CN110747134A - 一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用，属于微生物菌剂技术领域；所述单列毛壳菌的保藏编号为：CGMCC No.18156。本发明的单列毛壳菌通过促进秸秆有效降解、增加土壤中有机碳和可溶性碳氮含量、抵抗病原菌来促进土壤肥力提升。本发明的单列毛壳菌能够在土壤中自行生长繁殖，与土著微生物群落达到生态稳定平衡，无需重复添加。本发明的单列毛壳菌来源于长期进行秸秆还田的农田土壤，可以实现绿色生态农业，以确保食品的优质性与安全性。本发明的单列毛壳菌的扩大培养过程操作简单，成本低廉，能够制备成微生物菌剂，在农业领域推广应用。

Description

一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其涉及一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
球毛壳菌被作为生防菌较早被应用于农业领域，基因组信息显示其具有完整的降解纤维素半纤维素的酶体系，在木质纤维素降解真菌的开发中具有重要的研究价值(郝晓冉，牛学良，李强，等，2013.球毛壳菌降解天然木质素纤维素能力差异及酶系基因分析，生物技术通讯)。但是目前关于单列毛壳菌的研究非常少，也没有现有技术将其应用于农业领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用，该株单列毛壳菌及其菌剂通过促进秸秆有效降解、增加土壤中有机碳和可溶性碳氮含量、抵抗病原菌来促进土壤肥力提升。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株单列毛壳菌Chaetomium uniseriatum F1，保藏编号为：CGMCCNo.18156。
本发明还提供了一种包括上述方案所述单列毛壳菌的菌剂。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到第一发酵混合物；
2)将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养至菌丝完全覆盖发酵培养基后，得到第一菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆65～75份、豆饼粉20～30份、蔗糖2～4份和水90～110份。
优选的，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的另一种制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于蔗糖矿物液体培养基，于25～30℃的条件下培养3～5d，得到第二发酵混合物；
2)将所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉和水混合，进行造粒，得到第二菌剂；
所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉的质量比为60～70：15～20：1～2：2～4：8～9。
优选的，所述蔗糖矿物培养基包括以下重量份的原料：NH4Cl 1份、KH2PO4 6.23份、Na2HPO4·2H2O 3.72份、MgSO4·7H2O 0.25份、蔗糖5份和水1000份。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在提高土壤环境中秸秆降解率中的应用。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在增加土壤可溶性碳氮含量中的应用。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在提高土壤微生物量和/或抑制镰刀菌生长中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一株单列毛壳菌Chaetomium uniseriatum F1，保藏编号为：CGMCC No.18156。本发明的单列毛壳菌通过促进秸秆有效降解、增加土壤中有机碳和可溶性碳氮含量、抵抗病原菌来促进土壤肥力提升。本发明的单列毛壳菌具有长效性，能够在土壤中自行生长繁殖，与土著微生物群落达到生态稳定平衡，无需重复添加。本发明的单列毛壳菌具有生态环境安全性，该株单列毛壳菌来源于长期进行秸秆还田的农田土壤，可以实现绿色生态农业，以确保食品的优质性与安全性。本发明的单列毛壳菌具有可操作性，该株单列毛壳菌的扩大培养过程操作简单，成本低廉，能够制备成微生物菌剂，在农业领域推广应用。应用结果表明，纯培养添加合适矿物液体培养基条件下，该株单列毛壳菌7天内对玉米秸秆降解率为30％，培养液中还原糖浓度为4mM。在25mL反应体系中，以0.03g纯菌丝提取的粗酶液50℃反应30min，在25mL体系中生成浓度为1mM葡萄糖所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。内切葡聚糖活性为7.67U，外切葡聚糖酶活性8.33U，β-葡糖苷酶活性为7.92U；土壤微生物量碳提高了24％，微生物氮含量提高了29％，土壤可溶性氮提高了21％，抽雄期玉米生物量提高了10％，玉米叶绿素指标SPDA值增加了13％，说明该菌株直接促进了土壤碳氮的循环。
