CN108277172B - 多粘类芽孢杆菌gy40及其可湿性粉剂的制备与用途 - Google Patents

多粘类芽孢杆菌gy40及其可湿性粉剂的制备与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，其保藏号为：CGMCC NO.14481。本发明还公开了多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，以及利用多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备菌粉和可湿性粉剂的方法。本发明菌株具有陆源微生物不具有的较强耐盐性，生长温度低，抑菌作用强的优点；其产芽孢发酵方法配方简单，原料主要为农产品下脚料，价格低廉，来源广泛，菌株生长速度快，发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制，发酵芽孢产量高，减少了原料成本，降低了发酵能耗，提高了发酵生产效率，该菌株制得的可湿性粉剂具有很好的防治小麦赤霉病、黄瓜枯萎病作用，可以用于小麦和黄瓜种植。

Description

多粘类芽孢杆菌GY40及其可湿性粉剂的制备与用途
技术领域
本发明涉及一种源自海洋的菌株，特别是一种多粘类芽孢杆菌GY40菌株，本发明还涉及该多粘类芽孢杆菌GY40菌株的发酵培养方法，利用该菌株制备菌粉、可湿性粉剂的方法和用途。
背景技术
芽孢杆菌可以产生抗逆性强的内生芽孢，芽孢适合储藏和运输，因此是开发的微生物菌剂的主要活性成分。目前研制成功的生防活菌制剂中大多数以芽孢为主要成分，研究菌株产芽孢培养基和发酵条件，提高发酵水平和芽孢产率是开发芽孢杆菌活菌制剂的关键，对于提高生产效率具有重要意义。
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus.polymyxa)中很多菌株作为重要的生防资源，用于多种植物病害的生物防治，该菌对人畜安全、无环境污染、对植物非致病性，在生产过程中活菌量高且产品稳定性强，是目前进行微生物农药规模化生产的理想菌属。美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。一些学者分离得到了多个多粘类芽孢杆菌优良菌株，系统研究了起抗菌防病作用。也有学者将筛选到的多粘类芽孢杆菌研制成了0.1×108CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(KDLD)，已登记并在生产上应用，对番茄青枯病具有良好的防效。
海洋微生物生长在寡营养、低温、高盐等海洋环境中，因此会具有耐盐和低营养等特性，具有更广泛的适应性，容易培养，在环境中易于定殖，使得洋微生物的开发与研究具有巨大的潜力。不同学者在我国不同的海域分离到了一些能够抑制植物病原菌的海洋微生物菌株，如谢听等在其分离得到的8株对植物病菌具有抑制作用的的芽孢杆菌菌株，其中一株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，在该菌株代谢产物中提取到细胞壁降解酶类活性物质；牛军等在东海海域分离得到了一株对几种植物病原真菌具有拮抗作用的海洋真菌；刘淼等在大连湾地区分离得到了一株海洋枯草芽孢杆菌，其对稻瘟病具有强烈的抑制作用，马桂珍等从连云港海域分离到一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus.polymyxa)L1-9菌株，该菌株发酵液对水稻纹枯病菌等17种植物病原菌具有抑制作用，并系统研究了该菌株产生抑菌物质的发酵条件，胡飞等人对分离自青岛海域海泥中的多粘类芽孢杆菌DN-1菌株产生芽孢固态发酵条件进行优化，得到了产芽孢固态培养基配方和发酵条件，但培养基组分含量较高，发酵温度高，时间长，产生的芽孢产量较低，固态发酵效率低。综上所述有关源自海洋的多粘类芽孢杆菌产芽孢液体发酵培养基和发酵条件的优化以及生防制剂的研制尚未见报道。针对现有的用于生防制剂开发的多粘类芽孢杆菌来自于陆源、产芽孢培养基成分复杂、发酵温度较高、发酵时间长、多粘类芽孢杆菌制剂芽孢含量低等不足，本专利采用单因素试验和正交试验对从连云港海域分离得到的一株具有强抗菌作用的多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)GY40菌株的产芽孢发酵培养基和摇瓶发酵条件进行优化，并在1吨发酵罐中进行放大试验，筛选与菌株生物相容性好的载体和助剂并优化其配比，制备以源自海洋的多粘类芽孢杆菌的芽孢为主要成分的可湿性粉剂，并用于黄瓜枯萎病和小麦赤霉病的防治，为海洋多粘类芽孢杆菌的开发提供原料来源广泛价格低廉的产芽孢培养基配方及其发酵工艺和可湿性粉剂配方。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，特别是生产上优良菌株较少、适应性差、培养温度较高等不足，提供一种源自海洋的耐盐、培养温度低、营养简单的新的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株CGMCC NO.14481。
