CN103266101A - 一种冬虫夏草与蛹虫草原生质体的融合方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种冬虫夏草和蛹虫草原生质体的融合方法，其特征是将冬虫夏草和蛹虫草菌丝细胞酶解制备原生质体，以冬虫夏草原生质体热灭活、以蛹虫草原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合，并通过菌落形态、颉颃试验、RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证获得融合株。本发明能有效地将冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合获得可为冬虫夏草的人工替代品的新菌株,为原生质体融合选育目的菌株提供了一种有效方法。
Description
技术领域
本发明属于食用菌生物技术育种领域，提供了一种冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合方法，获得兼具二者所长融合株，可作为冬虫夏草的人工替代品，该发明为两种性状互补明显的食用菌属内种间融合构建目标新菌株提供了一种有效方法。
背景技术
近年来，由于诸多因素，野生冬虫夏草的资源匮乏，产量急剧下降，其市场价格十分昂贵；又因受其特有生境等条件制约，人工培养具有一定的难度，目前仍未取得突破性的进展。鉴于冬虫夏草与蛹虫草的发生机制、营养需求相近又同为虫草属，通过冬虫夏草和蛹虫草原生质体的制备、再生、标记、融合和融合株鉴定融合的方法选育兼具冬虫夏草与蛹虫草二者优势融合株，可作为冬虫夏草的人工替代品，该发明为人类科学合理利用和开发冬虫夏草资源带来积极的影响。
中国专利：申请号201010523452.X公开了一种草菇和杏鲍菇原生质体融合，它主要是采用单灭活法标记原生质体，并通过0℃低温条件筛选融合株，本发明与其最大的区别是融合过程中采用双灭活原生质体标记法，并通过颉颃实验、菌落表型并结合RAPD多种验证融合株方法，更能准确、全面确定融合株的真实性。
目前食用菌育种多为人工诱变方法，由于诱变的不定向特点，用于解决上述问题的效果不佳，查阅资料国内外尚无冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合育种报道。
发明内容
本发明目的通过对冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合方法克服常规育种方式的不足，将冬虫夏草与蛹虫草原生质体成功融合融，获得兼有两亲本优良特性新菌株，可作为冬虫夏草的人工替代品，为实现人工栽培或走发酵工程途径提供菌种资源。
为实现上述目的，本发明公开了一种冬虫夏草与蛹虫草原生质体的融合方法，其特征在于它是将冬虫夏草与蛹虫草的菌丝体酶解制备原生质体，以冬虫夏草原生质体热灭活为标记，以蛹虫草原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学方法，将冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合，并通过综合验证获得融合株。
所述方法包括如下步骤：
（1）菌丝体酶解 取新鲜的冬虫夏草与蛹虫草菌丝体，以0.1g湿重加1ml酶液比例进行酶解法，其中冬虫夏草丝体原生质体酶解温度32℃酶解时间2小时，蛹虫草菌丝体原生质体酶解温度30℃酶解时间2小时，本发明所述的冬虫夏草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6 mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2% 溶壁酶（质量体积比）与1.00%蜗牛酶为混合酶解液酶解；蛹虫草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2.00%溶壁酶与1.00%纤维素酶混合酶液酶解；
（2）酶解液过滤 酶解完毕后，采用装有孔径10微米无菌滤网注射器过滤，去除菌丝残片， 6000转/分钟离心10分钟获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L KCl渗透压稳定剂重悬，再次6000转/分钟离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L KCl为渗透压稳定剂调节浓度至105个/ml。
（3）原生质体灭活 冬虫夏草原生质体热灭活标记采用60℃水浴处理30分钟；蛹虫草原生质体紫外灭活采用30W紫外灯下10cm处垂直照射13分钟；
（4）原生质体融合 分别将纯化灭活后冬虫夏草与蛹虫草原生质体悬浮于0.6mol/L 蔗糖渗透压稳定剂中，调节浓度至107个/ml，按照悬液体积比1:1混合，2000转/分钟离心弃上清，沉淀中逐滴加入 40% PEG6000与50 mmol/L Ca2+混合溶液，35℃水浴融合20分钟；
（5）融合后洗涤 处理好的原生质体悬液2000r/分钟离心10分钟，弃上清液；再用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂洗涤2次，尽可能去除PEG。
