WO2024038903A1 - オボチオールａもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法 - Google Patents

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豪 仲谷
菜々実 仲島
尚弘 夛田
淳 松本
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長瀬産業株式会社
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing ovothiol A (hereinafter sometimes referred to as OVO-A) or a related substance thereof, or a mixture thereof, and a microorganism that produces the same.
  • OVO-A ovothiol A
  • the present disclosure provides a method for producing ovothiol A or a related substance thereof, or a mixture thereof, comprising: (a) a microorganism having an ovoA gene and at least one gene selected from an ovoB gene and an egt2 gene; A method comprising culturing in a medium, and (b) collecting ovothiol A or a related substance, or a mixture thereof from the medium and/or bacterial cells obtained by the culture, and the ovoA gene, and A microorganism having at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene, and in which the expression of one or both of the ovoA gene and at least one gene selected from the o
  • Obothiol A is a substance isolated from sea urchin eggs and is known to be contained in some marine organisms. Obothiol A has strong antioxidant activity and has been reported to suppress liver fibrosis and cancer cell proliferation (Non-Patent Documents 1-3). Although ovoA and ovoB are known as genes involved in the biosynthesis of ovothiol A, it has not been reported that ovothiol A was produced using these genes (Non-Patent Documents 4 and 5, respectively). Although an organic synthesis method is known as a method for producing obothhiol A (Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7), a method for producing obothiol A using microorganisms is not known. Obothiol A is also difficult to obtain as a reagent, and a new production method is desired.
  • [Section 1] A method for producing obothhiol A or its related substances, or a mixture thereof, comprising: (a) culturing a microorganism having an ovoA gene and at least one gene selected from ovoB gene and egt2 gene in a medium, and (b) extracting ovothiol A or collecting related substances or mixtures thereof; A method comprising; [Section 2] Item 2.
  • the production method according to Item 6, wherein the step of reducing comprises treating the medium and/or the bacterial cells obtained in (a) with a reducing agent;
  • a reducing agent [Section 8] It has an ovoA gene, and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene, and has enhanced expression of one or both of the ovoA gene and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene.
  • FIG. 1 shows the starting material of approximately 30 mL of a test tube culture broth thought to contain obothiol A, and the resulting broth was centrifuged at high speed in an unsterilized state (conditions: 9600xG, 10 minutes, 20°C). This is the result of LC-MS analysis of the sterilizing solution, which was obtained by filtering the supernatant using a 0.2 ⁇ m filter under reduced pressure.
  • FIG. 2 is a chromatogram obtained by subjecting the sterilizing solution to HPLC preparative separation conditions.
  • FIG. 3 is a 1 H-NMR chart of the HPLC preparative sample.
  • FIG. 4 shows the results of 13 C-NMR measurement of samples fractionated by HPLC.
  • FIG. 5 shows the comparative results of LC-MS analysis of samples after reduction treatment.
  • FIG. 6 shows the comparison results of [M+H] + of the reduced product and the sterilizing solution.
  • FIG. 7 is a calibration curve for free obothiol A.
  • FIG. 8 is a graph showing the production amount of obothiol A of each strain.
  • the present disclosure provides a method for producing ovothiol A or a related substance thereof, or a mixture thereof, comprising (a) an ovoA gene, and at least one gene selected from an ovoB gene and an egt2 gene.
  • the present invention relates to a method comprising culturing a microorganism in a medium, and (b) collecting obothiol A or a related substance thereof, or a mixture thereof from the medium and/or bacterial cells obtained by the culture.
  • a microorganism having the ovoA gene and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene it is possible to produce or increase the production amount of ovothiol A or its related substances.
  • Substances related to obothhiol A include oxidized forms and alkylated forms of obothhiol A.
  • oxidants include disulfide bonds, mixed disulfide bodies, and the like.
  • alkylated product include obothiol B, obothiol C, and the like.
  • disulfide bond include a compound produced by two molecules of ovothiol A forming a disulfide bond between their thiol groups (hereinafter sometimes referred to as ovothiol A disulfide or (OVO) 2 ).
  • mixed disulfides include compounds derived from amino acids or peptides and obothiol A.
  • a mixed disulfide includes a compound derived from cysteine and ovothiol A (hereinafter sometimes referred to as Ovo-Cys).
  • Substances related to ovothiol A also include, but are not limited to, ovothiol A precursors such as 5-thiohistidine, 5-histidylcysteine sulfoxide, and 2-methylhistidine.
  • Ovothiol A-related substances may themselves have physiological activity, and may also be reduced in the body to supply obothiol A.
  • the ovothiol A-producing microorganism used in the present disclosure is a microorganism that has the ovoA gene and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene.
  • the microorganism has an ovoA gene and an ovoB gene.
  • the microorganism has an ovoA gene and an egt2 gene.
  • Ovothiol A-producing microorganisms may be isolated from nature or may be recombinant. As for the genetic recombination method, those skilled in the art can adopt an appropriate method depending on the target microorganism.
  • the ovoA gene, ovoB gene and egt2 gene are known.
  • the ovoA, ovoB and egt2 genes contain DNA sequences encoding OvoA protein, and OvoB and Egt2 proteins, respectively.
  • the proteins include OvoA protein derived from Geobacter bemidjiensis (SEQ ID NO: 1), OvoA protein derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 2), OvoB protein derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 3), and Schiz Egt2 protein derived from osaccharomyces pombe (SEQ ID NO: 4).
  • the genes encoding them may have codon base sequences optimized for the microorganism in which they are expressed.
  • the base sequences obtained by codon-optimizing the amino acid sequence of the protein for E. coli K-12 may be used as the genes encoding them.
  • the base sequences include the ovoA gene derived from Geobacter bemidjiensis (SEQ ID NO: 5), the ovoA gene derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 6), the ovoB gene derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 7), and the ovoB gene derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 7).
  • the ovothiol A-producing microorganism is a microorganism having an ovoA gene derived from Geobacter bemidjiensis and having an ovoB gene derived from Erwinina tasmaniensis.
  • Those skilled in the art can use genes corresponding to known genes as appropriate.
  • ovothiol A or its related substances can be produced or the production amount can be increased.
  • expression of both the ovoA and ovoB genes is enhanced.
  • expression of both the ovoA and egt2 genes is enhanced.
  • Gene expression can be enhanced using known gene expression enhancement methods.
  • a common method is to place a gene under the control of a promoter with strong expression.
  • gene expression may be enhanced by introducing into a microorganism an expression vector incorporating a promoter and gene suitable for gene expression, or by integrating the gene into the host genome by homologous recombination or the like.
  • a vector a plasmid vector or a virus vector can be used.
