CN116949031A - 一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，将4%海藻酸钠、2%明胶加入30 ml水中混合成为包埋剂，加入15ml枯草芽孢杆菌菌液，混合均匀用蠕动泵滴入到氯化钙溶液中进行交联，静置后制得秸秆高效腐解菌剂共体；将制得的菌剂共体洗净，干燥后，放置在混有秸秆的土壤中，对秸秆进行降解，本发明对载体材料的传质性能、降解性能以及释放条件进行优化，本发明的菌剂共体在秸秆降解的应用中可有效提高降解效率，且无毒害、成本低、可持续释放微生物、自身有良好的降解性。
Description
技术领域
本发明属于农业秸秆降解技术领域，特别涉及秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用。
背景技术
随着农业的快速发展和作物产量的提高，农作物秸秆总产量呈稳步缓慢上升趋势。秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等有机物质，是一种富含养分的优质农业资源。
秸秆还田是平衡土壤碳流失和补充土壤有机质的重要途径，是资源化利用最主要的方式。秸秆还田后，在土壤微生物的作用下可被分解转化为腐殖质秸秆的主要支持组织是木质纤维素，是微生物降解的主要对象。
然而，其纤维素、半纤维素和木质素结构致密，抗分解能力强，导致自然条件下还田秸秆降解缓慢，耕作困难，不利于后继作物生长，温室气体排放增加。
有研究表明，秸秆还田使稻田CH4排放增加110.7%，旱地N2O排放增加8.3%。因此，秸秆降解缓慢带来的负面影响成为秸秆还田大规模应用的主要限制之一，需要外加菌剂加速秸秆的降解，开发有前景的技术来促进作物秸秆的降解至关重要。
目前常见的微生物菌剂多为液体或固体粉末，施入土壤后不仅受到阳光、温度、水分等非生物因素的强烈影响，还由于与本地微生物群的竞争而难以维持活性，使微生物在环境中拓植困难，难以在土壤中稳定繁殖、发挥功效，因此对秸秆的降解效率不高。
因此，提供一种可缓慢释放、容易降解的菌剂共体，提高秸秆的降解效率是十分有意义的。
中国专利CN114686469A公开涉及一种固定化菌藻微球，所述微球中含有枯草芽孢杆菌、微藻、载体和交联剂；所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.12317；所述载体为海藻酸钠和明胶，所述交联剂为氯化钙溶液。该菌藻微球可以快速、高效去除环境中的磺胺类抗生素，公开海藻酸钠、明胶包埋枯草芽孢杆菌和氯化钙制作共体的方案，但是现有技术保护应用是去除环境中的磺胺类抗生素，而本申请保护的是菌剂共体应用于秸秆腐解。
中国专利CN102409035A提供的是一种水中缓释的微生态菌剂，为枯草芽孢杆菌微胶囊制品，主要应用于水产养殖以及环境水体净化，以2.0％枯草芽孢杆菌芽孢为芯材，以0.8％明胶和1.5％海藻酸钠为复合壁材，以10％氯化钙为固化剂，采用锐孔凝固法制得微胶囊，包埋率达87％以上，微胶囊直径为3～5mm。本发明产品应用于水产养殖，可起到净化水体、抑制病原菌的作用，使用周期达60天以上，公开海藻酸钠、明胶包埋枯草芽孢杆菌和氯化钙制作共体的方案，但是现有技术保护应用是净化水体、抑制病原菌的作用，而本申请保护的是菌剂共体应用于秸秆腐解。
发明内容
解决的技术问题：本申请主要是提出一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，解决现有技术中存在的自然条件下还田秸秆降解缓慢，耕作困难，不利于后继作物生长，传统菌剂易受环境影响，难以在土壤中稳定繁殖、发挥功效因此对秸秆的降解效率不高；传统菌液菌剂施入土壤后不仅受到阳光、温度、水分等非生物因素的强烈影响，还由于直接与本地微生物群的竞争而难以维持活性，使微生物在环境中拓植困难，难以在土壤中稳定繁殖、发挥功效等技术问题，构造载体，使得菌剂内微生物活性得到保护，并优化菌剂共体制备条件，使其拥有好的释放效果，尽可能的发挥其功效，最终提高对秸秆的降解效率。
技术方案
一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，将海藻酸钠与明胶混合制成包埋剂，将包含菌种的菌液加入包埋剂中；通过蠕动泵滴入氯化钙溶液中进行交联，静置后得到秸秆高效腐解菌剂共体；将秸秆混入土壤中，将制得的秸秆高效腐解菌剂共体洗净，干燥后，放置在混有秸秆的土壤中，对秸秆进行降解。
