer som her er angitt ikke skal oppfattes som noen begrensning.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av krystallinsk alkoholoksydase , karakterisert ved at der fremstilles et vandig fluid inneholdende en suspensjon av celler av en metanol-forbrukende mikroorganisme av slekten Pichia, at det celleholdige fluid homogeniseres for fremstilling av et homogenat, at de suspenderte faststoffer fjernes fra homoge-natet, hvorved der dannes en oppløsning som inneholder oppløst alkoholoksydase, og at den således fremstilte oppløsning dialyseres mot et dialysemedium gjennom en membran som er ugjennomtrengelig for alkoholoksydasen, men gjennomtrengelig for vann og eventuelle buffermolekyler,•for oppnåelse av en effektiv celletetthet som er virksom for krystallisering av alkoholoksydase, i en gjenvinningsområde-oppløsning med en molar ionestyrke på 0,01-0,05 M og en pH-verdi på 5,75-6,75 på enzymsiden av membranen, hvorved der fås krystallinsk alkoholoksydase.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der benyttes et celleholdig vandig fluid fremstilt ved dyrking av mikroorganismer ved metanolbegrensende betingelser.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der benyttes en mikroorganisme valgt fra stammene Pichia pastoris NRRL Y-11430 og Pichia pastoris NRRL Y-11431.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at der som celleholdig fluid anvendes en gjæringsutløpsvæske oppnådd ved aerob gjæring og inneholdende celler med en tetthet på over 75 g tørre celler pr. 1 fluid.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at de suspenderte faststoffer fjernes fra homogenatet ved sentrifugering.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at gjenvinningsområde-opp-løsningen oppnås når eller før likevekt opprettes i dialyse-prosessen.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at gjenvinningsområde-opp-løsningen har en molar ionestyrke på ca. 0,02 M.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at den fremstilte krystallinske alkoholoksydase separeres fra dialysemediet som en fuktig oppslemning etterfulgt av lyofilisering.

9. Krystallinsk alkoholoksydase fra Pichia pastoris, karakterisert ved at den har en molekylvekt på ca. 5 00.000 og består av minst seks underenheter med en molekylvekt på ca. 72.000, at den har en Km-verdi for metanol på 4 og blir hindret av formaldehyd ved konsentrasjoner på over 30 mM, og at den har en optimal aktivitet ved en temperatur på 45°C og en pH-verdi på 8,0.

10. Anvendelse av alkoholoksydase som angitt i krav 9 til bestemmelse av alkoholinnhold i væskeprøver ved hjelp av en enzymelektrode bestående av en polarografisk elektrode av oppløst oksygen med alkoholoksydasen immobilisert på spissen av elektroden.

11. Anvendelse som angitt i krav 10, av en alkoholoksydase blandet med bærermateriale for dannelse av en pasta som holdes som en tynn film på elektrodespissen av en membran som er gjennomtrengelig for den forbindelse som skal bestemmes, men ugjennomtrengelig for selve enzympreparatet.

12. Anvendelse som angitt i krav 11, av en alkoholoksydase med et bærermateriale som er en polysakkaridionevekslerharpiks, og en membran som er en celluloseacetatfilm.