CN111944699B - 一种角毛壳菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种角毛壳菌菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种角毛壳菌菌剂及其制备方法、应用以及用于培养角毛壳菌的培养基。所述制备方法通过种子液制备、菌丝及孢子制备、将含菌丝及孢子的固料基质制备成角毛壳菌的颗粒剂和微胶囊剂，所述角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21‑2‑20，保藏编号为CGMCC No.15394。所制备的角毛壳菌CH21‑2‑20菌剂可以高效防治植物真菌病，降低植物发病率。

Description

一种角毛壳菌菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物菌剂技术领域，具体涉及一种角毛壳菌菌剂及其制备方法、应用以及用于培养角毛壳菌的培养基。
背景技术
毛壳菌属(Chaetomium)真菌是土壤真菌中的一大类群，该类菌群腐生于植物残体、土壤、动物粪便和富含纤维素的材料。多种毛壳菌可抑制植物病原真菌生长和诱导植物产生抗病性，具有较好的生物防治价值，其生防机理涉及产生抗病原真菌或诱导植物产生抗病性的次生代谢产物、对病原微生物进行重寄生、分泌降解病原微生物细胞壁的酶和降解纤维素的酶等。
研究发现，毛壳菌属菌株，如金色毛壳菌(Chaetomium aureum)，螺卷毛壳菌(Chaetomium spirile)，半裸毛壳菌(Chaetomium seminudum)，巴西毛壳(Chaetomium.Brasiliense)，暗色毛壳(Chaetomium.Atrobrunneum)，角毛壳菌(Chaetomium cupreum)，三边毛壳菌(Chaetomium trilaterale)，球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)等，在拮抗植物病原真菌生长，预防和防治作物真菌病害方面，有很好的活性作用。
如球毛壳菌(Chaetomium globosum)，角毛壳菌(Chaetomium cupreum)可预防谷物秧苗的枯萎病、甘蔗猝倒病,降低由尖镰孢属(Fusarium oxysporum)等引起的番茄枯萎病、黑星菌(Venturia inaequalis)引起的苹果斑点病等的发病率，且对立枯病丝核菌(Rhizoctonia solani)、甘蓝格链孢属(Alternaria Nees)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、毛盘孢属(Colletortrichum sp.)、葡萄孢属(Colletortrichum sp.)以及交链孢属(Alternaria)病原菌的生长有较强的抑制作用。
因此，将有生物防治功能的毛壳菌菌株，制备成微生物菌剂农药，用于农作物的绿色植物保护，减少化学农药的用量，对于保证农产品安全和农业生产可持续发展，有重要价值。
发明内容
有鉴于此，发明人在不同的特殊生态环境中，如深山土壤、温泉口、南海海底淤泥等特殊环境采集样品、分离近百株毛壳菌属(Chaetomium)菌株，经过大量筛选研究，获得一株对植物真菌病原菌有很好抑制效果的角毛壳菌，通过对该角毛壳菌进行紫外线照射等诱变改良工作，获得孢子生孢率和萌发率大幅提高的改良菌株角毛壳菌(Chaetomiumcupreum)CH21-2-20，并完成了该菌作为微生物菌剂农药的研究开发工作，获得了本发明。
本发明的目的在于提供一种角毛壳菌菌剂及其制备方法(如图1所示)，所述菌剂具有抑制植物病原真菌生长、防治植物真菌病害的功能。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20，属于毛壳菌属(Chaetomium)，其已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.15394)。