  • vector components such as promoters, terminators, and marker genes such as drug resistance genes and metabolic enzyme genes can be appropriately selected and used. Methods for introducing genes into microorganisms are also known.
  • the gene to be introduced can be incorporated into the genome of a microbial host or into a vector, and then introduced into the microorganism. When introducing two or more genes, it is sufficient that each gene can be expressed by the host. For example, each gene may all be carried on a single expression vector. Furthermore, each gene may be held separately on multiple expression vectors.
  • one vector encodes at least one gene selected from the ovoA gene and the ovoB gene and the egt2 gene. In another embodiment, one vector encodes the ovoA gene, and another vector encodes at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene.
  • gene introduction methods include lipofection method, calcium phosphate method, polymer method, electroporation method, particle gun method, etc., and these methods are selected as appropriate depending on the type of microorganism to be introduced and the gene to be introduced. be able to.
  • gene expression may be enhanced by deleting a specific gene or region on the genome, thereby inducing the expression of an endogenous gene.
  • the method for enhancing gene expression is not limited to the above method.
  • the microorganism used in the present disclosure may have enhanced gene expression as a result of natural mutation. Enhancement of gene expression can be confirmed by known methods such as Northern blotting and real-time PCR. Alternatively, enhancement of the expression of the gene can be confirmed by actually culturing the microorganism and quantifying the protein encoded by the gene produced within or outside the microbial cell (in the culture solution).
  • OvoA protein, OvoB protein, and Egt2 protein used in the present disclosure are independent from each other.
  • proteins include, but are not limited to, polypeptides derived from mammals, eukaryotes such as plants and fungi, bacteria such as actinomycetes, and archaea, or polypeptides corresponding thereto.
  • proteins expressed by obothiol A-producing microorganisms include proteins derived from enteric bacteria, iron-reducing bacteria, sea urchins, and fission yeast.
  • the protein expressed by the obothhiol A-producing microorganism is derived from bacteria.
  • the OvoA protein is a protein from Geobacter bemidjiensis, Erwinina tasmaniensis, or Paracentrotus lividus.
  • the OvoB protein is a protein from Erwinina tasmaniensis or Schizosaccharomyces pombe.
  • the OvoA protein, as well as the OvoB protein and Egt2 protein are derived from a microorganism.
  • OvoA protein, OvoB protein, and Egt2 protein used in the present disclosure include OvoA protein derived from Geobacter bemidjiensis (SEQ ID NO: 1), OvoA protein derived from Erwinina tasmaniensis (SEQ ID NO: 2), and OvoA protein derived from Erwinina tasmaniensis.
  • OvoA protein is a bifunctional enzyme and has domains involved in two enzymatic reactions.
  • the first involves the reaction that produces 5-histidylcysteine sulfoxide from histidine and cysteine.
  • Those skilled in the art can appropriately measure the activity of OvoA protein using known techniques, for example, by examining the consumption of histidine and cysteine and the production of 5-histidylcysteine sulfoxide using HPLC or LC-MS.
  • the second involves the reaction of methylating 5-thiohistidine to produce ovothiol A.
  • the production of obothhiol A can be measured by HPLC or LC-MS.
  • the OvoB protein is involved in the reaction that generates 5-thiohistidine and pyruvate from 5-histidylcysteine sulfoxide.
  • Those skilled in the art can appropriately measure the activity of OvoB protein using known techniques, for example, by examining the consumption of 5-histidylcysteine sulfoxide and the production of 5-thiohistidine using HPLC or LC-MS.
  • the Egt2 protein is involved in the reaction that produces ergothioneine and pyruvate from hercynylcysteine sulfoxide.
  • Those skilled in the art can appropriately measure the activity of Egt2 protein using known techniques, for example, by examining the consumption of hercynylcysteine sulfoxide and the production of ergothioneine using HPLC or LC-MS.
  • OvoA protein is a polypeptide described in (a)-(e) below: (a) A polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one to several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; (c) Having sequence identity of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one to several amino acid residues refers to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 amino acid residues. , refers to a substitution, deletion, insertion or addition of 9 or 10 amino acid residues, preferably a substitution of 1, 2, 3, 4, 5 or 6 amino acid residues. , deletion, insertion, or addition, more preferably a substitution, deletion, insertion, or addition of 1, 2, 3, or 4 amino acid residues.
  • hybridize under stringent conditions the hybridization used here is described, for example, by Molecular Cloning, T.; Maniatis et al. , CSH Laboratory (1983) and the like.
  • stringent conditions means, for example, 6x SSC (10x SSC is a solution containing 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate), 45°C in a solution containing 50% formamide. Conditions such as forming a hybrid in 2 ⁇ SSC and washing at 50°C (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 ), and conditions that provide equivalent stringency.
  • the microorganism having a biosynthetic gene for obothiol A or its related substances used in the present disclosure may be any microorganism.
  • Microorganisms capable of producing obothhiol A or its related substances are, for example, enterobacteria, actinomycetes, or yeast.
  • Enterobacteriaceae include, but are not limited to, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, and Salmonella.
  • microorganisms belonging to the Enterobacteriaceae family include microorganisms belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, and microorganisms belonging to the genus Pantoea such as Pantoea ananatis.
  • Actinomycetes are microorganisms belonging to the genus Streptomyces, Corynebacterium, and Mycobacterium, although they are not particularly limited.
  • Particularly preferred microorganisms belonging to the genus Streptomyces include Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, and Streptomyces avermitilis.
  • Streptomyces griseus examples include Streptomyces griseus, Streptomyces albus, and Streptomyces albulus.
  • yeast examples include yeasts of the genus Schizosaccharomyces and genus Saccharomyces.
  • the gene encoding the protein to be expressed may be a modified gene or an artificial gene whose codons have been optimized according to the frequency of codon usage in the host cell. For example, when expressing a protein derived from a species different from the species to which the host cell belongs or a species of a different genus, using such modified genes or artificial genes can be an effective means for efficient expression. Genetic modification such as codon optimization, synthesis of an artificial gene having a desired (e.g., codon-optimized) sequence, etc.
  • Mutation can be carried out by known methods such as site-directed mutagenesis using a mutagenesis primer, or by artificial synthesis of a nucleic acid having a mutated sequence (or a part of the sequence).
  • Cultivation of microorganisms in the production method of the present disclosure can be performed by a conventional method. Conditions such as culture medium composition, culture temperature, culture time, pH, ventilation conditions, etc. can be selected depending on the type of microorganism. Ovothiol A can be produced by culturing the above microorganism in a known medium, but the medium does not contain compounds that contribute to ovothiol A biosynthesis, such as histidine, methionine, or cystine, or their precursors. It's okay. In one embodiment, LB medium, 2xYT medium, NZY medium, M9 medium, SOC medium, YPD medium, etc. can be used.