（6）融合株再生 将步骤（5）处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂稀释至105个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7～15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。
（7）融合株鉴定：通过对颉颃实验、菌落表型、并结合RAPD分子生物学标记对融合株进行多角度综合验证。
本发明所述的新鲜冬虫夏草菌丝体可以通过以下方法培养得到： 取PDA综合培养基上生长旺盛菌丝体前端，接种于装有其液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3～4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5～11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到冬虫夏草新鲜的菌丝体。
本发明所述的新鲜蛹虫草菌丝体可以通过以下方法培养得到：取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，接种于装有其液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3～4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5～11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到蛹虫草新鲜的菌丝体。
本发明所述的冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合菌株的形态特征及生长特性如下：
融合株均与冬虫夏草形态相似，菌丝体以接种点为中心，向四周“发散式”生长，菌丝之间联结致密，菌丝洁白；菌落边缘齐整，气生菌丝较多，菌丝生长速度介于冬虫夏草与蛹虫草之间。
下面是本发明公开的冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合后的验证方法及结果：
颉颃实验：无论正面还是背面，3菌株之间的对峙带明显清晰。在足够的养料供给和培养时间的前提下，3菌株在生长过程中分泌的代谢产物强烈抑制着对方的生长。虽然融合株与其双亲之间呈现程度不同的颉颃线，但反应强度要远远弱于双亲间的表现。从外观形态上初步证明了3者为不同种，因此可初步证明平板上方的菌落确为融合子再生所得。
菌落表型：将冬虫夏草、蛹虫草、融合株转分别接于PDA综合平板培养基，25℃暗培养，4d后观察菌落颉颃现象：冬虫夏草、融合子、蛹虫草的菌丝萌发时间分别为44h、52h、72h，亲本冬虫夏草的生长速率最快，蛹虫草最慢，融合子介于二者之间，偏近于亲本冬虫夏草。此外，从正面看，融合株的形状大小、颜色、长势均与亲本冬虫夏草相似，直至生长后期仍旧保持亮白无暇，菌丝体均匀分布的状态；而蛹虫草随着不断生长，颜色逐渐变为浅黄色，且由于受其他两菌株的代谢物制约，长势虚弱，菌落矮小。从背面看，上方的融合子与亲本冬虫夏草形态相似，都有明显的褶皱现象产生，且同为“四分五裂”状；而另一亲本蛹虫草褶皱现象并不明显。因此从形态观察可初步推测，融合株更多继承了冬虫夏草的优势基因，达到了融合育种目的，因此通过菌落表型可初步判断融合株有别于冬虫夏草与蛹虫草，三菌株之间有明显差异。
分子生物学标记：经过RAPD实验，有13种随机引物均能扩增出3菌株的基因组DNA，其中引物S25、S27、S30、S38的扩增效果最好，相对多态性更丰富，重复性更高，稳定性更好。这4个引物所扩增的DNA谱带不尽相同。其中有些谱带为3个菌株共有，而另一些谱带为某菌株独有或融合菌株与单个亲本所共有。比较电泳图谱发现，融合株既有与冬虫夏草同源片段，又有与蛹虫草相同片段，融合株与亲本间均存在同源序列。
本发明公开的冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明首次通过冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合筛选出新菌株，为选育两种性状互补的属内种间融合新菌株提供了一种有效的融合方法。
（2）该冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合育种有别于传统人工诱变育种，采用双灭活的标记方法，能有效提高融合选育目的新菌株的成功概率，该技术可重复性较强，且方式属于非转基因育种方式，更有利于食品质量安全。
附图说明：
图1冬虫夏草原生质体热灭活涂板后再生的结果（40℃, 50℃, 55℃, 60℃）；
图2 蛹虫草原生质体紫外灭活后涂板后再生的结果（0min、1min、2min、4min、8min、10min、13min）；
图3 再生培养基上再生的融合株菌落；
图4 融合株与双亲菌株颉颃反应图（上：融合子；左：冬虫夏草亲本；右：蛹虫草亲本）；
图5引物S25、S27、 S30、S38引物扩增的RAPD指纹图谱（CS：冬虫夏草；CM：蛹虫草；F：融合株）。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述，下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法；所使用额材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。特别加以说明的是：其中冬虫夏草、蛹虫草均由天津师范大学蕈菌研究所提供，对外均有售，冬虫夏草与蛹虫草具体信息可见相关食用菌杂志及专业资料介绍。
