CN103255127A - 一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种白灵菇和杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征是将白灵菇和杏鲍菇菌丝细胞酶解制备原生质体，以白灵菇原生质体热灭活、以杏鲍菇原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将白灵菇和杏鲍菇原生质体融合，并通过颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证融合株。本发明有效把白灵菇和杏鲍菇原生质体融合获得具有菌盖不易碎、子实体单生特性的新菌株，为原生质体融合选育目的菌株提供了一种有效方法。

Description

一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法

技术领域

本发明属于食用菌生物技术育种领域，具体涉及一种利用白灵菇与杏鲍菇原生质体融合，获得兼具白灵菇与杏鲍菇二者优势特性的菌盖不易碎、子实体单生菌株的方法。

背景技术

目前传统食用菌育种方式多为人工诱变育种，尚无白灵菇与杏鲍菇原生质体融合方面的报道，由于白灵菇具有久煮不烂、耐运输、易保鲜、货架时间长、耐旱性强、能防癌抗癌、防治老年人心血管病、妇科肿痛、儿童佝偻病和软骨病等优点，但其分解木质素、纤维素、蛋白质能力很弱。而杏鲍菇系一种分解木质素、纤维素、蛋白质能力很强的菌类，富含维生素C、高蛋白、低糖、低脂肪、可降血压、降血脂、预防糖尿病及肥胖症，有改善肠胃、美容等保健功能。但耐旱性弱，菌盖和菌柄质地酥脆，易破裂，人工来去除原基分化产生大量菌蕾，加大了成本。因此培育兼具白灵菇与杏鲍菇二者优势，即能够耐旱、降解木质素、纤维素，提高菌盖韧性，子实体单生新菌株显得尤其重要，可以极大地降低生产成本，培育出优良品种的新菌株。

中国专利：申请号201010523452.X公开了一种草菇和杏鲍菇原生质体融合，它主要是采用单灭活法标记原生质体，并通过0℃低温条件筛选融合株，本发明与其最大的区别是融合过程中采用双灭活原生质体标记法，并通过颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD多种验证融合株方法，更能准确、全面确定融合株的真实性。

目前食用菌育种多为人工诱变方法，由于诱变的不定向特点，用于解决上述问题的效果不佳，查阅资料国内外尚无白灵菇与杏鲍菇原生质体融合报道。

发明内容

本发明目的通过对白灵菇与杏鲍菇原生质体融合方法克服常规育种方式的不足，将白灵菇与杏鲍菇原生质体成功融合融，获得兼有两亲本优良特性即菌盖不易碎、子实体单生新菌株，为实现人工栽培或走发酵工程途径提供菌种资源。

为实现上述目的，本发明公开了一种白灵菇和杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于将白灵菇和杏鲍菇的菌丝体经酶解制备纯化后的原生质体，以白灵菇原生质体热灭活、以杏鲍菇原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将白灵菇和杏鲍菇原生质体融合，并通过菌颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证得融合株。

所述的酶解液是白灵菇菌丝体酶解液：以0.6mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，配制1ml 1.50%（质量体积比）溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；杏鲍菇的菌丝体酶解液：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 %溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；

所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合：分别将纯化后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照原生质体悬液体积比1:1混合，3000r/min离心10min弃上清，0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬沉淀后逐滴加入等体积30%（质量体积比）PEG6000与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min。

本发明进一步公开了一种白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于它是按如下的步骤进行：

（1）白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备；

（2）原生质体的制备：白灵菇原生质体制备采用液体静置培养7d的菌丝体，以0.6 mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，在1.50%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；杏鲍菇原生质体制备采用液体静置培养11d的菌丝体，以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，在2.00%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；

（3）原生质体纯化：将步骤（2）所述酶液过滤去除菌丝残片，6000r/min离心获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬，再次6000r/min离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂调节浓度至10⁵个/ml：