  • Obothiol A can be produced using the above-mentioned medium, but the medium used is not limited to these. Further, the produced obothiol A or its related substances may be accumulated within the bacterial cells, or may be secreted or accumulated outside the bacterial cells (in the culture solution).
  • Obothiol A or its related substances released within or from the bacterial cells can be recovered by known methods.
  • the culture can be subjected to solid-liquid separation such as centrifugation or filtration, and an extract containing obothiol A or its related substances can be obtained from the bacterial cells by solvent extraction, hot water extraction, crushing treatment, etc.
  • the extract containing Ovothiol A or its related substances or the culture supernatant can be subjected to known chromatography such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, etc. to obtain Obothiol A or its related substances. Can be done.
  • Obothiol A may be obtained by reducing the related substances of obothiol A by subjecting the culture medium and/or bacterial cells obtained by culturing a microorganism having a biosynthetic gene for obothiol A or its related substances to a reduction treatment.
  • the step of reducing includes the step of using a reducing agent or the step of electrochemically reducing.
  • the term "reducing agent" refers to a substance that donates electrons to another substance and oxidizes itself. Reducing agents can be prepared by known methods or are commercially available.
  • the reducing agent examples include 2-mercaptoethanol (2-ME), dithiothreitol (DTT), glutathione (GSH), or tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP).
  • 2-ME 2-mercaptoethanol
  • DTT dithiothreitol
  • GSH glutathione
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • One type of reducing agent may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the reducing agent is DTT or TCEP.
  • reduction treatment is performed by reacting the cultured medium with DTT at a final concentration of approximately 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, or 300 mM.
  • the present disclosure has an ovoA gene and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene; , in which the expression of one or both is enhanced.
  • Example 1 Construction of obothiol A-producing bacteria
  • OVO-A ovothiol A production vector comprising an ovoA gene and at least one gene selected from the ovoB gene and the egt2 gene by the method described below.
  • OvoA is a Gb.
  • OvoA SEQ ID NO: 1: amino acid sequence
  • Et Two types of OvoA (SEQ ID NO: 2: amino acid sequence) were used.
  • OvoB is an Et.
  • OvoB SEQ ID NO: 3: amino acid sequence
  • Sp Sp.
  • Egt2 (SEQ ID NO: 4: amino acid sequence) was used. Based on the above amino acid sequence, the gene sequence Gb. ovoA (SEQ ID NO: 5: base sequence), Et. ovoA (SEQ ID NO: 6: base sequence) Et. ovoB (SEQ ID NO: 7: base sequence), Sp. egt2 (SEQ ID NO: 8: base sequence) was artificially synthesized. Using a vector containing the artificially synthesized ovoA, ovoB, and egt2 genes as a template, each gene sequence was amplified using the primers listed in Table 1.
  • the expression vector used was a vector having a p15A replication origin, an rrnB terminator, and a tetracycline resistance gene as a drug marker, and the promoter was modified to the E. coli gapA gene promoter.
  • the PCR products of the four genes were ligated to the HindIII-AflII site directly under the promoter of the expression vector using the In-Fusion HD cloning Kit (Takara Bio Inc.) in the combinations and order shown in Table 2 to produce obothhiol A.
  • pOT-Et. ovoA-Sp. egt2, pOT-Gb. ovoA-Sp. egt2, pOT-Et. ovoA-Et.
  • ovoB pOT-Gb. ovoA-Et. ovoB was constructed.
  • a primer was designed to connect the ovoA gene and the ovoB (egt2) gene with a linker region (5'-GAGCTCAGGAGGGCTAGC-3' (SEQ ID NO: 17)) containing an SD sequence.
  • the In-Fusion reaction was performed according to the protocol provided by Takara Bio.
  • an expression vector (pEmpty) in which no synthetic gene was cloned was used as a control.
  • E. coli ⁇ metJ strain can also be prepared, for example, according to the following method. It can be constructed by a conventionally known method of deleting each gene region of E. coli strain BW25113 by homologous recombination using a counter selection vector (including the sacB gene and drug resistance gene) containing the upstream and downstream sequences of the metJ gene.
  • the above-mentioned disruptive strain construction is based on M. S. Donnenberg and J. S. Kaper, Infect. Immun. , 1991, 4310-4317, and H. Mizoguchi et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem. , 2007, 71 (12), 2905-2911, etc.
  • Example 2 Acquisition of specimen and confirmation of product
  • ⁇ LC-MS analysis conditions The sterilizing solution was diluted 20 times with ultrapure water and then filtered through a 0.2 ⁇ m filter, and other samples were diluted appropriately so that the detection intensity was about the same and applied.
  • ⁇ NMR measurement conditions 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O) DSS-d 6 was set to 0 ppm. 13 C-NMR (100 MHz, D 2 O) DSS-d 6 Si- C H 3 was set to 0 ppm.
  • Example 3 Fermentation production test of obothiol A
  • ⁇ Culture> The four obothiol A producing strains constructed in Example 1, ⁇ metJ/pOT-Et. ovoA-Sp. egt2, ⁇ metJ/pOT-Gb. ovoA-Sp. egt2, ⁇ metJ/pOT-Et. ovoA-Et. ovoB, ⁇ metJ/pOT-Gb. ovoA-Et.
  • a fermentation production test of ovothiol A was conducted using ovoB.
  • ⁇ metJ/pEmpty which was obtained by introducing the empty vector pEmpty into the ⁇ metJ strain, was used as a control strain. Colonies were picked with a platinum loop from an agar plate containing ⁇ metJ/pEmpty and each of the four ⁇ metJ/pOT transformants, and 5 mL of LB medium (10 g of polypeptone, 5 g of yeast extract, 10 g of NaCl/1 L of medium), tetracycline ( The cells were inoculated into a test tube containing 10 ⁇ g/mL (final concentration 10 ⁇ g/mL) and cultured with shaking at 30° C.