溶壁酶购于广东碧德生物科技有限公司；蜗牛酶购于北京鼎国生物技术有限责任公司；本发明所用到的原料除特别说明外均为分析纯，均可从市面试剂公司购买。
实施例1
（1）取PDA综合培养基上生长旺盛菌丝体前端，接种于装有冬虫夏草液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3～4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5～11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到冬虫夏草新鲜的菌丝体。
（2）取新鲜的冬虫夏草与蛹虫草菌丝体，以0.1g湿重加1ml酶液比例进行酶解法，其中冬虫夏草菌丝体原生质体酶解温度32℃，酶解时间2小时，蛹虫草菌丝体原生质体酶解温度30℃，酶解时间2小时，本发明所述的冬虫夏草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6 mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2% 溶壁酶（质量体积比）与1.00%蜗牛酶为混合酶解液酶解；蛹虫草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2.00%溶壁酶与1.00%纤维素酶混合酶液酶解；
（3） 酶解完毕后，采用装有孔径10微米无菌滤网注射器过滤，去除菌丝残片， 6000转/分钟离心10分钟获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L KCL渗透压稳定剂重悬，再次6000转/分钟离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂调节浓度至105个/ml。
（4）取5ml 105个/ml冬虫夏草原生质体采用60℃水浴处理30分钟；取5ml 105个/ml蛹虫草原生质体紫外灭活采用30W紫外灯下10cm处垂直照射13分钟；
（5）分别将纯化灭活后冬虫夏草与蛹虫草原生质体悬浮于0.6mol/L KCL渗透压稳定剂中，调节浓度至107个/ml，按照悬液体积比1:1混合，2000转/分钟离心弃上清，沉淀中逐滴加入 30% PEG6000与10ml 50 mmol/L Ca2+混合溶液，28℃水浴融合30分钟；
（6）将处理好的原生质体悬液2000r/分钟离心10分钟，弃上清液；再用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂洗涤2次，尽可能去除PEG。
（7）将融合处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂稀释至105个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在0.6mol/L甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7～15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。
（8）融合株鉴定：通过对颉颃实验、菌落表型、并结合RAPD分子生物学标记对融合株进行多角度综合验证。
所述的PDA综合培养基配方：马铃薯20.00%(浸提液)、棉籽皮20.00 %(浸提液)、葡萄糖2.00 %、KH2PO4 0.30 %、MgSO4·7H2O 0.15 %、VB1微量、琼脂1.60 %，先将马铃薯、棉籽皮加水煮沸30min过滤，滤液中再加入其它药品完全溶解后，121℃灭菌30min，pH自然。
所述的冬虫夏草液体培养基配方：葡萄糖0.75%，蔗糖1.25%，蛋白胨0.02%，酵母粉0.0625%，KH2PO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.0125%，VB1 0.0025% ，pH自然。
所述的蛹虫草液体培养基配方：葡萄糖0.30%、麦芽糖0.30%、蛋白胨0.2%、酵母粉0.25%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%，VB10.01%，pH自然。
所述的融合株再生培养基配方：所述的融合株再生培养基：葡萄糖0.75%、麦芽糖0.05 %、酵母粉0.0625 %、蛋白胨0.05 %、KH2PO4 0.025 %、MgSO4·7H2O 0.15 %，VB10.02 %，CaCl20.02%，0.6 mol/L甘露醇，琼脂0.8%，pH自然。
（9）结合附图对所出现的情况加以分析说明
