KR20220053683A - 단일 세포 단백질 또는 바이오매스 생산을 위한 균주 및 방법 - Google Patents

단일 세포 단백질 또는 바이오매스 생산을 위한 균주 및 방법 Download PDF

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KR20220053683A
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솔라 푸즈 오와이
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Abstract

본 발명은 크산토박터 속의 박테리아 균주 및 크산토박터 속의 박테리아를 사용하여 단백질 또는 바이오매스를 생산하기 위한 연속 배양 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 기체 및 미네랄을 세포에 공급하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 방법의 산물 및 이러한 산물의 예를 들어 식품 또는 사료에서의 용도에 관한 것이다.

Description

단일 세포 단백질 또는 바이오매스 생산을 위한 균주 및 방법
본 발명은 미생물을 이용한 단백질 및/또는 기타 거대분자의 생산에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 신규한 박테리아 균주, 및 박테리아를 이용하여 단백질 또는 바이오매스를 생산하기 위한 연속 배양 방법에 관한 것으로서, 여기서 기체 및 미네랄이 세포에 공급된다. 본 발명은 또한 이러한 방법의 산물, 및 이러한 산물의 예를 들어 식품 또는 사료에서의 용도에 관한 것이다.
세계 인구 증가, 기후 변화 및 물 부족은 전통적인 농업 및 이에 따른 식량 및 사료의 충분한 공급을 점점 더 위협하고 있다. 그러므로, 유기 분자 예컨대 단백질의 대체 공급원을 조사하였다. 잠재적인 대안으로는 단일 세포 생산, 즉 미생물을 이용하여 단백질 및/또는 기타 거대분자를 생산하는 것이다.
화학독립영양 미생물 (chemoautotrophic microorganisms)은 에너지 공급원으로서 수소 기체 및 유일한 탄소 공급원으로서 이산화탄소를 사용하여 최소 미네랄 배지 (minimal mineral medium)에서 성장할 수 있다고 개시되어 있다. 이러한 미생물에 대한 검토는 예를 들어 Shively et al. (1998) Annu Rev Microbiol 52:191를 참조한다. 특허출원 WO2018144965는 기체 기질을 고-단백질 바이오매스로 전환하기 위한 다양한 미생물 및 생물공정을 개시하였다. Andersen et al. (1979) Biochim Biophys Acta 585:1-11은 종속영양 (heterotrophic) 및 자가영양 (autotrophic) 조건에서 쉽게 성장하는 수소 박테리아인 알칼리게네스 유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus)의 돌연변이 균주를 개시하였다. 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 (rubisco) 활성이 변경된 돌연변이체를 특성규명하였다. Ohmiya et al. (2003) J. Biosci. Bioeng. 95:549-561은 취급이 어려운 (recalcitrant) 바이오매스 활용에 대한 미생물 유전자의 적용을 검토하였다. Yu Jian et al. (2013) Int J Hydrogen Ener 38:8683-8690은 수소-산화 박테리아 단리물에 의한 이산화탄소 고정을 개시하였다. 50%의 높은 에너지 효율이 적당한 산소 농도 (10 mol%) 하에 측정되었다.
그러나, 다양한 화학독립영양 미생물은 성장 속도, 수율, 바이오매스 조성뿐만 아니라 식품 성분으로서의 사용과 관련된 특성 예컨대 인간 섭취의 안전성, 맛, 냄새, 마우스필 (mouth-feel), 조리시 기술적 및 기능적 특성 등의 측면에서 서로 다른 특성을 가지고 있다. 모든 화학독립영양 미생물이 충분한 성장 속도 및 충분한 수율을 제공하는 것은 아니며, 모든 공정이 경제적으로 실행 가능한 대규모 공정으로 현실적으로 확장될 수 있는 것은 아니다. 예를 들어 식품 또는 사료 적용을 위해 기능성 단백질을 충분히 생산하기 위해서는 대규모로 수행될 수 있는 적절한 공정 및 적절한 생산 유기체를 찾는 것이 중요하다. 이러한 필요성이 본 발명에 의해 다루어진다.
발명의 요약
제1 주요 양상에서, 본 발명은 단리된 박테리아 균주 VTT-E-193585 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주 또는 이의 유도체를 포함하는 배양물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바이오매스 및/또는 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 박테리아 균주 또는 이의 유도체를 배양하는 단계를 포함한다.
추가 양상에서, 본 발명은 바이오매스 및/또는 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 크산토박터 (Xanthobacter) 속의 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함한다.
추가의 주요 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 벌크 단백질, 바이오매스 또는 비-단백질 세포 또는 화학 성분, 및 본 발명의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 식품 또는 사료 제품에 관한 것이다.
도 1. VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 화학독립영양 200-L 배양 중에 600 nm에서 측정된 광학 밀도 (검정색 원) 및 광학 밀도 프로브 판독값.
도 2. 상이한 질소 공급원들에 대한 VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 병렬 화학독립영양 200-mL 배양 중에 600 nm에서 측정된 광학 밀도.
발명의 상세한 설명
정의
예를 들어 균주의 맥락에서 용어 "단리된"이 본원에서 사용되는 경우, 이의 자연 환경으로부터 단리되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 단리된 균주는 순수하며, 즉 다른 균주는 없다.
균주의 맥락에서 용어 "유도체"가 본원에서 사용되는 경우, 참조 균주로부터 유래되는, 즉 참조 균주를 출발점으로서 사용하여 생성된 균주를 지칭한다. 예를 들어, 유전자-조작되거나 또는 달리 돌연변이되거나 또는 유전자-변형된 균주는 이러한 유도체의 구체예이다. 유전자 변형은 전체 유전자좌 또는 이의 단편의 삽입 또는 결실을 포함하는 삽입 또는 결실 뿐만 아니라, 점 돌연변이를 포함한다. 유도체는 바람직하게는 참조 균주와 비교하여, 10개 미만의 유전자 변형, 예를 들어 5개 미만, 예컨대 4, 3, 2 또는 1개의 유전자 변형(들)을 갖는다.
명사 "배양물"이 본원에서 사용되는 경우, 액체 배지 중에 생존 세포의 현탁액을 지칭한다.
용어 "바이오매스"는 박테리아 발효 분야에서 이의 통상적 의미를 가지며, 세포 물질을 지칭한다.
용어 "연속 배양"이 본원에서 사용되는 경우, 새로운 배지가 배양에 연속적으로 부가되고, 박테리아 배양물이 있는 배지가 본질적으로 동일한 속도로 연속적으로 제거되는 배양 과정을 지칭한다.
본 발명의 양상 및 구체예
제1 주요 양상에서, 본 발명은 단리된 박테리아 균주 VTT-E-193585 또는 이의 유도체에 관한 것이다.
균주 VTT-E-193585는 핀란드 Naantali의 발트해 해변에서 단리되었다. 상기 유기체는 제한된 산소 조건에서 에너지 공급원으로서 수소 및 탄소 공급원으로서 이산화탄소와 함께, 최소 미네랄 배지를 사용하여 적절한 생물반응기 조건에서 성장시킬 수 있다. 16S 시퀀싱 및 Illumina 메타유전체학 시퀀싱으로, 상기 균주는 크산토박터 속의 구성원일 가능성이 가장 높지만, 알려진 종은 아닌 것으로 밝혀졌다. 상기 박테리아 균주는 건조된 세포 분말의 단백질 함량이 높고, 모든 필수 아미노산을 함유하기 때문에 식품 및 사료 적용에 매우 적합하다. 이는 또한 포화 지방산보다 더 많은 불포화 지방산 및 높은 수준의 B군 비타민을 함유한다. 알레르기 또는 독성을 유발할 수 있는 펩티도글리칸 및 리포폴리사카라이드의 수준은 낮다. 상기 균주에 대한 독성 분석을 수행하였으며, 유전독성 또는 세포독성이 관찰되지 않았다. 또한, 상기 균주는 일반적으로 항생제에 민감하다.
균주 VTT-E-193585 (SoF1)는 부다페스트 조약에 따른 국제 기탁 기관인, 핀란드 FI-02044 VTT, P.O. Box 1000에 주소를 둔, 핀란드 VTT Technical Research Centre의 VTT Culture Collection에 2019년 6월 11일자로 기탁되었다. 상기 균주의 특성 및 균주 배양 방법에 대한 추가 정보는 본원의 실시예에 제공된다.
바람직한 일 구체예에서, 균주가 균주 VTT-E-193585의 유도체인 경우, 상기 유도체는 에너지 공급원으로서 수소 기체 및 유일한 탄소 공급원으로서 이산화탄소를 사용하여 성장하는 능력을 보유하였다.
일 구체예에서, 균주가 균주 VTT-E-193585의 유도체인 경우, 상기 유도체는 서열번호: 1에 제시된 16S 리보솜 RNA, 또는 서열번호: 1과 최대 20개, 예를 들어 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 5개의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어 서열번호: 1과 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드 차이를 갖는 16S 리보솜 RNA를 포함한다.
서열번호: 1. 균주 VTT-E-193585의 16S 리보솜 RNA 서열:
Figure pct00001
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주 또는 이의 유도체를 포함하는 배양물에 관한 것이다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 배양물의 부피는 100 mL 이상, 예를 들어 1 L 이상, 예컨대 10 L 이상, 예를 들어 1,000 L 이상, 예컨대 10,000 L 이상, 예를 들어 50,000 L 이상, 예컨대 100,000 L 이상, 예를 들어 200,000 L 이상이다.
추가 양상에서, 본 발명은 바이오매스 및/또는 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 박테리아 균주 또는 이의 유도체를 배양하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스의 생산을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 단백질의 생산을 위한 것이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 균주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함한다. 추가 일 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스의 생산을 위한 것이며, 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 균주를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함한다. 상기 방법의 다양한 추가 구체예가 하기에 기재되어 있다.
추가의 주요 양상에서, 본 발명은 바이오매스 및/또는 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 크산토박터 속의 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 바이오매스의 생산을 위한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 단백질의 생산을 위한 것이다. 상기 방법의 다양한 추가 구체예가 하기에 기재되어 있다.
게놈 서열에 따르면, 번호 VTT-E-193585로 기탁된 균주는 탄소 고정을 위해 Calvin-Benson-Bassham 사이클을 사용할 가능성 있으며, 여기서 이산화탄소 분자는 리불로스 1,5-비스포스페이트의 5-탄소 사슬에 연결되어 글리세레이트 3-포스페이트의 2개의 분자를 형성한다. 이를 통해 균주는 성장에 필요한 다른 모든 유기 분자를 합성할 수 있다. 수소로부터의 에너지는 NAD+-환원 하이드로게나제 및/또는 NiFeSe-하이드로게나제를 통해 세포로 유입된다. 본질적으로 이는 수소 (H2)가 H+로 산화되고 NAD+가 NADH로 환원되는 산화환원 반응이다. ATP에 추가하여, NADH는 생물체 내부의 주요 에너지 운반체 중 하나이다. 대안으로서, 일부 다른 에너지 등가물은 H2를 사용하는 다른 하이드로게나제 효소에 의해 환원된다. Calvin-Benson-Bassham 사이클은 CO2를 고정하기 위해 ATP 및 NADH/NADPH의 형태로 에너지를 필요로 한다. 상기 균주는 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성할 수 있고, 이는 막을 가로질러 양성자 구배를 생성하는 4개의 단백질 복합체로 구성된다. 양성자 구배는 주로 NADH로부터의 에너지를 사용하여 생성된다. 상기 양성자 구배는 ATP를 생성하는 ATP 신타제 복합체를 유도한다. 게놈 서열에 따르면, 상기 균주는 박테리아 F-타입 ATP 신타제를 갖는다.
