CN113079951A

CN113079951A - 一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法

Info

Publication number: CN113079951A
Application number: CN202110567439.2A
Authority: CN
Inventors: 刘盛荣; 吴小环; 游飞燕; 郑世仲; 魏奇; 黄千慧; 张维瑞
Original assignee: Ningde Normal University
Current assignee: Ningde Normal University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113079951B

Abstract

本发明公开了一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法。其是利用含有前适应性底物的SSM液体培养基进行菌种母液的摇瓶培养或注入食用菌液体菌种罐中进行培养，并在培养至最后1 d时通过降低摇床转速或通气量，以利菌丝与前适应性底物接触、吸附和对其利用，提高所得液体菌种适应不同栽培基质配制的培养料的能力。按本发明方法生产的液体菌种菌丝球数量多，并具有宽基质适应性，能快速适应不同栽培基质配制的培养料，其菌丝萌发快、定植快，可缩短栽培周期，减少杂菌污染，且制备的液体菌种低温保藏20 d以上仍能保持优良特性，保藏期长，适用于木腐生、草腐生担子菌食用菌及部分子囊菌，具有极大的推广应用前景。

Description

一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法

技术领域

本发明属于食用菌及生物工程领域，具体涉及一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其适用于木腐生、草腐生担子菌食用菌及部分子囊菌。

背景技术

食用菌是一类重要的农业经济真菌，自故以来为人们提供了大量、重要的食物来源，与人类福祉密切相关，我国人民一直有食用食用菌的传统。我国食用菌产业经过四十多年的快速发展，已成为世界上食用菌栽培种类、栽培面积最多的国家，年产量占全球总产量的70%以上，是名符其实的食用菌生产大国，同时也是食用菌消费大国。目前，我国食用菌产值在农业中仅次于粮、油、果、菜，居第5位，已成为我国现代农业中重要的组成部分，且产业仍不断快速发展，发展前景广阔。

当前，我国食用菌栽培模式正由传统的家庭作坊式操作、季节性生产，逐渐向设施化、工厂化、周年化、规模化生产转变，工厂化栽培模式企业越来越多。食用菌栽培主要采用固体菌种和液体菌种。固体菌种具有生产设备投资小、技术相对简单、场地环境要求较低等优点，但制种周期长、菌龄不一致、接种不方便、定量接种困难、吃料慢、出菇同步性差等制约了其应用。液体菌种是利用液体培养基和深层发酵技术生产的含有大量活性菌丝体的接种物，优势明显，如生产周期短、生产不受季节限制、自动化程度高、菌龄一致、接种效率高、成本低、易分散、流动性好、吃料快、出菇同步性等。目前，金针菇、杏鲍菇等食用菌品种的工厂化栽培在我国大多采用液体菌种。

食用菌作为一种丝状真菌，其天然栖息地为固体基质。利用液体深层发酵技术制备的食用菌液体菌种，其菌丝生理状态（如酶系、活力）与采用固态发酵法生产的固体菌种有明显差异，其接种至固体栽培基质时菌丝需重新适应一个完全不同于液体培养的生长环境，易发生接种后菌丝萌发慢、吃料慢、甚至不吃料等现象，成为重大栽培风险，这是利用液体菌种进行食用菌工厂化栽培面临的巨大挑战，因此，生产上所用液体菌种菌丝应具有良好的适应液体生长环境向固体生长环境转变的能力。

另外一方面，由于大多数食用菌拥有降解木质素、纤维素及半纤维素的完整酶系，因而栽培上主要利用农业、林业、食品工业所产生的各种废弃物，如木屑、棉籽壳、各种秸秆、甘庶渣、玉米芯等为栽培料，实现转废为宝。食用菌栽培原料主要根据当地资源禀赋、原料成本、栽培食用菌种类等进行选择。不同地区、不同生产企业所采用的培养料，其主要栽培基质以及配方上差异较大，且菌包制作工艺也不尽相同，使得培养料的持水能力、空隙度、颗粒大小、通气性、酸碱度、营养成分、抑制性物质种类及含量等有极大差异，这些差异影响液体菌种菌丝萌发、定植与生长，因此，生产中使用的液体菌种应能够适应不同主要栽培基质配制的培养料，避免菌丝不吃料或吃料慢等现象的发生，提高栽培的可靠性。