作为本发明的一种优选技术方案：所述秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，具体方法包括如下步骤：
S1，菌液制备：
S11，菌种复活以及传代培养：吸取0.5 mL 液体培养基打入200微升菌液冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀制得菌悬液；吸取 0.2 mL 菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板，培养24 h后进行传代，传代3次，第4代菌种利用甘油法储存在-80℃超低温冰箱中；
S12：将冷藏在冰箱中的第4代菌种放在常温环境中复苏，待菌体与室温一致，吸取0.1 ml菌液涂布在固体培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h；然后将培养后的菌种转接种到三角瓶液体培养基中，加入玻璃珠，在180 r/min，30℃恒温震荡培养48 h，取出菌液，置于4℃的冰箱冷藏；
S2，共体制备：
S21: 按照质量浓度配比，将3-6%海藻酸钠、1-3%明胶加入30 ml水中，在磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，所述加热搅拌温度为80℃，转速为1500 r/min，使其溶解，然后放入高压灭菌锅中121℃灭菌20 min制得包埋剂; ;取CaCl2加入到60 mL的无菌去离子水中，搅拌，溶解，制得1-4%的CaCl2溶液，然后用高压灭菌锅灭菌在121℃温度下灭菌20 min备用；
S22：将灭菌后的包埋剂放入超净工作台，待冷却至室温，加入15ml菌液，用酒精灯加热灭菌过的玻璃棒搅拌均匀得包埋剂和菌液混合液；
S23：使用蠕动泵，口径为4.8 mm的软管，转速为90r/min,吸取包埋剂和菌液混合液滴入到交联剂1-4%的CaCl2溶液中，交联0.5-3h，取出后，用无菌去离子水清洗三遍；放在40℃烘箱烘干，装入灭菌过的离心管，置于4℃的冰箱中备用，制得秸秆高效腐解菌剂共体；
S3：将制得的菌剂共体洗净，干燥后，放置在混有秸秆的土壤中，对秸秆进行降解。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S11和S12中液体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得。
作为本发明的一种优选技术方案：菌液中的菌种为枯草芽孢杆菌、白腐真菌或里氏木霉。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S11中菌种与液体培养基的用量比为200微升菌种冻干粉：0.5毫升液体培养基。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S11中传代做法为在开启30 min以上的超净工作台中，点燃酒精灯，用左手拿S11中培养24 h后的平板，靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红 30 秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过 3 次；左手在酒精灯旁将平板开启一个小口，满足接种环的进入即可，将接种环伸入管内先在平板上部靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，盖上平板；将接种棒伸入事先准备好的装在10 ml试管中的灭菌蒸馏水中，搅拌至接种环无残留制得菌悬液，然后将菌悬液混合均匀，移液枪分别抽取100微升菌悬液加入新鲜制得的固体培养基中，涂布平板法后将两个平板放入培养箱中培养24 h。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S12中固体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂20g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S3中秸秆降解选取480 mL培养瓶，土壤250g，加秸秆2 g，再添加0.2g秸秆高效腐解菌剂共体后混合均匀，控制田间含水率20-80%条件下进行降解即可。