상기 방법이 무기 탄소 공급원으로 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것으로 명시되는 경우, 상기 무기 탄소 공급원은 배양에서 주요 탄소 공급원인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상기 배양물 중에 유기 탄소 공급원이 소량 존재할 수 있지만, 상기 배양의 주요 대사작용 및 성장은 탄소 공급원으로서 무기 탄소 공급원, 바람직하게는 이산화탄소의 이용에 기반한다. 바람직하게는, 배양에 공급되는 유기 탄소 공급원으로서의 탄소의 비율은 공정 중에 배양에 공급된 모든 탄소의 5% 미만, 예컨대 1% 미만, 예를 들어 0.1% 미만이다. 바람직하게는, 유기 탄소 공급원은 공정에 공급되지 않는다.
유사하게, 상기 방법이 에너지 공급원으로서 수소 (H2)를 사용하여 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것으로 명시되는 경우, 수소는 배양에서 주요 에너지 공급원인 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 질소 공급원으로 공급될 수 있는 암모니아 또는 소량의 유기 화합물과 같이 배양에서 다른 에너지 공급원이 소량 존재할 수 있지만, 상기 배양의 주요 대사작용 및 성장은 에너지 공급원으로서 수소의 이용에 기반한다. 전체 공정에서 수소는 바람직하게는 물 전기분해에 의해 생성되며; 즉, 전기로 물을 수소 및 산소 기체로 분해하여 생성된다. 따라서, 수소 및 산소 기체는 근처의 전기분해장치 (electrolyser)로부터 생물반응기로 제공된다. 대안으로서, 전극은 별도의 전기분해장치가 아닌 생물반응기에서 수소 및 산소를 생성하기 위해 생물반응기 내부에 배치될 수 있다.
이산화탄소를 포함하는 무기 탄소 공급원은 예를 들어 일산화탄소와 같은 다른 무기 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 기체 형태의 탄소 공급원 만이 배양에 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 이산화탄소는 배양에 제공되는 유일한 무기 탄소 공급원이며 실제로는 유일한 탄소 공급원이다. 일 구체예에서, 기체 및 미네랄 만이 배양에 제공되고, 기체 중 이산화탄소 수준은 10% 내지 50%, 예를 들어 15% 내지 45%, 예컨대 20% 내지 40%, 예를 들어, 25% 내지 35%, 예컨대 26% 내지 30%로 제공된다.
다른 구체예에서, 기체 및 미네랄이 배양에 제공되고, 기체 중 수소 (H2)의 수준은 30% 내지 80%, 예를 들어 35% 내지 75%, 예컨대 40% 내지 70%, 예를 들어 45% 내지 65%, 예컨대 50% 내지 60%로 제공된다.
다른 구체예에서, 기체 및 미네랄이 배양에 제공되고, 기체 중 산소 (O2)의 수준은 10% 내지 25%, 예를 들어 15% 내지 20%, 예컨대 16% 내지 18%로 제공된다. 다른 구체예에서, 산소 수준은 배양물 중 용존 산소 수준이 5% 내지 10%로 유지되도록 제공된다.
바람직한 일 구체예에서, 기체 및 미네랄 만이 배양으로 제공되며, H2, CO2 및 O2를 포함하는 기체가 제공되고, 여기서 H2의 퍼센트는 40% 내지 70%이며, CO2의 퍼센트는 18% 내지 28%이고, O2의 퍼센트는 12% 내지 22%이다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 질소 공급원의 부가를 포함한다. 상기 질소 공급원은 예를 들어 수산화암모늄, 암모늄 염 예컨대 황산암모늄 또는 염화암모늄, 암모니아, 우레아 또는 니트레이트 예를 들어 질산칼륨의 형태로 제공될 수 있다. 다른 구체예에서, 질소 기체 (N2)가 질소 공급원으로서 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 질소 공급원은 수산화암모늄 또는 암모늄 염 예컨대 황산암모늄이다.
일 구체예에서, 질소 공급원은 수산화 암모늄을 100 mg/L 내지 10 g/L, 예컨대 250 mg/L 내지 4 g/L, 예를 들어 0.5 g/L 내지 2 g/L, 예컨대 0.75 g/L 내지 1.5 g/L의 농도로 제공된다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 미네랄, 예컨대 암모늄, 포스페이트, 칼륨, 나트륨, 바나듐, 철, 설페이트, 마그네슘, 칼슘, 몰리브덴, 망간, 붕소, 아연, 코발트, 셀레늄, 요오드, 구리 및/또는 니켈을 함유하는 미네랄의 부가를 포함한다. 적합한 미네랄 배지는 잘 알려진 기술이며, 예를 들어 Thermophilic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL, Jacob K. Kristjansson, ed., 1992, for example on page 87, Table 4에 기재되었다.
일 구체예에서, 부가된 미네랄은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 암모니아, 암모늄 (예: 염화암모늄 (NH4Cl), 황산암모늄 ((NH4)2SO4), 니트레이트 (예: 질산칼륨 (KNO3)), 우레아 또는 유기 질소 공급원; 포스페이트 (예: 인산이나트륨 (Na2HPO4), 인산칼륨 (KH2PO4), 인산 (H3PO4), 이티오인산칼륨 (K3PS2O2), 오르토인산칼륨 (K3PO4), 인산이나트륨 (Na2HPO4·2H2O) 인산이칼륨 (K2HPO4) 또는 인산일칼륨 (KH2PO4); 설페이트; 효모 추출물; 킬레이트화된 철 (예를 들어 EDTA 또는 시트르산으로 킬레이트화됨); 칼륨 (예: 인산칼륨 (KH2PO4), 질산칼륨 (KNO3), 요오드화칼륨 (KI), 브롬화칼륨 (KBr)); 및 기타 무기염, 미네랄 및 미량 영양소 (예: 염화나트륨 (NaCl), 황산마그네슘 (MgSO4·7H2O) 또는 염화마그네슘 (MgCl2), 염화칼슘 (CaCl2), 황산칼슘 (CaSO4) 또는 탄산칼슘 (CaCO3), 황산망간 (MnSO4·7H2O) 또는 염화망간 (MnCl2), 염화제2철 (FeCl2), 황산제1철 (FeSO4·7H2O) 또는 염화제1철 (FeCl2·4H2O), 중탄산나트륨 (NaHCO3) 또는 탄산나트륨 (Na2CO3), 황산아연 (ZnSO4) 또는 염화아연 (ZnCl2), 몰리브덴산암모늄 (NH4MoO4) 또는 몰리브덴산나트륨 (Na2MoO4·2H2O), 황산제1구리 (CuSO4) 또는 염화구리 (CuCl2·2H2O), 염화코발트 (CoCl2·6H2O) 또는 황산코발트 (CoSO4), 염화알루미늄 (AlCl3·6H2O), 염화리튬 (LiCl), 붕산 (H3BO3), 염화니켈 (NiCl2·6H2O) 또는 황산니켈 (NiSO4), 염화주석 (SnCl2·H2O), 염화바륨 (BaCl2·2H2O), 셀렌산구리 (CuSeO4·5H2O), 셀렌산나트륨 (Na2SeO4) 또는 아셀레늄산나트륨 (Na2SeO3), 메타바나데이트 나트륨 (NaVO3), 크롬 염).
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 중 하나, 그 이상 또는 전부를 추가로 포함한다: NH4OH, KH2PO4, Na2HPO4·2H2O, NaVO3·H2O, FeSO4x7H2O, MgSO4·7H2O, CaSO4, Na2MoO4·2H2O, MnSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, H3BO3, CoSO4, CuSO4, NiSO4.
일 구체예에서, 세포에 제공된 배지는 1 g/L 미만의 클로라이드 염 (chloride salts), 예컨대 0.25 g/L 미만의 클로라이드 염, 예를 들어 0.1 g/L 미만의 클로라이드 염, 예컨대 0.025 g/L 미만의 클로라이드 염, 예를 들어 0.01 g/L 미만의 클로라이드를 포함한다. 일 구체예에서, 클로라이드 염은 배양에 공급되지 않는다.
다른 구체예에서, 공정 중에 비타민이 공급되지 않으며, 즉 배양에 제공된 배지는 비타민을 함유하지 않는다.
다른 구체예에서, 공정 중에 아미노산이 공급되지 않으며, 즉 배양에 제공된 배지는 아미노산을 함유하지 않는다.
다른 구체예에서, 공정 중에 유기 화합물이 공급되지 않으며, 즉 배양에 제공된 배지는 어떠한 유기 화합물도 함유하지 않는다.
소정의 구체예에서, 박테리아 배양물의 pH는 소정의 수준에서 제어된다. 소정의 구체예에서, pH는 박테리아 유지 및/또는 성장 및/또는 유기 화합물의 생산을 위한 최적 범위 내에서 제어된다. 일 구체예에서, 배양물의 pH는 5.5 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.0, 예컨대 6.8로 유지된다.
소정의 구체예에서, 박테리아 배양물의 온도가 제어된다. 소정의 구체예에서, 온도는 박테리아 유지 및/또는 성장 및/또는 유기 화합물의 생산을 위한 최적 범위 내에서 제어된다. 일 구체예에서, 상기 배양물은 25℃ 내지 40℃, 예를 들어 28℃ 내지 32℃, 예컨대 30℃의 온도에서 성장한다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 생물반응기에서 수행된다. 생물반응기가 세포 배양에 사용되며, 이들의 성장 곡선의 특정 단계에서 유지될 수 있다. 생물반응기의 사용은 화학독립영양 성장을 배양하는데 여러 면에서 유리하다. 일반적으로, 용존 이산화탄소, 산소, 및 다른 기체 예컨대 수소뿐만 아니라 다른 용존 영양소, 미량 원소, 온도 및 pH의 제어를 포함한 성장 조건의 제어가 생물반응기에서 용이하다. 기체 뿐만 아니라 영양 배지는 생물반응기에, 회분식 부가, 또는 주기적으로, 또는 검출된 고갈 또는 프로그래밍된 설정점에 대한 반응으로, 또는 배양물이 성장 및/또는 유지되는 기간 동안 연속적으로 부가될 수 있다. 연속 배양 공정에서, 기체 뿐만 아니라 영양 배지가 생물반응기에 연속적으로 부가된다. 또한, 박테리아-함유 배지는 생물반응기로부터 연속적으로 제거된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 박테리아 배양물의 부피는 100 mL 이상, 예컨대 1 L 이상, 예를 들어 10 L 이상, 예컨대 100 L 이상, 예를 들어 1,000 L 이상, 예컨대 10,000 L 이상, 예를 들어 50,000 L 이상, 예컨대 100,000 L 이상, 예를 들어 200,000 L 이상이다.