综上所述，开发和制备宽基质适应性食用菌液体菌种是食用菌栽培中液体菌种应用的关键，其可使菌丝快速适应生长环境的剧烈变化，并具有在不同主要栽培基质配制的培养料上快速萌发及生长的能力，从根本上提高液体菌种在栽培应用中的可靠性，有利于促进液体菌种在食用菌工厂化栽培中的推广。

目前的报道显示，食用菌液体菌种生产主要聚焦于培养基筛选、培养条件优化、液体菌种保藏等不同方面，但迄今为止，相关专利及文献未见以提高菌丝从液体生长环境向固体生长环境转变的适应能力，或提高液体菌种适应不同栽培基质为主要成分配制的培养料的能力。本发明采用在液体培养基中添加前适应性底物，以及培养后期降低培养液混合效率的方法制备具有宽基质适应能力的液体菌种，有效解决液体菌种吃料慢甚至不吃料等现象，有利于减少杂菌污染、缩短菌丝吃料时间，促进液体菌种在食用菌工厂化栽培中的应用，提高经济效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其可有效避免现有菌丝因适应性差别大而导致的不生长或生长慢等问题，使所得液体菌种能快速适应不同栽培基质配制的培养料，且其具有较长的保藏期，具有极大的推广应用前景。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其包括如下步骤：

1）利用蔗糖、杏鲍菇菌渣水提取物、豆粕、多种维生素矿物质片为原料配制SSM液体培养基，并在其中加入杏鲍菇菌渣精粉与柑橘皮粉末混合制成的前适应性底物；

2）培养：

a. 摇瓶培养（适用于小规模试验应用）：将含有前适应性底物的SSM液体培养基于三角瓶中进行分装，然后于121℃灭菌20 min，待冷却后按5vol%-10vol%的接种量接入菌种母液，25-30℃、150 r/min条件下培养3-7 d，培养至最后1 d时将转速调低至120 r/min，以利菌丝与前适应性底物接触、吸附及菌丝对其利用，提高菌丝从液体生长环境向固体生长环境转变的能力，并增强菌丝适应不同栽培基质配制的培养料的能力；

b. 食用菌液体菌种罐制备（工厂化栽培应用）：将含有前适应性底物的SSM液体培养基注入食用菌液体菌种罐中，121℃灭菌30 min，待冷却后按5vol%-10vol%的接种量接入菌种母液，在通气量为1 vvm、温度为25-30℃的条件下培养3-5 d，培养至最后1 d时调低通气量至0.5 vvm，以利菌丝与前适应性底物接触、吸附及菌丝对其利用，提高菌丝从液体生长环境向固体生长环境转变的能力，并增强菌丝适应不同栽培基质配制的培养料的能力；

3）将制备好的液体菌种直接用于栽培，或于4-10℃、相对湿度60-70%的暗环境中保存备用。

步骤1）中所述杏鲍菇菌渣水提取物是将杏鲍菇菌渣烘干后与水按重量比1:20混合，加热至沸后保持提取30 min，然后过滤，离心后取上清；

所述前适应性底物中杏鲍菇菌渣精粉与柑橘皮粉末的重量比为6:1；

其中，所述杏鲍菇菌渣精粉是将新鲜杏鲍菇菌渣于60℃烘干至恒重，再粉碎过60目筛制得；

所述柑橘皮粉末是将烘干的柑橘皮粉碎过60目筛制得。

所述杏鲍菇菌渣是按重量百分数，将木屑40%、棉籽壳35%、麸皮18%、玉米粉5%、石膏2%混合作为栽培料用于杏鲍菇栽培后剩余的菌渣。

步骤2）所述含有前适应性底物的SSM液体培养基中各物质的用量为：蔗糖20 g/L、杏鲍菇菌渣水提取物50 g/L、豆粕5 g/L、多种维生素矿物质片1片/L、前适应性底物0.7g/L。

新鲜或保藏后的液体菌种利用接种枪接入栽培包或栽培瓶后转移至养菌房，在温度25℃、相对湿度60-70%的条件下避光走菌；待菌丝吃料完全后转入出菇房，给予低温、光照、高湿度等管理措施，刺激和诱导子实体形成。