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Abstract

オボチオールＡまたはその関連物質の供給に課題がある。本開示では、オボチオールＡまたはその関連物質を製造する方法を提供する。　オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、（ａ）ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を培地で培養すること、および（ｂ）該培養により得られた培地および／または菌体よりオボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含む、方法。

Description

オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法
　関連出願
　この出願は、令和４年８月１９日に日本国特許庁に出願された出願番号２０２２－１３１２５５号の優先権の利益を主張する。優先権基礎出願はその全体について、出典明示により本明細書の一部とする。
　本開示は、オボチオールＡ（以下、ＯＶＯ－Ａと言う場合がある）もしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法、およびそれを生産する微生物に関する。詳細には、本開示は、オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、（ａ）ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を培地で培養すること、および（ｂ）該培養により得られた培地および／または菌体よりオボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含む、方法、ならびに、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有し、かつｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている、微生物、に関する。
　オボチオールＡはウニ卵から単離された物質で、一部の海洋生物に含まれていることが知られている。オボチオールＡには強い抗酸化活性があり、肝臓の線維化を抑制することや、がん細胞の増殖を抑制することが報告されている（非特許文献１－３）。オボチオールＡの生合成に関わる遺伝子としてｏｖｏＡおよびｏｖｏＢが知られているが、これらを使用してオボチオールＡが生産されたことは報告されていない（それぞれ非特許文献４および５）。オボチオールＡの製造方法として有機合成法が知られているが（非特許文献６および非特許文献７）、微生物を利用したオボチオールＡの製造方法は知られていない。オボチオールＡは試薬として入手することも困難であり、新たな製造方法が望まれている。
Weaver, Kim H., and Dallas L. Rabenstein. "Thiol/disulfide exchange reactions of ovothiol A with glutathione." The Journal of Organic Chemistry 60.6 (1995): 1904-1907. Brancaccio, Mariarita, et al. "Antifibrotic effect of marine ovothiol in an in vivo model of liver fibrosis. " Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2018 (2018). Brancaccio, Mariarita, et al. "Sulfur-containing histidine compounds inhibit γ-glutamyl transpeptidase activity in human cancer cells." Journal of Biological Chemistry 294.40 (2019): 14603-14614. Castellano, Immacolata, and Florian P. Seebeck. "On ovothiol biosynthesis and biological roles: from life in the ocean to therapeutic potential." Natural product reports 35.12 (2018): 1241-1250. Gerdol, Marco et al. "The complex evolutionary history of sulfoxide synthase in ovothiol biosynthesis." Proceedings. Biological sciences vol. 286,1916 (2019) Zaytseva, Elena Vasilevna, et al. "A cost-effective synthesis of enantiopure ovothiol A from L-histidine, its natural precursor". ARKIVOC Volume 2014 Part (vi): General Papers. Tod P. Holler, Fuqiang Ruan, Andreas Spaltenstein, and Paul B. Hopkins "Total synthesis of marine mercaptohistidines: ovothiols A, B, and C". The Journal of Organic Chemistry 1989 54 (19), 4570-4575
　上述のように、現状では、オボチオールＡまたはその関連物質の供給に課題がある。したがって、オボチオールＡまたはその関連物質を製造する方法が求められている。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を用いることで、オボチオールＡまたはその関連物質が生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって本開示は以下のものを提供する：
［項１］
　オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、
（ａ）ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を培地で培養すること、および
（ｂ）該培養により得られた培地および／または菌体よりオボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、
を含む、方法；
［項２］
　前記微生物が、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている微生物である、項１に記載の製造方法；
［項３］
　前記微生物が腸内細菌、放線菌、または酵母である、項１または２に記載の製造方法；
［項４］
　前記ｏｖｏＡ遺伝子および／またはｏｖｏＢ遺伝子が細菌由来である、項１－３のいずれか一項に記載の製造方法；
［項５］
　オボチオールＡの関連物質が、オボチオールＡジスルフィド、またはオボチオールＡとアミノ酸もしくはペプチドのジスルフィド体である、項１－４のいずれか一項に記載の製造方法；
［項６］
（ｃ）前記（ａ）で得られる培地および／または菌体を還元処理する工程を含む、項１－５のいずれか一項に記載の製造方法；
［項７］
　前記還元処理する工程が、還元剤で前記（ａ）で得られる培地および／または菌体を処理する工程を含む、項６に記載の製造方法；
［項８］
　ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有し、かつｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている、微生物；
［項９］
　前記微生物が腸内細菌、放線菌、または酵母である、項８に記載の微生物；
［項１０］
　前記ｏｖｏＡ遺伝子および／またはｏｖｏＢ遺伝子が細菌由来である、項８または９に記載の微生物。
　本開示によれば、オボチオールＡまたはその関連物質を製造することが可能となる。
図１は、オボチオールＡを含有すると思われる試験管培養液約３０ｍＬを出発原料とし、本ブロスを未殺菌の状態で高速遠心分離し（条件：９６００ｘＧ、１０分、２０℃）、得られた上清を０．２μｍフィルターで減圧濾過した液を除菌液とし、除菌液をＬＣ－ＭＳ分析した結果である。 図２は、除菌液をＨＰＬＣ分取条件に供したクロマトグラムである。 図３は、ＨＰＬＣ分取サンプルの1H-NMRチャートである。 図４は、ＨＰＬＣで分画したサンプルを１３Ｃ－ＮＭＲ測定に供した結果である。 図５は、還元処理後のサンプルのＬＣ－ＭＳ分析の比較結果である。 図６は、還元物および除菌液の［Ｍ＋Ｈ］＋の比較結果である。 図７は、遊離のオボチオールＡの検量線である。 図８は、各株のオボチオールＡの生産量を示すグラフである。