本发明所要解决的另一个液体发酵芽孢产量低、培养基成分复杂成本高的技术问题，供述了前述源自海洋的多粘类芽孢杆菌GY40菌株芽孢产量高的液体发酵培养方法。
本发明所要解决的再一个技术问题是根据现有多粘类芽孢杆菌制剂种类少、以及其活体可湿性粉剂中芽孢含量低的不足，提供利用多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备芽孢含量高的菌粉和可湿性粉剂的方法。
本发明所要解决的再一个技术问题是针对生产上黄瓜枯萎病和小麦赤霉病危害大防治有效药剂少或农药毒性高等不足提供可湿性粉剂的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，其特点是，其保藏号为：CGMCCNO.14481。
本发明所涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，已于2017年7月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，其保藏号为：CGMCC NO.14481，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355。
本发明还公开了前述多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，其特点是，其步骤如下：
(1)将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；
(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量调整为30m3/h，发酵时间为26h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。
本发明还公开了一种利用所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备GY40菌粉的方法，其特点是，其步骤如下：将多粘类芽孢杆菌GY40菌株在发酵罐中按以上技术方案所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY40菌粉。其中：吸附所加入的氯化钙优选为发酵液体积的2％，所加入的磷酸氢二钠按优选为发酵液体积的3％。
本发明还公开了一种利用所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备可湿性粉剂的方法，其特征在于点是，其步骤如下：取按以上技术方案所述的方法制得的GY40菌粉，按以下质量百分比向GY40菌粉中加入助剂：GY40菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂十二烷基苯磺酸钠8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到GY40菌株可湿性粉剂。
以上所述的方法所制得的发酵液、GY40菌粉或者GY40菌株可湿性粉剂可以作为有效成份用来制造防治小麦赤霉病的药物或者药物组合物。也可以作为有效成份用来制造防治黄瓜枯萎病的药物或者药物组合物。
以下是发明所做的相关的实验及其结果。
1材料与方法
1.1供试菌株
从连云港海域采集海水、海泥、漂浮物、海洋动物、海洋植物等多种样品采用稀释涂布法分离到海洋细菌235株，以小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporiumf.sp.Cucumerinum)为指示菌，采用平板对峙法测定235个菌株的抑菌活性，得到抑制作用较强的海洋细菌58株，采用牛津杯法测定58个菌株的无菌发酵液对指示菌的抑制作用，有26个菌株发酵液对2种指示菌的抑菌带宽度均大于10mm，其中GY40菌株对植物病原真菌生长的抑制作用最强，抑菌带宽度达25mm。该菌株由中国普通培养物保藏管理中心鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，并保藏于该中心，保藏号为CGMCC NO.：14481。
小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporiumf.sp.Cucumerinum)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum)等14种植物病原真菌由中国农科院植物保护研究所土传病害实验室提供。
1.2培养基
(1)GY40菌株、植物病原真菌活化和抑菌作用培养基(PDA)：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、琼脂20g/L、水1L。
(2)GY40菌株种子液制备培养基(PD)：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L。
(3)青枯病菌活化及其抑菌作用测定培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH7.5。
