KR20110024537A - 세포내 에너지 농도가 높은 세포 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는, 재조합 방법 또는 돌연변이에 의해 생성된 세포 및 그의 용도에 관한 것이다.
포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK), 과발현, 프로모터 교환, 세포.

Description

세포내 에너지 농도가 높은 세포 및 그의 용도{High energy charged cell and use thereof}
본 발명은 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는, 재조합 방법 또는 돌연변이에 의해 생성된 세포 및 그의 용도에 관한 것이다.
미생물이 단백질, 약물, 정밀 화학물질, 입체-특이적 화학물질 등과 같은 유용한 생체 물질을 생산하는 세포 공장(cell factory)으로 이용되고 있다. 기존의 발효공학 기술에 유전공학 기술 및 생물공학 기술을 접목하여, 유용한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있도록 박테리아, 효모, 진균 또는 동식물 세포의 대사 경로를 변형시키거나 특정 유전자의 과발현 또는 억제 또는 제거를 통해 미생물을 개량하는 방법이 널리 연구되고 이용되고 있다.
생체 내에서 단백질, 핵산 등과 같은 물질을 생합성하기 위해서는 에너지가 요구된다. 생체 내에서 사용되는 에너지의 대부분은 NADH, NADPH 및 ATP의 형태로 보존되어 이용된다. 특히, ATP는 대사과정에서 생성된 화학적 에너지를 생물체의 다양한 활동에 전달하는 에너지 운반자이다. ATP는 광합성, 발효 및 호흡 과정을 통해 생성되고 생합성, 운동, 신호전달 및 세포 분열과 같은 생체 내의 활동에서 소비된다. 이와 같이, ATP는 성장, 리보솜 RNA 합성 및 세포 대사 경로와 같은 다수의 세포내 과정을 조절하기 때문에, 세포내 ATP 농도는 세포의 생리적 활성을 위해 가장 중요한 인자중 하나이다. 따라서, 미생물이 유용한 물질을 생산하기 위한 효율적인 공장으로 이용되기 위해서도 충분한 에너지의 생성 및 유지가 요구된다.
미생물을 이용한 유용한 목적 물질의 생산을 위해 주로 특정 목적 물질의 생성에 관여된 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근방법이 주로 이용되었다. 예를 들면, L-아미노산을 고수율로 생산할 수 있는 대장균을 포함한 다수의 유용한 균주들이 개발되었다. 그러나, 상기와 같이 개발된 각 균주는 특정 목적 물질의 생산에만 이용될 수 있으며, 목적 물질의 종류에 관계 없이, 목적 물질의 고수율 생산을 위해 세포 공장으로 범용적으로 이용될 수 있는 세포는 아직 개발되지 않았다. 이에, 본 발명자들은 세포의 ATP 생산 수율 및 세포내 ATP 수준을 증가시키기 위한 연구를 수행하여, 당신생(gluconegenesis)에 관여하는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 과발현이나, 해당 과정에서의 발현이 세포내 ATP 생성 및 수준을 증가시킨다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 높은 세포내 ATP 생산 수율 또는 농도를 갖는 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 높은 세포내 ATP 생산 수율 또는 농도를 갖는 세포를 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현 변화에 의해, 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 생산 수율 또는 농도를 갖는 세포를 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 모세포(parent cell)에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포를 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 단계, 및
상기 배양물로부터 상기 목적 물질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)는 생체 내의 당신생(gluconeogenesis)에서 옥살로아세트산(OAA)으로부터 포스포에놀피루베이트(PEP)를 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소에 의해 촉매되는 반응은 가역적이므로, CO2가 존재하는 조건에서 PCK는 PEP로부터 OAA를 생성하는 반응을 촉매하면서 1 분자의 ATP를 생산한다. 따라서, 해당(glycolysis) 경로에서 동일한 반응을 촉매하는 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc)와 달리, PCK에 의한 반응이 증가되면 세포내 ATP 생산 및 농도가 높아질 수 있다. 세포 내에서 PCK를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나, 또는 PCK를 코딩하는 유전자가 해당 경로에서 발현될 수 있도록 조절 서열을 변화시키거나, 또는 PCK의 활성을 증가시키는 것에 의해 PCK에 의한 ATP 생성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 목적 물질을 생산하는 방법은 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포를 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기 세포를 배양하는 단계는 당업계에 알려진 적합한 배지와 배양 조건 하에 수행될 수 있다. 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 목적 물질 및 세포에 따라 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 외부로부터 도입된 목적 물질을 코딩하는 유전자의 발현을 위해 유도(induction)가 필요한 경우, 상기 세포를 배양하는 단계는 유전자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다. 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포내 ATP 농도가 높은 세포는 아미노산 등의 생합성에 관련된 유전자의 발현 및 리보솜 농도를 증가시켜서 단백질 합성을 증가시킬 수 있으므로 외래 단백질을 생산하기에 적합할 수 있다. 또한, ATP는 세포내외로의 능동 물질 수송에 이용되므로, 세포내 ATP 농도가 높은 경우, 세포들이 ATP를 이용하여 활발하게 물질을 수송시킬 수 있으므로 목적하는 대사산물을 보다 높은 수율로 생성할 수 있다. 즉, 생성된 대사산물을 세포외부로 수송하고, 필요한 탄소원을 세포 내로 수송하여 피드백 조절을 배제하면서 목적물질의 생성을 위한 대사 경로를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 항생제, 또는 대사산물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현은 모세포에 비해 과발현되거나 또는 해당 경로에서 발현되도록 조절되어 세포내 ATP 농도를 증가시키도록 변화된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포는 모세포에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열을 변형시키는 것에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자는 대장균을 포함한 세균, 효모, 식물세포 또는 동물세포로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수의 증가는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 외래 유전자의 도입에 의해 이루어질 수 있다.