本发明的有益效果是：

1）本发明采用蔗糖、豆粕、杏鲍菇菌渣等常见农副产品为液体菌种生产的主要培养基成分，其易于获得，降低了液体菌种的生产成本；

2）本发明所用SSM液体培养基中各主要营养成分含量在满足菌丝生长对营养要求的条件下控制在较低水平，有利于培养基灭菌彻底，降低潜在污染风险；

3）本发明在所用液体培养基中添加杏鲍菇菌渣精粉与柑橘皮粉末粉末混合制成的前适应性底物，可使生产的液体菌种具有良好的适应不同主要栽培基质配制的培养料的能力；

4）本发明所用前适应性底物均为粉末状颗粒，有利于培养过程中菌丝吸附，形成大量小颗粒菌丝球，接种时有利于形成大量菌丝萌发点；

5）本发明所用前适应性底物中的柑橘皮粉末有一定抑制杂菌的能力；

6）菌丝吸附于前适应性底物颗粒上，保藏时有利于避免低温对菌丝的伤害，保持菌丝活性和延长保藏期，使保藏期达20 d以上（传统液体菌种保藏期仅约10 d）。

具体实施方式

下面实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。

按重量百分数（干重），将木屑40%、棉籽壳35%、麸皮18%、玉米粉5%、石膏2%混合作为栽培料，将其用于杏鲍菇栽培并经采收后，取剩余的杏鲍菇菌渣备用。

将杏鲍菇菌渣烘干后与水按重量比1:20混合，加热至沸后保持提取30 min，然后过滤，离心后取上清，得杏鲍菇菌渣水提取物。

将新鲜杏鲍菇菌渣于60℃烘干至恒重，再粉碎过60目筛制得鲍菇菌渣精粉。

将烘干的柑橘皮粉碎过60目筛制得柑橘皮粉末。

所用多种维生素矿物质片中每片含：维生素B₁ 3.8 mg，B₂ 2.8 mg，B₆ 4.8 mg，B₁₂3.7μg，铁7.8 mg，锌10 mg，钾20 mg，淀粉200 mg，微晶纤维素1200 mg。

实施例1 金针菇宽基质适应性液体菌种制备以及对不同主要栽培基质制备培养料的适应性测试

1. 含有前适应性底物的SSM液体培养基的配制：按蔗糖20 g/L、杏鲍菇菌渣水提取物50 g/L、豆粕5 g/L、多种维生素矿物质片1片/L配成SSM培养基，并加入杏鲍菇菌渣精粉0.6 g/L、柑橘皮粉末0.1 g/L，制成含有前适应性底物的SSM液体培养基；

2. 将含有前适应性底物的SSM液体培养基分装至250 mL三角瓶中，每瓶装量100mL，121℃灭菌20 min；

3. 待培养基冷却后，按10vol%的接种量接入菌种母液，在25℃条件下，前3 d摇床转速为150 r/min，最后1 d（第4 d）将转速调低为120 r/min；

4. 培养好的液体菌种中含有菌丝球数量达到134个/mL；而采用常规方法（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150 r/min）所制备的液体菌种仅含约70个/mL菌丝球；

5. 不同主要栽培基质的适应性测试

利用移液器将液体菌种接入添加有以不同主要栽培基质配制的培养料的玻璃填料管（25mm×200mm）中（培养料成分见表1所示），装料量为湿重35 g (含水量65%)，接种量按每管1 mL。以常规方法制备的液体菌种（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150 r/min）作为对照。接种后25℃恒温箱培养，记录菌丝生长速度。

表1 不同培养料成分组成（干重百分比）及生长速度

从表1中可以看出，以木屑（配方1）、棉籽壳（配方2）、甘蔗渣（配方3）为主要栽培基质的3个不同配方中，前底物适应性法制备的液体种均比传统液体种接种后的生长速度更快。