（4）原生质体灭活标记：白灵菇原生质体采用55℃热灭活标记处理30min；杏鲍菇原生质体采用紫外灭活采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min标记处理；

（5）双亲原生质体融合：分别将纯化灭活后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照悬液体积比1:1混合，3000r/min离心弃上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000（聚乙二醇）与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min；

（6）将步骤（4）处理好的原生质体悬液4000r/min离心15min，弃上清液；再用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2次，去除PEG；

（7）融合株再生：将步骤（5）处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂稀释至10⁵个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7~15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（1）所述的白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备是指取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，分别接种于装有白灵菇和杏鲍菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到白灵菇与杏鲍菇新鲜的菌丝体。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）

所述酶解是以0.1g菌丝体（湿重）加入1ml酶解液比例进行酶解反应。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）

白灵菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间3h，杏鲍菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间2h。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（4）取浓度10⁵个/ml的白灵菇原生质体5ml，采用55℃水浴热灭活处理30min；取10⁵个/ml的杏鲍菇原生质体5ml，采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其中步骤（7）所述的甘露醇再生培养基：葡萄糖2.00%、麦芽糖2.00 %、酵母粉0.35 %、蛋白胨0.20 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %，VB₁0.001 %，0.6 mol/L甘露醇，pH自然。

其中所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其中融合株综合验证，指的是采用颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）分子生物学标记的方法。

本发明所述的新鲜白灵菇菌丝的可以通过以下方法培养得到： 取PDA综合培养基上生长旺盛菌丝体前端，接种于装有白灵菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到白灵菇新鲜的菌丝体。

本发明所述的新鲜杏鲍菇菌丝的可以通过以下方法培养得到：取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，接种于装有杏鲍菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到杏鲍菇新鲜的菌丝体。

本发明所述的白灵菇和杏鲍菇原生质体融合株菌落、子实体形态特征及生长特性如下：

融合株菌丝锁状联合数较多、较明显，菌落规则圆形，颜色洁白，长势较亲本弱，菇体类似白灵菇，菌盖颜色为浅灰色，与杏鲍菇相同，而且较亲本不易破碎，菌柄颜色稍微发黄；继承了两亲本的菌盖不易碎，子实体单生的优良性状。

下面是本发明公开的白灵菇和杏鲍菇原生质体融合后的验证方法及结果：

颉颃实验：将白灵菇、杏鲍菇、融合株BXf转分别接于PDA综合平板培养基，25℃暗培养，7d后观察菌落颉颃现象；每个平板内，随着三菌株菌落的不断延伸靠近，在三菌株交界处形成明显的颉颃线。融合株由于自身和两亲本的影响，从正面看，长势较两亲本弱，两亲本分泌的代谢产物强烈抑制融合株的生长；从背面看白灵菇和融合株BXf都有色素沉淀，因此可初步证明每个平板内不同于亲本的种确为融合株再生所得。

菌落表型：将白灵菇、杏鲍菇、融合株转接于同一PDA综合平板培养基，同一条件培养；结果显示白灵菇菌丝体粗壮而稀疏，洁白，菌落长势不均匀，生长不同步，菌落边缘不整齐。杏鲍菇菌丝体细而密，颜色洁白，长势均匀，可以观察到轮纹，但生长后期菌落表面会。融合株BXf菌落均为规则圆形，颜色洁白，三菌株之间有明显差异。 

菌丝形态：插片培养法取白灵菇、杏鲍菇、融合株BXf菌丝体于光学显微镜下观察；结果显示杏鲍菇菌丝体分枝多，菌丝细而密，白灵菇菌丝体分枝少，菌丝粗而稀，健壮，锁状联合比杏鲍菇明显。融合株菌丝体形态与白灵菇最为接近，融合株锁状联合数较多、较明显。具有锁状联合则可形成子实体，得到可育融合株，达到了实目的。