상기 외래 유전자의 도입은 형질전환 또는 형질감염을 포함하나, 이에 한정 되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자아게 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형은 프로모터 또는 인핸서의 교환에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 과발현시키기 위해 교환되는 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터 및 trp 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자(pck)의 프로모터가 해당과정에서 발현되는 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자(ppc)에 의해 교환된 것일 수 있다. 세포 내에서 pck 유전자의 프로모터가 해당 경로에서 발현되는 ppc 유전자의 프로모터로 교환된 경우, 상기 세포는 해당 경로에서 pck를 발현하여 PCK가 포스포에놀피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환되는 반응을 통해 ATP를 생산할 수 있으므로, 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는다. 즉, ppc 프로모터의 조절 하에 발현되는 pck 유전자를 갖는 세포는 외부로부터의 추가적인 pck 유전자의 도입 없이 게놈 상에 존재하는 pck 유전자의 조절 서열, 특히, 프로모터의 교환에 의해 자발적으로 해당 과정에서 pck 유전자를 발현하여 세포내 ATP 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖 는 세포는 돌연변이에 의해 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 또는 상기 효소의 활성이 모세포에 비해 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균일 수 있다. 상기 대장균에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자는 trc 프로모터에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 목적 물질을 생산하는 방법은 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하거나 또는 상기 세포의 대사 경로를 상기 목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포가 목적 물질을 생산하기에 적합하도록 외부로부터 필요한 유전자를 도입하거나 또는 세포 내의 게놈 상의 유전자의 발현이 목적 물질의 생산에 적합할 수 있도록 상기 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 단백질일 수 있고, 상기 세포에 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 발현시키는 것에 의해 목적 물질이 생산될 수 있다. 상기 세포에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하는 것은 형질전환 또는 형질감염을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 숙신산과 같은 대사산물일 수 있고, 상기 세포의 대사 경로에서 숙신산의 생성에 관여하는 단계의 효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 그 활성을 증가, 억제 또는 제거하는 것에 숙신산을 고수율로 생성할 수 있도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 아미노산일 수 있고, 상기 세포는 해당 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현 또는 그 활성을 증가, 억제 또는 제거하는 것에 의해 해당 아미노산을 고수율로 생성할 수 있도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 명세서에서, "모세포(parent cell)"는 돌연변이 또는 재조합 방법과 같은 분자생물학 기법에 의해 변형되어 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현이 모세포에 비해 증가되거나 또는 상기 유전자가 해당 경로에서 발현되도록 변화되어, 세포내 ATP 생성 수율 또는 농도가 증가되기 전의 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포를 의미한다.
본 명세서에서, "포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현 변화"은 모세포 대비 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자가 외부로부터 도입되거나 또는 발현 조절 서열의 변형에 의해 과발현되거나 또는 상기 유전자가 해당 경로에서 발현되도록 그 조절이 변형되거나, 또는 생성된 PCK의 활성이 증가되도록 변형되는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 "에너지 세포"는 세포내 에너지 수준, 특히, ATP 농도가 높은 세포를 의미한다.