所述包含上述方案的菌剂具有抑制植物病原真菌生长、防治植物真菌病害的功能。
所述角毛壳菌菌剂的制备方法为以下步骤：
1)种子液制备：采用液态发酵的工艺方法在种子培养基A中于25-27℃、150-200rpm三角瓶摇瓶振荡培养18h-30h再进行发酵罐培养；
2)菌丝及孢子制备：采用固态发酵的工艺方法在固料基质C中于温度25-27℃、湿度20％-50％、通无菌空气的密闭无菌环境中，培养20-30d；
3)制备菌剂：将步骤2)得到的含菌丝及孢子的固料基质C分散打碎成颗粒状加入填料和粘合剂制成颗粒菌剂或经高分子材料包裹，制成微胶囊菌剂。
进一步，步骤1)所述种子培养基A包括以下组分：以整体百分数计，淀粉0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.5％-6.0％、蛋白胨0.05％-2.0％、酵母粉0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.01％-0.5％、氯化钠0.01％-0.5％。
优选的，步骤1)所述种子培养基A包括以下组分：以整体百分数计，淀粉0.5％-3.0％、蔗糖\糖蜜0.2％-2.0％、葡萄糖0.6％-3.0％、蛋白胨0.1％-1.0％、酵母粉0.1％-0.5％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.05％-0.2％、氯化钠0.05％-0.2％。
进一步，步骤1)发酵罐培养的工艺参数是：发酵温度:25℃-27℃，搅拌转速：200-400rpm，罐压：0.045-0.048Mpa，溶解氧DO:10％-50％，发酵培养时间15h-35h。
某些实施例中，三角瓶(体积250mL-2.0L)N个，内装种子培养基A，装料量为三角瓶体积的10％-50％；于121℃灭菌30分钟，冷却到26℃，备用。液体培养基A的配方为：以整体百分数计，淀粉0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.5％-6.0％、蛋白胨0.05％-2.0％、酵母粉0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.01％-0.5％、氯化钠0.01％-0.5％。取角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20试管斜面菌种N支，向每支试管斜面中加入3mL无菌生理盐水，将斜面孢子轻轻刮下并充分搅动，使其分散均匀，然后1支试管斜面的孢子液转移至上述装有无菌种子培养基A的1个三角瓶中，于26℃、150-200rpm振荡培养18h-30h。
在全自动控制发酵罐(体积10.0L-1000.0L)中，内装种子培养基A，装料量为发酵罐体积的20％-40％；于121℃灭菌30分钟，培养基A冷却到26℃后，按照1％-20％的接种量，转接入上述三角瓶培养的角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20菌液，进行发酵培养。在发酵罐中进行发酵培养的工艺参数是：发酵温度:25℃-27℃，搅拌转速：200-400rpm，罐压：0.045-0.048Mpa，溶解氧DO:10％-50％，发酵培养时间15h-35h。
进一步，步骤2)所述固料基质C由料液比为1：0.5-4.0的固态基质与液体培养基B混合而成，所述液体培养基B包括以下组分：以整体百分数计，玉米淀粉0.1％-3.0％、乳糖0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.1％-6.0％、蛋白胨0.01％-3.0％、酵母粉0.01％-2.0％、花生饼粉或花生粉水解液0.01％-1.0％、大豆蛋白粉0.01％-1.0％、黄豆饼粉\发酵豆粕0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.001％-1.0％、硫酸镁0.001％-1.0％、氯化钠0.001％-1.0％。