　本開示は、第１の態様では、オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、（ａ）ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を培地で培養すること、および（ｂ）該培養により得られた培地および／または菌体よりオボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、を含む方法に関する。本開示に従って、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を用いることにより、オボチオールＡまたはその関連物質の生産ができる、または生産量を増大させることができる。
　オボチオールＡの関連物質は、オボチオールＡの酸化体やアルキル化体等を包含する。酸化体の具体例として、ジスルフィド結合体、混合ジスルフィド体などが挙げられる。アルキル化体としては、オボチオールB、オボチオールCなどが挙げられる。ジスルフィド結合体としては、二分子のオボチオールＡが互いのチオール基の間でジスルフィド結合を形成して生成した化合物（以下、オボチオールＡジスルフィド、または（ＯＶＯ）２と呼ぶことがある）が挙げられる。混合ジスルフィド体としてアミノ酸またはペプチドとオボチオールＡに由来する化合物が挙げられる。例えば混合ジスルフィド体としてシステインとオボチオールＡに由来する化合物（以下、Ｏｖｏ－Ｃｙｓと呼ぶことがある）が挙げられる。また、オボチオールＡの関連物質は、５－チオヒスチジン、５－ヒスチジルシステインスルホキシド、2-メチルヒスチジンなどのオボチオールＡ前駆体も包含するが、これらに限定されない。オボチオールＡの関連物質は、それ自体が生理活性を有する場合があり、また体内で還元されてオボチオールＡを供給できてもよい。
　本開示に用いるオボチオールＡ生産微生物は、ｏｖｏＡ遺伝子を有し、かつｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物である。ある実施形態では、当該微生物は、ｏｖｏＡ遺伝子およびｏｖｏＢ遺伝子を有する。別の実施形態では、当該微生物は、ｏｖｏＡ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子を有する。オボチオールＡ生産微生物は自然から単離されたものでも、組換え体であってもよい。遺伝子組み換え方法は当業者が対象となる微生物に応じて適した方法を採用できる。ｏｖｏＡ遺伝子、ｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子は公知である。ｏｖｏＡ遺伝子、ｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子は、それぞれＯｖｏＡタンパク質、およびＯｖｏＢタンパク質およびＥｇｔ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。当該タンパク質として、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＡタンパク質（配列番号１）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＡタンパク質（配列番号２）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＢタンパク質（配列番号３）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ由来のＥｇｔ２タンパク質（配列番号４）が挙げられる。それらをコードする遺伝子は、それを発現させる微生物に最適化したコドンの塩基配列が使用されてもよい。例えば、それらをコードする遺伝子として、ｏｖｏＡ遺伝子、ｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子は当該タンパク質のアミノ酸配列を大腸菌Ｋ－１２用にコドン最適化した塩基配列が使用されてもよい。当該塩基配列として、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ由来のｏｖｏＡ遺伝子（配列番号５）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のｏｖｏＡ遺伝子（配列番号６）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のｏｖｏＢ遺伝子（配列番号７）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ由来のｅｇｔ２遺伝子（配列番号８）が挙げられる。好ましい実施形態では、オボチオールＡ生産微生物は、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ由来のｏｖｏＡ遺伝子を有し、かつＥｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のｏｖｏＢ遺伝子を有する微生物である。当業者は適宜公知の遺伝子に相当する遺伝子を使用することができる。ｏｖｏＡ遺伝子、ｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子の少なくとも１つの発現を増強させることにより、オボチオールＡまたはその関連物質の生産ができる、または生産量が増大し得る。ある実施形態では、ｏｖｏＡ遺伝子およびｏｖｏＢ遺伝子の両方の発現が増強されている。別の実施形態では、ｏｖｏＡ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子の両方の発現が増強されている。
　遺伝子の発現の増強は、公知の遺伝子発現増強方法を用いて行うことができる。発現の強いプロモーターの制御下に遺伝子を置く方法が一般的である。例えば、遺伝子の発現に適したプロモーターと遺伝子を組み込んだ発現ベクターを微生物に導入することによって、または相同組み換え等により宿主のゲノムに遺伝子を組み込むことによって、遺伝子の発現を増強させてもよい。ベクターとしてはプラスミドベクターやウイルスベクターを用いることができる。ベクターの構築に際して、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子や代謝酵素遺伝子などのマーカー遺伝子などのベクターの構成要素を適宜選択し、使用することができる。微生物への遺伝子導入方法も公知である。導入すべき遺伝子を微生物宿主のゲノム、あるいはベクターに組み込んで、微生物に導入することができる。２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が宿主により発現できればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよい。一態様では、１つのベクターにｏｖｏＡ遺伝子ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がコードされている。別の態様では、１つのベクターにｏｖｏＡ遺伝子がコードされ、かつ別のベクターにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子がコードされている。遺伝子導入方法の例としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ポリマーを用いる方法、電気穿孔法、パーティクルガン法などがあり、遺伝子導入する微生物の種類や導入する遺伝子に応じてこれらの方法を適宜選択することができる。また、遺伝子の発現の増強は、ゲノム上の特定の遺伝子もしくは領域を欠失させることで、内在性の遺伝子の発現を誘導させてもよい。
　遺伝子の発現の増強方法は上記方法に限定されない。また、本開示に用いる微生物は、自然変異の結果として遺伝子の発現が増強されたものであってもよい。遺伝子の発現の増強は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて確認することができる。あるいは、実際に微生物を培養して、菌体内または菌体外（培養液中）に生産される当該遺伝子がコードするタンパク質を定量することにより、当該遺伝子の発現の増強を確認することもできる。
　本開示で使用されるＯｖｏＡタンパク質、およびＯｖｏＢタンパク質およびＥｇｔ２タンパク質の由来はそれぞれ独立している。それらのタンパク質は、特に限定されないが、哺乳類動物、植物および真菌などの真核生物、放線菌などの細菌、古細菌に由来するポリペプチドまたはそれらに相当するポリペプチドである。例えば、オボチオールＡ生産微生物が発現するタンパク質として、腸内細菌、鉄還元細菌、ウニ、分裂酵母由来のタンパク質が挙げられる。好ましくは、オボチオールＡ生産微生物が発現するタンパク質は細菌に由来する。特定の実施形態では、ＯｖｏＡタンパク質はＧｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、またはＰａｒａｃｅｎｔｒｏｔｕｓ　ｌｉｖｉｄｕｓ由来のタンパク質である。別の実施形態では、ＯｖｏＢタンパク質は、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ由来のタンパク質である。ＯｖｏＡタンパク質、およびＯｖｏＢタンパク質およびＥｇｔ２タンパク質は微生物由来であることが好ましい。本開示で使用されるＯｖｏＡタンパク質、およびＯｖｏＢタンパク質およびＥｇｔ２タンパク質として、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＡタンパク質（配列番号１）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＡタンパク質（配列番号２）、Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ由来のＯｖｏＢタンパク質（配列番号３）、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ由来のＥｇｔ２タンパク質（配列番号４）が挙げられる。