实验结果如附图所示。附图1中，分别采用40℃, 50℃, 55℃, 60℃水浴处理10min，仅在60℃水浴中热处理10min，全部彻底灭活，因此60℃水浴10min作为亲本冬虫夏草原生质体的灭活条件；附图2中，距离30W的紫外灯10cm处，0min、1min、2min、4min、8min、10min、13min垂直照射，13min处理就能够使原生质体全部失活，因此确定紫外线照射13min作为蛹虫草原生质体的灭活条件；附图3中，将冬虫夏草、蛹虫草、融合株分别转接于PDA综合平板培养基，25℃暗培养，4d后观察菌落颉颃现象：从平板正面还是背面观察，融合株均与冬虫夏草形态相似，菌丝体以接种点为中心，向四周“发散式”生长，菌丝之间联结致密，菌丝洁白；菌落边缘齐整，气生菌丝较多。蛹虫草萌发较慢，长势相对较弱，气生菌丝丰富，初期菌体也呈白色，有别于其他两种，因此通过颉颃试验可初步判断融合株有别于冬虫夏草与蛹虫草；附图4无论正面还是背面，3菌株之间的对峙带明显清晰，外观形态上初步证明了3者为不同种，因此可初步证明平板上方的菌落确为融合子菌落。附图5中经过RAPD实验，有13种随机引物均能扩增出3菌株的基因组DNA，其中引物S25、S27、S30、S38的扩增效果最好，相对多态性更丰富，重复性更高，稳定性更好。这4个引物所扩增的DNA谱带不尽相同。其中有些谱带为3个菌株共有，而另一些谱带为某菌株独有或融合菌株与单个亲本所共有。比较电泳图谱发现，融合株既有与冬虫夏草同源片段，又有与蛹虫草相同片段，融合株与亲本间均存在同源序列。
Claims (8)
1.一种冬虫夏草和蛹虫草原生质体的融合方法，其特征在于将冬虫夏草和蛹虫草的菌丝体经酶解制备纯化后的原生质体，以冬虫夏草原生质体热灭活、以蛹虫草原生质体紫外灭活作为标记，采用PEG介导的化学融合方法，将冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合，并通过菌落形态、颉颃试验、RAPD（随机扩增片段多态性）综合验证得融合株；
所述的酶解液是冬虫夏草菌丝体酶解液：以0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂，配制1ml 2% 溶壁酶（质量体积比）与1.00%蜗牛酶为混合酶解液；蛹虫草的菌丝体酶解液：以0.6mol/L 蔗糖为渗透压稳定剂，配制1ml 2.00 %溶壁酶与1.0%纤维素酶为混合酶解液；
所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合：分别将纯化后冬虫夏草和蛹虫草原生质体悬浮于0.6mol/L KCl渗透压稳定剂中，调节浓度至105个/ml，按照原生质体悬液体积比1:1混合，3000转/分钟离心10分钟弃上清，0.6mol/L KCl渗透压稳定剂重悬沉淀后逐滴加入等体积30%（质量体积比）PEG6000与50 mmol/L Ca2+混合溶液，35℃水浴融合20分钟。
2.权利要求1所述的冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合方法，其特征在于它是按如下的步骤进行：
（1）冬虫夏草和蛹虫草菌丝体制备；
（2）原生质体的制备：冬虫夏草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6 mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2% 溶壁酶（质量体积比）与1.00%蜗牛酶为混合酶解液作用；蛹虫草原生质体制备采用液体静置培养3d的菌丝体，以0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂，在2.00%溶壁酶与1.00%纤维素酶混合酶液作用；
（3）原生质体纯化：将步骤（2）所述酶液过滤去除菌丝残片，6000转/分钟离心获得原生质体沉淀，再将原生质体沉淀经0.6mol/L KCL渗透压稳定剂重悬，再次6000转/分钟离心洗涤弃上清，分别用0.6mol/L KCL为渗透压稳定剂调节浓度至107个/ml：
（4）原生质体双灭活标记：冬虫夏草原生质体采用60℃热灭活标记处理10分钟；蛹虫草原生质体紫外灭活采用30W紫外灯下10cm处垂直照射13分钟标记处理；
（5）双亲原生质体融合：分别将纯化灭活后冬虫夏草和蛹虫草原生质体悬浮于0.6mol/L KCL渗透压稳定剂中，调节浓度至107个/ml，按照悬液体积比1:1混合，2000转/分钟离心弃上清，沉淀中逐滴加入 40% PEG6000（聚乙二醇）与50 mmol/L Ca2+混合溶液，35℃水浴融合20分钟；
（6）将步骤（4）处理好的原生质体悬液2000r/分钟离心10分钟，弃上清液；再用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂洗涤2次，尽可能去除PEG；
（7）融合株再生：将步骤（5）处理好的原生质体沉淀用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂稀释至105个/ml，然后取0.1ml稀释液涂布在甘露醇再生培养基上，25℃暗培养7~15d，定期观察菌落生长情况，待出现菌落时，及时挑出再生菌落转接备份及获得融合株。
3.根据权利要求2所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其特征在于步骤（1）所述的冬虫夏草和蛹虫草菌丝体制备是指取PDA综合培养基上生长旺盛的两亲本菌丝体前端，分别接种于装有冬虫夏草和蛹虫草液体培养基100mL三角瓶中，装瓶量为50mL，每瓶接3~4块0.5cm的菌块，25℃静置暗培养5~11 d；无菌条件下挑取菌丝体，无菌滤纸吸干水分，即得到冬虫夏草和蛹虫草新鲜的菌丝体。