作为本发明的一种优选技术方案：田间含水率60%条件下进行降解。
作为本发明的一种优选技术方案：所述S21中海藻酸钠浓度为4%，明胶浓度为2%，CaCl2溶液浓度为2%。
原理解释：秸秆中主要成分是纤维素，半纤维素，木质素，还包括少量的脂肪，粗蛋白，碳水化合物等容易降解的物质；海藻酸钠-明胶混合材料包埋，改善单一海藻酸钠降解慢、释放通道较少的问题；当海藻酸钠和明胶混合胶体滴落在交联剂CaCl2中，海藻酸钠与CaCl2快速反应形成胶球；使用海藻酸纳和明胶包埋枯草芽孢杆菌形成菌剂共体，通过土壤实验，研究菌剂共体微生物的释放特性和包埋材料的降解特征；用海藻酸纳和明胶包埋枯草芽孢杆菌、里氏木霉、白腐菌，制得木质纤维素降解菌剂共体；该菌剂载体传质性能佳，缓释效果好，可持续作用时间长于液体菌剂，对秸秆木质纤维素降解效率高。
有益效果：本申请所述秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、菌剂共体相比于传统液体菌剂能提高微生物活性，延长微生物释放，从而提高降解效率，在同样的灭菌土壤中，不同田间含水率情况下菌剂共体的降解率均明显高于菌液的降解率；
2、菌剂共体能够在第28天内微生物生物量一直上升，且在第14天微生物生物量超过菌液，枯草芽孢杆菌在初始阶段前10天释放较快，在释放初期，微生物菌剂共体吸收大量水而膨胀，使得表层以及表层附近的菌剂共体中枯草芽孢杆菌被释放出来，10-16天开始变慢，16天-24天趋于稳定状态，到了后期，菌剂共体内部的枯草芽孢杆菌基本释放完全，且培养土壤中有机质含量较少，导致枯草芽孢杆菌的生长繁殖受到限制，枯草芽孢杆菌的数量无法继续快速增长，数据结果表明了固定化菌剂具有明显的缓释作用，从而获得更大的长期有效性；
3、本申请通过为微生物构造包埋载体，使得微生物的活性得到保护，菌剂共体内剩余微生物占比明显优于同等储存条件下的菌液，保存效果甚至优于冷藏条件下的菌液；无论在室温亦或是冷藏条件下，菌剂共体的保存效果均好于菌液，且菌剂共体受温度影响较小,相比之下可以节省运输和保存费用，菌剂共体能够很好的保存微生物，防止微生物流失，共体制作完成后两个月，常温环境下共体菌剂微生物仍能保存62%的数量，相同储存条件下的菌液为9%；冷藏环境下共体菌剂微生物仍能保存54%的数量，相同储存条件下的菌液为27%；第三个月时常温环境下共体菌剂微生物仍能保存58%的数量，相同储存条件下的菌液为6%；冷藏环境下共体菌剂微生物仍能保存54%的数量，相同储存条件下的菌液为20%；
4、本发明制备的秸秆高效腐解菌剂共体能够对不易降解的物质加速降解，从而提高对秸秆的降解效率；最佳的包埋条件为4%海藻酸钠、2%明胶、2%CaCl2、交联时间1 h，在溶胀率218.34%、传质性能好；机械强度足够，包埋率高达93.25%；溶胀率比较适中，既保证了菌剂共体有较多的传质通道，又不至于膨胀过大导致微生物释放过快，112.13 mN的机械强度也保证了菌剂共体运输和贮存时不会破裂；
5、本发明通过优化载体条件，使得载体传质性能得到很好的提升，让微生物可以顺利的从包埋载体中缓慢释放出来，起到缓释效果，作用持久；
6、本发明通过优化降解条件，秸秆在菌液和菌剂共体处理下的60%田间含水率的灭菌土壤中的降解率分别为52.9%和57.28%；在不灭菌土壤60%田间含水率条件下分别为43.29%和47.43%。菌剂共体在土壤中降解秸秆的效能大于菌液，表明本发明所制备的高效秸秆腐解菌剂共体能提高微生物的存活率而后更高效发挥效能。
附图说明
图1为本申请菌剂共体包埋微生物在土壤中的释放的示意图；
图2为本申请不同处理下的秸秆降解率的示意图；
图3为本申请菌剂共体和菌液在室温条件下保存微生物数量的示意图；
图4为本申请菌剂共体和菌液在冷藏条件下保存微生物数量的示意图。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中液体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得；固体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂20g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得。