일 구체예에서, 배양물의 생산성은 시간당 리터당 0.1 g 초과의 세포 건조 중량, 예컨대 시간당 리터당 0.2 초과, 예를 들어 0.3 초과, 예컨대 0.4 초과, 예를 들어 0.5 초과, 예컨대 0.6 초과, 예를 들어 0.7 초과, 예컨대 0.8 초과, 예를 들어 0.9 초과, 예컨대 1 g 초과이다.
박테리아는 세포 은행 (cell bank)으로부터 직접, 또는 더 작은 규모로 시드 배양 (seed culture)을 통해 접종될 수 있다. 바람직하게는, 새로운 배지의 배양물로의 공급 및 소모된 배지와 박테리아의 제거는 생물반응기의 부피가 동일하게 유지되도록 동일한 속도로 발생한다.
일 구체예에서, 적절한 세포 밀도에 도달하는 초기 단계 후에, 박테리아는 이의 지수 단계 (log phase)로 연속적으로 유지되는 정상 상태 (steady state) 또는 유사 정상 상태 (pseudo steady state)로, OD600 5 이상, 예컨대 10 이상, 예를 들어 20 이상, 예컨대 50 내지 200, 예를 들어 50 내지 100으로 성장한다.
본 발명의 방법의 일 구체예에서, 상기 박테리아 균주는 0.04 - 0.12 h-1의 성장 속도를 갖는다.
본 발명의 방법의 다른 구체예에서, 연속상의 액체 공급 속도는 성장 속도의 50-80%이다.
크산토박터크산토박테라세에 (Xanthobacteraceae)과 유래의 그람-음성 박테리아의 속이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 크산토박터 균주는 이산화탄소를 생물체에 필수적인 유기 화합물, 예를 들어 글루코스로 전환하기 위해 Calvin Benson Bassham 경로를 사용하는 균주이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 크산토박터 균주는 수소 (H2)를 세포 에너지 등가물로 전환하기 위해 NiFeSe-하이드로게나제를 사용하는 균주이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 크산토박터 균주는 수소 (H2)를 세포 에너지 등가물로 전환하기 위해 NAD+-환원 하이드로게나제를 사용하는 균주이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 크산토박터 균주는 질소 고정이 가능하다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 박테리아 균주는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다: X. 아길리스 (X. agilis), X. 아미녹시단스 (X. aminoxidans), X. 오토트로피쿠스 (X. autotrophicus), X. 플라부스 (X. flavus), X. 타게티디스 (X. tagetidis), X. 비스코서스 (X. viscosus), 크산토박터 종 126 (Xanthobacter sp. 126), 크산토박터 종 91 (Xanthobacter sp. 91) 및 균주 VTT-E-193585.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 VTT-E-193585 또는 X. 타게티디스 (X. tagetidis)이다. 가장 바람직하게는 본 발명의 방법에 사용되는 균주는 VTT-E-193585이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 1에 제시된 16S 리보솜 RNA, 또는 서열번호: 1과 최대 20개, 예를 들어 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 5개의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어 서열번호: 1과 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드 차이를 갖는 16S 리보솜 RNA를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 3에 제시된 서열, 또는 서열번호: 3에 제시된 서열에 대해 93% 초과의 동일성, 예를 들어 95% 초과의 동일성, 예컨대 96% 초과의 동일성, 예를 들어 97% 초과의 동일성, 예컨대 98% 초과의 동일성, 예를 들어 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 (rubisco) 큰 사슬을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 5에 제시된 서열, 또는 서열번호: 5에 제시된 서열에 대해 83% 초과의 서열 동일성, 예를 들어 86% 초과의 동일성, 예컨대 90% 초과의 동일성, 예를 들어 95% 초과의 동일성, 예컨대 96% 초과의 동일성, 예를 들어 97% 초과의 동일성, 예컨대 98% 초과의 동일성, 예를 들어 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 (rubisco) 작은 사슬을 코딩하는 유전자를 포함한다.
서열번호: 2:
리불로스 비스포스페이트 카복실라제 큰 사슬의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00002
서열번호: 3:
리불로스 비스포스페이트 카복실라제 큰 사슬의 아미노산 서열
Figure pct00003
서열번호: 4:
리불로스 비스포스페이트 카복실라제 작은 사슬의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00004
서열번호: 5:
리불로스 비스포스페이트 카복실라제 작은 사슬의 아미노산 서열:
Figure pct00005
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 7에 제시된 서열, 또는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 알파를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 9에 제시된 서열, 또는 서열번호: 9에 제시된 서열에 대해 77% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 베타를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 11에 제시된 서열, 또는 서열번호: 11에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 감마를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 13에 제시된 서열, 또는 서열번호: 13에 제시된 서열에 대해 79% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 델타를 코딩하는 유전자를 포함한다.
서열번호: 6:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 알파의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00006
서열번호: 7:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 알파의 아미노산 서열:
Figure pct00007
서열번호: 8:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 베타의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00008
서열번호: 9:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 베타의 아미노산 서열:
Figure pct00009
서열번호: 10:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 감마의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00010
서열번호: 11:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 감마의 아미노산 서열:
Figure pct00011
서열번호: 12:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 델타의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00012
서열번호: 13:
NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 델타의 아미노산 서열:
Figure pct00013
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 15에 제시된 서열, 또는 서열번호: 15에 제시된 서열에 대해 84% 초과의 서열 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NiFeSe 하이드로게나제 큰 서브유닛을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 17에 제시된 서열, 또는 서열번호: 17에 제시된 서열에 대해 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NiFeSe 하이드로게나제 작은 서브유닛을 코딩하는 유전자를 포함한다.
서열번호: 14:
주변세포질 [NiFeSe] 하이드로게나제 큰 서브유닛의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00014
서열번호: 15:
주변세포질 [NiFeSe] 하이드로게나제 큰 서브유닛의 아미노산 서열:
Figure pct00015
서열번호: 16:
주변세포질 [NiFeSe] 하이드로게나제 작은 서브유닛의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00016
서열번호: 17:
주변세포질 [NiFeSe] 하이드로게나제 작은 서브유닛의 아미노산 서열:
Figure pct00017
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 19에 제시된 서열, 또는 서열번호: 19에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 감마 사슬 atpG_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 21에 제시된 서열, 또는 서열번호: 21에 제시된 서열에 대해 78% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 23에 제시된 서열, 또는 서열번호: 23에 제시된 서열에 대해 62% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b atpF_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 25에 제시된 서열, 또는 서열번호: 25에 제시된 서열에 대해 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 c, 나트륨 이온 특이적 atpE_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 27에 제시된 서열, 또는 서열번호: 27에 제시된 서열에 대해 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 a atpB_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 29에 제시된 서열, 또는 서열번호: 29에 제시된 서열에 대해 71% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 엡실론 사슬 atpC_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 31에 제시된 서열, 또는 서열번호: 31에 제시된 서열에 대해 84% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 33에 제시된 서열, 또는 서열번호: 33에 제시된 서열에 대해 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 35에 제시된 서열, 또는 서열번호: 35에 제시된 서열에 대해 86% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 감마 사슬 atpG_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 37에 제시된 서열, 또는 서열번호: 37에 제시된 서열에 대해 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 39에 제시된 서열, 또는 서열번호: 39에 제시된 서열에 대해 85% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 델타 atpH를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 41에 제시된 서열, 또는 서열번호: 41에 제시된 서열에 대해 87% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b atpF_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 43에 제시된 서열, 또는 서열번호: 43에 제시된 서열에 대해 81% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b' atpG_3을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 45에 제시된 서열, 또는 서열번호: 45에 제시된 서열에 대해 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 c atpE_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 47에 제시된 서열, 또는 서열번호: 47에 제시된 서열에 대해 92% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 a atpB_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 49에 제시된 서열, 또는 서열번호: 49에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 단백질 I atpI를 코딩하는 유전자를 포함한다.
서열번호: 18:
ATP 신타제 감마 사슬 atpG_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00018
서열번호: 19:
ATP 신타제 감마 사슬 atpG_1의 아미노산 서열
Figure pct00019
서열번호: 20:
ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00020
서열번호: 21:
ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_1의 아미노산 서열
Figure pct00021
서열번호: 22:
ATP 신타제 서브유닛 b atpF_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00022
서열번호: 23:
ATP 신타제 서브유닛 b atpF_1의 아미노산 서열
Figure pct00023
서열번호: 24:
ATP 신타제 서브유닛 c, 나트륨 이온 특이적 atpE_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00024
서열번호: 25:
ATP 신타제 서브유닛 c, 나트륨 이온 특이적 atpE_1의 아미노산 서열
Figure pct00025
서열번호: 26:
ATP 신타제 서브유닛 a atpB_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00026
서열번호: 27:
ATP 신타제 서브유닛 a atpB_1의 아미노산 서열
Figure pct00027
서열번호: 28:
ATP 신타제 엡실론 사슬 atpC_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00028
서열번호: 29:
ATP 신타제 엡실론 사슬 atpC_1의 아미노산 서열
Figure pct00029
서열번호: 30:
ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00030
서열번호: 31:
ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_1의 아미노산 서열
Figure pct00031
서열번호: 32:
ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00032
서열번호: 33:
ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_2의 아미노산 서열
Figure pct00033
서열번호: 34:
ATP 신타제 감마 사슬 atpG_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00034
서열번호: 35:
ATP 신타제 감마 사슬 atpG_2의 아미노산 서열
Figure pct00035
서열번호: 36:
ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00036
서열번호: 37:
ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_2의 아미노산 서열
Figure pct00037
서열번호: 38:
ATP 신타제 서브유닛 델타 atpH의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00038
서열번호: 39:
ATP 신타제 서브유닛 델타 atpH의 아미노산 서열
Figure pct00039
서열번호: 40:
ATP 신타제 서브유닛 b atpF_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00040
서열번호: 41:
ATP 신타제 서브유닛 b atpF_2의 아미노산 서열
Figure pct00041
서열번호: 42:
ATP 신타제 서브유닛 b' atpG_3의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00042
서열번호: 43:
ATP 신타제 서브유닛 b' atpG_3의 아미노산 서열
Figure pct00043
서열번호: 44:
ATP 신타제 서브유닛 c atpE_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00044
서열번호: 45:
ATP 신타제 서브유닛 c atpE_2의 아미노산 서열
Figure pct00045
서열번호: 46:
ATP 신타제 서브유닛 a atpB_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00046
서열번호: 47:
ATP 신타제 서브유닛 a atpB_2의 아미노산 서열
Figure pct00047
서열번호: 48:
ATP 신타제 단백질 I atpI의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00048
서열번호: 49:
ATP 신타제 단백질 I atpI의 아미노산 서열
Figure pct00049
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 51에 제시된 서열, 또는 서열번호: 51에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 92% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 53에 제시된 서열, 또는 서열번호: 53에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 55에 제시된 서열, 또는 서열번호: 55에 제시된 서열에 대해 87% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_1을 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 57에 제시된 서열, 또는 서열번호: 57에 제시된 서열에 대해 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_2를 코딩하는 유전자를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 박테리아 균주는 서열번호: 59에 제시된 서열, 또는 서열번호: 59에 제시된 서열에 대해 98.5% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 철 단백질 nifH를 코딩하는 유전자를 포함한다.