1.3 GY40菌株特性测定
1.3.1 GY40菌株对不同病原菌真菌的抑菌作用测定
采用对峙培养法，将活化的直径5mm的供试病原真菌的菌苔接种于PDA平板中央，在距离平板边缘2.5em处对称划线接种GY40菌株，28℃培养3-5d，采用十字交叉法测量不同菌株的抑菌带宽度。
1.3.2 GY40菌株发酵液对病原菌的抑菌作用测定
将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液。
将种子液按6％的接种量接入到装有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，pH7.0，28℃，180r/min振荡培养36h，4℃、12000r/min条件下离心20min去掉菌体，上清液经孔径0.22μm的细菌过滤器过滤，即为无菌发酵液。
(1)对真菌的抑制作用测定采用挖孔法。在PDA平板中央接种直径为5mm的不同病原菌菌苔，距培养皿边缘15mm处，对称打直径为5mm的孔，每个孔内加入200μl GY40菌株的无菌发酵液，25℃恒温培养4d后，观察病原真菌的菌落生长状况，测量抑菌带宽度。
(2)菌株发酵液对病原菌细菌的抑菌作用采用滤纸片法。取培养20h的青枯病菌斜面加入液体培养基制成浓度为108个细胞/ml的菌悬液，取200μl菌悬液涂布于直径9cm的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，将直径为5mm的无菌滤纸片均匀摆放于平板上，每个滤纸片上滴加100μlGY40菌株的无菌发酵液，30℃条件下培养24h，观察测定抑菌带宽度。
1.3.3)GY40菌株的耐盐性测定：将发酵液用氯化钠分别调节盐度为：1％、2％、3％、4％、5％，接种GY40菌株后28℃，180r/min振荡培养，2h取样一次，血球计数板法测定不同盐浓度发酵液中细胞数目。根据不同盐度发酵液中的GY40菌株细胞数目判断其耐盐性。
1.4海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株产芽孢培养基的筛选
1.4.1基础培养基筛选
将GY40菌株种子液分别接种到6种不同培养基中进行发酵(表1)，发酵的基本条件为250mL三角瓶装60mL培养基，pH7.0、接种量10％、28℃、180r/min摇床培养48h，每种培养基为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，分别测定GY40菌株在不同培养基中发酵液的细菌数和芽孢产率。细菌数的测定采用血球计数板法。芽孢产率的测定采用结晶紫染色法。
表1 不同产芽孢培养基的配方
Figure BDA0001527706750000041
1.4.2海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株产芽孢培养基优化的单因素试验
1.4.2.1氮源种类的筛选
分别用等量的不同氮源代替基础培养基中的氮源，培养基中其余的成分不变，以基础培养基作为对照，每种氮源为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复，按1.4.1的发酵条件要求进行摇瓶发酵，测定不同氮源发酵液的细菌数和产芽孢率。
1.4.2.2氮源浓度的筛选
根据筛选出的最佳氮源，在GY40菌株产芽孢基础培养基中加入不同浓度的最佳氮源配制含不同氮源浓度的培养基，接种GY40菌株种子液，按1.4.1的发酵条件进行发酵，测定不同浓度氮源发酵液的细菌数和产芽孢率。
1.4.2.3碳源种类的筛选
分别用等量的不同碳源代替筛选出的GY40菌株产芽孢基础培养基中的其中一种碳源，培养基其余成分不变，每种碳源为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，以基础培养基作为对照组，按1.4.1的发酵条件要求进行发酵，测定不同碳源发酵液的细菌数和产芽孢率。
1.4.2.4碳源浓度的筛选
将不同浓度的最佳碳源分别加入到GY40菌株产芽孢基础培养基中，制成碳源浓度不同的培养基，按1.4.1的发酵条件进行发酵，测定不同碳源浓度发酵液的细菌数和产芽孢率。
1.4.2.5无机盐种类的筛选
分别用等量的不同种类的无机盐来代替GY40菌株产芽孢基础培养基中的无机盐，培养基其余的成分不变，每种无机盐为一个处理，每个处理接种3瓶为3次重复，按1.4.1的发酵条件进行发酵试验。测定不同无机盐发酵液的细菌数和芽孢产率。
1.4.2.6无机盐浓度的筛选
在GY40菌株产芽孢基础培养基中加入不同浓度的筛选出的无机盐，配制成无机盐浓度不同的培养基，接种GY40菌株种子液，按1.4.1的发酵条件进行发酵，测定不同浓度无机盐发酵液的细菌数和芽孢产率。
1.4.3海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株产芽孢培养基优化正交试验
将筛选到的最佳碳源、氮源、无机盐按正交试验表中相应的因素和水平设计并进行正交试验。按1.4.1的发酵条件进行发酵试验，测定细菌数及芽孢产率。以细菌数多、芽孢产率高的组合作为GY40菌株产芽孢的最佳培养基配方。
