CN102409035A

CN102409035A - 一种水中缓释微生态菌剂的制备及其应用

Info

Publication number: CN102409035A
Application number: CN2011101162527A
Authority: CN
Inventors: 窦文芳; 张旦旦; 史劲松; 许正宏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2012-04-11

Abstract

本发明提供的是一种水中缓释的微生态菌剂，为枯草芽孢杆菌微胶囊制品，主要应用于水产养殖以及环境水体净化。它是以2.0％枯草芽孢杆菌芽孢为芯材，以0.8％明胶和1.5％海藻酸钠为复合壁材，以10％氯化钙为固化剂，采用锐孔凝固法制得微胶囊，包埋率达87％以上，微胶囊直径为3～5mm。本发明产品应用于水产养殖，可起到净化水体、抑制病原菌的作用，使用周期达60天以上。

Description

一种水中缓释微生态菌剂的制备及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和微生态制剂领域。

技术背景

枯草芽孢杆菌是一种成熟的微生态制剂，将其应用于水产养殖，能起到净化养殖水体，降低水产养殖的发病率，提高存活率等有益效果。目前市场上的枯草芽孢杆菌制剂均为其芽孢干粉，使用前必须先行活化，由于该菌株为好氧菌，浓度过高繁殖过快将迅速降低水中溶解氧，影响水产动物的生存，因此，投料浓度有一定的限制，且使用周期较短，在7～15天之间。本发明将提供一种在水中缓释的枯草芽孢杆菌微生态制剂，解决其投料浓度较低，使用周期较短的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效净化养殖水体、降低水产动物的发病率的水中缓释的微生态菌剂及其制备方法。

本发明制剂的制备方法：

1、枯草芽孢杆菌的制备

1.1培养基

斜面培养基(g/L)：营养琼脂20，pH7.0-7.2

种子培养基(g/L)：牛肉膏12，氯化钠5，MnSO₄0.5，pH7.0-7.2。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80～100，豆饼粉10～15，玉米淀粉5～7，(NH)₂SO₄4，K₂HPO₄8，CaCl₂2，pH7.0-7.2。

1.2培养条件

斜面培养：37℃恒温培养48h。

种子培养：从试管斜面接种一环至种子培养基，200rpm，37℃摇床培养16h。

发酵培养：将种子液以3～5％的接种量接种至发酵培养基，5L发酵罐，500rpm，37℃培养40～48h。

1.3枯草芽孢杆菌芽孢的收集

取发酵培养液，10000rpm离心5min收集芽孢，80℃鼓风干燥4h，得到芽孢粉末。

2、微胶囊的制备方法

2.1微胶囊评估指数

包埋率(encapsulated efficiency，EE)＝(投入的芽孢总量-溶液中未包埋的芽孢量)/投入的芽孢总量×100％

载菌量(Bacteria loading，BL)＝微胶囊中芽孢总量/微胶囊总质量×100％

评估指数(evaluating indicator，EI)＝(EE+BL)/2

2.2微胶囊的制备

将0.8g的明胶和1.5g的海藻酸钠混合后融于100ml蒸馏水，投入2％芽孢干粉充分混匀，通过2mm的锐孔，边搅拌边挤压滴入10％的氯化钙固化液，形成直径为3～5mm的微胶囊，其芽孢包埋率达到87％以上。

3、本发明制剂的应用效果

将本发明产品应用于河虾养值，其投料周期为60天，水体pH控制7.0～7.5之间，氨氮含量低于0.4mg/L，溶解氧高于3.0mg/L，河虾存活率为99％以上。起到了有效净化水体和降低发病率的作用。

附图说明：

图1海藻酸钠质量浓度对微胶囊的影响

图2明胶质量浓度对微胶囊的影响

图3CaCl₂质量浓度对微胶囊的影响

图4芽孢质量浓度对微胶囊的影响

具体实施方式

实施例1：枯草芽孢杆菌芽孢的富集培养

本发明所使用的枯草芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.3871，保藏日期2010年5月24日。将该菌从保存的斜面转接于新鲜斜面，于37℃恒温培养48h。从斜面接种一环至50ml种子培养基，37℃、200rpm摇床震荡培养16h。5L发酵罐中装入3L发酵培养基，以5％的接种量接入种子液，500rpm，37℃培养48h得到芽孢发酵液。将发酵液于10000rpm离心5min收集芽孢，80℃鼓风干燥4h，得到芽孢粉末作为微胶囊芯材。