서열번호: 50:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00050
서열번호: 51:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_1의 아미노산 서열
Figure pct00051
서열번호: 52:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00052
서열번호: 53:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_2의 아미노산 서열
Figure pct00053
서열번호: 54:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_1의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00054
서열번호: 55:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_1의 아미노산 서열
Figure pct00055
서열번호: 56:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_2의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00056
서열번호: 57:
니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_2의 아미노산 서열
Figure pct00057
서열번호: 58:
니트로게나제 철 단백질 nifH의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00058
서열번호: 59:
니트로게나제 철 단백질 nifH의 아미노산 서열
Figure pct00059
다운스트림 처리
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 배양 중에 생산된 바이오매스를 수확하는 추가 단계를 포함한다. 바이오매스는 예를 들어 침강 (중력에 기반한 침전), 여과, 원심분리 또는 응집에 의해 수확될 수 있다. 응집에는 응집제의 부가가 필요할 수 있다. 원심분리는 예를 들어 연속 흐름 원심분리기를 사용하여 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 수확된 바이오매스는 그 후에 건조된다. 건조는 예를 들어 원심분리, 드럼 건조, 증발, 동결 건조, 가열, 분무 건조, 진공 건조 및/또는 진공 여과를 포함하는 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 건조된 바이오매스는 그 후에 제품, 예를 들어 식품 또는 사료 제품 또는 사료 또는 식품 성분에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 수확된 바이오매스의 세포가 용해된다. 일부 구체예에서 용해물은 불용성 분획 및 가용성 분획으로 분리될 수 있고, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 그 후에 농축되거나 또는 건조될 수 있고, 후속하여 제품, 예를 들어 식품 또는 사료 제품에 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 바이오매스가 수확되고, 상기 바이오매스로부터 단백질이 단리되어, 단백질 분획 및 비-단백질 성분을 포함하는 분획이 수득된다. 따라서, 일 구체예에서, 상기 방법은 단백질의 생산을 위한 것이고, 균주 VTT-E-193585 또는 이의 유도체를 배양하는 단계, 이어서 바이오매스를 수확하는 단계, 및 상기 바이오매스로부터 단백질을 단리하는 추가 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 단백질의 생산을 위한 것이고, 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 크산토박터 속의 박테리아 균주를 배양하는 단계 (여기서 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함함), 이어서 바이오매스를 수확하는 단계, 및 상기 바이오매스로부터 단백질을 단리하는 추가 단계를 포함한다. 단백질 단리 방법에 따라, 수득된 분획들은 더 순수하거나 또는 덜 순수할 수 있다. 따라서, 용어 "단백질 분획"은 단백질이 풍부한 분획을 의미한다. 단백질 분획은 여전히 상당한 양의 다른 성분을 포함할 수 있고, 또한 상당한 양의 단백질은 "비-단백질 성분을 포함하는 분획"이 될 수 있다.
단백질의 단리는 임의의 적절한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 단백질은 세포를 기계적으로 파괴하고, 단백질을 세포 데브리스로부터 하나 이상의 여과 단계, 예를 들어 감소하는 공극 크기를 가진 다중 필터를 통한 연속 여과를 통해 분리함으로써 단리된다. 기계적 파괴는 임의의 적절한 방법 예를 들어 볼 밀링, 초음파 처리, 균질화, 고압 균질화, 기계적 전단 등을 사용하여 수행될 수 있다. 수득된 여과된 단백질 분획은 단백질이 풍부하지만, 여전히 다른 더 작은 성분들을 함유할 것이다. 단백질은 선택적으로 이러한 분획으로부터 임의의 적절한 방법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
다른 구체예에서, 단백질 분획은 에탄올 추출을 수행한 다음에 1회 이상의 여과 단계를 수행함으로써 단리된다. 이러한 방법은 예를 들어 대두 단백질의 제조로부터 알려져 있다 (예를 들어, Chapter 5 "Soybean Protein Concentrates" in "Technology of production of edible flours and protein products from soybeans" by Berk FAO Agricultural Services Bulletin No. 97 (1992) 참조). 수득된 단백질 분획은 단백질이 풍부하지만, 여전히 다른 성분을 함유할 것이다. 단백질은 선택적으로 이러한 분획으로부터 임의의 적절한 방법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법으로부터 수득된 단백질 분획을 가수분해하여 아미노산 및 작은 펩티드를 수득하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이오매스, 상기 단백질 분획, 또는 상기 비-단백질 성분을 포함하는 분획으로부터 식품 또는 사료 제품을 제조하는 추가 단계를 포함한다. 상기 추가 단계는 단순히 상기 바이오매스, 단백질 분획 또는 비-단백질 성분을 포함하는 분획을 식품 또는 사료 제품의 제조 중에 부가함으로써, 식품 또는 사료 제품에 혼입시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 바이오매스 또는 이의 분획의 추가 정제 또는 변형이 이의 식품 또는 사료 제품으로의 혼입 과정 중에 수행된다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 산물, 예컨대 바이오매스, 단백질 또는 비-단백질 성분에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법으로부터 수득된 산물은 40% 초과의 단백질, 예를 들어 40% 내지 99%의 단백질, 예를 들어 40% 내지 90%의 단백질, 예를 들어 40% 내지 60%의 단백질을 포함한다. 특정 구체예에서, 산물은 25% 내지 75%의 단백질, 0% 내지 20%의 지질 및 5% 내지 40%의 탄수화물을 포함한다. 추가 구체예에서, 산물은 40% 내지 60%의 단백질, 0% 내지 15%의 지질 및 10% 내지 25%의 탄수화물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법으로부터 수득된 산물은 45% 내지 55%의 단백질, 5% 내지 10%의 지질 및 10% 내지 20%의 탄수화물을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 추가 양상에서 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 식품 또는 사료 제품에 관한 것이다. 용어 "식품" 및 "사료"가 본원에서 사용되는 경우, 가공 식품과 같은 기존의 식품 및 사료 제품뿐만 아니라, 단백질 바, 분말 또는 쉐이크와 같은 식품 및 사료 보충제, 육류 대체품, 식품 성분, 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 기능식품 등과 같은 관련 제품을 포함하는 것으로 의도된다. 소정의 구체예에서, 상기 바이오매스, 상기 단백질 분획 또는 상기 비-단백질 성분을 포함하는 분획은 베지테리언 (vegetarian) 또는 비건 (vegan) 식품의 생산에 이용된다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예를 사용하여 추가로 예시된다:
실시예
실시예 1. 화학독립영양 성장이 가능한 박테리아 균주의 단리
핀란드 Naantali의 발트해 해변에서 토양과 해수를 함유하는 50 mL의 샘플을 멸균 falcon 튜브에 수집하였다. 토양 샘플의 일부를 멸균 삼각 플라스크내에서 10 mL의 미네랄 배지와 혼합하였다. 상기 배지는 수돗물 중에서 제조된 1 g/L NH4OH, 0.23 g/L KH2PO4, 0.29 g/L Na2HPO4·2 H2O, 0.005 g/L NaVO3·H2O, 0.2 g/L FeSO4·7 H2O, 0.5 g/L MgSO4·7 H2O, 0.01 g/L CaSO4, 0.00015 g/L Na2MoO4·2 H2O, 0.005 g/L MnSO4, 0.0005 g/L ZnSO4·7 H2O, 0.0015 g/L H3BO3, 0.001 g/L CoSO4, 0.00005 g/L CuSO4 및 0.0001 g/L NiSO4로 구성되었다. 토양 및 배지의 현탁액을, 150 mL/min의 N2, 18 mL/min의 H2, 3 mL/min의 O2 및 6 mL/min의 CO2의 기체 혼합물로 연속적으로 플러싱된 밀봉된 강철 박스내에서 +30℃ 온도의 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 7일 간격으로 1 mL의 현탁액을 채취하여 상기 배양을 재충전하고, 이를 멸균 조건에서 삼각 플라스크내의 배지 9 mL에 부가한 다음에, 다시 인큐베이션 박스에 배치하였다. 네 번째 희석 후에, 현탁액 중에 눈에 띄는 토양이 남아 있지 않았다. 생물반응기 배양을 위해 바이오매스를 증가시키기 위해 세포 현탁액의 부피를 100 mL로 증가시켰다. 상기 현탁액이 15-용기 200-mL 병렬 생물반응기 시스템 (Medicel Explorer, Medicel Oy, Finland)에서 190 mL의 미네랄 배지에 접종되었을 때 상기 현탁액의 광학 밀도 (OD600)는 1.53이었다. 배양 조건은 800 rpm 교반, +30℃ 온도 및 pH는 1M NaOH로 제어하여 6.8로 설정하였다. 14 mL/min H2, 3 mL/min O2 및 6 mL/min CO2로 구성된 기체 혼합물을 갖는 스퍼저 (sparger)를 통해 기체를 공급하였다. 반응기의 헤드 공간을 300 mL/min 공기로 플러싱하였다. 연속 배양에 미네랄 배지를 6 mL/h로 공급하였고, 세포 현탁액을 반응기로부터 모세관을 통해 빼내어 부피를 200 mL로 일정하게 유지하였다. 반응기로부터 채취한 세포 현탁액을 +4℃에서 저장하였다. 생물반응기로부터 샘플을 매일 자동으로 채취하고, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 성장을 모니터링하였다. 생물반응기에서 498시간 배양 후에, 샘플을 무균 상태로 채취하고, 현탁액을 희석하여, 상기 미네랄 및 2% 박테리아용 아가 (bacteriological agar)를 함유하는 아가 미네랄 배지 플레이트에 플레이팅하였다. 삼각 플라스크의 경우에 대해 상기 기재된 바와 동일한 조건에서 플레이트를 인큐베이션하였다. 그 다음에 아가 플레이트로부터 콜로니를 선택하고, 하나의 콜로니에서 하나의 유기체를 단리하기 위해 새로운 아가 플레이트에 스트리킹하였다. 이를 2회 반복하였다. 단일 콜로니를 선택하고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 있는 200 μL의 배지에 현탁시켰다. 현탁액을 +30℃ 온도, 및 150 mL/min의 N2, 18 mL/min의 H2, 3 mL/min의 O2 및 6 mL/min의 CO2로 연속적으로 플러싱된 EnzyScreen 기밀 박스에서 625 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 하나의 웰의 현탁액을 삼각 플라스크로 옮기고, 새로운 배지로 보충하였다. 생물반응기 배양을 수행하기에 충분한 바이오매스가 생산될 때까지 부피를 증가시켰다. 유기체는 VTT-E-193585로 VTT culture collection에 기탁하였다.