下述实施例中枯草芽孢杆菌购于北纳生物，编号：BNCC109047。
实施例1
一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，具体方法包括如下步骤：
S1，菌液制备：
S11，枯草芽孢杆菌复活以及传代培养：吸取0.5 mL 液体培养基打入含有200微升菌液的冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀制得菌悬液；吸取 0.2 mL 菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板，培养24 h后进行传代，传代3次，第4代枯草芽孢杆菌利用甘油法储存在-80℃超低温冰箱中；
S12：将冷藏在冰箱中的第4代枯草芽孢杆菌放在常温环境中复苏，待菌体与室温一致，吸取0.1 ml菌液涂布在固体培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h；然后将培养后的枯草芽孢杆菌转接种到三角瓶液体培养基中，加入玻璃珠，在180 r/min，30℃恒温震荡培养48 h，取出菌液，置于4℃的冰箱冷藏；
S2，共体制备：
S21: 按照质量浓度配比，将4%海藻酸钠、2%明胶加入30 ml水中，在磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，所述加热搅拌温度为80℃，转速为1500 r/min，使其溶解，然后放入高压灭菌锅中121℃灭菌20 min制得包埋剂; 取CaCl2加入到60 mL的无菌去离子水中，搅拌，溶解，制得2%的CaCl2溶液，然后用高压灭菌锅灭菌在121℃温度下灭菌20 min；
S22：将灭菌后的包埋剂放入超净工作台，待冷却至室温，加入15ml菌液，用酒精灯加热灭菌过的玻璃棒搅拌均匀得包埋剂和菌液混合液；
S23：使用蠕动泵，口径为4.8 mm的软管，转速为90r/min,吸取包埋剂和菌液混合液滴入到交联剂2%的CaCl2溶液中，固定1 h，取出后，用无菌去离子水清洗三遍；放在40℃烘箱烘干，装入灭菌过的离心管，置于4℃的冰箱中备用，制得秸秆高效腐解菌剂共体；
S3：选取480 mL培养瓶，土壤250 g，加秸秆2 g，再添加秸秆高效腐解菌剂共体后混合均匀，控制含水率60%条件下进行降解即可。
传代做法为在开启30 min以上的超净工作台中，点燃酒精灯，用左手拿S11中培养24 h后的平板，靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红 30 秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过 3 次；左手在酒精灯旁将平板开启一个小口，满足接种环的进入即可，将接种环伸入管内先在平板上部靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，盖上平板；将接种棒伸入事先准备好的装在10 ml试管中的灭菌蒸馏水中，搅拌至接种环无残留制得菌悬液，然后将菌悬液混合均匀，移液枪分别抽取100微升菌悬液加入新鲜制得的固体培养基中，涂布平板法后将两个平板放入培养箱中培养24 h。
秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，在不灭菌土壤60%田间含水率条件下分别为43.29%和47.43%。
实施例2
一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，具体方法包括如下步骤：
S1，菌液制备：
S11，枯草芽孢杆菌复活以及传代培养：吸取0.5 mL 液体培养基打入带有200微升菌液的冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀制得菌悬液；吸取 0.2 mL 菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板，培养24 h后进行传代，传代3次，第4代枯草芽孢杆菌利用甘油法储存在-80℃超低温冰箱中；
S12：将冷藏在冰箱中的第4代枯草芽孢杆菌放在常温环境中复苏，待菌体与室温一致，吸取0.1 ml菌液涂布在固体培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h；然后将培养后的枯草芽孢杆菌转接种到三角瓶液体培养基中，加入玻璃珠，在180 r/min，30℃恒温震荡培养48 h，取出菌液，置于4℃的冰箱冷藏；