附图说明
图1为单毛壳菌对镰刀菌的平板对峙实验，左侧为镰刀菌，右侧为单列毛壳菌，中间为明显的拮抗线；
图2为蔗糖矿物培养基上的菌体聚集物；
图3为接种单列毛壳菌对玉米植株生长的影响对比图，左侧3株玉米是对比例，右侧3株玉米为实施例。
生物保藏说明
单列毛壳菌(Chaetomium uniseriatum F1)，于2019年09月06日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.18156。
具体实施方式
本发明提供了一株单列毛壳菌Chaetomium uniseriatum F1，保藏编号为：CGMCCNo.18156。菌丝直径为5～7uM，多为顶生孢子囊，孢子囊圆形，直径10～15uM，少数间生孢子囊，菌丝分叉较少。其ITS序列如SEQ ID NO：1所示：TGGCTGCACCAGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTGCAAAACTCCCTAAACCATTGTGAACATACCTTCAACGTTGCTTCGGCGGGTTGGCTCCGGGTCTCCCGGGGCCCCCGGCCCTACTCGGGCGCCCGCCGGAGGTATCTAACTCTTGACAATTGTATGGCCTCTCTGAGTCTTTGTACTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAgAACGCAGCA；所述单列毛壳菌是从河南省原阳县的国家潮土肥力肥效试验中长期秸秆还田处理耕层土壤中分离、培养获得，其耕作制度为小麦-玉米轮作；该土壤质地组成为：粘粒16.1％、粉粒50.7％、砂粒33.2％，粘土矿物组成(<2μm)为：蒙脱石10.0％、高岭石21.0％、绿泥石25％、水云母29％、蛭石10％、其它5.0％，表层土壤养分指标为:pH 8.1、土壤有机碳10.42g/kg、全氮12.53g/kg、有效磷24.85mg/kg。
本发明还提供了一种包括上述方案所述单列毛壳菌的菌剂。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到第一发酵混合物；
2)将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养至菌丝完全覆盖发酵培养基后，得到第一菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆65～75份、豆饼粉20～30份、蔗糖2～4份和水90～110份。
本发明将所述单列毛壳菌接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到第一发酵混合物；所述单列毛壳菌保存于PDA培养基；本发明对所述单列毛壳菌的接种量没有特殊限制，采用本领域常规接种量即可；所述PD液体培养基优选的包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份；更优选的，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯200份、葡萄糖20份和水1000份，pH自然；所述培养的温度优选为28℃；所述培养的转速优选为150rpm；所述培养的时间优选为8～9d，以出现大量淡黄色小米状菌丝球为准。
得到第一发酵混合物后，本发明将所述第一发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养至菌丝完全覆盖发酵培养基，且孢子和菌丝密度达到106cfu/g，得到第一菌剂；所述第一发酵混合物的接种量优选为每100mL发酵培养基接种15～25mL第一发酵培养物，更优选的接种20mL第一发酵培养物；所述培养的时间优选为28℃；所述培养的时间优选为10～15d，本发明具体实施过程中，所述培养的方式为静置培养，所述培养的容器优选为三角瓶，在菌丝把发酵培养基(秸秆-豆饼-蔗糖培养基)固结成块后，使培养基横在三角瓶中，使得菌饼两面可接触到空气；所述发酵培养基优选的包括以下质量份的组分：玉米秸秆72份、豆饼粉25份、蔗糖3份和水100份，pH自然；所述玉米秸秆优选的经过粉碎处理；所述发酵培养基优选的采用以下方法制备获得：将所述豆饼粉和水混合30min后得到混合物，将所述混合物和蔗糖、玉米秸秆混合后，于121℃条件下灭菌20min，pH自然，得到发酵培养基。