샘플의 16S rRNA 시퀀싱으로 상기 샘플은 단 하나의 유기체를 함유하였음을 보여주었다. 1x150 bp 메타게놈 샷건 서열 (metagenomic shotgun sequences)을 제공하는 Illumina NextSeq 시퀀싱에 동일한 샘플을 사용하였다. Unicycler (Wick et al, 2017 PLoS computational biology 13:e1005595)를 사용하여, 101개의 contig로 구성된 메타게놈 서열에 대한 데 노보 (de novo) 조립체를 만들었다. 전체 게놈 길이는 4,846,739 bp이었고, GC 함량은 67.9%이었다. 유전자 예측 및 기능 주석은 Prokka를 사용하여 수행하였다 (Seemann, 2014 Bioinformatics 30:2068). 게놈 주석은 4,429개의 유전자를 생성하였다. Roary pan 게놈 정렬 (Page et al, 2015 Bioinformatics 31:3691)은 크산토박터 종 중에서 VTT-E-193585를 그룹화하였다. 그러므로 상기 균주는 크산토박터 종으로 동정되었고, 가장 가까운 게놈은 크산토박터 타게티디스 (Xanthobacter tagetidis)이다. 이종상동성 단편 (orthologous fragments)만을 고려한 평균 뉴클레오티드 동일성의 정렬-기반 계산 (OrthoANI) (Lee et al, 2016 Int J Syst Evol Microbiol 66:1100)으로 크산토박터 타게티디스 (ATCC 700314; GCF_003667445.1)에 대해 80.4%로 최고 일치를 제공하였고, 제시된 종 경계 컷-오프 (species boundary cut-off)는 95-96%이다 (예를 들어, Chun et al., 2018 Int J Syst Evol Microbiol, 68: 461-466 참조). 크산토박터 오토트로피쿠스 Py2는 79.6%의 일치율을 제공한 반면에, 크산토박터 종 91에 대한 일치율은 79.0%이었다. 따라서 VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주는 프로테오박테리아 (Proteobacteria) 문; 알파 프로테오박테리아 (Alpha Proteobacteria) 강; 리조비알레스 (Rhizobiales) 속에 속한다고 결론내릴 수 있었다. 가장 가능성이 높은 과 (Family)는 크산토박테라세에 (Xanthobacteraceae), 속은 크산토박터 (Xanthobacter)이다. VTT-E-193585 박테리아 균주는 임의의 알려진 종에 명확하게 배정할 수 없었다.
추정되는 항미생물제 내성 유전자에 대한 검색을 수행하였다. ABRicate (https://github.com/tseemann/abricate) 툴은 blastn 또는 blastp를 사용하여 Arg-Annot, NCBI, ResFinder, the ecOH, Megares 및 VFDB 데이터베이스에 대해 게놈을 검색하는데 사용하였다. 뉴클레오티드 및 단백질 수준 모두에서 동일성 및 적용 범위 모두에 대해 50%의 역치 (threshold)를 설정하였다. 추정되는 항미생물제 내성 유전자 2개만이 확인되었다. 이러한 2개의 유전자는 항생제 내성과 관련된 아미노산 변화를 함유하지 않았으므로, 내성 표현형은 예상되지 않는다.
실시예 2. 단리된 박테리아 균주의 파일럿 배양 및 분석
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주를 기존의 200-리터 교반 탱크 생물반응기 (MPF-U, Marubishi Ltd, Japan)에서 배양하였다. 400 rpm으로 회전하는 Rushton-타입 임펠러를 사용하여 혼합을 수행하였다. 배양 온도는 +30℃로 유지하였다. 소프트웨어 제어에 의해 8M NaOH 또는 3.6M H3PO4를 부가하여 pH를 6.8±0.2로 유지하였다. 배양 배지는 수돗물 중에서 제조된 1 g/L NH4OH, 0.23 g/L KH2PO4, 0.29 g/L Na2HPO4·2 H2O, 0.005 g/L NaVO3·H2O, 0.2 g/L FeSO4·7 H2O, 0.5 g/L MgSO4·7 H2O, 0.01 g/L CaSO4, 0.00015 g/L Na2MoO4·2 H2O, 0.005 g/L MnSO4, 0.0005 g/L ZnSO4·7 H2O, 0.0015 g/L H3BO3, 0.001 g/L CoSO4, 0.00005 g/L CuSO4 및 0.0001 g/L NiSO4를 함유하였다. 1.8-10.5 L/min의 수소 기체, 0.6-2.5 L/min의 산소 기체 및 1.8-5 L/min의 이산화탄소 기체를 함유하는 혼합물을 주요 에너지 및 탄소 공급원으로 일정하게 공급하였다. 기체 혼합물 조성을 조정하여 용존 산소 수준을 7.2±0.5%로 유지하였다. 배양을 위한 접종원은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 샘플을 수동으로 채취하고, 600 nm에서 흡광도 (Ultrospec 2100 pro UV/visible spectrophotometer, Biochrom Ltd., England)를 측정하여 광학 밀도로서 세포 밀도를 분석하고, 105℃의 오븐에서 밤새 건조시켜서 세포 건조 중량 (CDW)을 측정하여 성장을 모니터링하였다. 광학 밀도는 또한 인 시추 (in situ) 흡광도 프로브 (Trucell 2, Finesse Ltd, USA)를 사용하여 모니터링하였다. 배양의 성장 곡선을 도 1에 제시하였다. 회분식 단계에서 최대 성장 속도는 0.06 h-1이었다. 최대 세포 밀도는 92시간에 4.5 g_CDW/L이었다. 92시간의 배양 후에, 상기 기재된 신선한 배양 배지의 공급을 0.01 h-1의 희석율로 개시하였다. 공급을 계속하는 동안, 세포 밀도는 평균 2.9 g_CDW/L이었다. 배양액을 냉각된 (+10℃) 탱크에 일정하게 수집하였고, 이 탱크로부터 연속 원심분리기 (BTPX-205, Alfa-Laval AB, Sweden)에 300-리터 배치로 공급하였다. 상기 분리기로부터 수집된 세포-함유 슬러리를 대기압 이중 드럼 건조기 (Buflovak 6x8 ADDD, Hebeler process solutions Llc., USA)로 공급하였고, 이를 4 bar의 스팀으로 가열하였고, 드럼은 3.5 rpm으로 회전하였다. 그 결과 건조 물질 함량이 약 96%인 건조 세포 분말을 수득하였다. 건조 세포 분말의 분석 결과를, 표 1에 근사 조성 (proximate composition), 표 2에 아미노산 조성, 표 3에 지방산 조성, 표 4에 비타민 함량을 제시하였다. 분석에 따르면 건조 세포 분말은 모든 필수 아미노산과 함께 높은 단백질 함량을 갖는 것으로 나타났다. 이는 또한 포화 지방산보다 불포화 지방산을 더 많이 함유하였고, 비타민 B군을 많이 함유하였다. 펩티도글리칸 함량은 단지 0.002 mg/g_CDW이었고, 리포폴리사카라이드 함량은 0.01 mg/g_CDW이었다. 이들 농도는 가능한한 적은 것이 유리할 것이다. 비교로서, 동시에 상업용 락트산 박테리아 제제를 분석하여, 펩티도글리칸 함량은 0.244 mg/g_DW이었고, 리포폴리사카라이드 함량은 0.015 mg/g_DW이었다. 세포독성 및 유전독성 분석은 배양 상등액 샘플을 사용하여 수행하였다. HepG2 또는 HeLa229 인간 세포주에 대한 세포독성은 관찰되지 않았다. 대장균 (Escherichia coli) WP2 trp- 또는 CM871 uvrA recA lexA 균주에 대한 유전독성은 관찰되지 않았다.
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 건조 세포 분말의 분석 결과.
파라미터 방법 단위
수분 103 ℃에서 건조 g/100g 3.3
단백질 Kjeldahl (N x 6,25) g/100g 72.2
지방 Weibull-Stoldt g/100g 6.0
포화 지방산 표 3에 기반하여 산출 g/100g 1.8
일-불포화 지방산 표 3에 기반하여 산출 g/100g 3.8
다중불포화 지방산 표 3에 기반하여 산출 g/100g 0.4
오메가 3 지방산 표 3에 기반하여 산출 g/100g < 0.01
오메가 6 지방산 표 3에 기반하여 산출 g/100g 0.4
식이섬유 중량 측정 g/100g 10.5
회분 550 ℃에서 회분화 g/100g 5.8
글루코스 HPLC-ELSD g/100g < 0.15
프럭토스 HPLC-ELSD g/100g < 0.1
수크로스 HPLC-ELSD g/100g < 0.1
락토스 HPLC-ELSD g/100g < 0.25
말토스 HPLC-ELSD g/100g < 0.2
전체 당 산출 g/100g < 0.8
탄수화물 산출 g/100g 2.2
에너지 산출 kJ/100g 1572
에너지 산출 kcal/100g 373
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 건조 세포 분말 중 아미노산 조성.
파라미터 방법 단위
리신 이온 크로마토그래피 % 3.95
메티오닌 이온 크로마토그래피 % 1.60
시스테인 이온 크로마토그래피 % 0.39
아스파르트산 이온 크로마토그래피 % 6.82
트레오닌 이온 크로마토그래피 % 3.47
세린 이온 크로마토그래피 % 2.75
글루탐산 이온 크로마토그래피 % 8.84
프롤린 이온 크로마토그래피 % 3.14
글리신 이온 크로마토그래피 % 4.40
알라닌 이온 크로마토그래피 % 6.94
발린 이온 크로마토그래피 % 4.96
이소류신 이온 크로마토그래피 % 3.34
류신 이온 크로마토그래피 % 6.08
티로신 이온 크로마토그래피 % 2.99
페닐알라닌 이온 크로마토그래피 % 4.58
히스티딘 이온 크로마토그래피 % 1.66
아르기닌 이온 크로마토그래피 % 4.96
트립토판 HPLC % 1.34
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 건조 세포 분말 중 지방산 조성.
파라미터 방법 단위
C16:0 (팔미트산) GC-MS % 24.8
C16:1 (팔미톨레산) GC-MS % 3.0
C18:0 (스테아르산) GC-MS % 4.4
C18:1n9 (올레산) GC-MS % 59.9
C18:2n6 (리놀레산) GC-MS % 6.1
C18:3n3 (알파-리놀렌산) GC-MS % 0.4
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주의 건조 세포 분말 중 비타민 함량.
파라미터 방법 단위
비타민 A (RE) HPLC IU/100 g <100
비타민 E (TE) HPLC mg/100 g 0.33
비타민 D3 HPLC IU/100 g <10
비타민 D2 HPLC IU/100 g 21.6
비타민 C HPLC mg/100 g <1
티아민 클로라이드 염산염 LC-MS/MS mg/100 g 0.9
비타민 B1 (티아민) 산출 mg/100 g 0.708
비타민 B2 (리보플라빈) HPLC mg/100 g 6.27
피리독신 염산염 HPLC mg/100 g 3.39
비타민 B6 (피리독신) 산출 mg/100 g 2.79
비타민 B12 LC-MS/MS μg/100 g 224
콜린 클로라이드 LC-MS/MS mg/100 g 14.3
바이오틴 LC-MS/MS μg/100 g 15.6
엽산 Microbiological μg/100 g 1270
니아신 (비타민 B3) Microbiological mg/100 g 23.2
판토텐산 Microbiological mg/100 g 6.53
실시예 3. 다양한 질소 공급원에서 단리된 박테리아 균주의 배양.