본 명세서에서, "세포"는 박테리아, 효모, 진균, 동물세포 또는 식물세포를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서, "목적 물질"은 본 발명의 일 구체예에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 물질을 의미하며, 단백질, L-아미노산, 핵산, 항생제, 비타민, 생리활성 물질, 대사산물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서, "목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는"은 세포에 목적 물질의 생합성을 위해 필요한 유전자를 외부로부터 도입시키거나 또는 세포의 게놈 상에 존재하는 목적 물질의 생성에 관여하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 목적 물질의 생성을 방해하거나 또는 목적 물질의 분해에 관여하는 유전자의 발현을 억제 또는 제거하여 세포를 목적 물질을 생산하기에 유리한 상태로 변형시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 목적 물질을 생산하는 방법은 세포의 배양액으로부터 목적 물질을 회수하는 단계를 포함한다. 배양물로부터 목적 물질을 회수하는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 목적 물질의 분리를 위해 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 결정화 등의 방법이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현 변화에 의해, 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 생산 수율 또는 농 도를 갖는 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 변화는 상기 세포 내에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 것에 의해 이루어진 것된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시나아제를 코딩하는 유전자의 프로모터가 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자의 프로모터로 교환된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 세포는 높은 세포내 ATP 농도를 가지므로, 목적 물질을 생산하기 위한 세포 공장으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포는 목적 물질을 코딩하는 외래 유전자가 도입되거나 또는 목적 물질의 생산을 위해 대사 경로가 유전적으로 변형된 것 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 단백질일 수 있고, 상기 세포에 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 발현시키는 것에 의해 목적 물질이 생산될 수 있다. 상기 세포에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하는 것은 형질전환 또는 형질감염을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 목적 물질은 숙신산과 같은 대사산물일 수 있고, 상기 세포의 대사 경로에서 숙신산의 생성에 관여하는 단계의 효소를 코딩하 는 유전자의 발현 또는 그 활성을 증가, 억제 또는 제거하는 것에 상기 세포가 숙신산을 고수율로 생성할 수 있도록 유전적으로 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명에 따른 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포 및 이를 이용한 목적 물질의 생산방법을 이용하면, 높은 세포내 ATP 농도가 유전자 발현, 생합성, 물질 수송 등을 증진시키므로 단백질, 대사산물 등을 포함한 유용한 목적 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.
실시예 1. PCK 과발현 균주의 제조
본 실시예에서는 대장균의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 과발현하는 균주를 제조하였다.
(1) pEcPCK의 제조
대장균의 PCK를 코딩하는 유전자(pck)를 갖는 플라스미드를 제조하였다. 대장균 W3110(Korena Collection of Type Culture, KCTC 2223)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각각 EcoRI 및 PstI 인식부위를 갖는 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용 하여 PCR을 수행하여(95℃에서 40초간의 변성, 68.5℃에서 40초간의 어닐링, 및 72℃에서 40초간의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복 수행함) pck를 증폭시켰다. pck 유전자에 해당하는 1.6 kb PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, U.S.A.)(PCR cloning vector, ApR)에 클로닝하였다. 그 후, 수득된 pck 유전자를 pTrc99A 발현 벡터(AP Biotech, Uppsala, Sweden)의 EcoRI-PstI 부위에 서브클로닝시켜, pEcPCK를 수득하였다.
(2) 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK의 제조
DE3 Lysogenation 키트(Novagen, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 대장균 W3110(KCTC 2223)로부터, 대장균 W3110(DE3)을 제조하였다. 전기천공(Gene Pulser, Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.)을 이용하여 상기 (1)에서 제조된 pEcPck를 대장균 W3110(DE3)에 형질전환시켜, pck를 과발현하도록 pck 유전자를 도입시킨 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK를 제조하였다. 도 1은 대장균 W3110(DE3)와 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)와 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(PPC)에 의해 촉매되는 반응을 도시한다. 야생형 대장균 W3110(DE3)의 경우, 해당과정에서는 PPC가 PEP를 OAA로 전환하는 반응에 관여하고, 당 신생과정에서는 PCK가 동일한 반응에 관여한다. 그러나, PCK를 과발현하도록 형질전환된 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에서는 해당과정에서 염색체 상의 PPC와 도입된 플라스미드 상에 존재하는 PCK가 모두 작용한다.
(3) 대장균 BL21(DE3)/pEcPCK의 제조
세포생리연구용도인 야생형 대장균 W3110 이외에 재조합단백질 합성에 주로 사용되는 대장균주 BL21(DE3) (E. coli B dcm ompT hsdS(rB -mB -) gal )에 상기 (1)에서 제조된 pEcPck를 전기천공에 의해 형질전환시켜, pck를 과발현하도록 pck 유전자를 도입시킨 대장균 BL21(DE3)/pEcPCK를 제조하였다.
실시예 2. PCK 과발현 균주의 생리적 특성
실시예 1에서 제조된 PCK 과발현 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK의 생리적 특성을 파악하기 위해 모균주(대장균 W3110(DE)) 대비 바이오매스, 세포내 ATP 농도 및 리보솜 농도를 측정하였다.
(1) 바이오매스
배양은 6 mL의 배지(포도당 9g, NaHCO3 10g, IPTG 1 mM, 항생제(암피실린 및 카나마이신) 50 ㎍/ml 및 미네랄/L)를 포함하는 50-mL 테스트 튜브에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 24시간 동안 수행하였다. 600 nm에서 측정된 OD(optical density)로부터 환산된 바이오매스의 양은 대장균 W3110(DE)와 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에 대해 각각 0.42±0.02 (g-cell/L)와 0.16±0.01 (g-cell/L)였다.