1.5海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株摇瓶发酵条件优化
1.5.1产芽孢的时间曲线
将GY40菌株种子液接种到优化的GY40菌株产芽孢培养基中进行发酵，每隔2h取样测定发酵液的细菌数和芽孢产率，以时间为横坐标，菌体数目和芽孢率为纵坐标绘制时间曲线。
1.5.2发酵初始pH值的优化
用1M HCl或1M NaOH调节优化的GY40菌株产芽孢培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，将GY40菌株种子液接种到不同pH值的GY40培养基中进行发酵，每个pH值为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的pH值作为最佳发酵初始pH值。
1.5.3温度的优化
在发酵时间优化和发酵初始pH值优化的基础上，将GY40菌株种子液接种到优化的GY40菌株产芽孢培养基后进行发酵试验。发酵温度分别为：24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，每个温度为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵温度作为最佳发酵温度。
1.5.4接种量的优化
在时间、温度和初始pH值筛选试验结果的基础上，将菌株GY40菌液分别按2％、4％、6％、8％、10％、12％6个接种量接种到优化的GY40菌株产芽孢培养基后进行发酵试验，每种接种量为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复。测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵接种量作为最佳发酵接种量。
1.5.5装液量的优化
在时间、温度、初始pH值和接种量筛选试验结果的基础上，将菌株GY40菌液分别接种于装有30mL、50mL、60mL、70mL、90mL、110mL优化的GY40菌株产芽孢培养基的250mL三角瓶中进行发酵试验，每种装液量为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵装液量作为最佳发酵装液量。
1.5.6转速的优化
在时间、温度、初始pH值、接种量和装液量筛选试验结果的基础上，将GY40菌株种子液接种到优化的GY40菌株产芽孢培养基后进行发酵试验。转速为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min，每个转速处理为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复。测定发酵液的细菌数和芽孢产率，筛选出细菌数多、芽孢产率高的发酵转速作为最佳发酵转速。
1.5.7 GY40菌株产芽孢培养基摇瓶发酵条件优化验证试验
分别采用优化前的和优化后的培养基和摇瓶发酵条件对GY40菌株进行发酵试验。测定两者发酵液的细菌数和芽孢产率，并进行对比。
1.5.8优化的产芽孢培养基配方特异性验证
将优化的培养基配方与另外3种培养基分别记为1、2、3、4号培养基，配方见表2。将菌株GY40和本公司保藏的1株海洋解淀粉芽孢杆菌GY30菌株分别接种到4种培养基中，以优化后的发酵条件进行发酵，比较2个菌株在不同配方培养基配方中的菌体数量和芽孢率。
表2 4种培养基配方
Figure BDA0001527706750000061
Figure BDA0001527706750000071
1.6海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株产芽孢发酵工艺扩大
采用优化出的发酵培养基，根据优化的摇瓶发酵条件，GY40菌株在1吨发酵罐中在不同温度、接种量和物料浓度条件下进行发酵，比较不同条件下的菌体数目和产芽孢率，发酵基本条件为装量400L、初始pH值为7.0、初始搅拌速度为150r/min，发酵初期通气量为14m3/h，随着发酵液中菌体数目的增加加大通气量，接种量分别为1％和10％、发酵温度分别为30℃和32℃，在接种量10％的条件下增加培养基中的不同物料种类增加20％。每隔4h连续取样测定发酵液的pH值、总菌量和芽孢率。
1.7 GY40菌株可湿性粉剂加工助剂的筛选
1.7.1不同载体和助剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定
将制备好的种子液取6mL接入装有60mL含4％载体或助剂的PD培养基的250mL的三角瓶中，在28℃，180r/min的条件下培养24h，用稀释涂布计数法检测培养液中的含菌量。每个处理3个重复。根据活菌数量判断不同助剂或载体与海洋细菌GY40菌株的生物相容性。活菌数量越多表明生物相容性越好，反之则越差，筛选出与海洋细菌GY40菌株生物相容性较好的载体和助剂。
1.7.2海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂加工载体的筛选
(1)不同载体对海洋细菌GY40菌株吸附量的测定