优选的，所述液体培养基B由以下组分组成：以整体百分数计，玉米淀粉0.5％-2.0％、乳糖0.3％-3.0％、蔗糖\糖蜜0.5％-3.0％、葡萄糖0.5％-4.0％、蛋白胨0.1％-1.0％、酵母粉0.1％-1.0％、花生饼粉或花生粉水解液0.08％-0.5％、大豆蛋白粉0.05％-0.3％、黄豆饼粉\发酵豆粕0.05％-0.5％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.005％-0.5％、硫酸镁0.005％-0.05％、氯化钠0.005％-0.5％。进一步，所述固料基质C中的固态基质选自小麦麸皮、玉米芯、水稻秸秆、棉籽壳、花生壳、谷糠壳、木屑中的一种或两种以重量比0-5.0:0-5.0混合。
某些实施例中，采用天然纤维固体材料为固态发酵基质。所用的天然纤维固体材料，如小麦麸皮、玉米芯、水稻秸秆、棉籽壳、花生壳、谷糠壳、木屑等，其中的一种，或二种材料按照0-5.0:0-5.0比例混合，经过粉碎、过筛，制备成直径为50-200目的颗粒状固态基质。
按照固态基质：液体培养基B为1：0.5-4.0，优选为1：1.0-2.0的料液比，在固态基质中加入液体培养基B，充分搅拌混合均匀后，成为固料基质C，装入高度为5-10厘米浅盘中，装料量为浅盘体积的1/10-1/2，优选为1/5-1/3；并在盘中均匀铺平。该浅盘可以是不锈钢盘，也可以是陶瓷盘、玻璃盘等耐高温、无毒材料制成的盘。液体培养基B的配方为：以整体百分数计，玉米淀粉0.1％-3.0％、乳糖0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.1％-6.0％、蛋白胨0.01％-3.0％、酵母粉0.01％-2.0％、花生饼粉或花生粉水解液0.01％-1.0％、大豆蛋白粉0.01％-1.0％、黄豆饼粉\发酵豆粕0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.001％-1.0％、硫酸镁0.001％-1.0％、氯化钠0.001％-1.0％。
将装好固料基质C的浅盘，盖上盖子，于大型高压灭菌锅中，121℃灭菌30-60min；固料基质C在无菌环境中冷却至25℃-27℃。将在发酵罐中培养至对数生长期的种子液，按照5％-10％的接种量，均匀喷施接种于浅盘固料基质C中，于温度25℃-27℃、湿度20％-50％、通无菌空气的密闭无菌环境中，培养20-30天，直到浅盘固料基质C中长满菌丝和成熟孢子。
浅盘固料基质C中孢子的生长情况，可以用血球计数板和平板菌落计数法分别统计单位发酵基质产孢量(个/g)和孢子活力(萌发率)(％)。
孢子计数方法：对固料基质C取样，样品置于烧杯中，再加入一定量的生理盐水，充分搅动混匀后用三层无菌擦镜纸过滤，除去固料基质，得到孢子悬液，取1mL孢子悬液进行适度稀释后，然后用血球计数板法计量孢子数(个/mL)，重复3次，取平均值，最后换算成单位基质的产孢量。计算公式(25×16规格血球计数板)：每毫升孢子悬液的孢子数(个/mL)＝(K×N×400×104)/80
单位发酵基质的产孢量(个/g)＝(每毫升孢子悬液的孢子数(个/mL)×孢子悬液总体积mL)/初始基质重量(g)。(K为稀释倍数；N为5个中格计数的孢子数)
孢子萌发率检测：根据血球计数板法所得孢子数进行梯度稀释，使稀释后溶液中孢子浓度范围为30-50个/100uL，然后吸取100uL孢子悬液，均匀涂布于装有15-20mL PDA培养基的培养皿中，每个梯度3次重复，在26℃恒温培养箱中培养，记录孢子萌发所形成的菌落个数，孢子萌发率为菌落个数与稀释后溶液中每100uL中孢子数的比值。孢子萌发率＝菌落个数/每100uL孢子悬液中孢子数×100％。
进一步，所述菌剂可以制备成颗粒剂或微胶囊剂。
某些实施例中，将培养好的长满菌丝和成熟孢子固料基质C分散打碎成50-200目的颗粒状，加入适宜的填料，如炉渣、沙子、粘土等，可适当加入必要的黏合剂，如琼脂、黄原胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠CMC等混合搅拌，制成颗粒状制剂。通常情况，该颗粒剂含10％～20％的固料基质C(含菌丝和成熟孢子)、75％～89％的载体和1％～5％的黏合剂。