本发明还提供了上述方案所述菌剂的另一种制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于蔗糖矿物液体培养基，于25～30℃的条件下培养3～5d，得到第二发酵混合物；所述培养的温度优选28℃；所述培养的时间优选为4d；所述培养的方式优选为静置培养，以蔗糖矿物液体培养基表面形成全覆盖的菌丝聚集物为准；
2)将所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉水混合，进行造粒，得到第二菌剂；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；本发明对所述造粒的方法没有特殊限制，采用本领域常规造粒方法即可；所述第二菌剂的粒径优选为0.2～0.4cm；所述第二菌剂的含水量优选为10％～15％。
所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉的质量比为60～70：15～20：1～2：2～4：8～9；优选为75：18：1.5：3：8.5。
优选的，所述蔗糖矿物培养基包括以下重量份的原料：NH4Cl 1份、KH2PO4 6.23份、Na2HPO4·2H2O 3.72份、MgSO4·7H2O 0.25份、蔗糖5份和水1000份；所述蔗糖矿物培养基与PD相比，长势更好，无机盐加蔗糖，配置上更简单，成本更低，更适合浅盘发酵。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在提高土壤环境中秸秆降解率中的应用。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在增加土壤可溶性碳氮含量中的应用。
本发明还提供了上述方案所述单列毛壳菌或者所述菌剂在提高土壤微生物量和/或抑制镰刀菌生长中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1单列毛壳菌F1对镰刀菌的平板对峙实验
分别1周内接种活化的单列毛科菌和镰刀菌到90mm PDA平板的直径的1/4和3/4处。所用的镰刀菌为Fusarium solani，接种菌块直径0.5cm。放置25℃培养箱中黑暗倒置培养3～4天，期间观察菌落的生长速度以及是否存在明显的拮抗效应。
试验结果参见图1，由图1可以看出虽然镰刀菌生长速度略快于单列毛科菌，但是单列毛科菌周围镰刀菌丝的延伸明显受到限制，菌落形成明显的缺口。
实施例2一种包括本发明所述单列毛壳菌的第一菌剂
1.接种在PDA培养基上生长旺盛的菌丝块至PD液体培养基中，置于恒温摇床28℃、220rpm培养10d，出现大量小米状黄色菌丝球，得到发酵混合物；
2.无菌条件下取20mL发酵混合物加入100g发酵培养基(秸秆-豆饼粉-蔗糖培养基)中，立即摇匀；置于28℃静置培养；待到菌丝把秸秆豆饼蔗糖培养基固结成块后，使培养基横在三角瓶中，使得菌饼两面可接触到空气；之后置于28℃培养箱，直到菌丝完全覆盖秸秆豆饼蔗糖培养基后，用玻璃棒捣散，即得到菌剂。
采用的PD培养基配方为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL，发酵培养基(秸秆-豆饼粉-蔗糖培养基)为：粉碎玉米秸秆72g、豆饼粉25g、蔗糖3g、水100mL，水先加入豆饼粉湿润30min后，再加入秸秆、蔗糖拌匀，装入500mL三角瓶中，121℃灭菌20min后，趁热摇散。
实施例3一种包括本发明所述单列毛壳菌的第二菌剂
1.接种在PDA培养基上生长旺盛的菌丝块至蔗糖矿物液体培养基中，置于恒温培养箱28℃静置培养4天，液体培养基表面形成全覆盖的菌丝聚集物，参见图2，由图2可见看出菌丝聚集物呈黄色白色，孢子不发达，避免了造粒过程中对人体的呼吸系统的危害，同时菌体聚集物的量远大于摇瓶培养获得菌体量将该菌丝聚集物与秸秆粉末、黄腐酸等保水剂蔗糖混匀，少量通水作用下进行圆盘造粒机冷造粒，制成成品微生物菌剂。
2.采用的蔗糖矿物培养基配方为：NH4Cl 1g，KH2PO46.23g，Na2HPO42H2O 3.72g，MgSO47H2O 0.25g，蔗糖5g，水1000mL。121℃灭菌20min备用。
3.复合微生物菌剂包括以下质量份的组分：菌丝聚集物60％～70％，秸秆粉末质量占比15％～20％，黄腐酸1％～2％，蔗糖2％～4％，岩棉8％～9％。
实施例4
1.将生长良好的单毛壳菌接种至PD液体培养基中，28℃、220rpm摇床黑暗培养5d，得到发酵混合物。
2.将发酵混合物接种到灭过菌的发酵培养基(秸秆-豆饼粉-蔗糖培养基)中，28℃静置黑暗培养，直到菌丝完全覆盖培养基。
3.将不同三角瓶中菌丝取出，混匀后即为菌剂。
4.准确称取20g菌剂，加入10kg土壤中，充分混匀后装盆。在离盆口15cm处埋入烘干后准确称重的秸秆10g(装入150目双层尼龙袋中)。
