CN112940949B - 一种哈茨木霉菌、培养方法、应用及复合生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株、培养方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)JNHC菌株，包括:保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14638。本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC对柑橘溃疡病有良好防效；对柑橘促生、促产效果良好；哈茨木霉(Trichodermaharzianum)JNHC菌剂与其他农药化肥配合力高，保护植物根系，提高肥料利用率。

Description

一种哈茨木霉菌、培养方法、应用及复合生物制剂
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株、培养方法、应用及复合生物制剂。
背景技术
柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodispv.citri)引起的一种国内外检疫性细菌病害，主要侵染芸香科柑橘属、枳属及金柑属植物，引起柑橘叶片、果实、枝干溃疡斑，导致树势生长衰弱，产量和品质下降，造成巨大的经济损失。
目前国内对柑橘溃疡病的防治主要以化学防治为主，众所周知，化学农药的长期大量使用往往会导致环境污染、农药残留及病原菌的抗药性等诸多问题难以解决。利用植物内生菌产生的抗菌活性物质进行植物病害的生物防治，则具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等优点。因此，柑橘产业现急需一种对柑橘溃疡病有良好防效的生物制剂。
发明内容
为了解决上述农业生产存在的技术问题及现有技术的不足，本发明提供了一种对柑橘溃疡病有良好防效的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株。
为达此目的，本发明采用以下技术方案。
在第一方面，本发明提供一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14638。
在第二方面，提供一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活化的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种到PDA液体培养基上，转速为100-140r/min的条件下，培养温度为25-30℃，培养时间为50-72h，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液接种至液体发酵培养基中，在25-30℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
(3)将步骤(2)制得发酵液按质量百分比20％-30％的比例接种于固体发酵培养基中，在25-30℃、空气湿度60％-90％的条件下，固体发酵72-96h，40℃以下烘干至含水量低于10％，粉碎，包装。
优选的，在步骤(1)前还包括将所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株进行活化的步骤：
将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种于PDA培养基平板上，于25-30℃，条件下培养3-6天，制得活化菌株。
优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基的各组分如下：
马铃薯12-15g，葡萄糖3-5g，磷酸氢二钾0.8-1.5g，氯化钠1.0-3.0g，水定容至1L，p H 4.5-5。
优选的，所述步骤(3)中固体发酵培养基按如下方法制备：
将麦麸30-50份、豆粕20-40份、稻壳10-30份、矿物质元素0.5-2份，加水直至混合物密度为3-7g/ml，调pH4.5-5，即得。
优选的，所述步骤(4)中，干燥先进行通风晾晒24-48h，然后在35-38℃条件下，干燥至水量低于10％。
在第三方面，提供一种所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株在防治柑橘溃疡病中的应用。
在第四方面，提供一种复合生物制剂，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂1-20份，复配物80-99份，均为重量份；
其中，所述复配物选自豆粕、可降解甲壳素和农家肥中的一种或多种。
在第五方面，所述复合生物制剂在防治柑橘溃疡病中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株对柑橘溃疡病有良好防效。
本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂对柑橘促生、改良品质和增产效果显著。
本发明通过正交实验，优化哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株的活化条件，最终确定活化温度为28℃，活化时间为5d的活化效果最好。优化哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株的发酵条件，最终确定在发酵温度28℃的条件下，转速120r/min，种子液培养时间64h，固体发酵时间85h，孢子存活量最多，孢子存活量达到1.0×108cfu/g。
本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂与其他农药化肥配合力高，具有与土壤有益微生物高度配合力，抑制作物的土传病害，尤其是柑橘溃疡病，同时促进土壤有益微生物生长，调整土壤生物结构，保护植物根系，提高肥料利用率。
本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂制备条件简单，易于工业化生产及保存，具有良好的开发应用前景。
保藏信息
本发明分离鉴定的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株，己于2017年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.14638。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC在培养基中的菌落特征示意图；
图2为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂田间实验图片