S2，共体制备：
S21: 按照质量浓度配比，将4%海藻酸钠、2%明胶加入30 ml水中，在磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，所述加热搅拌温度为80℃，转速为1500 r/min，使其溶解，然后放入高压灭菌锅中121℃灭菌20 min制得包埋剂; 取CaCl2加入到60 mL的无菌去离子水中，搅拌，溶解，制得2%的CaCl2溶液，然后用高压灭菌锅灭菌在121℃温度下灭菌20 min；
S22：将灭菌后的包埋剂放入超净工作台，待冷却至室温，加入15ml菌液，用酒精灯加热灭菌过的玻璃棒搅拌均匀得包埋剂和菌液混合液；
S23：使用蠕动泵，口径为4.8 mm的软管，转速为90r/min,吸取包埋剂和菌液混合液滴入到交联剂2%的CaCl2溶液中，固定1 h，取出后，用无菌去离子水清洗三遍；放在40℃烘箱烘干，装入灭菌过的离心管，置于4℃的冰箱中备用，制得秸秆高效腐解菌剂共体；
S3：选取一组480 mL培养瓶，灭菌土壤250 g，加秸秆2 g，实验处理每瓶分别投加0.2 g的秸秆高效腐解菌剂共体，菌剂共体与秸秆及土壤均匀混合实验设置，总计16个处理，每个处理3个重复，控制含水率60%条件下进行降解即可，在恒温培养箱30℃培养并测定28 d秸秆最终的降解率。
实施例3
除了将海藻酸钠浓度改为3%，明胶浓度为1%，CaCl2浓度为1%，固定时间为0.5h，其他条件同实施例1。
实施例4
除了将海藻酸钠浓度改为5%，明胶浓度为2%，CaCl2浓度为3%，固定时间为3h，其他条件同实施例1。
实施例5
除了将海藻酸钠浓度改为6%，明胶浓度为3%，CaCl2浓度为4%，固定时间为1h，其他条件同实施例1。
实施例6
除了控制田间含水率为80%外，其余条件同实施例2。
实施例7
除了控制田间含水率为40%外，其余条件同实施例2。
实施例8
除了控制田间含水率为20%外，其余条件同实施例2。
包埋条件的探究优化
1.菌剂共体的直径
用150 mm游标卡尺测量不同配方的湿、干燥微生物菌剂共体的直径，每种配方取20个微生物菌剂共体，计算出不同菌剂共体直径的平均值，重复三次；
2.菌剂共体的含水率W
分别取不同配方的湿微生物菌剂共体30个，利用40℃烘箱干燥24 h，采用分析天平测出微生物菌剂共体干燥前后的质量M0、M1，计算出不同菌剂共体的平均含水率，重复三次；
；
3.菌剂共体的溶胀率Q
准确称取各个配方完全干燥的样品（W0，单位：g），浸没入无菌去离子水中，浸泡24h后，快速用滤纸擦干菌剂共体表面的水分，称其质量（W1，单位：g）；利用下面公式计算出溶胀率；
；
4.菌剂共体的机械强度
分别选取相同配方直径相近的菌剂共体5个，放置于天平上进行归零，用载玻片盖上并保持载玻片稳定不倾斜，在盖玻片上放置一个已知质量的空烧杯，不断往其中加水，挤压，当产生形变时，读取小球的最大承受质量Mi（单位：g），g是重力系数，大小为9.8 N/Kg然后用算数平均法算出单个菌剂共体的机械强度F，单位 mN；
；
5.菌剂共体的包埋率
菌液活菌数用稀释涂布平板法测得，记为a1，单位：cfu/mL，交联一定时间后，取出包埋的菌剂共体，快速用滤纸擦干菌剂共体内表面的水分，总质量记为M，单位：g，称取微生物菌剂共体1 g，加入10 mL的0.2 mo1/L的柠檬酸钠溶液中，以旋涡式振荡器充分振荡至颗粒完全溶解，目的使菌体释放完全，用去离子水稀释适当的倍数，平板涂布于28℃培养1 d，菌落计数a2 ，单位：cfu/mL，微生物的包埋率G的计算公式为：
。
如表1所示，根据试验的结果，判断出最佳的包埋条件为4%海藻酸钠、2%明胶、2%CaCl2、交联时间1 h，在溶胀率、机械强度达到一定要求的情况下，包埋率高达93.25%。通过正交实验以及成球性试验，判断最佳包埋条件，海藻酸钠浓度过高时，包埋液粘度大，成球困难，载体通透性低，一方面导致营养物质难以充足供应给菌剂共体内的微生物，一方面使得微生物释放困难。交联时间是影响包埋率的最主要因素，过长的交联时间会导致包埋率急剧下降。溶胀率比较适中，既保证了菌剂共体有较多的传质通道，又不至于膨胀过大导致微生物释放过快，一定的机械强度也保证了菌剂共体运输和贮存时不会破裂。实验结果表明海藻酸钠-明胶是一种良好的复合包埋材料。