　ＯｖｏＡタンパク質は、２機能酵素で２つの酵素反応に関わるドメインをもつ。一つ目はヒスチジンとシステインから、５－ヒスチジルシステインスルホキシドを生成する反応に関わる。当業者は適宜公知の技術でＯｖｏＡタンパク質の活性を測定することができ、例えば、ヒスチジンやシステインの消費、５－ヒスチジルシステインスルホキシドの生成をＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳで調べることにより測定できる。二つ目は、５－チオヒスチジンをメチル化し、オボチオールＡを生成する反応に関わる。オボチオールＡの生成をＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳ調べることにより測定できる。
　ＯｖｏＢタンパク質は、５－ヒスチジルシステインスルホキシドから、５－チオヒスチジンとピルビン酸を生成する反応に関わる。当業者は適宜公知の技術でＯｖｏＢタンパク質の活性を測定することができ、例えば、５－ヒスチジルシステインスルホキシドの消費や５－チオヒスチジンの生成をＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳで調べることにより測定できる。
　Ｅｇｔ２タンパク質は、ヘルシニルシステインスルホキシドから、エルゴチオネインとピルビン酸を生成する反応に関わる。当業者は適宜公知の技術でＥｇｔ２タンパク質の活性を測定することができ、例えば、ヘルシニルシステインスルホキシドの消費やエルゴチオネインの生成をＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳで調べることにより測定できる。
　本開示で使用されるＯｖｏＡタンパク質、およびＯｖｏＢタンパク質およびＥｇｔ２タンパク質は、それぞれ、機能的に同等である限り、任意のポリペプチドが選択される。例えば、ＯｖｏＡタンパク質は、下記（ａ）－（ｅ）に記載のポリペプチドである：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド；または
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド。
　本開示において、「１～数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」とは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味し、好ましくは、１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味し、さらに好ましくは、１個、２個、３個または４個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を意味する。
　「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＣＳＨ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８３）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｎ．　Ｙ．　（１９８９），　６．３．１－６．３．６）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
　本開示に用いるオボチオールＡまたはその関連物質の生合成遺伝子を有する微生物は、いかなる微生物であってもよい。オボチオールＡまたはその関連物質を生産する能力のある微生物は、例えば、腸内細菌、放線菌、または酵母である。腸内細菌は、特に限定されないが、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物である。特に好ましい腸内細菌科に属する微生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア属に属する微生物が挙げられる。放線菌は、特に限定されないが、ストレプトマイセス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属に属する微生物である。特に好ましいストレプトマイセス属に属する微生物としては、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・アルバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス・アルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ）が挙げられる。酵母としては、シゾサッカロマイセス属、サッカロマイセス属などの酵母が挙げられる。
　発現させるタンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞におけるコドン使用頻度に合わせてコドン最適化等を行った改変遺伝子や人工遺伝子であってもよい。例えば、宿主細胞が属する生物種とは異なる種または異なる属の生物種に由来するタンパク質を発現させる場合、かかる改変遺伝子や人工遺伝子を用いることが効率的な発現のために有効な手段となり得る。コドン最適化等の遺伝子改変や、所望の（例えばコドン最適化された）配列を有する人工遺伝子の合成等は、当該技術分野において公知の方法によって行えばよく、特に限定するものではないが、例えば、変異導入プライマーを用いた部位特異的変異導入など公知の手法による変異導入、または変異後の配列（もしくは配列の一部）を有する核酸の人工合成によって行うことができる。
　本開示の製造方法における微生物の培養は、通常の方法にて行うことができる。微生物の種類に応じて培地組成や培養温度、培養時間、ｐＨ、通気条件等の諸条件を選択することができる。上記微生物を公知の培地にて培養することにより、オボチオールＡを産生させることができるが、ヒスチジン、メチオニン、またはシスチンなどのオボチオールＡ生合成に寄与する化合物あるいはそれらの前駆体が培地に含まれていてもよい。一実施形態では、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地などを用いることができる。上記の培地を用いて、オボチオールＡを産生させることができるが、用いる培地はこれらに限定されない。また、生産させたオボチオールＡまたはその関連物質は菌体内に蓄積してもよいし、菌体外（培養液中）に分泌または蓄積してもよい。
　菌体内、または菌体から遊離されたオボチオールＡまたはその関連物質の回収は公知の方法によって行うことができる。例えば、培養物を遠心分離あるいは濾過等の固液分離に供して、菌体内からは溶媒抽出、熱水抽出、破砕処理等によりオボチオールＡまたはその関連物質を含む抽出液を取得できる。オボチオールＡまたはその関連物質を含む抽出液、または培養上清からは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知のクロマトグラフィーに供してオボチオールＡまたはその関連物質を得ることができる。
　オボチオールＡまたはその関連物質の生合成遺伝子を有する微生物の培養で得られる培地および／または菌体を還元処理することにより、オボチオールＡの関連物質を還元し、オボチオールＡを得てもよい。還元処理する工程は、還元剤を使用する工程、または電気化学的に還元する工程を含む。本明細書において「還元剤」は、他の物質に電子を与えて自らは酸化される物質を意味する。還元剤は、公知の方法により調製でき、または商業的に入手可能である。還元剤は、例えば、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。還元剤は、１種単独で用いてもよく、または２種以上を組合せて用いてもよい。好ましい態様では、還元剤はＤＴＴまたはＴＣＥＰである。例えば、培養した培地に終濃度約１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭのＤＴＴを反応させて還元処理が行われる。
　本開示は、第２の態様では、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有し、かつｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている、微生物に関する。本開示の微生物を用いることにより、オボチオールＡまたはその関連物質の生産能を高めることができる。
　本明細書において「約」とは±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。
　以下に実施例を示して本開示をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本開示の範囲を限定するものではない。なお、特に説明がない場合には、分子生物学、応用微生物学に関する標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾、改変した方法を用いて実験を実施した。また、％は、特に明記しない限りｗ／ｖ％を表す。
［実施例１：オボチオールＡ生産菌の構築］
＜大腸菌生産用ベクター構築＞