实施例2 宽基质适应性杏鲍菇液体菌种的制备及栽培应用

1. 含有前适应性底物的SSM液体培养基的配制方法同实施例1；

2．采用100 L食用菌液体菌种罐，121℃空消30 min；然后加入70 L含有前适应性底物的SSM液体培养基，121℃灭菌30 min；

3. 待培养基冷却后于无菌条件下接入3500 mL菌种母液，在25℃条件下，前3 d通气量为1 vvm，最后1 d (第4 d) 通气量调至0.5 vvm；

4. 液体菌种栽培应用

灭菌过的接种管及接种枪与菌种罐的液体菌种使用接口连接，接种室内将液体菌种喷射接入栽培包，每包接入15 mL；栽培包中栽培料的配方为（干重比），木屑74%、麸皮20%、玉米粉5%、石膏1%，装料量湿重1000 g/包。

栽培包接种后转入养菌房，25℃避光、相对湿度65%的环境条件下培养。结果显示，吃料时间为34-36 d，而采用常规方法制备的液体菌种（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150 r/min）的吃料时间为37-38 d，证明前底物适应性方法制备的菌丝定植及吃料较快，缩短生产周期约2-3 d；菌包吃料完全及后熟期5 d后转入出菇房，给予低温、光照、湿度刺激，诱导子实体形成，其产量比常规方法制备的液体菌种提高约5%。

实施例3 秀珍菇宽基质适应性液体菌种的制备及不同培养料的适应能力测试

1. 含有前适应性底物的SSM液体培养基的配制方法同实施例1；

2. 装瓶及灭菌同实施例1；

3. 待培养基冷却后，按10vol%的接种量接入秀珍菇菌种母液，25℃条件下，前3 d摇床转速为150 r/min，最后1 d（第4 d）将转速调低为120 rev/min；

4. 培养好的液体菌种中含菌丝球数量达到124个/mL，且可直接用于秀珍菇栽培或保藏于4-8℃（可保藏20 d以上）；而采用常规方法（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150 r/min）制备的液体菌种仅含58个/mL菌丝球；

5. 液体菌种不同培养料适应能力测试

在超净工作台上将1 mL液体菌种接种至添加有以不同栽培基质配制的培养料的玻璃填料管 (25 mm×200 mm)中（培养料成分见表2所示），装料量湿重35 g（含水量65%）。以常规方法制备的液体菌种（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150r/min）作为对照。接种后的管放置于恒温培养箱25℃培养，记录菌丝生长速度。

表2 不同培养料的成分组成（干重百分比）及其接种液体种的生长速度

结果表明，前底物适应性方法制备的液体菌种以及传统液体菌种在以不同主要栽培基质组成的培养料中均能快速萌发，生长速度快。如表2所示，在5种不同配方中菌丝平均生长速度范围为0.62 cm-0.93 cm/d，采用传统液体种的菌丝平均生长速度为0.55 cm-0.76 cm/d，低于制备的前底物适应性液体菌种，差异具有统计显著意义（P<0.01）。

实施例4 宽基质适应性草菇（草腐生担子菌食用菌）液体菌种的制备及不同栽培基质的评价

1. 含有前适应性底物的SSM液体培养基的配制方法同实施例1；

3. 待培养基冷却后，在无菌条件下按10vol%的接种量接入草菇菌种母液，在25℃条件下，前3 d摇床转速为150 r/min，最后一天（第4 d）将转速调低为120 r/min；

4. 液体菌种在不同主要栽培基质配制的培养料的适应性测试

在超净工作台上将1 mL液体菌种接种至添加有以不同栽培基质配制的培养料的玻璃填料管 (25 mm×200 mm)中（培养料成分见表3所示），装料量湿重35 g（含水量65%）。以常规方法制备的液体菌种（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150r/min）作为对照。接种后的管放置于恒温培养箱25℃培养，记录菌丝生长速度。

表3 不同培养料的成分组成（干重百分比）及其接种液体种的生长速度

结果显示，前底物适应性方法制备的液体菌种在不同主要栽培基质组成的配方中均能快速萌发，生长速度快。如表3所示，6种配方中菌丝平均生长速度范围为0.94cm-1.12cm/d，而采用传统液体种的菌丝平均生长速度范围为0.78 cm-0.92 cm/d，差异具统计学显著性（P<0.01）。