表1
| 溶胀率% | 包埋率% | 含水量% | 机械强度mN | 呈球形 | |
| 实施例1 | 218.34% | 93.25 | 88.25 | 112.13 | 好 |
| 实施例3 | 255.24 | 84.06 | 93.89 | 79.52 | 较好 |
| 实施例4 | 134.63 | 67.88 | 89.68 | 139.27 | 好 |
| 实施例5 | 140.16 | 88.52 | 88.34 | 130.51 | 严重拖尾 |
通过对制得的菌剂共体物理特性进行探究，4%海藻酸钠、2%明胶、2%CaCl2、交联时间1 h，溶胀率为218.34%，包埋率为93.25%，含水率为88.25%，机械强度为112.13 mN，成球性好。溶胀率218.34%比较适中，既保证了菌剂共体有较多的传质通道，又不至于膨胀过大导致微生物释放过快，一定的机械强度112.13 mN也保证了菌剂共体运输和贮存时不会破裂。
6.微生物的释放率测定
采用稀释涂布法计数，通过破坏性取样，分别从接种了菌剂小球1 d、5 d 、10 d、16 d、24 d的培养皿中取出5 g土壤，称取5 g土样，于超净台中放入装有50 ml无菌水的灭菌三角瓶中，放到恒温振荡器上震荡30 min，使土壤中的微生物充分悬浮，后静置5 min，然后用移液管吸取1 ml菌悬液，按每级10倍的顺序制备梯度土壤稀释液，以10-4、10-6、10-8三个梯度的土壤稀释液作于接种液，从中吸取100 ul涂布于细菌计数培养基上，每一梯度做3个重复，待涂布均匀后，将培养皿倒置存放于培养箱内，于28℃培养1 d后，进行计数；
表2
| 天数 | 土壤中枯草芽孢杆菌数量（logcfu/g） |
| 1 | 3.26 |
| 5 | 5.33 |
| 10 | 7.1 |
| 16 | 8.1 |
| 24 | 8.55 |
如图1所示，土壤中枯草芽孢杆菌数量的测定，为探究所制得菌剂共体在土壤中的缓释效果，如表2所示，枯草芽孢杆菌在初始阶段前10天释放较快，10-16天开始变慢，16天-24天趋于稳定状态。这是因为在释放初期，微生物菌剂共体吸收大量水而膨胀，使得表层以及表层附近的菌剂共体中枯草芽孢杆菌被释放出来，而到了后期，菌剂共体内部的枯草芽孢杆菌基本释放完全，且培养土壤中有机质含量较少，导致枯草芽孢杆菌的生长繁殖受到限制，枯草芽孢杆菌的数量无法继续快速增长。数据结果表明了固定化菌剂具有明显的缓释作用，从而获得更大的长期有效性。
7.秸秆降解率测定
取出培养瓶内的秸秆，洗涤干净后用50℃烘箱烘干，称重，质量记为M；
；
表3
| 项目 | 菌剂共体降解率 | 菌液降解率 |
| 实施例2 (60%) | 57.28% | 52.9% |
| 实施例6 (80%) | 54.18% | 50.04% |
| 实施例7 (40%) | 51.28% | 47.24% |
| 实施例8 (20%) | 41.62% | 38.38% |
通过对比不同田间含水量下，秸秆的降解率，采用失重法测得秸秆第28天的降解率如表 3所示，结果表明，60%田间含水率下的秸秆降解率最高，施用菌球的灭菌土壤中秸秆降解率更是达到了57.28%，其次是80%田间含水率和40%田间含水率，而20%田间含水率土壤秸秆降解率最低，说明水分是影响秸秆降解的重要因素。菌剂共体处理的秸秆降解率大于菌液处理，说明菌剂的载体起到了保护微生物、提高微生物活性和延长微生物释放的作用。
通过对菌剂共体对秸秆的降解实验，在田间持水量为60%的条件下进行降解，降解率为57.28%,高于菌液对秸秆的降解率52.9%。
如图2所示，在同样的灭菌土壤中，不同田间含水率情况下菌剂共体的降解率均明显高于菌液的降解率。
8.菌数测定
LB培养基的制备：酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂20g（液体培养基不含）、5mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0；
柠檬酸钠的配备：取取5.884 g柠檬酸钠颗粒溶于去离子水中，制成0.2 mol/L的柠檬酸钠溶液；
梯度稀释准备：取若干20 ml试管洗净烘干后，加入9 ml去离子水后，用试管塞轻轻覆盖，以免灭菌时顶出；