5.充分浇水后进行玉米(郑单958)种植，于三叶期定苗，每盆留1株。玉米于人工气候室中进行培养。培养条件为14h光照(28℃)，10h黑暗(20℃)，相对湿度70％。期间按需浇水除草。抽雄期进行土壤有机质养分、玉米植株生物量以及玉米根系激素含量的测定。
对比例1
1.准确称取灭菌处理的秸秆豆饼粉蔗糖培养基20g，加入10kg土壤中，充分混匀后装盆。
2.充分浇水后进行玉米(郑单958)种植，于三叶期定苗，每盆留1株。玉米于人工气候室中进行培养。培养条件为14h光照(28℃)，10h黑暗(20℃)，相对湿度70％。期间按需浇水除草。抽雄期进行土壤有机质养分、玉米植株生物量以及玉米根系激素含量的测定。
实施例3和对比例1的测定结果如表1、表2和图3所示。接种单毛壳菌的玉米生物量增加了10％，玉米叶绿素指标SPDA值增加了13％。接种单毛壳菌处理的土壤微生物量碳提高了24％，微生物氮含量提高了29％(表1)，土壤可溶性氮提高了21％，秸秆降解率提高了18.52％。接种单毛壳菌处理的土壤微生物量碳氮、土壤可溶性碳氮含量均出现明显提升，说明该菌剂的加入激活了土壤生态系统，促进土壤微生物的活动。接种单列毛壳菌使的耕作层土壤氧含量显著降低了0.4个百分点，氧气含量的降低有效降低土壤呼吸强度，促进土壤有机质累积，尽管在我们短期的培养过程中SOC变化未达到显著性。
表1接种单列毛壳菌对土壤指标的影响
表2接种单列毛壳菌对植物指标的影响
Figure BDA0002277238920000082
N＝4.*表示p＜0.05水平上的显著性，**表示p＜0.01水平上的显著性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggctgcacc agcggaggga tcattaaaga gttgcaaaac tccctaaacc attgtgaaca 60
taccttcaac gttgcttcgg cgggttggct ccgggtctcc cggggccccc ggccctactc 120
gggcgcccgc cggaggtatc taactcttga caattgtatg gcctctctga gtctttgtac 180
ttaataagtc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag 240
ca 242

Claims (9)

1.一株单列毛壳菌Chaetomium uniseriatum F1，保藏编号为：CGMCC No.18156。
2.一种包括权利要求1所述单列毛壳菌的菌剂。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于PD液体培养基，于25～30℃，120～180rpm的条件下培养7～10d，得到第一发酵混合物；
2)将所述发酵混合物接种于发酵培养基，于25～30℃条件下培养至菌丝完全覆盖发酵培养基后，得到第一菌剂；
所述发酵培养基包括以下重量份的成分：玉米秸秆65～75份、豆饼粉20～30份、蔗糖2～4份和水90～110份。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PD液体培养基包括以下质量份的成分：去皮马铃薯180～220份、葡萄糖18～22份和水900～1100份。
5.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述单列毛壳菌接种于蔗糖矿物液体培养基，于25～30℃的条件下培养3～5d，得到第二发酵混合物；
2)将所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉和水混合，进行造粒，得到第二菌剂；
所述第二发酵混合物、秸秆粉末、黄腐酸、蔗糖、岩棉的质量比为60～70：15～20：1～2：2～4：8～9。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蔗糖矿物培养基包括以下重量份的原料：NH4Cl 1份、KH2PO4 6.23份、Na2HPO4·2H2O 3.72份、MgSO4·7H2O 0.25份、蔗糖5份和水1000份。
7.权利要求1所述单列毛壳菌或者权利要求2所述菌剂在提高土壤环境中秸秆降解率中的应用。
8.权利要求1所述单列毛壳菌或者权利要求2所述菌剂在增加土壤可溶性碳氮含量中的应用。
9.权利要求1所述单列毛壳菌或者权利要求2所述菌剂在提高土壤微生物量和/或抑制镰刀菌生长中的应用。
CN201911127229.0A 2019-11-18 2019-11-18 一株单列毛壳菌、包括单列毛壳菌的菌剂及其制备方法和应用 Active CN110747134B (zh)

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