　大腸菌においてオボチオールＡ（以下、ＯＶＯ－Ａと言う場合がある）を生産させるために、以下に説明する方法でｏｖｏＡ遺伝子ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含むオボチオールＡ生産ベクターを構築した。ＯｖｏＡは鉄還元菌（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ）由来のＧｂ．ＯｖｏＡ（配列番号１：アミノ酸配列）、腸内細菌（Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＥｔ．ＯｖｏＡ（配列番号２：アミノ酸配列）の２種をそれぞれ用いた。ＯｖｏＢは、腸内細菌（Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＥｔ．ＯｖｏＢ（配列番号３：アミノ酸配列）と、さらにエルゴチオネインの生合成酵素でβ－リアーゼ反応を触媒する分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）由来のＳｐ．Ｅｇｔ２（配列番号４：アミノ酸配列）を使用した。上記アミノ酸配列をもとに、大腸菌Ｋ－１２株用にコドン最適化を行った遺伝子配列Ｇｂ．ｏｖｏＡ（配列番号５：塩基配列）、Ｅｔ．ｏｖｏＡ（配列番号６：塩基配列）Ｅｔ．ｏｖｏＢ（配列番号７：塩基配列）、Ｓｐ．ｅｇｔ２（配列番号８：塩基配列）を人工合成した。人工合成したｏｖｏＡ、ｏｖｏＢ、ｅｇｔ２遺伝子を含むベクターを鋳型に、表１記載のプライマーを用いて各遺伝子配列をそれぞれ増幅した。
　発現ベクターは、ｐ１５Ａ複製起点、ｒｒｎＢターミネーター、薬剤マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子を有するベクターを用いて、さらにプロモーターを大腸菌のｇａｐＡ遺伝子のプロモーターに改変したものを用いた。発現ベクターのプロモーター直下にあるＨｉｎｄＩＩＩ－ＡｆｌＩＩ部位に、表２の組み合わせ、および順番となるよう４遺伝子のＰＣＲ産物をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて連結し、オボチオールＡの生産用ベクターとしてｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２、ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２、ｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢ、ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢを構築した。ｏｖｏＡ遺伝子とｏｖｏＢ（ｅｇｔ２）遺伝子の間には、ＳＤ配列を含むリンカー領域（５’－ＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＧＣ－３’(配列番号１７)）で連結できるようプライマーを設計した。また、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応はタカラバイオ社提供のプロトコールに従って行った。また、合成遺伝子をクローニングしていない発現ベクター（ｐＥｍｐｔｙ）をコントロールとして用いた。
　奈良先端科学技術大学院大学より、Ｍｏｌ．　Ｓｙｓｔ．　Ｂｉｏｌ．，　２００６；　２：　２００６．０００８（　Ｂａｂａ，　Ｔ．ら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ｉｎ－ｆｒａｍｅ，　ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｍｕｔａｎｔｓ：　ｔｈｅ　Ｋｅｉｏ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　記載の方法に準じて大腸菌ＢＷ２５１１３（ＮＢＲＣ１０３４０４）株から調製された、ＭｅｔＪタンパク質をコードする遺伝子の欠損した大腸菌ΔｍｅｔＪ株を入手し使用した。構築したオボチオールＡ生産ベクター４種とｐＥｍｐｔｙを合わせた５種のベクターでΔｍｅｔＪ株を形質転換し、オボチオールＡ生産株を得た。
　なお、大腸菌ΔｍｅｔＪ株は例えば以下の方法に準じて調製することもできる。ｍｅｔＪ遺伝子の上流配列と下流配列を含むカウンターセレクションベクター（ｓａｃＢ遺伝子、薬剤耐性遺伝子を含む）を用いた相同組み換え法により、大腸菌ＢＷ２５１１３株の各遺伝子領域を欠失させる従来公知の方法で構築できる。上記の破壊株構築は、Ｍ．　Ｓ．　Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｊ．　Ｓ．　Ｋａｐｅｒ，　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｉｍｍｕｎ．，　１９９１，　４３１０－４３１７や、Ｈ．　Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２００７，　７１　（１２），　２９０５-２９１１などを参照できる。
［実施例２：標品の取得と生産物の確認］
＜ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢの培養＞
　実施例１で構築したオボチオールＡ生産菌、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢを用いて、試験管での培養を実施し、オボチオールＡの定量に必要な標品の取得を試みた。
　ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢの形質転換体を含む寒天プレートから白金耳でコロニーを釣菌し、５ｍＬのＬＢ培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇ／培地１Ｌ）、テトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を含む試験管に植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで１８時間、定常期に達するまで振盪培養し前培養液を得た。さらに、Φ２４ｍｍ試験管中の５ｍＬの培地（ポリペプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、グルコース５ｇ、Ｌ－ヒスチジン５ｍＭ、Ｌ－シスチン２．５ｍＭ、Ｌ－メチオニン１５ｍＭ／培地１Ｌ）にテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加し、ＯＤ＝０．５となるよう前培養液を添加し、３０℃３００ｒｐｍで７２時間振盪することで本培養を行った。また、培養３０時間でＬ－ヒスチジン５ｍＭ、Ｌ－シスチン２．５ｍＭ、Ｌ－メチオニン１０ｍＭ（終濃度）をそれぞれ添加した。培養は試験管６本で実施し、培養終了後合一し、精製、分取へ使用した。
＜精製＞
　上記オボチオールＡを含有すると思われる試験管培養液約３０ｍＬを出発原料とした。本ブロスを未殺菌の状態で高速遠心分離し（条件：９６００ｘＧ、１０分、２０℃）、得られた上清を０．２μｍフィルターで減圧濾過した液を除菌液として分取作業に供した。
＜分取＞
　除菌液をＬＣ－ＭＳ分析したところ（図１）、オボチオールＡおよびオボチオールＡジスルフィド（以下、（ＯＶＯ）２と言う）に対応する［Ｍ＋Ｈ］＋を確認した（後者は培養から精製の過程で酸化されて生成したと推定した）。
　除菌液をＨＰＬＣ分取条件により分画したところ、保持時間７．５分までに溶出される親水性夾雑ピーク（ＵＶ吸収のない塩類も含む）と比較して、（ＯＶＯ）２のピークはカラム内に保持され（保持時間１０分前後）、高純度での分離に成功した（図２）。これを複数回（計３０００μＬを３回に分けて注入）分画したものを合一してＮＭＲ測定に供した。
＜ＮＭＲ測定＞
　上で合一したフラクションをロータリーエバポレーターで濃縮し、－８０℃のディープフリーザーで半日間冷凍したものを１昼夜かけて真空凍結乾燥した。凍結乾燥品は５．８ｍｇ回収された。この乾燥物とＤＳＳ－ｄ６標準物質をそれぞれ精密天秤で１．５４９３ｍｇ、０．３８５７ｍｇ秤量し、０．７５ｍＬのＤ２Ｏで溶解したものをＮＭＲサンプルとした。
　１Ｈ－ＮＭＲの測定結果（図３）を非特許文献７で報告されている値と比較したところ、本分取サンプルの測定結果は（ＯＶＯ）２のＤＬ体の値とよく一致した。１３Ｃ－ＮＭＲの測定結果（図４）についても、その構造を支持した。また、定量ＮＭＲによるＤＳＳ－ｄ６標準物質との比較から上記乾燥物の（ＯＶＯ）２純度は、８０．３％であった。
＜還元反応＞
　乾燥物０．４９５ｍｇとＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）塩３ｍｇをイオン交換水０．５ｍＬと共に混和し、３０分程静置した。反応終了後のサンプルを比較サンプルと共にＬＣ－ＭＳ分析したところ（図５）、還元物のクロマトグラム中に、除菌液中でも確認されていたオボチオールＡのピークとそれに対応する［Ｍ＋Ｈ］＋を確認したことから（図６）、本乾燥物をオボチオールＡジスルフィドと同定した。取得した乾燥物を（ＯＶＯ）２標品として、実施例３のオボチオールＡ発酵生産試験の定量に用いた。また、図５の除菌液中にはＳ－［Ｌ－システイニル］－オボチオールＡジスルフィド（以下、ＯＶＯ－Ｃｙｓと言う）と考えられるピークとそれに対応する［Ｍ＋Ｈ］＋（理論値３２１．０６９１に対し実測値３２１．０６８４）も確認された。