(2) 세포내 ATP 농도
상기 (1)과 동일한 조건에서 배양하고, 세포 성장이 활발한 초기 지수기, 즉 600nm에서의 OD가 약 0.3에 도달했을 때, 세포들을 채취하여 세포내 ATP 농도를 측정하였다. 세포내 ATP 농도는 ATP determination kit(FL-AA; Sigma Chemical, St. Louis, MO) 및 루미노미터(luminometer)(20/20n Luminometer System, Turner Biosystems, Sunnyvale, CA)와 ATP 표준을 이용하여 측정하였다. 세포내 ATP의 양은 대장균 W3110(DE)와 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에 대해 각각 0.58±0.02 및 1.45 ± 0.03(nmol/g-cell)이었다. PCK를 과발현하는 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에 대조군에 비해 약 3배 정도 높은 세포내 ATP 농도를 가졌다.
(3) 리보솜 농도
PCK를 과발현하는 미생물이 단백질 합성을 위해 필요한 리보솜의 농도 증가를 갖는지를 확인하기 위해 세포내 리보솜 농도를 측정하였다.
상기 (1)과 동일한 조건에서 배양된 활발하게 성장하는 세포들(OD
Figure 112009054131816-PAT00001
0.5)을 채취하고, 15 ml의 완충액 A(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM 2-머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA, pH 7.6)에 현탁시켰다. 상기 세포들을 얼음 상에서 1초 간격으로 3분 동안 30 W로 설정된 초음파 처리기에 의해 파쇄시켰다. 10 ㎕의 DNase I(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)을 첨가한 후, 상층액을 얻기 위해 용해물을 4℃, 15,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상기 상층액에 0.5M NH4Cl 용액의 첨가 후에, 초원심분리(4℃, 100,000 g, 5시간)에 의해 리보솜을 회수하였다. 상층 액을 버린 후에, 펠렛을 완충액 B(50 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 100 mM NH4Cl, 6 mM 2-머캅토에탄올, 0.5 mM EDTA, pH 7.6)에 용해시켰다. 12.5% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 단백질을 분리시키고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. L4-리보솜에 대한 제1 항체(한국 외국어대학교 환경학과 이규호 교수로부터 공여됨) 및 제2 항체(항-랫트 IgG AP-conjugated, Sigma)를 순차적으로 상기 니트로셀룰로오스 막에 결합시켰다. AP 완충액(100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9.5)을 이용하여 리보솜을 확인하였다. 이미지 분석기(GelDoc1000/2000, Bio-Rad Lab, Inc., Hercules, CA. U.S.A)에 의한 강도의 분석을 통해 추정된 리보솜의 농도(임의 단위)는 대장균 W3110(DE)와 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에 대해 각각 342.5 및 605.9였다. 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK는 대조군인 대장균 W3110(DE)에 비해 약 1.8배 더 높은 리보솜 농도를 보였고, 이는 높은 세포내 ATP 농도를 갖는 세포들이 보다 많은 단백질 합성 기구를 갖는다는 것을 보여준다.
상기 결과는 PCK를 과발현하는 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK는 대조군에 비해 세포내 ATP 농도 및 리보솜 농도가 각각 약 3배 및 2배 높았으나, 세포성장속도는 대조군에 비해 느리다는 것을 보여주었다. 세포내 ATP 농도가 높기 때문에, 해당과정의 억제에 의해 세포 성장이 제한되고 성장을 위한 에너지가 생합성 등을 위해 이용될 수 있는 것으로 사료된다.
실시예 3. PCK 과발현 균주에 의한 외래 단백질의 제조
3-1. 외래 단백질 eGFP의 제조
(1) eGFP 발현 벡터의 제작
대장균 W3110(Korena Collection of Type Culture, KCTC 2223)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각각 EcoRI 및 XhoI 인식부위를 갖는 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여(95℃에서 1분간의 변성, 68℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함) eGFP를 증폭시켰다. eGFP 유전자에 해당하는 PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, U.S.A.)에 클로닝하고, DNA 서열결정에 의해 확인하였다(솔젠트, 대전, 한국). 그 후, 수득된 eGFP 유전자를 pET41a(Novagen)의 XhoI-EcoRI 부위에 서브클로닝시켜, pEGFP(eGFP expression vector based on pET41a, pT7, KmR)를 수득하였다.
