DE3783399T2

DE3783399T2 - Verfahren fuer biologische reaktionen mittels an traegern immobilisierten zellen und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens.

Info

Publication number: DE3783399T2
Application number: DE8787830167T
Authority: DE
Inventors: Attilio Converti; Borghi Marco Del; Giuseppe Ferraiolo; Federico Parisi
Original assignee: Agenzia Nazionale per le Nuove Tecnologie lEnergia e lo Sviluppo Economico Sostenibile ENEA
Current assignee: Agenzia Nazionale per le Nuove Tecnologie lEnergia e lo Sviluppo Economico Sostenibile ENEA
Priority date: 1986-05-07
Filing date: 1987-05-06
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2007-05-07
Also published as: ES2038211T3; EP0253774B1; IT1190289B; DE3783399D1; EP0253774A1; IT8647994A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ausführen von alkoholischer Fermentation unter Verwendung von Hefezellen, die auf schwammigen Trägern, welche aus schwammigem Stoff bestehen, immobilisiert sind.
Gegenwärtig sind Verfahren bekannt, welche Zellen verwenden, die auf Trägern immobilisiert sind, welche einen erheblichen Fortschritt im Vergleich zu kontinuierlichen Verfahren ohne Träger darstellen, insofern als diese Verfahren eine wesentliche Steigerung der volumetrischen Produktivität aufgrund der erhöhten Zellkonzentration pro Volumeneinheit aufweisen.
Der Träger, auf dem die Zellen immobilisiert sind, verhindert in der Tat, daß die Zellen aus dem Reaktor ausgewaschen werden, selbst bei höheren Flußraten, als denjenigen, unter denen das "Auswaschen" in dem gleichen Reaktor ohne Träger auftritt. Die am häufigsten bis jetzt verwendeten Träger für zelluläre Immobilisierung in kontinuierlichen Verfahren sind starre synthetische oder natürliche Polymermaterialien, die ein wirksames physikalisches Einschließen der Zellen zulassen. Die Wahl des Trägers ist direkt mit den Arbeitsbedingungen und dem biologischen Verfahren, welches in Frage kommt, verbunden. Materialien, die für diese Anwendungen verwendet worden sind, schließen die folgenden ein:
a) Calciumalginat-Matrices
b) Polyacrylamidgel
c) k-Carragenat-Matrices
d) Glasfasern
e) wasserunlösliche Ionenaustauschermaterialien
f) Matrices, in denen die Zelle chemisch an den Träger mittels bifunktionellen Reagenzien wie Glutaraldehyd gebunden ist
g) Zellulosetetraacetatfasern.
Obwohl Verfahren, welche diese Träger verwenden, zu sehr hoher Produktivität im Hinblick auf Verfahren ohne Träger führen, leiden sie auch unter Nachteilen, insofern als sie extrem schwierig zu regenerieren und wiederzuverwenden sind. Zum Beispiel ist im Fall von Verfahren, welche Alginatträger verwenden, die Regeneration extrem schwierig und das Verfahren, welches diesen Träger verwendet, wäre optimal, wenn das kontinuierliche Verfahren unbegrenzt arbeiten würde. Verfahren, welche leicht einer bakteriellen Verunreinigung oder einem Altern der Kultur unterliegen, erfordern eine periodische Erneuerung durch Regeneration oder Austausch der Matrix und neue Animpfung, was offensichtlich zu erhöhten Kosten führt.
Andere gegenwärtig verwendete Verfahren beinhalten die Immobilisierung von Zellen mit chemischen Reagenzien. Diese Immobilisierung eliminiert jede Möglichkeit der Erneuerung der Kultur aufgrund der starken chemischen Bindungen zwischen dem Träger und den Zellwänden.
Im Fall von Fermentationsverfahren, in denen gasförmige Produkte oder Nebenprodukte erzeugt werden (CO&sub2; im Fall der alkoholischen Fermentation und des aeroben Abbaus von Abwasser und CH&sub4; im Fall des anaeroben Abbaus), sind andere Nachteile mit dem unvermeidbaren Zerbrechen des festen Bettes durch die produzierten Gase mit dem daraus folgenden erhöhten Verlust an Beladung im Reaktor und der Verstopfung im Fall von Fermentationssäulen verbunden.