对比例1 宽基质适应性蛹虫草（子囊菌）液体菌种的制备及保藏评价

1. 按蔗糖20 g/L、杏鲍菇菌渣水提取物50 g/L、蚕蛹粉5 g/L、多种维生素矿物质片1片/L配成培养基，并添加0.6 g/L杏鲍菇菌渣精粉、柑橘皮粉末0.1 g/L；

2. 装瓶与灭菌同实施例4；

3. 待培养基冷却后按5vol%的接种量接入液体菌种，在25℃条件下，前2 d转速为150 r/min，最后1 d（第3 d）将转速调低为120 r/min；

4. 将培养好液体菌种保藏于4℃，于不同保藏时间取出用于栽培评价；液体菌种的栽培评价方法为：采用400 mL组培瓶，加入20 g大米+35 mL营养液 (20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨)组成的培养基，灭菌冷却后每瓶接入不同保藏期的5 mL液体菌种，接种后于25℃、相对湿度60-70%条件下避光培养，吃料转色后给予低温、光照、高湿度刺激，诱导子实体形成。记录采用不同保藏期的液体菌种以及采用常规方法（采用相同培养基，但未添加前适应底物且摇床恒转速为150 r/min）制备的液体菌种进行栽培的原基形成时间及鲜草重。

表4 宽基质适应性液体菌种与常规液体菌种在不同保藏时期的出草时间及产量

由表4可以看出，前底物适应性液体种在保藏20 d后，仍能正常出草，与新鲜种相比产量仅略有下降，而传统液体种在保藏后的10 d后就不能萌发生长。

对比例2 金针菇宽基质适应性液体菌种在不同培养料中的生长测试

1. 含有前适应性底物的SSM液体培养基的配制方法同实施例1；

3. 待培养基冷却后于无菌条件下接入3500 mL菌种母液，在25℃条件下，前3 d通气量为1 vvm，最后1 d (第4 d) 通气量调至0.5 vvm，并以培养期间（4 d）采用恒通气量1vvm为对照；

4. 液体菌种在不同培养料的适应能力测试

在超净工作台上将1 mL液体菌种接种至添加有以不同栽培基质配制的培养料的玻璃填料管 (25 mm×200 mm)中（培养料成分见表5所示），装料量湿重35 g（含水量65%）。接种后的管放置于恒温培养箱25℃培养，记录菌丝生长速度。

表5 不同培养料的成分组成（干重百分比）及其接种液体种的生长速度

由表5可以看出，液体菌种培养过程中采用二阶段通气速度制备的液体菌种，其在不同培养料中的生长速度高于采用恒通气速度的液体菌种，差异具有统计学显著性（P<0.01）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2）摇瓶培养：将含有前适应性底物的SSM液体培养基进行分装，然后于121℃灭菌20min，待冷却后按5vol%-10vol%的接种量接入菌种母液，25-30℃、150 r/min条件下培养3-7d，培养至最后1 d时将转速调低至120 r/min；

3）将制备好的液体菌种直接用于栽培或于4-10℃、相对湿度60-70%的暗环境中保存备用。

2.一种宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2）食用菌液体菌种罐制备：将含有前适应性底物的SSM液体培养基注入食用菌液体菌种罐中，121℃灭菌30 min，待冷却后按5vol%-10vol%的接种量接入菌种母液，在通气量为1vvm、温度为25-30℃的条件下培养3-5 d，培养至最后1 d时调低通气量至0.5 vvm；

3. 根据权利要求1或2所述的宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述杏鲍菇菌渣水提取物是将杏鲍菇菌渣烘干后与水按重量比1:20混合，加热至沸后保持提取30 min，然后过滤，离心后取上清；

所述柑橘皮粉末是将烘干的柑橘皮粉碎过60目筛制得。

4.根据权利要求3所述的宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于：所述杏鲍菇菌渣是按重量百分数，将木屑40%、棉籽壳35%、麸皮18%、玉米粉5%、石膏2%混合作为栽培料用于杏鲍菇栽培后剩余的菌渣。

5. 根据权利要求1或2所述的宽基质适应性食用菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤2）所述含有前适应性底物的SSM液体培养基中各物质的用量为：蔗糖20 g/L、杏鲍菇菌渣水提取物50 g/L、豆粕5 g/L、多种维生素矿物质片1片/L、前适应性底物0.7g/L。