(2) 형질전환 및 발현
실시예 1에서 제조된 PCK 과발현 균주인 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK에 상기 (1)에서 제조된 pEGFP를 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 세포 W3110(DE3)/pEGFP/pEcPCK와 대조구 세포 W3110(DE3)/pEcPCK를 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 및 항생제를 포함하는 포도당-최소 배지(리터당, 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각각 25 ㎍/mL, 대조군의 경우, 카나마이신 50 ㎍/mL), 및 미네랄) 및 LB-포도당 배지(리터당, 펩톤 (5g), 트립톤 (10g), NaCl (10 g), 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 및 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각각 25 ㎍/mL, 대조군의 경우, 카나마이신 50 ㎍/mL))에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 24시간 동안 배양하였다. eGFP의 발현량을 추정하기 위해, 배양액(700 마이크로리터)을 395 nm에서의 여기 및 509 nm에서의 방출 조건 하에 형광 분광분석기(RF-5301PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 배치하였다. 위상차 현미경 및 형광 현미경(LSM 510, Carl Zeiss)을 이용하여 세포들을 관찰하였다. 도 2 및 도 3은 각각 포도당-최소 배지 및 LB-포도당 배지에서 배양된 대장균 W3110(DE3)/pEcPCK와 대장균 W3110(DE3)/pEGFP/pEcPCK의 관찰 결과를 보여준다. 발현량(volumetric expression)(형광 강도, RF)은 각각 367.1±0.02와 643.6±0.03이었고 비 발현량(specific expression, 형광 강도/g-cell)은 869.5 및 3984.6이었다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조된 PCK 과발현 대장균 BL21(DE)pECK에 상기 (1)에서 제조된 pEGFP를 전기천공에 의해 형질전환시켜 대장균 BL21(DE3)/pEGFP/pEcPCK를 제조하였다. 형질전환된 대장균 상기 (1)에서 제조된 pEGFP를 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pEGFP/pEcPCK와 대조구 대장균 BL21(DE3)/pEcPCK를 IPTG 및 항생제를 포함하는 LB-포도당 배지(리터당, 펩톤 (5g), 트립톤 (10g), NaCl (10 g), 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 및 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각각 25 ㎍/mL, 대조군의 경우, 카나마이신 50 ㎍/mL))에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 12시 간 동안 배양하였다. eGFP의 발현량은 상기 대장균 W3110(DE3)/pEGFP/pEcPCK의 경우와 동일한 방법으로 측정하였다. 포도당-LB 배지에서 대장균 BL21(DE3)/pEGFP와 BL21(DE3)/pEcPCK/pEGFP에서 발현량은 각각 463.3 및 873.3 였고, 비 발현량(RF/mg-세포)은 923.9±5.1 및 1440.8±104.9였다. 이 결과는 PCK와 eGFP를 동시발현한 BL21(DE3)균주는 대조구 대비 세포당 외부단백질 eGFP 발현량은 약 56%, 전체 외부단백질 eGFP 발현량은 약 89% 증가했다는 것을 보여준다.
3-2. 외래 단백질 베타-갈락토시다아제(LacZ)의 제조
(1) lacZ 발현 벡터의 제조
대장균 W3110(Korena Collection of Type Culture, KCTC 2223)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각각 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여(95℃에서 40초간의 변성, 67.5℃에서 40초간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함) lacZ를 증폭시켰다. lacZ 유전자에 해당하는 PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, U.S.A.)에 클로닝하고, DNA 서열결정에 의해 확인하였다(솔젠트, 대전, 한국). 그 후, 수득된 lacZ 유전자를 pET41a(Novagen)의 XhoI-EcoRI 부위에 서브클로닝시켜, pLacZ(LacZ expression vector based on pET41a, pT7, KmR)를 수득하였다.
(2) 형질전환 및 발현
실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 대장균 BL21(DE3)(F- ompT hsdS B (rB -mB - gal dcm (DE3)(Novagen Inc.)에 전기천공에 의해 pEcPCK를 형질전환시켜 pck를 과발현하는 균주인 대장균 BL21(DE3)/pEcPCK를 제조하였다. 상기 균주 및 대조군 대장균 BL21(DE3)에 각각 상기 (1)에서 제조된 pLacZ를 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 세포 BL21(DE3)pEcPCK/pLacZ와 BL21(DE3)/pLacZ를 포도당-최소 배지(리터당, 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각 25 ㎍/mL), 및 미네랄) 및 LB-포도당 배지(리터당, 펩톤 (5g), 트립톤 (10g), NaCl (10 g), 포도당(9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 및 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각 25 ㎍/mL))에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 24시간 동안 배양하였다. 24시간의 혐기 배양 후에, 세포들을 회수하고 초음파 처리에 의해 파쇄시켰다. o-니트로페닐-β-D-갈락토시드(ONPG) (Miller, J. 1972. Experiments in Molecular Genetics, p. 352-355. Cold Spring Harbor Laboratory, NY.)를 기질로 이용하여 상기 파쇄물의 베타-갈락토시다아제 활성을 측정하였다. 세포 파쇄물에 ONPG를 첨가한 후 2분간 30℃에서 교반한 후 황색이 발색되면 Na2CO3 500㎕를 첨가하여 반응을 종료시키고 각각 OD420nm와 OD550nm에서 활성을 측정하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포(BL21(DE3)pEcPCK/pLacZ) 및 대조군 세포(BL21(DE3)/pLacZ)의 배양에 의해 생성된 외래 단백질, 베타 갈락토시다아제의 활성을 도시한다. BL21(DE3)pEcPCK/pLacZ의 베타-갈락토시다아제 활성이 BL21(DE3)/pLacZ에 비해 약 3배 정도 더 높았고, 이는 eGFP의 발현에서와 유사한 경향이었다. 즉, PCK의 과발현에 의해 높은 세포내 ATP 농도를 갖는 세포가 외래 단백질의 제조를 위해 유용하게 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4. PCK 과발현 균주에 의한 대사산물의 제조
PCK를 과발현하는 균주에 의한 외래 단백질의 발현 및 이에 따른 대사산물의 생산을 수행하였다.