Aufgabe der Erfindung

Es ist überraschenderweise entdeckt worden, daß ein Verfahren, in welchem schwammige Materialien, die aus schwammigem Stoff bestehen, als Träger für Zellimmobilisierung verwendet werden, die Nachteile der Verfahren, welche die vorhergehende Methode verwenden, überwindet, insbesondere im Fall der alkoholischen Fermentation.
Um diese Nachteile zu überwinden, verwendet das erfindungsgemäße Verfahren als Träger zum zellulären Einschluß schwammige Materialien, die aus schwammigem Stoff bestehen, welche die folgenden Vorteile bieten:
a) einfacher Einbau des Trägers in den Reaktor;
b) einfache Regenerierung des Trägers durch Waschen, dank der Flexibilität des Materials;
c) Wiederverwendung des Trägers in aufeinanderfolgenden Fermentationszyklen, mit daraus folgenden ökonomischen Vorteilen;
d) Erneuerung der Zellkolonien in den innersten Hohlräumen durch periodische Wascharbeitsgänge und Animpfung mit neuen Zellbeladungen;
e) Verhinderung von Kontamination aufgrund der Erneuerung der Kultur;
f) kein Zusammenbruch des Betts aufgrund der Bildung von gasförmigen Produkten oder Nebenprodukten; diese Beständigkeit gegen Zusammenbruch, insbesondere wichtig im Fall von Träger-gefüllten Säulen, wird durch die hohe einheitliche Porosität und Flexibilität des schwammigen Materials garantiert;
g) niedrige Kosten der schwammigen Stoffmaterialien im Hinblick auf komplexere synthetische Materialien;
j) Möglichkeit der Verwendung von schwammigen Materialien in verschiedenen Typen von kontinuierlichen Reaktoren auf der Basis der Form und der Abmessungen der schwammigen Partikel.
Deshalb ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Ausführen von alkoholischer Fermentation, unter Verwendung von Hefezellen, die auf schwammigen Trägern immobilisiert sind, welche aus schwammigem Stoff bestehen. Dieses Material umfaßt Viskose, Baumwolle und pflanzliche Zellulose in geeigneten Anteilen und weist die folgenden Eigenschaften auf:
- Absorption von dem 2 bis 4-fachen seines Gewichts an H&sub2;;
- maximale Zell-Retention zwischen 1 und 1,5 g Trockensubstanz pro Gramm des Trägers;
- spezifische Fläche zwischen 28 und 35 cm²/g;
- volumetrische Variation zwischen 32 und 37%;
- Ungiftigkeit;
- Sterilisierbarkeit;
- biologische Abbaubarkeit;
- Regenerierbarkeit.
Was die biologische Abbaubarkeit angeht, soll dieser Ausdruck sich auf Verbindungen beziehen, die zu natürlichen Bedingungen bei nicht biologischen Behandlungen zurückkehren. Für Zell-Träger ist die biologische Abbaubarkeit eine negative Eigenschaft, da sie dazu neigt, das schwammige Material zu verbrauchen. Deshalb erfordern Verfahren, die stark biologisch abbauende Mikroorganismen verwenden, Träger, welche vollkommen synthetisch (Polyamide, Polyester usw.), ohne Zellulose sind. In anderen Fällen (wie der alkoholischen Fermentation) ist die biologische Abbaubarkeit kein Problem und deshalb kann pflanzliche Zellulose in dem schwammigen Material vorhanden sein. Im Hinblick auf Alginate, Carragenate usw., die in den Verfahren, die zum Stand der Technik gehören, verwendet werden, ist der schwammige Stoffträger nicht nur aus ökonomischen Gründen von Vorteil, da er wesentlich billiger als die anderen beiden oben erwähnten Träger ist, sondern auch weil er im industriellen Maßstab praktikablere Lösungen zuläßt. Tatsächlich muß bei den oben erwähnten Substanzen in einem kontinuierlichen Verfahren, ganz gleich, welche geometrische Form die Substanz annimmt, sie oft ersetzt werden, was das Verfahren zum Stillstand bringt. Weiterhin sind die oben genannten Substanzen (Alginat, Carragenat) nicht sterilisierbar, sind oft toxisch und können während des Verfahrens chemischen Veränderungen unterliegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Umwandlung von hydrolysierter Stärke und/oder Melasse in Ethanol durch Hefezellen, unter Verwendung des schwammigen Stoffs mit den oben angegebenen Eigenschaften und der oben angegegebenen chemischen Zusammensetzung.
Der Ausdruck Melasse bezieht sich auf ein Nebenprodukt der Zuckerverarbeitungsindustrie.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist von besonderem Interesse, wenn es auf besondere Arten von Reaktoren angewandt wird, welche in Verfahren verwendet werden, die zum Stand der Technik gehören, insbesondere im Fall von sogenannten Bioscheibenreaktoren (RBS) (biodisk reactors).