某些实施例中，将培养好的长满菌丝和成熟孢子固料基质C分散打碎成50-200目的颗粒状，经高分子材料包裹，从而制成微胶囊制剂。所采用的高分子材料，一般是海藻酸盐、玉米粉、壳聚糖、几丁质、琼脂、羧甲基纤维素钠、阿拉伯树胶、明胶等。通常情况，长满菌丝和成熟孢子的固料基质C分散颗粒与高分子材料的用量比例在1:6范围内。微胶囊剂能延缓菌丝和孢子的生理活动，延长菌剂储存时间，优化菌体的微环境；同时能显著提高菌剂的防效，提高菌剂对阳光的抗性，可避免不良环境对孢子萌发的影响等。
本发明还提供了所述制备的角毛壳菌菌剂在防治植物病原真菌病害的农药中的应用。所述制备的角毛壳菌菌剂，可以有效防治番茄灰霉病、马铃薯晚疫病、辣椒炭疽病、西瓜枯萎病、白菜腐霉病、黄瓜灰霉病、番茄枯萎病、苹果斑点病等植物真菌病害。
本发明的目的还在于提供二种用于培养角毛壳菌的培养基和固态基质，所述培养基包括种子培养基A、液体培养基B，种子培养基A以整体百分数计，淀粉0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.5％-6.0％、蛋白胨0.05％-2.0％、酵母粉0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.01％-0.5％、氯化钠0.01％-0.5％；
液体培养基B：以整体百分数计，玉米淀粉0.1％-3.0％、乳糖0.1％-4.0％、蔗糖\糖蜜0.1％-5.0％、葡萄糖0.1％-6.0％、蛋白胨0.01％-3.0％、酵母粉0.01％-2.0％、花生饼粉或花生粉水解液0.01％-1.0％、大豆蛋白粉0.01％-1.0％、黄豆饼粉\发酵豆粕0.01％-1.0％、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.001％-1.0％、硫酸镁0.001％-1.0％、氯化钠0.001％-1.0％；
所述固态基质选自小麦麸皮、玉米芯、水稻秸秆、棉籽壳、花生壳、谷糠壳、木屑中的一种或两种以重量比0-5.0:0-5.0混合。
进一步，所述角毛壳菌的保藏编号为CGMCC No.15394。
本发明的有益效果在于：本发明所提供的制备的角毛壳菌菌剂可以明显防治植物真菌病，降低植物发病率。
附图说明
图1角毛壳菌菌剂制备流程图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1制备角毛壳菌微胶囊剂
三角瓶(体积1.0L)7个，内装种子培养基A(以整体百分数计，淀粉2.5％，蔗糖2.0％，葡萄糖3.0％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，磷酸氢二钾0.06％，氯化钠0.05％)，装料量为三角瓶体积的30％；于121℃灭菌30分钟，冷却到26℃，备用。
取角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20试管斜面菌种7支，向每支试管斜面中加入3mL无菌生理盐水，将斜面孢子轻轻刮下并充分搅动，使其分散均匀，然后分别转移至上述装有无菌种子培养基A的三角瓶中，1支试管斜面菌孢子液转移1个三角瓶；接种后的三角瓶于26℃、150rpm振荡培养28h。
在全自动控制发酵罐50.0L中，内装上述种子培养基A，装料量为发酵罐体积的40％；于121℃灭菌30分钟，种子培养基A冷却到26℃后，按照10％的接种量，转接入上述三角瓶培养的角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20菌液，进行发酵培养。在发酵罐中进行发酵培养的工艺参数是：发酵温度:25℃-27℃，搅拌转速：200-400rpm，罐压：0.045-0.048Mpa，溶解氧DO:30％-50％，发酵培养时间25h。
采用天然纤维固体材料为固态发酵制备菌丝及孢子的基质。所用的天然纤维固体材料为小麦麸皮和花生壳，二种材料按照0.1:5.0比例混合，经过粉碎、过筛，制备成直径为50-200目的颗粒状固态基质。