＜ＬＣ－ＭＳ分析条件＞
　除菌液は超純水で２０倍希釈した後、０．２μｍフィルター濾過したものを、その他のサンプルについては検出強度が同程度になるよう適宜希釈してアプライした。
＜ＮＭＲ測定条件＞
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）ＤＳＳ－ｄ６を０ｐｐｍとした。
　１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）ＤＳＳ－ｄ６のＳｉ－ＣＨ３を０ｐｐｍとした。
［実施例３：オボチオールＡの発酵生産試験］
＜培養＞
　実施例１で構築したオボチオールＡ生産株４種、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢ、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢを用いて、オボチオールＡの発酵生産試験を行った。ΔｍｅｔＪ株に空ベクターｐＥｍｐｔｙを導入したΔｍｅｔＪ／ｐＥｍｐｔｙをコントロール株とした。ΔｍｅｔＪ／ｐＥｍｐｔｙと４種のΔｍｅｔＪ／ｐＯＴそれぞれの形質転換体を含む寒天プレートから白金耳でコロニーを釣菌し、５ｍＬのＬＢ培地（ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ　１０ｇ／培地１Ｌ）、テトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を含む試験管に植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで１５－１８時間、定常期に達するまで振盪培養し前培養液を得た。さらに、Φ２４ｍｍ試験管中の５ｍＬの培地（ポリペプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ、グルコース５ｇ、Ｌ－ヒスチジン５ｍＭ、Ｌ－シスチン２．５ｍＭ、Ｌ－メチオニン１５ｍＭ／培地１Ｌ）にテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加し、ＯＤ＝０．５となるよう前培養液を添加し、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間振盪することで本培養を行った。また、培養３０時間でＬ－ヒスチジン５ｍＭ、Ｌ－シスチン２．５ｍＭ、Ｌ－メチオニン１０ｍＭ（終濃度）をそれぞれ添加した。本培養の間、培養開始後４８、７２時間に培養液１ｍＬを採取し培養サンプルを評価した。採取した培養液の菌体濁度（ＯＤ６００）を測定後、１４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。試験に用いた５種の菌株は、それぞれｎ＝３となるよう独立した形質転換体を用いて実施した。
＜オボチオールＡ生産性の評価＞
　オボチオールＡの生産性の評価は下記の通り行った。実施例２に記載の通り、分離した培養液（菌体外サンプル）中には、オボチオールＡが酸化された（ＯＶＯ）２、ＯＶＯ－Ｃｙｓが存在することが分かっている。この結果から、さらに培養液中のタンパク質のＣｙｓ残基等にオボチオールＡが結合することも示唆された。より正確に各菌株のオボチオールＡの生産性を評価するために、還元剤であるＤＴＴ（ジチオトレイトール）を培養液に添加しオボチオールＡを含むジスルフィド体を還元し、遊離のオボチオールＡ量をＨＰＬＣにより測定し、各生産菌の正味のオボチオールＡ生産量とした。ＨＰＬＣでの定量では、実施例２で得た（ＯＶＯ）２標品を用いて０．５、１．０、２．０、５．０ｍｇ／Ｌの標準溶液を作成し、ＤＴＴ（終濃度２００ｍＭ）を添加し還元したサンプルをＬＣ－ＭＳで分析し保持時間１．４分付近に生じるオボチオールＡピークの面積値から検量線を作成し外部標準法により遊離のオボチオールＡを定量した（図７）。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表５の通りである。各生産菌の培養液サンプルは、検量線の範囲内にピーク面積値が収まる様に適宜希釈を実施した。また、使用した（ＯＶＯ）２標品の純度は８０．３％であるため、得られたオボチオールＡ定量値に０．８０３を乗じた数値を各生産菌の生産量とした。
＜生産試験結果＞
　培養試験の結果、培養４８時間、７２時間後それぞれにおいて、コントロール株ΔｍｅｔＪ／ｐＥｍｐｔｙからはＯＶＯの生産は確認されなかったが、４種のオボチオールＡ生産株全ての培養液中にオボチオールＡの生産を確認できた。培養７２時間でそれぞれ、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢ株が０．８５±０．１８ｇ／Ｌ、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｅｔ．ｏｖｏＢ株が１．０９±０．３３ｇ／Ｌ、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｅｔ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２株が０．６３±０．０８ｇ／Ｌ、ΔｍｅｔＪ／ｐＯＴ－Ｇｂ．ｏｖｏＡ－Ｓｐ．ｅｇｔ２株が０．６４±０．１１ｇ／Ｌを生産した（図８）。
　β－リアーゼ反応にＥｔ．ＯｖｏＢを使用した菌株だけでなく、エルゴチオネインの合成酵素Ｓｐ．Ｅｇｔ２を使用した菌株でもオボチオールＡを生産した。エルゴチオネインの合成に関わるβ－リアーゼであるＥｇｔ２やＥｇｔＥがオボチオールＡ生合成で生じる、５－ヒスチジルシステインスルフォキシド（ｈｉｓｔｉｄｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を基質とする報告はこれまでになかった。上記結果より、エルゴチオネインの合成酵素であるＥｇｔ２やＥｇｔＥがオボチオールＡの生産に利用できることが示された。全ての菌株で０．５ｇ／Ｌを超えるオボチオールＡの生産を確認でき、鉄還元菌（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ　ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ）由来のＧｂ．ＯｖｏＡ、腸内細菌（Ｅｒｗｉｎｉｎａ　ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＥｔ．ＯｖｏＢを使用した時に最も生産し、１ｇ／Ｌと著量のオボチオールＡ生産を確認した。これまで、オボチオールＡの取得にはウニなどの海洋生物から抽出する方法や、有機合成法が知られていたが、微生物を利用してオボチオールＡを製造する方法は知られていなかった。本願記載の微生物を用いた生産方法を用いることで、オボチオールＡを取得できることを確認した。
［配列表］

Claims (10)

  1. 　オボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物の製造方法であって、
    （ａ）ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有する微生物を培地で培養すること、および
    （ｂ）該培養により得られた培地および／または菌体よりオボチオールＡもしくはその関連物質、またはこれらの混合物を採取すること、
    を含む、方法。
  2. 　前記微生物が、ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている微生物である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記微生物が腸内細菌、放線菌、または酵母である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記ｏｖｏＡ遺伝子および／またはｏｖｏＢ遺伝子が細菌由来である、請求項１－３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　オボチオールＡの関連物質が、オボチオールＡジスルフィド、またはオボチオールＡとアミノ酸もしくはペプチドのジスルフィド体である、請求項１－４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. （ｃ）前記（ａ）で得られる培地および／または菌体を還元処理する工程を含む、請求項１－５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記還元処理する工程が、還元剤で前記（ａ）で得られる培地および／または菌体を処理する工程を含む、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　ｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を有し、かつｏｖｏＡ遺伝子、ならびにｏｖｏＢ遺伝子およびｅｇｔ２遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の、一方または両方の発現が増強されている、微生物。
  9. 　前記微生物が腸内細菌、放線菌、または酵母である、請求項８に記載の微生物。
  10. 　前記ｏｖｏＡ遺伝子および／またはｏｖｏＢ遺伝子が細菌由来である、請求項８または９に記載の微生物。
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