Kurze Beschreibung der Abbildung

Fig. 1 ist eine Querschnittansicht eines Bioscheibenreaktors mit einem auf die Scheiben aufgetragenen schwammigen Material.
Fig. 2 ist ein Flußdiagramm eines kontinuierlichen Verfahrens, welches den Bioscheibenreaktor mit den an den Scheiben angebrachten schwammigen Material verwendet.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die einen Einund/oder Zweistufenbioscheibenreaktor mit dem schwammigen Stoffträger mit einem Ein- und/oder Zweistufenbioscheibenreaktor ohne dem schwammigen Stoffträger im Fall von alkoholischer Fermentation vergleicht.
Ein Beispiel für das schwammige Material, welches besonders geeignet in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, ist der Schwammstoff "WETTEX"®, ein eingetragenes Warenzeichen, welches ein Spektrum von Produkten verkörpert, die im Bereich der Reinigung verwendet werden, obwohl es andere analoge Produkte kommerziell erhältlich gibt, die die oben angegebenen Eigenschaften und die oben angegebene chemische Zusammensetzung aufweisen. Die Verwendung dieses schwammigen Trägers in dem erfindungsgemäßen Verfahren macht es möglich, die oben erwähnten Vorteile im Hinblick auf andere zum Stand der Technik gehörende Träger zu erhalten.
Eine Vorrichtung, die einen biologischen Drehscheibenreaktor mit schwammigem Stoffträger auf den Scheiben umfaßt, wird mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen beschrieben.
In Fig. 1 umfaßt die Vorrichtung einen Reaktor, der in ein thermostatisches Bad eingetaucht ist, welches aus einer Flüssigkeit (z. B. Wasser) in einem Stahlbehälter (nicht gezeigt) besteht, welches mit einem elektrischen Heizsystem ausgerüstet ist, das durch einen geeignet kalibrierten Thermostaten kontrolliert wird, so daß die gewünschte Temperatur in dem Reaktor aufrechterhalten wird. In dem unten als Beispiel beschriebenen Verfahren ist diese Temperatur 30ºC.
Der Behälter enthält einen oder mehrere Reaktoren, da die Reaktion modular aufgebaut sein kann, von denen jeder einen Hohlzylinder (1) aus PYREX®-Glas umfaßt, welcher an den Enden mit zwei Stahlflanschen (10) und (11) geschlossen ist und waagerecht angeordnet ist. Der obere Teil des Zylinders enthält einige Öffnungen zur Eingabe (2) und Ausgabe (3) des Nährmediums ebenso wie zur Probennahme (4), Temperaturmessung (5) und pH-Einstellung (6). Der Zylinder (1) enthält eine zentrale waagerechte Welle (7) mit Stahlscheiben (8) von geeigneten Durchmesser (etwas weniger als der Durchmesser des Zylinders), auf dem das schwammige Material (9) angeordnet ist, wo das Einschließen der Zellen stattfinden wird. Diese Scheiben sind bis etwa zur Hälfte ihres Umfangs in Nährmedium eingetaucht und bilden auch mit der Welle (7) eine Einheit.
Ein Ende der Welle rotiert in einem Blind-Hohlraum (12) in der Mitte des Flansches (10), während das andere Ende mit einer angetriebenen Riemenscheibe (14) durch eine Stopfbüchse (13) verbunden ist, die mit dem zweiten Flansch (11) verbunden ist. Diese Riemenscheibe ist ihrerseits durch einen Riemen mit einer Antriebsriemenscheibe, die mit der Welle eines Motors mit verstellbarer Geschwindigkeit eine Einheit bildet, verbunden (dieser Riemen-Riemenscheibe-Motor-Komplex ist in der Abbildung nicht gezeigt).
Fig. 2 ist ein schematisches Diagramm des Systems, welches den Motor zum Betrieb der Welle (15), die Kontrolle und automatische Einstellung der Temperatur (16) und des pH-Werts (17-18), das Thermometer (19), den Einlaß (20) und den Auslaß (21) für den fermentierten "Most" zeigt.
Eine peristaltische Pumpe wird gezeigt (22), welche Nährmedium dem Reaktor in einem kontinuierlichen Fluß zuführt. Ebenso wird das Zulaufgefäß (23) gezeigt.
Ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches die oben beschriebene Vorrichtung verwendet, wird im folgenden angegeben.