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주를 15-용기 병렬 생물반응기 시스템에서 200 mL 부피 (Medicel Explorer, Medicel Oy, Finland)로 배양하였다. 800 rpm으로 회전하는 Rushton-타입 임펠러를 사용하여 혼합을 수행하였다. 배양 온도는 +30℃로 유지하였다. 1M NaOH를 부가하여 pH를 6.8로 유지하였다. 배양 배지는 수돗물 중에서 제조된 0.23 g/L KH2PO4, 0.29 g/L Na2HPO4·2 H2O, 0.005 g/L NaVO3·H2O, 0.2 g/L FeSO4·7 H2O, 0.5 g/L MgSO4·7 H2O, 0.01 g/L CaSO4, 0.00015 g/L Na2MoO4·2 H2O, 0.005 g/L MnSO4, 0.0005 g/L ZnSO4·7 H2O, 0.0015 g/L H3BO3, 0.001 g/L CoSO4, 0.00005 g/L CuSO4 및 0.0001 g/L NiSO4를 함유하였다. 또한, 4개의 배양은 18.7 mM NH4OH를 함유하고, 4개의 배양은 9.34 mM 우레아 (OC(NH2)2)를 함유하며, 4개의 배양은 18.7 mM의 질산칼륨 (KNO3)을 함유하고, 3개의 배양은 배지 중에 질소 공급원 없이 유지되도록, 배양에서 질소 공급원을 가변하였다. 22 mL/min의 수소 기체, 3.2 mL/min의 공기 및 6.4 mL/min의 이산화탄소를 함유하는 혼합물을 주요 에너지 및 탄소 공급원으로 일정하게 공급하였다. 따라서, 공기와 함께, 모든 배양에는 또한 질소 기체를 공급하였다. 샘플을 자동으로 채취하고, 600 nm에서 흡광도 (Ultrospec 2100 pro UV/visible spectrophotometer, Biochrom Ltd., England)를 측정하여, 광학 밀도로서 세포 밀도를 분석하여 성장을 모니터링하였다. 배양의 성장 곡선을 도 2에 제시하였다. 암모니아 및 우레아에서의 성장은 유사하였다. 니트레이트 또는 질소 기체에서의 성장은 암모니아 또는 우레아에서보다 명확하게 더 느렸다. 배양 종료 무렵, 니트레이트에서의 성장은 유일한 질소 공급원으로서 질소 기체에서의 성장보다 더 우수하였다. 그럼에도 불구하고 질소 기체가 유일한 질소 공급원인 배양에서도 성장하였고, 이는 VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주가 질소 고정이 가능함을 보여주었다.
실시예 4. 항생제 감수성의 특성규명
VTT-E-193585로 기탁된 단리된 박테리아 균주에 대한 겐타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 암피실린, 시프로플록사신, 콜리스틴 및 포스포마이신의 항생제 감수성은, 양이온-조정된 Mueller Hinton Broth -배지 (LabM, LAB114, 양이온 Mg2+ 및 Ca2+ 각각 부가)를 사용하여 +35 ± 2℃의 호기성 조건에서 48 ± 1시간 동안, 포스포마이신의 경우 아가 희석 방법 (agar dilution method)을 사용하고, 겐타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 테트라사이클린의 경우 브로스 미세희석 방법 (broth microdilution method)을 사용하는, VetMIC Lact-1 플레이트 (SVA National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden)에서, 암피실린, 시프로플록사신 및 콜리스틴의 경우 핸드-메이트 미세희석 플레이트 (hand-made microdilution plate)에서, CLSI M07-A111 표준 (Clinical and laboratory standards institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 11th ed. CLSI standard M07, 2018)에 따라 분석하였다. 대장균 ATCC 25922는 품질 대조 균주로서 사용하였고, 이는 호기성 조건에서 +35 ± 2℃에서 18 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다. 균주들의 항생제 감수성 결과를 표 5에 제시하였다. 단리 박테리아 균주는 일반적으로 항생제에 민감한 것으로 밝혀졌다. 겐타마이신, 카나마이신, 스트렙토마이신 및 테트라사이클린의 경우, VTT-E-193585에 대한 최소 억제 농도 (MIC) 값은 대장균 ATCC 25922에 비해 낮거나 또는 비슷하였지만, 암피실린, 시프로플록사신, 콜리스틴 및 포스포마이신의 경우, MIC 값은 VTT-E-193585에서 더 높았다.
VTT-E-193585 균주 및 대장균 ATCC 25922에 대한 항생제의 최소 억제 농도 (MIC, μg/ml) - 값
VTT-E-193585
48 h ± 1 h
대장균 ATCC 25922
18 h ± 2 h
겐타마이신 0.5 0.5
카나마이신 2 4
스트렙토마이신 0.5 4
테트라사이클린 0.25 1
암피실린 16 8
시프로플록사신 0.06 0.008
콜리스틴 4 2
포스포마이신 32 0.5
VTT Culture Collection VTT-E-193585 20190611
SEQUENCE LISTING <110> Solar Foods <120> STRAINS AND PROCESSES FOR SINGLE CELL PROTEIN OR BIOMASS PRODUCTION <130> Solar002 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1482 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Novel strain <400> 1 cttgagagtt tgatcctggc tcagagcgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc 60 gagcgcccag caatgggagc ggcagacggg tgagtaacgc gtggggatgt gcccaatggt 120 acggaataac ccagggaaac ttggactaat accgtatgag cccttcgggg gaaagattta 180 tcgccattgg atcaacccgc gtctgattag ctagttggtg gggtaacggc ccaccaaggc 240 gacgatcagt agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag 300 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcca 360 tgccgcgtgt gtgatgaagg ccttagggtt gtaaagcact ttcgccggtg aagataatga 420 cggtaaccgg agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg 480 ggctagcgtt gctcggaatc actgggcgta aagcgcacgt aggcggatcg ttaagtcagg 540 ggtgaaatcc tggagctcaa ctccagaact gcccttgata ctggcgacct tgagttcgag 600 agaggttggt ggaactgcga gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgca agaacaccag 660 tggcgaaggc ggccaactgg ctcgatactg acgctgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgg atgctagccg ttgggcagct 780 tgctgttcag tggcgcagct aacgcattaa gcatcccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 840 ttaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900 aagcaacgcg cagaacctta ccagcctttg acatggcagg acgatttcca gagatggatc 960 tcttccagca atggacctgc acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcctc tagttgccag cattcagttg 1080 ggcactctag agggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1140 tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag tgggatgcga 1200 aagggcgacc tctagcaaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgtac tctgcaactc 1260 gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gtggatcagc atgccacggt gaatacgttc 1320 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gctttacccg aaggcgctgc 1380 gctaacccgc aagggaggca ggcgaccacg gtagggtcag cgactggggt gaagtcgtaa 1440 caaggtagcc gtaggggaac ctgcggctgg atcacctcct tt 1482 <210> 2 <211> 1467 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 2 atgggtgccg aagcaaccgt cgggcagatc acggacgcca agaagagata cgccgccggc 60 gtgctgaagt acgcccagat gggctactgg aacggcgact acgttcccaa ggacaccgac 120 ctcctggcgg tgttccgcat caccccccag gcgggcgtgg acccggtgga agccgccgcg 180 gcggtcgccg gcgaaagctc caccgctacc tggaccgtgg tgtggaccga ccggctcacc 240 gccgccgacg tctaccgcgc caaggcctac aaggtggagc cggtgccggg ccaggaaggc 300 cagtatttct gctacatcgc ctatgatctc gatttgttcg aggaaggctc catcgccaac 360 ctcacggcgt cgatcatcgg caacgtcttc tccttcaagc cgctgaaggc ggcgcggctg 420 gaggacatgc ggcttcccgt cgcctatgtg aagaccttcc gcggcccgcc caccggcatc 480 gtggtcgagc gcgagcgcct ggacaagttc ggccgccccc ttctgggcgc caccaccaag 540 ccgaagcttg gcctctcggg caagaattac ggccgcgtgg tctatgaggc cctcaagggc 600 ggcctcgact tcgtgaagga cgacgagaac atcaactcgc agcccttcat gcactggcgc 660 gatcgcttcc tctattgcat ggaggccgtc aacaaggccc aggccgagac cggcgaggtg 720 aaggggcact atctcaacat caccgccggg accatggagg agatgtaccg ccgcgccgag 780 ttcgccaagg aactgggctc cgtggtggtg 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His Tyr Leu Asn Ile Thr Ala Gly Thr Met Glu Glu Met Tyr 245 250 255 Arg Arg Ala Glu Phe Ala Lys Glu Leu Gly Ser Val Val Val Met Val 260 265 270 Asp Leu Ile Ile Gly Trp Thr Ala Ile Gln Ser Met Ser Asn Trp Cys 275 280 285 Arg Glu Asn Asp Met Ile Leu His Met His Arg Ala Gly His Gly Thr 290 295 300 Tyr Thr Arg Gln Lys Ser His Gly Val Ser Phe Arg Val Ile Ala Lys 305 310 315 320 Trp Leu Arg Leu Ala Gly Val Asp His Leu His Thr Gly Thr Ala Val 325 330 335 Gly Lys Leu Glu Gly Asp Pro Met Thr Val Gln Gly Phe Tyr Asn Val 340 345 350 Cys Arg Glu Thr Thr Thr Gln Gln Asp Leu Thr Arg Gly Leu Phe Phe 355 360 365 Glu Gln Asp Trp Gly Gly Ile Arg Lys Val Met Pro Val Ala Ser Gly 370 375 380 Gly Ile His Ala Gly Gln Met His Gln Leu Ile Asp Leu Phe Gly Glu 385 390 395 400 Asp Val Val Leu Gln Phe Gly Gly Gly Thr Ile Gly His Pro Asp Gly 405 410 415 Ile Gln Ala Gly Ala Thr Ala Asn Arg Val Ala Leu Glu Thr Met Ile 420 425 430 Leu Ala Arg Asn Glu Gly Arg Asp Ile Arg Asn Glu Gly Pro Glu Ile 435 440 445 Leu Val Glu 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caagacccgc gtcaacgtcc tgcccggctg ccacctcacg 540 cccggcgatc tggatgagat gcggaccatc ttcgaggatt tcgggctcac accctatttc 600 ctgccggatc tggccggctc gctggatggg catatccccg aggacttctc gcccaccacc 660 atcggcggca tcggcatcga tgagatcgcc accatgggcg aggcggccca caccatctgc 720 atcggcgcgc agatgcgccg ggcgggcgag gccatggaga agaagaccgg cattcccttc 780 aagctgttcg agcgcctgtg cggcctggag gcgaacgacg ccttcatcat gcacctgtcg 840 cagatctccg gccggccggt gccggtgaag tatcgccggc agcggggcca gctggtggat 900 gccatgctgg acggccactt ccatctgggc ggtcgcaagg tggccatggg ggcggagccg 960 gacctgctct acgacgtggg ctccttcctg cacgagatgg gcgcccacat cctttccgcg 1020 gtcaccacca cccagtcgcc ggtgctggcg cgcctgcctg ccgaggaggt gcttatcggc 1080 gacctggagg atctggagac ccaggcgaag gcgcgcggat gcgatctcct gctcacccat 1140 tcccatgggc gccaggcggc ggagcgcctc cacatcccct tctaccggat cggcattccc 1200 atgtttgacc ggctgggggc ggggcatctg ttgtcggtgg gctatcgcgg cacccgcgac 1260 ctcatcttcc atctcgccaa ccttgtgatc gccgaccacg aggaaaatca cgagccgacg 1320 cccgacacct gggccaccgg ccatggcgag catgccgccg cccccacttc ccattga 1377 <210> 55 <211> 458 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 55 Met Ala Thr Val Ser Val Ser Lys Lys Ala Cys Ala Val Asn Pro Leu 1 5 10 15 Lys Met Ser Gln Pro Val Gly Gly Ala Leu Ala Phe Met Gly Val Arg 20 25 30 Lys Ala Met Pro Leu Leu His Gly Ser Gln Gly Cys Thr Ser Phe Gly 35 40 45 Leu Val Leu Phe Val Arg His Phe Lys Glu Ala Ile Pro Met Gln Thr 50 55 60 Thr Ala Met Ser Glu Val Ala Thr Val Leu Gly Gly Leu Glu Asn Val 65 70 75 80 Glu Gln Ala Ile Leu Asn Ile Tyr Asn Arg Thr Lys Pro Glu Ile Ile 85 90 95 Gly Ile