按照固态基质：液体培养基B为1：1.5的料液比，在固态基质中加入液体培养基B(以整体百分数计，玉米淀粉1.5％，乳糖0.3％，蔗糖1.0％，葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，酵母粉0.1％，花生饼粉0.2％，大豆蛋白粉0.05％，黄豆饼粉0.05％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.02％，氯化钠0.05％)，充分搅拌混合均匀后，成为固料基质C，装入高度为9厘米不锈钢浅盘中，装料量为浅盘体积的1/3；并在盘中均匀铺平。
将装好固料基质C的浅盘，盖上盖子，于大型高压灭菌锅中，121℃灭菌60min；固料基质C在无菌环境中冷却至25℃-27℃。将在发酵罐中培养至对数生长期的种子液，按照6％的接种量，均匀喷施接种于浅盘固料基质C中，于温度25℃-27℃、湿度20％-50％、通无菌空气的密闭无菌环境中，培养26天，直到浅盘固料基质C中长满菌丝和成熟孢子。
该方法浅盘固料基质C中，单位发酵基质产孢量3.0X 105个/g以上，孢子活力(萌发率)70％以上。
将培养好的长满菌丝和成熟孢子固料基质C分散打碎成50-200目的颗粒状(后简称JC)，以海藻酸钠(后简称SA)为包埋剂，CaCl2溶液为固化剂，制备成微胶囊剂。在洁净的环境下，以JC和SA的体积比为1:6混合，用注射器将JC和SA混合液注入6％的CaCl2溶液中固化成型。将成型的小球滤出，清水洗涤，28℃热风吹干，即得角毛壳菌CH21-2-20微胶囊剂。
实施例2制备角毛壳菌微胶囊剂
三角瓶(体积1.0L)10个，内装种子培养基A(以整体百分数计，淀粉2.0％，蔗糖2.0％，葡萄糖3.0％，蛋白胨0.8％，酵母粉0.3％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.05％)装料量为三角瓶体积的30％；于121℃灭菌30分钟，冷却到26℃，备用。
取角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20试管斜面菌种10支，向每支试管斜面中加入3mL无菌生理盐水，将斜面孢子轻轻刮下并充分搅动，使其分散均匀，然后分别转移至上述装有无菌种子培养基A的三角瓶中，1支试管斜面菌孢子液转移1个三角瓶；接种后的三角瓶于26℃、180rpm振荡培养26h。
在全自动控制发酵罐(体积100.0L)中，内装上述种子培养基A，装料量为发酵罐体积的30％；于121℃灭菌30分钟，培养基A冷却到26℃后，按照10％的接种量，转接入上述三角瓶培养的角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20菌液，进行发酵培养。在发酵罐中进行发酵培养的工艺参数是：发酵温度:25℃-27℃，搅拌转速：200-400rpm，罐压：0.045-0.048Mpa，溶解氧DO:10％-50％，发酵培养时间32h。
采用天然纤维固体材料为固态发酵制备菌丝及孢子的基质。所用的天然纤维固体材料为花生壳和木屑，二种材料按照5.0:0.2比例混合，经过粉碎、过筛，制备成直径为50-200目的颗粒状固态基质。
按照固态基质：液体培养基B为1：2的料液比，在固态基质中加入液体培养基B(以整体百分数计，玉米淀粉2.0％，乳糖0.4％，蔗糖1.0％，葡萄糖3.0％，蛋白胨0.6％，酵母粉0.1％，花生粉水解液0.3％，大豆蛋白粉0.1％，黄豆饼粉0.05％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.03％，氯化钠0.05％)，充分搅拌混合均匀后，成为固料基质C，装入高度为10厘米不锈钢盘浅盘中，装料量为浅盘体积的1/4，并在盘中均匀铺平。
将装好固料基质C的浅盘，盖上盖子，于大型高压灭菌锅中，121℃灭菌50min；固料基质C在无菌环境中冷却至25℃-27℃。将在发酵罐中培养至对数生长期的种子液，按照5％的接种量，均匀喷施接种于浅盘固料基质C中，于温度25℃-27℃、湿度20％-50％、通无菌空气的密闭无菌环境中，培养30天，直到浅盘固料基质C中长满菌丝和成熟孢子。
该方法浅盘固料基质C中，单位发酵基质产孢量5.0X 105个/g以上，孢子活力(萌发率)76％以上。