(1) ygjE 발현 벡터의 제조
대장균의 숙시네이트 능동 수송체 YgjE (active transporter, export intracellular succinate outward)를 코딩하는 유전자 ygjE를 대장균 W3110(Korena Collection of Type Culture, KCTC 2223)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각각 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여(95℃에서 1분간의 변성, 63℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복 수행함) 증폭시켰다. ygjE 유전자에 해당하는 PCR 산물을 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, WI, U.S.A.)에 클로닝하고, DNA 서열결정에 의해 확인하였다(솔젠트, 대전, 한국). 그 후, 수득된 ygjE 유전자를 pET41a(Novagen)의 EcoRI-XhoI 부위에 서브클로닝시켜, pYgjE(YgjE expression vector based on pET41a, pT7, KmR)를 수득하였다.
(2) 형질전환 및 발현
실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 대장균 BL21(DE3)(F- ompT hsdS B (rB -mB - gal dcm (DE3)(Novagen Inc.)에 전기천공에 의해 pEcPCK를 형질전환시켜 pck를 과발현하는 균주인 대장균 BL21(DE3)/pEcPCK를 제조하였다. 상기 균주 및 대조군 대장균 BL21(DE3)에 각각 상기 (1)에서 제조된 pYgjE를 전기천공에 의해 형질전환시켰다. YgjE는 막 결합 수송체(membrane-integrated transporter)이므로, 형질전환된 세포 BL21(DE3)/ygjE.pck와 BL21(DE3)/ygjE를 혐기 조건 하에 포도당 최소 배지(리터당, 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (50 ｕM), 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각 25 ㎍/mL), 및 미네랄)에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 24시간 동안 배양하였다. 24시간의 혐기 배양 후에, YgjE의 활성은 세포내/외의 숙시네이트 농도를 측정하는 것에 의해 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포(BL21(DE3)/ygjE.pck) 및 대조군 세포(BL21(DE3)/ygjE)의 혐기 배양에 의해 생성된 숙시네이트의 양을 도시한다.
혐기 조건에서의 배양 산물인 숙시네이트 생산량은 대조군 대장균 BL21(DE3)/ygjE보다 PCK를 과발현하는 대장균 BL21(DE3)/ygjE.pck에서 증가되었다. 이 결과는 외래 단백질 생산 및 대사산물의 생산을 위해 본 발명에 따른 높은 세포내 ATP 농도를 갖는 세포가 유용하게 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 5. 자발적 PCK 발현 균주의 제조 및 이를 이용한 외래 단백질의 제조
(1) 자발적 PCK 발현 균주의 제조
대장균의 게놈 내에서 당신생 조건에서 조절되는 pck 프로모터를 해당 (glycolysis)조건에서 조절되는 ppc 프로모터와 교환함으로서 해당조건에서 ppc 프로모터 조절에 의해서 pck가 발현되도록 함으로써 플라스미드 벡터의 도입에 의한 과발현 없이 자발적으로 더 높은 에너지 생산해 내는 세포를 제작하였다.