实施例2：枯草芽孢杆菌微胶囊的制备

以明胶和海藻酸钠作为混合壁材，以枯草芽孢杆菌芽孢干粉作为芯材，以氯化钙作为固化液，采用锐孔凝固法制备微胶囊。研究了各个成分对微胶囊物理性能的影响。

1、海藻酸钠质量浓度对微胶囊制备的影响

保持明胶浓度为0.6％，CaCl₂浓度为10％，芯材芽孢浓度为2％，采用不同浓度的海藻酸钠制备微胶囊结果如图1：海藻酸钠浓度小于1.5％时，微胶囊的载菌量和包埋率与海藻酸钠浓度成正比，之后成反比。这可能是由于海藻酸钠质量浓度太低时，明胶-海藻酸钠聚电解质膜过薄，形成的微球机械强度低，不能有效地对芯材进行包埋；而海藻酸钠质量浓度过高时，体系黏度大，包埋效果不佳。海藻酸钠最佳添加浓度为1.5％。

2、明胶质量浓度对微胶囊制备的影响

保持海藻酸钠浓度为1.5％，CaCl₂浓度为10％，芯材芽孢浓度为2％，采用不同浓度的明胶制备微胶囊结果如图2：明胶添加浓度在0.8％时，微胶囊的载菌量和包埋率都达到最佳效果。

3、CaCl₂质量浓度对微胶囊制备的影响

保持海藻酸钠浓度为1.5％，保持明胶浓度为0.8％，芯材芽孢浓度为2％，采用不同浓度的CaCl₂固化液制备微胶囊结果如图3：微胶囊的评估指数与CaCl₂添加量成正比，当CaCl₂质量浓度达到10％时，微胶囊的载菌量和包埋率均达到最佳效果，继续添加CaCl₂不能明显增加微胶囊的评估指数。

4、芯材芽孢质量浓度的确定

根据上诉实验结果，保持海藻酸钠浓度为1.5％，保持明胶浓度为0.8％，CaCl₂浓度为10％不变，研究枯草芽孢杆菌的最佳添加量，结果如图4：微胶囊的载菌量随着芽孢浓度的增加而增加，而包埋率随着浓度的增加而降低，当芽孢浓度为2.0％时，两者效果之和最佳，评估指数达到最高值。

5、不同pH条件下微胶囊的缓释作用

将枯草芽孢杆菌微胶囊置于不同pH值得缓冲体系中，24h后测胶囊内剩余芽孢量，计算其释放速率，结果见表1：低pH值下，微胶囊壳体的海藻酸钙缓慢溶解，从而增加微胶囊的通透性，芯材枯草芽孢杆菌向水体的渗透速率增加。水体pH值下降是养殖水体水质下降的表现之一，本发明利用这一特性，使微胶囊的释放速率随水质下降而增加，从而有效的调控水体质量。

表1微胶囊缓释速率及使用周期

水体pH	芽孢释放速率(％/天)	使用周期(天)
			6.0	5.3	19
6.5	3.8	27
			7.0	2.6	39
7.5	1.9	53
			8.0	1.2	84
8.5	0.7	143

芽孢释放速率＝(1-24h后胶囊内剩余芽孢量/胶囊内芽孢总量)×100％

使用周期＝1/芽孢释放速率，小数点后入一位取整

实施例3：枯草芽孢杆菌微胶囊制剂的应用效果

在1M²的河虾养殖试验池中，研究了本发明产品在水产养殖中的应用效果。实验设置对照组(不添加)和试验组(添加50g微胶囊菌剂)，接种2.0～2.5cm的幼虾，每天喂食相同的人工饲料，研究结果如下：试验组水体pH值维持在7.0～7.5之间，氨氮含量低于0.4mg/L，溶解氧高于3.0mg/L，与枯草芽孢杆菌菌群数处于一个动态平衡的过程，60天河虾存活率在99％以上；而空白组水体pH至在29天时达到6.2，之后河虾生长缓慢，水体氨氮含量达到1.1mg/L，溶解氧降至1.3mg/L，60天河虾存活率仅为53％。以上结果表明：项目产品具有较强的水体净化功能，能有效降低水产动物的致病率，在水产养殖领域具有较好的发展潜力。

Claims

1.一种微生态缓释菌剂，其特征是：枯草芽孢杆菌微胶囊制品。

2.如权利要求1所述的微胶囊制品，其制备方法为：以2.0％枯草芽孢杆菌芽孢为芯材，以0.8％明胶和1.5％海藻酸钠为复合壁材，以10％氯化钙为固化剂，采用锐孔凝固法制得微胶囊/微球，包埋率达87％以上，直径为3～5mm。

3.如权利要求1所述的微生态制剂，其作用效果为：有效净化水体，降低水体氨氮含量，提高水体溶解氧，降低养殖动物的发病率。