将培养好的长满菌丝和成熟孢子固料基质C分散打碎成100-200目的颗粒状(后简称JC)，以海藻酸钠(后简称SA)为包埋剂，CaCl2的溶液为固化剂，制备成微胶囊剂。在洁净的环境下，以JC和SA的体积比为1:6混合，用注射器将JC和SA混合液注入6％的CaCl2溶液中固化成型。将成型的小球滤出，清水洗涤，28℃热风吹干，即得角毛壳菌CH21-2-20微胶囊剂。
实施例3制备角毛壳菌颗粒剂
三角瓶(体积500mL)20个，内装种子培养基A(以整体百分数计，淀粉2.5％，蔗糖1.5％，葡萄糖2.0％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.2％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.05％)，装料量为三角瓶体积的20％；于121℃灭菌30分钟，冷却到26℃，备用。
取角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20试管斜面菌种20支，向每支试管斜面中加入3mL无菌生理盐水，将斜面孢子轻轻刮下并充分搅动，使其分散均匀，然后分别转移至上述装有无菌种子培养基A的三角瓶中，1支试管斜面菌孢子液转移1个三角瓶；接种后的三角瓶于26℃、200rpm振荡培养26h。
在全自动控制发酵罐(体积100.0L)中，内装上述种子培养基A，装料量为发酵罐体积的40％；于121℃灭菌30分钟，培养基A冷却到26℃后，按照5％的接种量，转接入上述三角瓶培养的角毛壳菌(Chaetomium cupreum)CH21-2-20菌液，进行发酵培养。在发酵罐中进行发酵培养的工艺参数是：发酵温度:25℃-27℃，搅拌转速：200-400rpm，罐压：0.045-0.048Mpa，溶解氧DO:10％-50％，发酵培养时间35h。
采用天然纤维固体材料为固态发酵制备菌丝及孢子的基质。所用的天然纤维固体材料为小麦麸皮和花生壳，二种材料按照0.1:5.0比例混合，经过粉碎、过筛，制备成直径为50-200目的颗粒状固态基质。
按照固态基质：液体培养基B为1：1.5的料液比，在固态基质中加入液体培养基B(以整体百分数计，玉米淀粉1.5％，乳糖0.4％，糖蜜2.0％，葡萄糖2.0％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，花生饼粉0.1％，大豆蛋白粉0.2％，黄豆饼粉0.06％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％)，充分搅拌混合均匀后，成为固料基质C，装入高度为10厘米不锈钢盘浅盘中，装料量为浅盘体积的1/3，并在盘中均匀铺平。
将装好固料基质C的浅盘，盖上盖子，于大型高压灭菌锅中，121℃灭菌60min；固料基质C在无菌环境中冷却至25℃-27℃。将在发酵罐中培养至对数生长期的种子液，按照8％的接种量，均匀喷施接种于浅盘固料基质C中，于温度25℃-27℃、湿度20％-50％、通无菌空气的密闭无菌环境中，培养30天，直到浅盘固料基质C中长满菌丝和成熟孢子。
该方法浅盘固料基质C中，单位发酵基质产孢量1.0X 106个/g，孢子活力(萌发率)70％以上。
将培养好的长满菌丝和成熟孢子固料基质C分散打碎成50-200目的颗粒状，以20％固料基质C颗粒状，55％粘土，20％沙粒，5％羧甲基纤维素钠CMC等混合搅拌，制成的颗粒状制剂。
实施例4角毛壳菌CH21-2-20微胶囊剂防治蔬菜真菌病害
将角毛壳菌CH21-2-20微胶囊剂，分散施撒在田间土壤表面至土壤5厘米深处，防治植物真菌病，发病率比对照药剂处理分别降低41.5％，37.1％，26.2％，54.5％，48.9％，47.1％，如表1所示。
表1
Figure BDA0002602856910000121
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.角毛壳菌（Chaetomium cupreum ）的菌剂的制备方法，其特征在于，所述角毛壳菌（Chaetomium cupreum）CH21-2-20，保藏编号为CGMCC No.15394，所述制备方法为以下步骤：