먼저, 대장균 W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하고 각각 서열번호 9와 10을 이용한 PCR(95℃에서 1분간의 변성, 67.5℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함), 서열번호 11과 12를 이용한 PCR(95℃에서 1분간의 변성, 61.5℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함) 및 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용한 PCR(95℃에서 1분간의 변성, 69℃에서 1분간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함)을 수행하여 단편 I (pck upstream, 1.5 kb), 단편 II (ppc promoter region, 0.5 kb), 및 단편 III (pck structural region 1.6 kb)을 증폭하였다. 상기에서 수득된 단편 I, II 및 III의 증폭 산물을 T 벡터(T&A cloning vector, RBC Co., Taiwan)에 클로닝하여 DNA 서열결정을 통해 서열을 확인한 후, 각각 SmaI과 XbaI, XbaI과 PstI, 및 PstI과 HindIII로 처리한 후 순차적으로 pTrc99A 발현 벡터(AP Biotech, Uppsala, Sweden)에 클로닝하였다. 클로닝 후에 각 제한효소로 절단하여 DNA 크기를 재확인하였다. 상기 클로닝에 의해 수득된 pTrc99A-I-II-III를 주형으로 서열번호 15 및 16의 프라이머를 사용하여 전체 총 3.6 kb의 단편 I-II-III을 PCR을 통해(95℃에서 40초간의 변성, 67.5℃에서 40초간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수 행함) 증폭한 후 프로모터 교환(exchange)을 위하여 최종적으로 온도민감성(ts: temperature sensitive)인 자살벡터(suicide vector) pKOV (J. Bacteriology 171: 4617-4622 [1989]; Harvard Medical School, Department of Genetics, Prof. George M. Church 로부터 공여받음.)의 NotI 삽입부위에 서브클로닝 시켰다. 그 후 상기 벡터를 전기천공을 이용하여 대장균 W3110(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환 직후, LB 액체배지에 1시간 동안 30℃에서 배양한 후 42℃에서 클로람페니콜(50 ug/mL)을 포함한 LB 고체배지에서 세포들을 배양하여 생성된 콜로니들을 1차 교차(crossover)가 일어난 세포들로 선택하였다. 이 콜로니들을 다시 1 mL LB 액체배지에 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 교반하면서 약 5시간 동안 배양하고, 즉시, 5% 수크로오스를 포함한 LB 고체배지와 5% 수크로오스 및 클로람페니콜(85 ug/mL)을 포함한 LB 고체배지에 도말 후 30℃에서 배양하여 클로람페니콜에 저항성이 없어진 균주를 선별하여 이중 교차(double crossover)가 일어난 세포들을 선별하였다. 도 6은 대장균 K12의 게놈 상에서 pck 유전자의 프로모터를 ppk 유전자의 프로모터로 교환하는 상동성 재조합을 개략적으로 보여준다. 선별된 균주의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 15와 16의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여(95℃에서 40초간의 변성, 67.5℃에서 40초간의 어닐링, 및 72℃에서 1분간의 신장으로 구성된 사이클을 25회 반복 수행함) pck 유전자의 프로모터가 ppc 프로모터로 교환된 대장균을 확인하고 HEC01로 명명하였다. 도 7의 A는 본 실시예에서 제조된 pck의 프로모터가 ppc 프로모터로 교환된 자발적 에너지 세포 게놈의 모식도를 보여주며, 도 7의 B는 상기 세포에서 일어나는 생화학적 반응을 나타낸다. 최종적으로 실시예 2의 (2)에 기재된 방법을 이용하여 상기 세포를 배양하고 세포내 ATP 농도를 측정하였다. 포도당 최소배지에서 활발히 성장하는 HEC01 균주를 분리하여 세포내 ATP 농도를 측정한 결과 35.81±0.08 nmol/g-cell의 농도로 대조군인 W3110(DE3)의 24.73±1.26 nmol/g-cell보다 약 50% 이상 향상된 것을 확인하였다. 또한 이 농도는 IPTG유도에 의해 pck를 과발현한 W3110(DE3)/pEcPck 균주의 37.41±1.88 nmol/g-cell과 유사한 세포내 ATP 농도를 보이는 것으로 확인되었다.
(2) 형질전환 및 발현외래 단백질(eGFP)의 제조
상기 (1)에서 제조된 자발적 PCK 발현 에너지 세포인 HEC01와 대조군인 대장균 W3110(DE3)에 각각 상기 실시예 3-1에서 제조된 pEGFP를 전기천공에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 세포 HEC01/pEGFP와 W3110(DE3)/pEGFP를 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 및 항생제를 포함하는 포도당-최소 배지(리터당, 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각각 25 ㎍/mL, 대조군의 경우, 카나마이신 50 ㎍/mL), 및 미네랄) 및 LB-포도당 배지(리터당, 펩톤 (5g), 트립톤 (10g), NaCl (10 g), 포도당 (9 g/L), NaHCO3 (10 g), IPTG (1 mM), 및 항생제(암피실린 및 카나마이신, 각각 25 ㎍/mL, 대조군의 경우, 카나마이신 50 ㎍/mL))에서 37℃, 250 rpm의 조건 하에 12시간 동안 배양하였다. eGFP의 발현량을 추정하기 위해, 배양액(700 마이크로리터)을 395 nm에서의 여기 및 509 nm에서의 방출 조건 하에 형광 분광분석기(RF-5301PC, Shimadzu, Kyoto, Japan)에 배치하였다. 위상차 현미경 및 형광 현미경(LSM 510, Carl Zeiss)을 이용하여 세포들을 관찰하였다. 대장균 HEC01/pEGFP의 발현량(형광 강도)은 194.45±9.27로, 대조군인 대장균 W3110(DE3)/pEGFP의 100.4±9.35보다 약 2배 많은 양을 발현하였다.