将培养基、柠檬酸钠溶液、梯度稀释组管、试剂瓶、移液枪枪头放入灭菌锅中在121℃，0.103 MPa 条件下灭菌25分钟，待排气冷却完成后取出，置于已提前开启40 min 的超净工作台中继续冷却；
采用稀释涂布法计数，将0.1 g菌剂共体加入装有10 ml柠檬酸钠溶液的试剂瓶中进行溶解，放置30 ℃水浴锅中进行搅拌，使微生物释放；然后用移液管吸取1 ml菌液，按每级10倍的顺序制备梯度菌稀释液，每一梯度从中吸取100 ul涂布于细菌计数培养基上，每一梯度做3个重复，待涂布均匀后，将培养皿倒置存放于培养箱内，于28℃培养1 d后，进行计数，溶解释放后的共体菌剂重复上述操作。
如图3和图4所示，不同储存条件下菌液和菌剂共体分别对微生物活性保护的效果示意图，图3为本申请菌剂共体和菌液在室温条件下保存微生物数量的示意图，图4为本申请菌剂共体和菌液在冷藏条件下保存微生物数量的示意图，通过对共体菌剂保护微生物活性能力的探究，表明菌剂共体在58天时，室温保存的共体内剩余62%，冷藏条件下为58%；88天时，温保存的共体内剩余54%，冷藏条件下为54%。无论在室温亦或是冷藏条件下，菌剂共体的保存效果均好于菌液，且菌剂共体受温度影响较小,相比之下可以节省运输和保存费用。
表4
| 天数 | 菌液微生物数量（109个/毫升） | 菌液剩余微生物百分比 | 共体微生物数量（109个/克） | 共体剩余微生物百分比 |
| 0 | 4.8 | 100% | 2.52 | 100% |
| 3 | 1.46 | 30% | 1.8 | 71% |
| 7 | 1.26 | 16% | 1.39 | 55% |
| 14 | 0.9 | 19% | 1.26 | 50% |
| 28 | 0.51 | 11% | 1.2 | 48% |
| 58 | 0.44 | 9% | 1.31 | 62% |
| 88 | 0.31 | 6% | 1.32 | 58% |
通过对比不同储存条件下的菌液和菌剂共体菌数数量可知，如表 4 所示在室温条件下，菌液内的微生物前 3 天迅速流失，而后并持续流失，在两个月后仅剩初始微生物数量的9%，三个月后剩余6%，而室温保存下的菌剂共体对微生物的保存效果要明显好于菌液，共体内微生物数量经过前7天的快速流失后，趋于稳定，两个月后仍能保持初始微生物数量的60%左右。如表 5 在冷藏条件下，冷藏菌液相较于室温储存的菌液流失较慢，在两个月后仍能剩余初始微生物数量的28%，但仍然达不到菌剂共体的保存效果，同为冷藏条件下的菌剂共体剩余微生物数量为初始的54%。由此可以说明，同等储存条件下，菌剂共体对微生物的保存效果要远优于菌液，且菌剂共体受温度影响不大，降低保存和运输花费。
表5
| 天数 | 菌液微生物数量（109个/克） | 菌液剩余微生物百分比 | 共体微生物数量（109个/克） | 共体剩余微生物百分比 |
| 0 | 5.01 | 100% | 2.69 | 100% |
| 3 | 2.1 | 42% | 2.07 | 77% |
| 7 | 2.06 | 41% | 1.83 | 68% |
| 14 | 1.96 | 39% | 1.67 | 62% |
| 28 | 2 | 36% | 1.5 | 56% |
| 58 | 1.53 | 27% | 1.44 | 54% |
| 88 | 1.02 | 20% | 1.43 | 54% |
上面对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (10)
1.一种秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：将海藻酸钠与明胶混合制成包埋剂，将包含菌种的菌液加入包埋剂中；通过蠕动泵滴入氯化钙溶液中进行交联，静置后得到秸秆高效腐解菌剂共体；将秸秆混入土壤中，将制得的秸秆高效腐解菌剂共体洗净，干燥后，放置在混有秸秆的土壤中，对秸秆进行降解。
2.根据权利要求1所述秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：具体包括如下步骤：
S1，菌液制备：
S11，菌种复活以及传代培养：吸取0.5 mL 液体培养基打入200微升菌液冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀制得菌悬液；吸取 0.2 mL 菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板，培养24 h后进行传代，传代3次，第4代菌种利用甘油法储存在-80℃超低温冰箱中；