1）种子液制备
将角毛壳菌采用液态发酵的工艺方法在种子培养基A中于25-27℃、150-200 rpm三角瓶摇瓶振荡培养18h-30h再进行发酵罐培养；
2）菌丝及孢子制备
采用固态发酵的工艺方法在固料基质C中于温度25-27℃、湿度20%-50%、通无菌空气的密闭无菌环境中，将角毛壳菌培养20-30d；
3）制备菌剂
将步骤2）得到的含菌丝及孢子的固料基质C分散打碎成颗粒状加入填料和粘合剂制成颗粒菌剂或经高分子材料包裹，制成微胶囊菌剂；
所述种子培养基A包括以下组分：以整体百分数计，淀粉0.1%-4.0%、蔗糖\糖蜜0.1%-5.0%、葡萄糖0.5%-6.0%、蛋白胨0.05%-2.0%、酵母粉0.01%-1.0%、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.01%-0.5%、氯化钠0.01%-0.5%；
所述固料基质C由料液比为1：0.5-4.0的固态基质与液体培养基B混合而成，所述液体培养基B包括以下组分：以整体百分数计，玉米淀粉0.1%-3.0%、乳糖0.1%-4.0%、蔗糖\糖蜜0.1%-5.0%、葡萄糖0.1%-6.0%、蛋白胨0.01%-3.0%、酵母粉0.01%-2.0%、花生饼粉或花生粉水解液0.01%-1.0%、大豆蛋白粉0.01%-1.0%、黄豆饼粉\发酵豆粕0.01%-1.0%、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.001%-1.0%、硫酸镁0.001%-1.0%、氯化钠0.001%-1.0%。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）发酵罐培养的工艺参数是：发酵温度: 25℃-27℃， 搅拌转速：200-400rpm， 罐压：0.045-0.048 Mpa，溶解氧 DO: 10%-50%，发酵培养时间15h-35h。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述固料基质C中的固态基质选自小麦麸皮、玉米芯、水稻秸秆、棉籽壳、花生壳、谷糠壳、木屑中的一种或两种以重量比0-5.0 :0-5.0混合。
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的菌剂。
5.权利要求1中所述的角毛壳菌CH21-2-20和/或权利要求4所述的菌剂在制备抑制植物病原真菌生长的农药中的应用；所述角毛壳菌CH21-2-20的保藏编号为CGMCC No.15394。
6.用于培养角毛壳菌（Chaetomium cupreum）CH21-2-20的培养基，包括种子培养基A、液体培养基B和固态基质，其特征在于，所述种子培养基A包括以下组分：以整体百分数计，淀粉0.1%-4.0%、蔗糖\糖蜜0.1%-5.0%、葡萄糖0.5%-6.0%、蛋白胨0.05%-2.0%、酵母粉0.01%-1.0%、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.01%-0.5%、氯化钠0.01%-0.5%；
所述液体培养基B包括以下组分：以整体百分数计，玉米淀粉0.1%-3.0%、乳糖0.1%-4.0%、蔗糖\糖蜜0.1%-5.0%、葡萄糖0.1%-6.0%、蛋白胨0.01%-3.0%、酵母粉0.01%-2.0%、花生饼粉或花生粉水解液0.01%-1.0%、大豆蛋白粉0.01%-1.0%、黄豆饼粉\发酵豆粕0.01%-1.0%、磷酸氢二钾\磷酸二氢钾0.001%-1.0%、硫酸镁0.001%-1.0%、氯化钠0.001%-1.0%；
所述固态基质选自小麦麸皮、玉米芯、水稻秸秆、棉籽壳、花生壳、谷糠壳、木屑中的一种或两种以重量比0-5.0 :0-5.0混合；所述角毛壳菌（Chaetomium cupreum）CH21-2-20的保藏编号为CGMCC No.15394。
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