出菇试验：采用出菇培养料接种三菌株，通过发菌，育菇得到了两亲本及融合株子实体，白灵菇子实体形状马蹄形，单生或丛生，整个菇体洁白，厚实，菌盖扁而大，边缘向内卷曲，菌柄粗而肥厚，下部稍细；杏鲍菇子实体保龄球形状，多群生或丛生，菇体酥脆，菌盖灰褐色，相对于白灵菇来说较小，在生长初期呈半球形，成熟时呈浅凹圆形，表面平滑，菌柄呈棍棒球茎状，表面平滑，颜色洁白。融合株BXf整个菇体类似于白灵菇，菌盖颜色为浅灰色，与杏鲍菇相同，而且较亲本不易破碎，菌柄颜色稍微发黄；经过一系列的比较得出：融合株继承了两亲本的菌盖不易碎、子实体单生的优良形状，认为是理想的目的融合株。

分子生物学标记：经过RAPD实验，有8种随机引物能扩增出三菌株基因组DNA，其中引物4种引物扩增效果最好，相对多态性更丰富，重复性更高，稳定性佳，扩增出DNA条带大小在200~2000bp之间。四种引物对白灵菇扩增出27条谱带，杏鲍菇19条谱带，融合株19条谱带，比较电泳图谱发现，融合株既有与白灵菇同源片段，又有与杏鲍菇相同片段，融合株与亲本间均存在同源序列。

本发明公开的白灵菇和杏鲍菇原生质体融合方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明首次通过白灵菇和杏鲍菇原生质体融合筛选出兼有菌盖不易碎、子实体单生的双亲优良特性的新菌株，为选育两种性状互补的属内种间融合目标的新菌株提供了一种有效的融合方法。

（2）该白灵菇与杏鲍菇原生质体融合育种有别于传统人工诱变育种，采用双灭活的标记方法，能有效提高融合选育目的新菌株的成功概率，该技术可重复性较强，且方式属于非转基因育种方式，更有利于食品质量安全。

附图说明：

图1白灵菇原生质体热灭活涂板后再生的结果；

图2 杏鲍菇原生质体紫外灭活后涂板后再生的结果；

图3 再生培养基上再生的融合株BXf菌落；

图4 融合株BXf与双亲菌株颉颃反应图；

图5 融合株BXf与双亲菌株菌落形态比较（左：白灵菇；中：杏鲍菇，右：融合株BXf）

图6 引物S18(左)、S24(右)引物扩增的RAPD指纹图谱；

图7 引物S33(左)、S37(右)引物扩增的RAPD指纹图谱；

图 8 出菇试验子实体形态（左：白灵菇；中：杏鲍菇，右：融合株BXf）。

具体实施方式

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述，下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法；所使用额材料、试剂等如无特殊说明均可从商业途径购买得到。特别加以说明的是：其中白灵菇、杏鲍菇均为天津地区主要栽培种类，由天津师范大学蕈菌研究所提供，对外有售。白灵菇与杏鲍菇具体信息可见相关食用菌杂志及专业资料介绍。 

溶壁酶购于广东碧德生物科技有限公司；蜗牛酶购于北京鼎国生物技术有限责任公司；本发明所用到的原料除特别说明外均为分析纯，均可从市面试剂公司购买。

实施例1

（1）取PDA综合培养基上生长旺盛菌丝体前端，接种于装有白灵菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到白灵菇新鲜的菌丝体。

（2）取新鲜的白灵菇与杏鲍菇菌丝体，以0.1g湿重加1ml酶液比例进行酶解，其中白灵菇菌丝体原生质体酶解温度34℃酶解时间3h，杏鲍菇菌丝体原生质体酶解温度34℃解时间2h，本发明所述的白灵菇菌丝体酶解：以2ml 0.6mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，在1ml 1.50%溶壁酶与1ml 1.00% 蜗牛酶作用下酶解；杏鲍菇的菌丝体酶解：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 % 溶壁酶与1.00% 蜗牛酶作用下酶解；