Cys Ser Thr Gly Val Thr Glu Thr Lys Gly Asp Asp Val Asp 100 105 110 Gly Tyr Ile Lys Leu Ile Arg Asp Lys Tyr Pro Gln Leu Ala Asp Phe 115 120 125 Pro Leu Val Tyr Val Ser Thr Pro Asp Phe Lys Asp Ala Phe Gln Asp 130 135 140 Gly Trp Glu Lys Thr Val Ala Lys Met Val Glu Ala Leu Val Lys Pro 145 150 155 160 Ala Ala Asp Lys Gln Lys Asp Lys Thr Arg Val Asn Val Leu Pro Gly 165 170 175 Cys His Leu Thr Pro Gly Asp Leu Asp Glu Met Arg Thr Ile Phe Glu 180 185 190 Asp Phe Gly Leu Thr Pro Tyr Phe Leu Pro Asp Leu Ala Gly Ser Leu 195 200 205 Asp Gly His Ile Pro Glu Asp Phe Ser Pro Thr Thr Ile Gly Gly Ile 210 215 220 Gly Ile Asp Glu Ile Ala Thr Met Gly Glu Ala Ala His Thr Ile Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Gln Met Arg Arg Ala Gly Glu Ala Met Glu Lys Lys Thr 245 250 255 Gly Ile Pro Phe Lys Leu Phe Glu Arg Leu Cys Gly Leu Glu Ala Asn 260 265 270 Asp Ala Phe Ile Met His Leu Ser Gln Ile Ser Gly Arg Pro Val Pro 275 280 285 Val Lys Tyr Arg Arg Gln Arg Gly Gln Leu Val Asp Ala Met Leu Asp 290 295 300 Gly His Phe His Leu Gly Gly Arg Lys Val Ala Met Gly Ala Glu Pro 305 310 315 320 Asp Leu Leu Tyr Asp Val Gly Ser Phe Leu His Glu Met Gly Ala His 325 330 335 Ile Leu Ser Ala Val Thr Thr Thr Gln Ser Pro Val Leu Ala Arg Leu 340 345 350 Pro Ala Glu Glu Val Leu Ile Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Thr Gln 355 360 365 Ala Lys Ala Arg Gly Cys Asp Leu Leu Leu Thr His Ser His Gly Arg 370 375 380 Gln Ala Ala Glu Arg Leu His Ile Pro Phe Tyr Arg Ile Gly Ile Pro 385 390 395 400 Met Phe Asp Arg Leu Gly Ala Gly His Leu Leu Ser Val Gly Tyr Arg 405 410 415 Gly Thr Arg Asp Leu Ile Phe His Leu Ala Asn Leu Val Ile Ala Asp 420 425 430 His Glu Glu Asn His Glu Pro Thr Pro Asp Thr Trp Ala Thr Gly His 435 440 445 Gly Glu His Ala Ala Ala Pro Thr Ser His 450 455 <210> 56 <211> 1560 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 56 atgccacaaa atgctgacaa tgtgctcgat cacttcgagc tcttccgtgg tcccgaatac 60 cagcagatgc tggccaataa gaaaaagatg ttcgagaacc cccgcgatcc ggccgaagtc 120 gagcgcgtgc gggaatgggc gaagactcct gaatacaagg agctgaactt cgcccgcgag 180 gcgctcaccg tgaatccggc caaggcttgt cagccgctgg gcgcggtgtt cgtcgccgtc 240 ggcttcgaga gcacgatccc cttcgtgcac ggctcgcagg gttgcgtcgc gtattaccgc 300 tcgcacctct cccgccactt caaggagccg tcctcctgcg tctcctcgtc catgaccgag 360 gatgcggcgg tgttcggcgg cctcaacaac atgattgacg gcctcgccaa cacctacaac 420 atgtacaagc cgaagatgat cgccgtctcc accacctgca tggcggaagt catcggcgac 480 gatctgaacg ccttcatcaa gaccgcgaag gaaaagggct cggttccggc cgaatacgac 540 gtgcccttcg cccacacccc ggcgttcgtc ggcagccatg tcaccggcta cgacaatgcg 600 ctcaagggca tcctcgagca cttctgggac ggcaaggccg gcaccgcgcc gaagctggag 660 cgcgttccca acgagaagat caacttcatc ggcggcttcg acggctacac cgtcggcaac 720 actcgcgaag tgaagcgcat cttcgaggcg ttcggcgccg attacaccat cctcgccgac 780 aattccgaag tgttcgacac cccgaccgac ggcgagttcc gcatgtatga cggcggcacg 840 accctggagg acgcggcgaa cgcggtgcac gccaaggcca ccatctccat gcaggaatac 900 tgcacggaga agaccctgcc catgatcgcc ggtcatggcc aggacgtggt cgccctcaac 960 caccccgtgg gcgtgggcgg caccgacaag ttcctcatgg agatcgcccg cctcaccggc 1020 aaggagatcc ccgaggagct gacccgcgag cgcggccgtc tcgtggacgc tatcgcggac 1080 tcttccgcgc acatccacgg caagaagttc gccatctacg gcgatccgga tctgtgcctg 1140 ggcctcgccg cgttcctgct ggagctgggc gccgagccga cccatgtgct ggccaccaac 1200 ggcaccaaga agtgggccga gaaggttcag gaactgttcg actcttcgcc gttcggcgcc 1260 aactgcaagg tctatcccgg caaggacctg tggcacatgc gctcgctcct gttcgtggag 1320 ccggtggatt tcatcatcgg caacacctac ggcaagtatc tcgagcgcga cacgggcacc 1380 ccgctgatcc gtatcggctt cccggtgttc gaccgtcacc accaccaccg ccgtccggtg 1440 tggggctatc agggcggcat gaacgtcctg atcacgatcc tcgacaagat ctttgacgag 1500 atcgaccgca acaccaacgt gccggccaag accgactact cgttcgacat cattcgttga 1560 <210> 57 <211> 519 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 57 Met Pro Gln Asn Ala Asp Asn Val Leu Asp His Phe Glu Leu Phe Arg 1 5 10 15 Gly Pro Glu Tyr Gln Gln Met Leu Ala Asn Lys Lys Lys Met Phe Glu 20 25 30 Asn Pro Arg Asp Pro Ala Glu Val Glu Arg Val Arg Glu Trp Ala Lys 35 40 45 Thr Pro Glu Tyr Lys Glu Leu Asn Phe Ala Arg Glu Ala Leu Thr Val 50 55 60 Asn Pro Ala Lys Ala Cys Gln Pro Leu Gly Ala Val Phe Val Ala Val 65 70 75 80 Gly Phe Glu Ser Thr Ile Pro Phe Val His Gly Ser Gln Gly Cys Val 85 90 95 Ala Tyr Tyr Arg Ser His Leu Ser Arg His Phe Lys Glu Pro Ser Ser 100 105 110 Cys Val Ser Ser Ser Met Thr Glu Asp Ala Ala Val Phe Gly Gly Leu 115 120 125 Asn Asn Met Ile Asp Gly Leu Ala Asn Thr Tyr Asn Met Tyr Lys Pro 130 135 140 Lys Met Ile Ala Val Ser Thr Thr Cys Met Ala Glu Val Ile Gly Asp 145 150 155 160 Asp Leu Asn Ala Phe Ile Lys Thr Ala Lys Glu Lys Gly Ser Val Pro 165 170 175 Ala Glu Tyr Asp Val Pro Phe Ala His Thr Pro Ala Phe Val Gly Ser 180 185 190 His Val Thr Gly Tyr Asp Asn Ala Leu Lys Gly Ile Leu Glu His Phe 195 200 205 Trp Asp Gly Lys Ala Gly Thr Ala Pro Lys Leu Glu Arg Val Pro Asn 210 215 220 Glu Lys Ile Asn Phe Ile Gly Gly Phe Asp Gly Tyr Thr Val Gly Asn 225 230 235 240 Thr Arg Glu Val Lys Arg Ile Phe Glu Ala Phe Gly Ala Asp Tyr Thr 245 250 255 Ile Leu Ala Asp Asn Ser Glu Val Phe Asp Thr Pro Thr Asp Gly Glu 260 265 270 Phe Arg Met Tyr Asp Gly Gly Thr Thr Leu Glu Asp Ala Ala Asn Ala 275 280 285 Val His Ala Lys Ala Thr Ile Ser Met Gln Glu Tyr Cys Thr Glu Lys 290 295 300 Thr Leu Pro Met Ile Ala Gly His Gly Gln Asp Val Val Ala Leu Asn 305 310 315 320 His Pro Val Gly Val Gly Gly Thr Asp Lys Phe Leu Met Glu Ile Ala 325 330 335 Arg Leu Thr Gly Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Thr Arg Glu Arg Gly 340 345 350 Arg Leu Val Asp Ala Ile Ala Asp Ser Ser Ala His Ile His Gly Lys 355 360 365 Lys Phe Ala Ile Tyr Gly Asp Pro Asp Leu Cys Leu Gly Leu Ala Ala 370 375 380 Phe Leu Leu Glu Leu Gly Ala Glu Pro Thr His Val Leu Ala Thr Asn 385 390 395 400 Gly Thr Lys Lys Trp Ala Glu Lys Val Gln Glu Leu Phe Asp Ser Ser 405 410 415 Pro Phe Gly Ala Asn Cys Lys Val Tyr Pro Gly Lys Asp Leu Trp His 420 425 430 Met Arg Ser Leu Leu Phe Val Glu Pro Val Asp Phe Ile Ile Gly Asn 435 440 445 Thr Tyr Gly Lys Tyr Leu Glu Arg Asp Thr Gly Thr Pro Leu Ile Arg 450 455 460 Ile Gly Phe Pro Val Phe Asp Arg His His His His Arg Arg Pro Val 465 470 475 480 Trp Gly Tyr Gln Gly Gly Met Asn Val Leu Ile Thr Ile Leu Asp Lys 485 490 495 Ile Phe Asp Glu Ile Asp Arg Asn Thr Asn Val Pro Ala Lys Thr Asp 500 505 510 Tyr Ser Phe Asp Ile Ile Arg 515 <210> 58 <211> 621 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 58 gtggagtccg gtggtcctga gccgggcgtg ggctgcgccg gccgcggcgt gatcacctcc 60 atcaacttcc tggaggagaa cggcgcctac gaggacatcg actatgtgtc ctacgacgtg 120 ctgggcgacg tggtgtgcgg cggcttcgcc atgcccatcc gcgagaacaa ggcgcaggaa 180 atctacatcg tgatgtccgg cgagatgatg gccatgtatg cggccaacaa catctccaag 240 ggcatcctga agtatgccaa ttccggcggc gtgcgcctgg gcgggctggt ctgcaacgag 300 cgccagaccg acaaggagct ggagctggcg gaggctctgg cgaagaagct cggcaccgag 360 ctgatctact tcgtgccgcg cgacaacatc gtgcagcatg ccgagctgcg ccgcatgaca 420 gtgatcgagt atgcgcccga ttccgcccag gcccagcact accggaacct ggccgagaag 480 gtgcacgcca acaagggcaa cggcatcatc ccgaccccga tcaccatgga cgagctggaa 540 gacatgctca tggagcacgg catcatgaag gccgtggacg agagccagat cggcaagacc 600 gccgccgagc tcgccgtctg a 621 <210> 59 <211> 206 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> novel strain <400> 59 Met Glu Ser Gly Gly Pro Glu Pro Gly Val Gly Cys Ala Gly Arg Gly 1 5 10 15 Val Ile Thr Ser Ile Asn Phe Leu Glu Glu Asn Gly Ala Tyr Glu Asp 20 25 30 Ile Asp Tyr Val Ser Tyr Asp Val Leu Gly Asp Val Val Cys Gly Gly 35 40 45 Phe Ala Met Pro Ile Arg Glu Asn Lys Ala Gln Glu Ile Tyr Ile Val 50 55 60 Met Ser Gly Glu Met Met Ala Met Tyr Ala Ala Asn Asn Ile Ser Lys 65 70 75 80 Gly Ile Leu Lys Tyr Ala Asn Ser Gly Gly Val Arg Leu Gly Gly Leu 85 90 95 Val Cys Asn Glu Arg Gln Thr Asp Lys Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala 100 105 110 Leu Ala Lys Lys Leu Gly Thr Glu Leu Ile Tyr Phe Val Pro Arg Asp 115 120 125 Asn Ile Val Gln His Ala Glu Leu Arg Arg Met Thr Val Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Pro Asp Ser Ala Gln Ala Gln His Tyr Arg Asn Leu Ala Glu Lys 145 150 155 160 Val His Ala Asn Lys Gly Asn Gly Ile Ile Pro Thr Pro Ile Thr Met 165 170 175 Asp Glu Leu Glu Asp Met Leu Met Glu His Gly Ile Met Lys Ala Val 180 185 190 Asp Glu Ser Gln Ile Gly Lys Thr Ala Ala Glu Leu Ala Val 195 200 205

Claims (20)

  1. 단리된 박테리아 균주 VTT-E-193585 또는 이의 유도체로서, 상기 유도체는 바람직하게는 에너지 공급원으로서 수소 기체 및 유일한 탄소 공급원으로서 이산화탄소를 사용하여 성장하는 능력을 보유한 것인 단리된 박테리아 균주 VTT-E-193585 또는 이의 유도체.