S12：将冷藏在冰箱中的第4代菌种放在常温环境中复苏，待菌体与室温一致，吸取0.1ml菌液涂布在固体培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h；然后将培养后的菌种转接种到三角瓶液体培养基中，加入玻璃珠，在180 r/min，30℃恒温震荡培养48 h，取出菌液，置于4℃的冰箱冷藏；
S2，共体制备：
S21: 按照质量浓度配比，将3-6%海藻酸钠、1-3%明胶加入30 ml水中，在磁力搅拌水浴锅中加热搅拌，所述加热搅拌温度为80℃，转速为1500 r/min，使其溶解，然后放入高压灭菌锅中121℃灭菌20 min制得包埋剂; ;取CaCl2加入到60 mL的无菌去离子水中，搅拌，溶解，制得1-4%的CaCl2溶液，然后用高压灭菌锅灭菌在121℃温度下灭菌20 min备用；
S22：将灭菌后的包埋剂放入超净工作台，待冷却至室温，加入15ml菌液，用酒精灯加热灭菌过的玻璃棒搅拌均匀得包埋剂和菌液混合液；
S23：使用蠕动泵，口径为4.8 mm的软管，转速为90r/min,吸取包埋剂和菌液混合液滴入到交联剂1-4%的CaCl2溶液中，交联0.5-3h，取出后，用无菌去离子水清洗三遍；放在40℃烘箱烘干，装入灭菌过的离心管，置于4℃的冰箱中备用，制得秸秆高效腐解菌剂共体；
S3：将制得的菌剂共体洗净，干燥后，放置在混有秸秆的土壤中，对秸秆进行降解。
3.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S11和S12中液体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得。
4.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：菌液中的菌种为枯草芽孢杆菌、白腐真菌或里氏木霉。
5.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S11中菌种与液体培养基的用量比为200微升菌种冻干粉：0.5毫升液体培养基。
6.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S11中传代做法为在开启30 min以上的超净工作台中，点燃酒精灯，用左手拿S11中培养24 h后的平板，靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红 30 秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过 3 次；左手在酒精灯旁将平板开启一个小口，满足接种环的进入即可，将接种环伸入管内先在平板上部靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，盖上平板；将接种棒伸入事先准备好的装在10 ml试管中的灭菌蒸馏水中，搅拌至接种环无残留制得菌悬液，然后将菌悬液混合均匀，移液枪分别抽取100微升菌悬液加入新鲜制得的固体培养基中，涂布平板法后将两个平板放入培养箱中培养24 h。
7.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S12中固体培养基为酵母粉5g、氯化钠5g、蛋白胨10g、琼脂20g、5 mg一水合硫酸锰、无菌水1000 ml，调节pH 7.0制得。
8.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S3中秸秆降解选取480 mL培养瓶，土壤250 g，加秸秆2 g，再添加0.2g秸秆高效腐解菌剂共体后混合均匀，控制田间含水率20-80%条件下进行降解即可。
9.根据权利要求8所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：田间含水率60%条件下进行降解。
10.根据权利要求2所述的秸秆高效腐解菌剂共体在秸秆降解中的应用，其特征在于：所述S21中海藻酸钠浓度为4%，明胶浓度为2%，CaCl2溶液浓度为2%。
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