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1株枯草芽孢杆菌的来源及筛选
(1)根际细菌的分离纯化
土样为应用“三点采样法”采集自广西壮族自治区河池市环江毛南族自治县水源镇三才村的沃柑根际土，按照土壤微生物常规平板稀释法进行分离。称取根际土样品10g左右，放入装有100mL无菌水的玻璃容器中振荡30min，使其中的土壤颗粒分散均匀，静置5min后，取土壤悬液的上清液部分进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-3、10-4、10-5，将稀释液各取0.1mL涂布至PDA平板(土豆200g，葡萄糖20g，H2O 1L，琼脂20g，pH 7)，所有平板置于恒温培养箱中28℃培养24h，待平板表面长出菌落后，挑取菌落边缘幼嫩菌丝到PDA平板上反复纯化。从形成的单个分散的菌落上移植菌丝体于PDA斜面上冷冻保存待用。
(2)哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC的筛选
在PDA平板上活化土壤中筛选到的木霉菌，用5mm的打孔器在木霉菌平板上打成5mm的菌饼。用平板对峙法分别检测土壤中筛选到的木霉菌对沃柑溃疡病菌的拮抗效果，在PDA平板中心接种直径为5mm的木霉菌菌饼，沃柑溃疡病接种于距木霉菌菌饼3cm处，28℃恒温箱中培养5～6天，待各接种木霉菌的菌株长满整个培养皿时，测量各培养皿中木霉菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种细菌后的抑制生长半径)，用抑制率表示(抑制率(％)＝(对照生长量－处理生长量)/对照生长量×100％)，选出拮抗效果最明显的且沃柑溃疡病菌长势最弱的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株。
实施例2哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂的制备方法
(1)将活化的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种到PDA液体培养基上，转速为100～140r/min的条件下，培养温度为25-30℃，培养时间为50-72h，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液接种至液体发酵培养基中，在25-30℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
(3)将步骤(2)制得发酵液按质量百分比20％-30％的比例接种于固体发酵培养基中，在25-30℃、空气湿度60％-90％的条件下，固体发酵72-96h，40℃以下烘干至含水量低于10％，粉碎，包装。
在步骤(1)前还包括将所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株进行活化的步骤：
将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株接种于PDA培养基平板上，于25-30℃，条件下培养3-6天，制得活化菌株。
所述步骤(2)中的液体发酵培养基的各组分如下：
马铃薯12-15g，葡萄糖3-5g，磷酸氢二钾0.8-1.5g，氯化钠1.0-3.0g，水定容至1L，PH4.5-5。
所述步骤(3)中固体发酵培养基按如下方法制备：
将麦麸30-50份、豆粕20-40份、稻壳10-30份、矿物质元素0.5-2份，加水直至混合物密度为3-7g/ml，调pH4.5-5，即得。
所述步骤(4)中，干燥先进行通风晾晒24-48h，然后在35-38℃条件下，干燥至水量低于10％。
表1哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂的制备
Figure BDA0003038499600000061
本发明通过正交实验，优化哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株的活化条件，最终确定活化温度为28℃，活化时间为5d的活化效果最好。
本发明通过正交实验，优化哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株的发酵条件，最终确定在发酵温度28℃的条件下，转速120r/min，种子液培养时间64h，固体发酵时间85h，孢子存活量最多，孢子存活量达到1.5×108cfu/g。
实验例1哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂应用于沃柑
本试验共设2个处理，每个处理进行3次重复，每个重复随机选取15株沃柑，共设6个小区，各小区随机排列，总计90株沃柑。
处理1(对照组)：对沃柑施用清水50g/棵/次，间隔20d施用一次。
处理2(实验组)：对沃柑施用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂，哈茨木霉菌剂的用量50g/棵/次，间隔20d施用一次。
1、沃柑叶片中叶绿素含量
每个小区随机选取5株沃柑，每株分成上、中、下三个部位，每个部位随机摘取5片树叶，使用手持式叶绿素计(KONICA MINOLTA SPAD—502PIus)对每片树叶的3个不同位置进行测定，然后将测定结果求平均值，作为该片树叶的SPAD值，最后将全部摘取树叶的SPAD值求平均值，作为该棵沃柑树叶片中叶绿素含量。
表2木霉菌剂对沃柑叶片中叶绿素含量的影响
Figure BDA0003038499600000071
[注]不同小写字母表示差异达显著水平(P＜0.05)，下同。
使用清水处理后的沃柑叶片中叶绿素的含量在各小区之间差异不显著，使用木霉菌处理后的沃柑叶片中叶绿素的含量在各小区之间差异也不显著，但是两处理之间通过差异显著性分析，差异达显著性水平，并且使用木霉菌处理过的沃柑叶片中叶绿素的含量较清水处理增加5.36个百分点。
2、沃柑果实溃疡病发病率及防效
每个小区随机选取5株沃柑，每株沃柑分成上、中、下三个部位，每个部位随机观察10个果实，记录具有溃疡病病斑的果实，统计果实发病率，并按果实上沃柑溃疡病病斑个数进行分级，统计分析木霉菌对沃柑溃疡病的防治效果。
沃柑溃疡病分级标准：
0级：果实上无病斑；
1级：果实上有1—5个病斑；
2级：果实上有6—10个病斑；
3级：果实上有10个以上的病斑。
发病率(％)＝病果数/调查总果数×100
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100
病情指数(％)＝∑(病级叶数×该病级值)/(调查总叶数×最高级值)×100
表3木霉菌剂对沃柑果实溃疡病发病率的影响及防效
Figure BDA0003038499600000081