  2. 청구항 1에 따른 박테리아 균주를 포함하는 배양물.
  3. 바이오매스를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 1의 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하는 바이오매스를 생산하는 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함하는 것인 방법.
  5. 바이오매스를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 에너지 공급원으로서 수소 및 무기 탄소 공급원을 사용하여 연속 배양으로 크산토박터 (Xanthobacter) 속의 박테리아 균주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 무기 탄소 공급원은 이산화탄소를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 배양물 중 용존 산소는 5% 내지 10%로 유지되는 것인 방법.
  7. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 암모늄, 우레아, 니트레이트 및/또는 질소 기체가 질소 공급원으로서 사용되는 것인 방법.
  8. 청구항 4 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 미네랄을 포함하고, 상기 미네랄은 1 g/L 미만의 클로라이드 염 (chloride salts), 예컨대 0.25 g/L 미만의 클로라이드 염, 예를 들어 0.1 g/l 미만의 클로라이드 염을 포함하며, 바람직하게는 클로라이드 염을 포함하지 않는 것인 방법.
  9. 청구항 4 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 비타민을 함유하지 않는 것인 방법.
  10. 청구항 4 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 배양물의 pH는 5.5 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.0, 예컨대 6.8로 유지되는 것인 방법.
  11. 청구항 4 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물은 25℃ 내지 40℃, 예를 들어 28℃ 내지 32℃, 예컨대 30℃의 온도에서 성장되는 것인 방법.
  12. 청구항 4 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 균주는 0.04-0.12 h-1의 성장 속도를 갖는 것인 방법.
  13. 청구항 4 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 균주는 VTT-E-193585 또는 X. 타게티디스 (X. tagetidis)인 것인 방법.
  14. 청구항 4 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 균주는 서열번호: 1에 제시된 16S 리보솜 RNA, 또는 서열번호: 1과 최대 20개, 예를 들어 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 5개의 뉴클레오티드 차이, 예를 들어 서열번호: 1과 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드 차이를 갖는 16S 리보솜 RNA를 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 4 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 균주는:
    i) 서열번호: 3에 제시된 서열, 또는 서열번호: 3에 제시된 서열에 대해 93% 초과의 동일성, 예를 들어 95% 초과의 동일성, 예컨대 96% 초과의 동일성, 예를 들어 97% 초과의 동일성, 예컨대 98% 초과의 동일성, 예를 들어 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 (rubisco) 큰 사슬을 코딩하는 유전자, 및/또는
    ii) 서열번호: 5에 제시된 서열, 또는 서열번호: 5에 제시된 서열에 대해 83% 초과의 서열 동일성, 예를 들어 86% 초과의 동일성, 예컨대 90% 초과의 동일성, 예를 들어 95% 초과의 동일성, 예컨대 96% 초과의 동일성, 예를 들어 97% 초과의 동일성, 예컨대 98% 초과의 동일성, 예를 들어 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 (rubisco) 작은 사슬을 코딩하는 유전자, 및/또는
    iii) 서열번호: 7에 제시된 서열, 또는 서열번호: 7에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 알파를 코딩하는 유전자, 및/또는
    iv) 서열번호: 9에 제시된 서열, 또는 서열번호: 9에 제시된 서열에 대해 77% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 베타를 코딩하는 유전자, 및/또는
    v) 서열번호: 11에 제시된 서열, 또는 서열번호: 11에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 감마를 코딩하는 유전자, 및/또는
    vi) 서열번호: 13에 제시된 서열, 또는 서열번호: 13에 제시된 서열에 대해 79% 초과의 서열 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NAD+-환원 하이드로게나제 HoxS 서브유닛 델타를 코딩하는 유전자, 및/또는
    vii) 서열번호: 15에 제시된 서열, 또는 서열번호: 15에 제시된 서열에 대해 84% 초과의 서열 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NiFeSe 하이드로게나제 큰 서브유닛을 코딩하는 유전자, 및/또는
    viii) 서열번호: 17에 제시된 서열, 또는 서열번호: 17에 제시된 서열에 대해 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 NiFeSe 하이드로게나제 작은 서브유닛을 코딩하는 유전자, 및/또는
    ix) 서열번호: 19에 제시된 서열, 또는 서열번호: 19에 제시된 서열에 대해 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 감마 사슬 atpG_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    x) 서열번호: 21에 제시된 서열, 또는 서열번호: 21에 제시된 서열에 대해 78% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xi) 서열번호: 23에 제시된 서열, 또는 서열번호: 23에 제시된 서열에 대해 62% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b atpF_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xii) 서열번호: 25에 제시된 서열, 또는 서열번호: 25에 제시된 서열에 대해 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 c, 나트륨 이온 특이적 atpE_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xiii) 서열번호: 27에 제시된 서열, 또는 서열번호: 27에 제시된 서열에 대해 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 a atpB_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xiv) 서열번호: 29에 제시된 서열, 또는 서열번호: 29에 제시된 서열에 대해 71% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 엡실론 사슬 atpC_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xv) 서열번호: 31에 제시된 서열, 또는 서열번호: 31에 제시된 서열에 대해 84% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xvi) 서열번호: 33에 제시된 서열, 또는 서열번호: 33에 제시된 서열에 대해 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 베타 atpD_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xvii) 서열번호: 35에 제시된 서열, 또는 서열번호: 35에 제시된 서열에 대해 86% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 감마 사슬 atpG_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xviii) 서열번호: 37에 제시된 서열, 또는 서열번호: 37에 제시된 서열에 대해 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 알파 atpA_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xix) 서열번호: 39에 제시된 서열, 또는 서열번호: 39에 제시된 서열에 대해 85% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 델타 atpH를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xx) 서열번호: 41에 제시된 서열, 또는 서열번호: 41에 제시된 서열에 대해 87% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b atpF_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xxi) 서열번호: 43에 제시된 서열, 또는 서열번호: 43에 제시된 서열에 대해 81% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 b' atpG_3을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xxii) 서열번호: 45에 제시된 서열, 또는 서열번호: 45에 제시된 서열에 대해 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 c atpE_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xxiii) 서열번호: 47에 제시된 서열, 또는 서열번호: 47에 제시된 서열에 대해 92% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 서브유닛 a atpB_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xiv) 서열번호: 49에 제시된 서열, 또는 서열번호: 49에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 80% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 ATP 신타제 단백질 I atpI를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xv) 서열번호: 51에 제시된 서열, 또는 서열번호: 51에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 70% 초과의 동일성, 예컨대 92% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xvi) 서열번호: 53에 제시된 서열, 또는 서열번호: 53에 제시된 서열에 대해 60% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 알파 사슬 nifD_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xvii) 서열번호: 55에 제시된 서열, 또는 서열번호: 55에 제시된 서열에 대해 87% 초과의 동일성, 예를 들어 90% 초과의 동일성, 예컨대 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_1을 코딩하는 유전자, 및/또는
    xviii) 서열번호: 57에 제시된 서열, 또는 서열번호: 57에 제시된 서열에 대해 95% 초과의 동일성, 예를 들어 96% 초과의 동일성, 예컨대 97% 초과의 동일성, 예를 들어 98% 초과의 동일성, 예컨대 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 몰리브덴-철 단백질 베타 사슬 nifK_2를 코딩하는 유전자, 및/또는
    xxix) 서열번호: 59에 제시된 서열, 또는 서열번호: 59에 제시된 서열에 대해 98.5% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 가진 니트로게나제 철 단백질 nifH를 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 균주는 바람직하게는:
    Figure pct00060
    iii), iv), v) 및 vi)에 기재된 유전자들,
    Figure pct00061
    vii) 및 viii)에 기재된 유전자들, 또는
    Figure pct00062
    iii), iv), v), vi), vii) 및 viii)에 기재된 유전자들을 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 4 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 배양 중에 생산된 바이오매스를 수확하는 추가 단계를 포함하고, 선택적으로 상기 바이오매스를 건조시키는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 단백질을 생산하는 방법으로서, 청구항 16에 따른 방법을 수행하는 단계 및 상기 바이오매스로부터 단백질을 단리하는 추가 단계를 포함하고, 상기 방법으로 단백질 분획 및 비-단백질 성분을 포함하는 분획을 수득하는 것인 방법.
  18. 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 바이오매스, 상기 단백질 분획 또는 상기 비-단백질 성분을 포함하는 분획으로부터 식품 또는 사료 제품을 제조하는 추가 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 4 내지 18 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 바이오매스, 단백질 또는 비-단백질 성분과 같은 산물.
  20. 청구항 18에 따른 방법에 의해 수득되거나 또는 수득 가능한 식품 또는 사료 제품.
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