4.根据权利要求2所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）所述酶解是以0.1g菌丝体（湿重）加入1ml酶解液比例进行酶解反应。
5.根据权利要求2所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其特征在于步骤（2）冬虫夏草菌丝体原生质体酶解温度32℃，酶解时间2小时，蛹虫草菌丝体原生质体酶解温度30℃，酶解时间2小时。
6.根据权利要求2所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其特征在于步骤（4）取浓度107个/ml的冬虫夏草原生质体5ml，采用60℃水浴热灭活处理10分钟；取107个/ml的蛹虫草原生质体5ml，采用30W紫外灯下10cm处垂直照射13分钟。
7.根据权利要求2所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其中步骤（7）所述的甘露醇再生培养基：葡萄糖0.75%、麦芽糖0.05 %、酵母粉0.0625 %、蛋白胨0.05 %、KH2PO4 0.025 %、MgSO4·7H2O 0.15 %，VB10.02 %，CaCl20.02%，0.6 mol/L甘露醇，琼脂0.8%，pH自然。
8.根据权利要求1所述冬虫夏草和蛹虫草原生质体融合的方法，其中融合株综合验证，指的是采用颉颃实验、菌落表型、并结合RAPD（随机扩增片段多态性）分子生物学标记的方法。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673780A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-06-03 | 天津市畜牧兽医研究所 | 一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法 |
| CN106834144A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-06-13 | 成都图径生物科技有限公司 | 冬虫夏草原生质体的制备方法 |
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| TWI819429B (zh) * | 2021-12-10 | 2023-10-21 | 賴孟煜 | 真菌融合株、其製造方法及含其之組成物 |
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2013
- 2013-04-18 CN CN2013101341530A patent/CN103266101A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张金霞: "《中国食用菌菌种学》", 31 October 2011 * |
| 郭成金 等: "冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合初探", 《食品科学》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673780A (zh) * | 2015-04-02 | 2015-06-03 | 天津市畜牧兽医研究所 | 一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法 |
| CN106834144A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-06-13 | 成都图径生物科技有限公司 | 冬虫夏草原生质体的制备方法 |
| CN108410854A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-08-17 | 福建师范大学 | 一种制备蛹虫草菌与羊肚菌融合菌株的方法 |
| CN108410854B (zh) * | 2018-03-21 | 2021-07-13 | 福建师范大学 | 一种制备蛹虫草菌与羊肚菌融合菌株的方法 |
| CN109943490A (zh) * | 2019-04-18 | 2019-06-28 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种广东虫草原生质体制备及复苏方法 |
| CN109943490B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-03-04 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 一种广东虫草原生质体制备及复苏方法 |
| TWI819429B (zh) * | 2021-12-10 | 2023-10-21 | 賴孟煜 | 真菌融合株、其製造方法及含其之組成物 |
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