（3） 酶解完毕后，采用装有孔径10微米无菌滤网注射器过滤，去除菌丝残片， 6000r/min离心10min获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬，再次6000r/min离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂调节浓度至10⁵个/ml。

（4）取5ml 10⁵个/ml白灵菇原生质体采用55℃水浴处理30min；取5ml 10⁵个/ml杏鲍菇原生质体紫外灭活采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min；

（5）分别将纯化灭活后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照悬液体积比1:1混合，3000r/min离心弃上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000与10ml 50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min；

（6）将处理好的原生质体悬液4000r/min离心15min，弃上清液；再用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2次，尽可能去除PEG。

（7）将融合处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂稀释至10⁵个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7~15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。

（8）融合株鉴定：通过对颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD分子生物学标记对融合株进行多角度综合验证。

所述的PDA综合培养基配方：马铃薯20.00%(浸提液)、棉籽皮20.00 %(浸提液)、葡萄糖2.00 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %、V_B1微量、琼脂1.60 %，先将马铃薯、棉籽皮加水煮沸30min过滤，滤液中再加入其它药品完全溶解后，121℃灭菌30min，pH自然。

所述的白灵菇液体培养基配方：葡萄糖2.00%、马铃薯20.00 %（浸提液）、酵母粉0.35 %、蛋白胨0.20 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %，VB₁0.001 %，pH自然。

所述的杏鲍菇液体培养基配方：葡萄糖2.00 %、麦芽糖2.00 %、麸皮0.20%（浸提液）、酵母粉0.30 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %，VB₁0.001 %，pH自然。

所述的融合株再生培养基配方：葡萄糖2.00%、麦芽糖2.00 %、酵母粉0.35 %、蛋白胨0.20 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %，VB₁0.001 %，0.6 mol/L甘露醇，pH自然。

（9）结合附图对所出现的情况加以分析说明

实验结果如附图1~8所示。附图1中，白灵菇原生质体热灭活后涂板再生，在再生平板上没有菌落出现，说明原生质体已经彻底灭活；附图2杏鲍菇原生质体紫外灭活后涂板再生也无再生菌落出现，同样说明原生质体已经灭活彻底；附图3中再生菌落为融合株再生的菌落，初期培养10~20d后平板出现白色扁平菌落，然后渐渐展开，菌丝纤细，颜色较暗。附图4在三菌株交界处形成明显的颉颃线。从背面看白灵菇和融合株BXf都有色素沉淀，可以推断融合株BXf跟亲本存在区别；附图5白灵菇（左）菌丝体粗壮而稀疏，洁白，菌落长势不均匀，生长不同步，菌落边缘不整齐。杏鲍菇（中）菌丝体细而密，颜色洁白，长势均匀，可以观察到轮纹，融合株BXf（右）菌落均为规则圆形，颜色洁白，三菌株之间有明显差异。附图6~7 RAPD实验，有8种随机引物能扩增出三菌株基因组DNA，其中引物4种引物扩增效果最好，相对多态性更丰富，重复性更高，稳定性佳，扩增出DNA条带大小在200~2000bp之间。四种引物对白灵菇扩增出27条谱带，杏鲍菇19条谱带，融合株BXf 19条谱带，比较电泳图谱发现，融合株基因谱带既有与白灵菇同源片段，又有与杏鲍菇相同片段，融合株与亲本间均存在同源序列，又存在特有扩增片段；附图8显示白灵菇（左图）子实体形状马蹄形，单生，整个菇体洁白，厚实，菌盖扁而大，边缘向内卷曲，菌柄粗而肥厚，下部稍细；杏鲍菇（中图）子实体保龄球形状，多群生或丛生，菇体酥脆，菌盖灰褐色，相对于白灵菇来说较小，在生长初期呈半球形，成熟时呈浅凹圆形，表面平滑，菌柄呈棍棒球茎状，表面平滑，颜色洁白。融合株BXf（右图）整个菇体类似于白灵菇，菌盖颜色为浅灰色，与杏鲍菇相同，而且较亲本不易破碎，菌柄颜色稍微发黄；经过一系列的比较得出：融合株继承了两亲本的菌盖不易碎、子实体单生的优良形状。