도 1은 대장균에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)와 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제(PPC)에 의해 촉매되는 반응을 도시한다. 첨자로 표시된 p와 c는 각각 프로모터 기원 유전자 및 염색체 기원 유전자라는 것을 표시한다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포의 포도당-최소 배지(glucose-minimal media)에서의 배양에 의해 생성된 외래 단백질 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)의 위상차 현미경 및 형광 현미경 하에서의 관찰 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 세포의 LB(Luria Bertani)-포도당 배지에서의 배양에 의해 생성된 외래 단백질 eGFP의 위상차 현미경 및 형광 현미경 하에서의 관찰 결과를 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포(BL21(DE3)pEcPCK/pLacZ) 및 대조군 세포(BL21(DE3)/pLacZ)의 배양에 의해 생성된 외래 단백질, 베타 갈락토시다아제의 활성을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 세포(BL21(DE3)/ygjE.pck) 및 대조군 세포(BL21(DE3)/ygjE)의 혐기 배양에 의해 생성된 숙시네이트의 양을 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 세포 (HECO1)을 제조하기 위해, 대장균 K12의 게놈 상에서 pck 유전자의 프로모터를 ppk 유전자의 프로모터로 교환하는 상동성 재조합을 개략적으로 보여준다.
도 7에서 A는 본 발명의 일 구체예에 따른 자발적 pck 발현 세포인 대장균 HEC01과 대조군 세포인 대장균 W3110(DE3)의 게놈 구조를 나타내고, B는 대장균 HEC01에서 PCK 발현에 의해 해당 경로에서 일어나는 생화학적 반응을 나타낸다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of the Catholic University of Korea <120> High energy charged cell and use thereof <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pck <400> 1 gaattcatgc gcgttaacaa tggtttgacc cc 32 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for pck <400> 2 ctgcagttac agtttcggac cagccgctac 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for eGFP <400> 3 gaattcatgg tgagcaaggg cgagga 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for eGFP <400> 4 ctcgagcttg tacagctcgt ccatgcc 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for lacZ <400> 5 gaattcatgg tgagcaaggg cgagga 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for lacZ <400> 6 ctcgagcttg tacagctcgt ccatgcc 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ygjE <400> 7 gaattcatga aaccttccac tgaatggt 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ygjE <400> 8 ctcagattaa agcaacacca cgggcat 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fragment I <400> 9 cccgggggct tcgtccccag ttttccatcc t 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fragment I <400> 10 tctagatggc tggcgctagt gtttattgcc 30 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fragment II <400> 11 tctagaacct acagtgactc aaacgatgc 29 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fragment II <400> 12 ctgcagatta ccccagacac cccatcttat 30 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fragment III <400> 13 ctgcagatgc gcgttaacaa tggtttgac 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fragment III <400> 14 aagcttttac agtttcggac cagccgcta 29 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fragment I-II-III <400> 15 gcggccgcgg cttcgtcccc agttttccat cc 32 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fragment I-II-III <400> 16 gcggccgctt acagtttcgg accagccgct 30

Claims (17)

  1. 모세포(parent cell)에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포를 목적 물질을 생산하기에 적합한 조건에서 배양하는 단계, 및
    상기 배양물로부터 상기 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포는 모세포 대비 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현이 세포내 ATP 농도를 증가시키도록 변화된 것인,
    모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포를 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계 전에 상기 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포에 목적 물질을 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입하거나 또는 상기 세포의 대사 경로를 목적 물질을 생산하도록 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 목적 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 항생제, 또는 대사산물인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아 제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현은 모세포에 비해 과발현되거나 또는 해당(glycolysis) 경로에서 발현되도록 변화된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포에서 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 변화는 상기 세포 내에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 것에 의해 이루어진 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수의 증가는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 외래 유전자의 도입에 의해 이루어진 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형은 프로모터 또는 인핸서의 교환에 의해 이루어진 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시나아제를 코딩하는 유전자의 프로모터가 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자의 프로모터로 교환된 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포는 돌연변이에 의해 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현이나 상기 발현된 효소의 활성이 모세포에 비해 증가된 세포인 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균인 것인 방법.
  12. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제(PCK)를 코딩하는 유전자의 발현 변화에 의해, 모세포에 비해 증가된 세포내 ATP 농도를 갖는 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 변화는 상기 세포 내에서 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 변형시키는 것에 의해 이루어진 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포스포에놀피루베이트 카르복시나아제를 코딩하는 유전자의 프로모터가 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자의 프 로모터로 교환된 것인 세포.
  15. 제12항에 있어서, 상기 세포는 목적 물질을 코딩하는 외래 유전자가 도입되거나 또는 목적 물질의 생산을 위해 대사 경로가 유전적으로 변형된 것인 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 목적 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 항생제, 또는 대사산물인 것인 세포.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균, 식물 세포 또는 동물 세포인 것인 세포.
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