清水处理后的沃柑果实溃疡病平均发病率为10.44％，通过显著性分析，各小区之间差异不显著，木霉菌处理后的沃柑果实溃疡病平均发病率为3.11％；通过显著性分析，各小区之间差异不显著，但是两处理之间差异达显著性水平，且使用木霉菌处理后果实发病率降低7.33％；通过沃柑果实溃疡病分级标准，计算分析得，该株木霉菌对沃柑果实溃疡病的防治效果达75.92％。
3、沃柑果汁中可溶性固形物的含量
沃柑成熟后，在每个小区随机选取5个果实，榨汁，使用糖度分析仪(ATAGO PAL-1)测沃柑果汁中的可溶性固形物含量。
表4木霉菌剂对沃柑果汁中可溶性固形物的影响
Figure BDA0003038499600000091
清水处理后的沃柑果汁中平均可溶性固形物的含量为13.07％，木霉菌处理后的沃柑果汁中平均可溶性固形物的含量为14.65％，木霉菌处理后的沃柑果汁中可溶性固形物较清水处理提高12％。
4、沃柑单株产量
沃柑成熟后，在每个小区随机选取5株，将每株沃柑上收获到的所有果实进行称重、记录。
表5木霉菌剂对沃柑单株产量的影响
Figure BDA0003038499600000101
清水处理后的沃柑平均单株产量为28.84kg，木霉菌处理后的沃柑平均单株产量为33.24kg，木霉菌处理后的沃柑单株产量较清水处理增加15.26个百分点，且两处理之间通过显著性分析，差异达显著性水平；通过比较各处理之间小区的沃柑平均单株产量，清水处理和木霉菌处理在各小区内差异都不显著。
通过上述实验例可以看出：经过哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂处理的沃柑叶绿素含量显著提高，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC对沃柑溃疡病防治效果达75.92％，经过哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂处理的沃柑单株产量显著提高。因此，该哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌株对沃柑叶片黄化现象改良效果显著，表现在提高了叶片中叶绿素的含量，叶色更加浓绿，促进沃柑光合产物的积累，树势长势更加喜人，抗病性增强，并且该株木霉菌对沃柑溃疡病病原菌具有抑制作用，防控溃疡病病害的发生。该木霉菌菌株通过活动所产生的的代谢产物有利于增加沃柑果汁中可溶性固形物的含量，改良果实品质。树势长势良好，病害减少，有利于产量的增加。
实施例3
一种复合生物制剂，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂5份，豆粕95份，均为重量份。
实施例4
一种复合生物制剂，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂20份，可降解甲壳素80份，均为重量份。
实施例5
一种复合生物制剂，包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂1份，农家肥99份，均为重量份。
对比例
不包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂的普通农家肥。
处理1(对照组)：对沃柑施用对比例的复合农用制剂3kg/棵/次，间隔20d施用一次。
处理2(实验组)：对沃柑分别施用实施例3、实施例4、实施例5中的复合生物制剂，用量分别为3kg/棵/次，间隔20d施用一次。
表6木霉菌剂对沃柑单株产量的影响
Figure BDA0003038499600000111
对照组沃柑的单株产量为44.34kg/棵，实验组平均沃柑单株产量为51.58kg/棵，较对照组增加16.33％。其中实施例4中沃柑单株产量最多，为56.40kg/棵，本实施例产量增加最多，可能造成这一现象的原因是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)JNHC菌剂在本实施例中所占份额最多。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株在防治柑橘溃疡病中的应用，其特征在于，所述哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCCNO.14638。
2.一种哈茨木霉菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将活化的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株接种到PDA液体培养基上，转速为100-140r/min的条件下，培养温度为25-30℃，培养时间为50-72h，制得种子液, 其中, 所述哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年11月20日，保藏编号为CGMCC NO.14638；
（2）将步骤（1）制得的种子液接种至液体发酵培养基中，在25-30℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
（3）将步骤（2）制得发酵液按质量百分比20%-30%的比例接种于固体发酵培养基中，在25-30℃、空气湿度60%-90%的条件下，固体发酵72-96h， 40℃以下烘干至含水量低于10%，粉碎，包装。
3.如权利要求2所述哈茨木霉菌剂的制备方法，其特征在于，在步骤（1）前还包括将所述哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株进行活化的步骤：
将哈茨木霉（Trichoderma harzianum）JNHC菌株接种于PDA培养基平板上，于25-30℃，条件下培养3-6天，制得活化菌株。
4.如权利要求2所述哈茨木霉菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的液体发酵培养基的各组分如下：
马铃薯12-15g，葡萄糖3-5g，磷酸氢二钾0.8-1.5g，氯化钠1.0-3.0g，水定容至1L，pH4.5-5。
5.如权利要求2所述哈茨木霉菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中固体发酵培养基按如下方法制备：
将麦麸30-50份、豆粕20-40份、稻壳10-30份、矿物质元素0.5-2份，加水直至混合物密度为3-7g/ml，调pH 4.5-5，即得。
6.一种复合生物制剂，其特征在于，包括权利要求2-5任一项中制备的哈茨木霉菌剂1-20份，复配物80-99份，均为重量份；
其中，所述复配物选自豆粕、可降解甲壳素和农家肥中的一种或多种。
7.一种如权利要求6所述复合生物制剂在防治柑橘溃疡病中的应用。
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