Claims (8)

1. 一种白灵菇和杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于将白灵菇和杏鲍菇的菌丝体经酶解制备纯化后的原生质体，以白灵菇原生质体热灭活、以杏鲍菇原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将白灵菇和杏鲍菇原生质体融合，并通过颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证得融合株；

所述的酶解液是白灵菇菌丝体酶解液：以0.6mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，配制1ml 1.50%（质量体积比）溶壁酶与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；杏鲍菇的菌丝体酶解液：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 % 溶壁酶与1.00% 蜗牛酶为混合酶解液；

所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合：分别将纯化后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照原生质体悬液体积比1:1混合，3000r/min离心10min弃上清，0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬沉淀后逐滴加入等体积30%（质量体积比）PEG6000与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min。

2.权利要求1所述白灵菇与杏鲍菇原生质体的融合方法，其特征在于它是按如下的步骤进行：

（1）白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备；

（2）原生质体的制备：白灵菇原生质体制备采用液体静置培养7d的菌丝体，以0.6 mol/L MgSO₄·7H₂O为渗透压稳定剂，在1.50%溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；杏鲍菇原生质体制备采用液体静置培养11d的菌丝体，以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，在2.00% 溶壁酶与1.00% 蜗牛酶混合酶液作用下酶解；

（3）原生质体纯化：将步骤（2）所述酶液过滤去除菌丝残片，6000r/min离心获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂重悬，再次6000r/min离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂调节浓度至10⁵个/ml：

（4）原生质体灭活标记：白灵菇原生质体采用55℃热灭活标记处理30min；杏鲍菇原生质体采用紫外灭活采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min标记处理；

（5）双亲原生质体融合：分别将纯化灭活后白灵菇与杏鲍菇原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至10⁵个/ml，按照悬液体积比1:1混合，3000r/min离心弃上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000（聚乙二醇）与50 mmol/L Ca²⁺混合溶液，28℃水浴融合30min；

（6）将步骤（4）处理好的原生质体悬液4000r/min离心15min，弃上清液；再用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂洗涤2次，去除PEG；

（7）融合株再生：将步骤（5）处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L蔗糖渗透压稳定剂稀释至10⁵个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7~15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。

3.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（1）所述的白灵菇与杏鲍菇菌丝体制备是指取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，分别接种于装有白灵菇和杏鲍菇液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，于25℃静置、暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到白灵菇与杏鲍菇新鲜的菌丝体。

4.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）所述酶解是以0.1g菌丝体（湿重）加入1ml酶解液比例进行酶解反应。

5.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）白灵菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间3h，杏鲍菇菌丝体原生质体酶解温度34℃，酶解时间2h。

6.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其特征在于步骤（4）取浓度10⁵个/ml的白灵菇原生质体5ml，采用55℃水浴热灭活处理30min；取10⁵个/ml的杏鲍菇原生质体5ml，采用15W紫外灯下10cm处垂直照射5min。

7.根据权利要求2所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其中步骤（7）所述的甘露醇再生培养基：葡萄糖2.00%、麦芽糖2.00 %、酵母粉0.35 %、蛋白胨0.20 %、KH₂PO₄ 0.30 %、MgSO₄·7H₂O 0.15 %，VB₁0.001 %，0.6 mol/L甘露醇，pH自然。

8.根据权利要求1所述白灵菇与杏鲍菇原生质体融合的方法，其中融合株综合验证，指的是采用颉颃实验、菌落表型、菌丝形态、出菇试验，并结合RAPD（随机扩增片段多态性）分子生物学标记的方法。

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