Ein Substrat auf Zuckerbasis mit einem Zuckergehalt von annähernd 50% (Glucose und/oder Saccharose, die aus hydrolysierter Stärke und/oder Melasse erhalten wurde) wird verwendet. Die Substanz wird aus einem geeignet sterilisierten Gefäß genommen, nach der Behandlung mit 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (Ammoniumsulfat), 0,4 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 5 g/l KH&sub2;PO&sub4; (Kaliumdihydrogenphosphat) Die Substanz wird dann mit einer 0,03 molaren Natriumcitratpufferlösung (1 molare Citronensäure mit gelöster NaOH-Lösung) behandelt, bis ein pH von 5 erreicht ist (der optimale pH für die Fermentation). Bevor sie in den Reaktor eingebracht wird, wird das Volumen der Substanz durch Verdünnung auf die gewünschte Konzentration erhöht und sie bei 116ºC 20 min sterilisiert. Im Anschluß an diese Vorbereitung wird der Reaktor kontinuierlich bei optimalem Fluß mit der Nährlösung mittels einer einstellbaren peristaltischen Pumpe beladen. Der optimale Fermentations-pH wird im Inneren des Reaktors mittels eines pH-Meßgeräts, das mit einem Kontrollmodul verbunden ist, welches mittels einer weiteren peristaltischen Pumpe automatisch die zur pH-Stabilisierung nötige Lösung (2,5 N Na&sub2;CO&sub3;) einspritzt, kontinuierlich eingestellt (auf einen Wert von 5).
Das Fermentationsverfahren wird durch Einspritzen einer Hefezellensuspension in den Reaktor nach der Eingabe des Nährmediums gestartet. Die zelluläre Suspension verteilt sich einheitlich innerhalb der schwammigen Matrix und beginnt sich überreichlich zu vermehren, wobei sie große Kolonien in den Hohlräumen des schwammigen Trägers während des Verfahrens bildet. Das System erreicht nach ungefähr 10 Tagen die Arbeitsbedingungen. Der Spiegel der Flüssigkeit in dem Reaktor wird bei annähernd der Hälfte des Volumens des Reaktors eingestellt und stabilisiert, mittels einer weiteren peristaltischen Pumpe oder mittels der vorhergehenden mit zwei Stufen, welche ein identisches Volumen für jede Zugabe in den Reaktor entfernt. Die Einstellung des Flusses erfordert Details wie die Anordnung des Eingaberohrs am Boden des Reaktors und des Ausgaberohrs am Wasserspiegel, wobei letzteres eine größere Flußrate als ersteres hat. Dies wird fortgesetzt bis der Spiegel der Flüssigkeit sich bei der Hälfte des Volumens des Reaktors einpendelt. Mit Bezug auf das oben beschriebene Verfahren wird das Nährmittel im Innern des Reaktors in das Endprodukt (Ethanol) in ungefähr 3 Std. umgewandelt. Es sollte beachtet werden, daß in Reaktoren ohne schwammiger Matrix diese Umwandlung annähernd viermal solange dauert. Deshalb produziert der Reaktor unter optimaler Bedingung einen stündlichen Fluß, der annähernd gleich einem Drittel des Volumens der Lösung in dem Reaktor (Zuckerkonzentration 100 g/l) ist. Durch das kontinuierliche Verfahren wird deshalb das Nährmedium beinahe vollständig in annähernd 3 Std. ersetzt, wobei eine Alkohollösung als Endprodukt entsteht.
In Fig. 3 ist eine graphische Darstellung gezeigt, die ein Ethanolproduktionsverfahren mit einem Bioscheibenreaktor mit einem schwammigen Träger und ohne einen schwammigen Träger vergleicht. Die graphische Darstellung zeigt deutlich, daß die Ethanolproduktion in Gegenwart der schwammigen Träger sehr viel effizienter ist.

Claims

1. Verfahren zum Ausführen von alkoholischer Fermentation unter Verwendung von auf schwammigen Trägern immobilisierten Hefezellen, ausgehend von hydrolysierter Stärke und/oder Melasse, dadurch gekennzeichnet, daß die schwammigen Träger aus schwammigem Stoff gemacht sind, welcher aus Viskose, Baumwolle und pflanzlicher Zellulose besteht und die folgenden Eigenschaften aufweist:

Ungiftigkeit;

Sterilisierbarkeit;

biologische Abbaubarkeit;

Regenerierbarkeit;

Absorption des 2 bis 4-fachen seines Gewichts an Wasser;

maximale Zell-Retention zwischen 1 und 1,5 g Trockensubstanz/ g des Trägers;

spezifische Fläche zwischen 28 und 35 cm²/g;

volumetrische Variation zwischen 32 und 37%.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die schwammigen Stoffträger aus schwammigen Wettex®-Stoff gemacht sind.