分别向100mL的烧杯中加入各种载体各2g。将海洋细菌GY40菌株的发酵液向烧杯中的载体缓慢滴加，滴加的同时用玻璃棒搅拌。当载体粉末开始凝结成团且不散开时，停止向其中继续滴加发酵液。记录滴加到载体中的发酵液的量。每种载体3个重复。
(2)不同载体对制剂悬浮率的影响
载体悬浮率测定采用国家标准农药可湿性粉剂悬浮率测定方法(GB/T 14825-93)。
(3)不同载体对制剂润湿性的影响
载体润湿性采用国家标准农药可湿性粉剂润湿时间测定方法GB/T5451-85)。根据不同载体吸附量及其对制剂悬浮率和润湿性的影响，筛选出适合海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂加工的载体。
1.7.3海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂加工助剂的筛选
测定不同湿润剂、分散剂、稳定剂对制剂悬浮率和润湿性的影响，选择生物相容性较好、悬浮率高、润湿时间短、价格便宜的助剂作为GY40菌株可湿性粉剂加工的湿润剂、分散剂、稳定剂。
筛选出的稳定剂与海洋细菌GY40菌株的新鲜干粉按1∶5、1∶10、1∶20的质量比混合均匀。分别在放置5d、10d、15d时称取不同配比的试样测定活菌数。确定稳定剂的配比。
将筛选出的最佳湿润剂和分散剂按不同的比例混合，粉碎机混合均匀后过325目筛，测定其润湿时间和悬浮率，筛选出湿润剂与分散剂的最佳质量配比。
将筛选出的最佳质量配比的分散剂和润湿剂按2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％的不同用量添加到海洋细菌GY40菌株的新鲜菌粉中。综合考虑润湿性和悬浮效果，筛选出湿润剂和分散剂的最佳用量。
1.8海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的加工
1.8.1发酵液载体的吸附
根据载体筛选实验结果对发酵液进行吸附。
发酵液温度降低20℃以下后将载体按计算好的用量缓慢加入到发酵液中，搅拌速度为150r/min，加完后继续搅拌30min，静置1-2h。
吸附过程中分别按发酵液体积的2％和3％加入氯化钙和磷酸氢二钠。
把氯化钙和磷酸氢二钠分别加热水搅拌溶解，用水量为能其溶解即可，搅拌转速为100r/min，至完全溶解，溶液温度降到40℃后，分别加入到载体吸附的发酵液中，继续搅拌20min，转速150r/min。搅拌5-10min，后静置30-60min。
1.8.2菌粉的制备
吸附絮凝好的GY40菌株发酵液转入板框过滤机中，利用压力将发酵液压缩进300目的筛布中挤压出水后，再通过空气压缩机吹入空气进行吹干。使板框内部压力达到0.3MPa，连续吹10min左右。板框过滤后的样品测定含水量和芽孢含量，干燥至含水量低于10％，得到GY40菌粉，测定芽孢含量。
1.8.3 GY40菌株可湿性粉剂的加工及其性质测定
按照筛选出的助剂种类和配比，向菌粉中加入助剂，气流粉碎，过300目筛，测定芽孢含量，按照国家可湿性粉剂的标准测定悬浮率、润湿时间和含水量，并测定不同保藏时间的可湿性粉剂芽孢含量。
1.9 GY40菌株可湿性粉剂对2种植物病原真菌的毒力测定
采用含药平板法，将制备得到的不同质量的GY40菌株可湿性粉剂加入到装有70mLPDA培养基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复，以不加粉剂为对照。取直径为5mm的供试黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌菌苔于不同浓度的含药平板中央，28℃下培养5d。采用十字交叉法测量植物病原菌菌落直径，计算抑制率，查询抑制率几率值，以浓度对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，建立GY40菌株可湿性粉剂对2种植物病原真菌的毒力回归方程，计算EC50和EC90。
1.10 GY40菌株可湿性粉剂对黄瓜生长的促进作用和对黄瓜枯萎病的防治作用
1.10.1黄瓜枯萎病菌的活化及其麦粒培养物的制备
将直径9mm的黄瓜枯萎病菌接菌苔5片，接种到装有装入20g麦粒和30m水的500ml三角瓶中，28℃恒温培养5d。取出扩繁后的黄瓜枯萎病菌培养物加入土壤中，混匀制成菌含量为3％的含菌土壤。
1.10.2拌种处理：
取黄瓜种子质量的1％、3％、5％、7％和9％的GY40菌粉与黄瓜种子进行拌种后催芽，播种到不同花盆中，以未处理的种子作为对照组(CK)。每个浓度播种3盆，每盆播种30粒黄瓜种子。
1.10.3拌土法：
按照菌粉和土壤的质量比，将GY40可湿性粉剂与接种黄瓜枯萎病菌的含菌土壤进行混合，配成0.15g/g、0.20g/g、0.25g/g、0.30g/g和0.35g/g的含菌土壤，以不加菌粉的土壤为对照组(CK)，每个花盆加入2000g不同菌粉含量的土壤，播种已催芽的黄瓜种子，每盆栽种30粒种子，每个浓度播种3盆。
1.10.4灌根法：使溶液最终将催芽后的黄瓜种子播种在装有接种黄瓜枯萎病菌土壤的花盆中，待黄瓜长到子叶期时期，分别用浓度为0.20g/ml、0.27g/ml、0.33g/ml、0.40g/ml和0.47g/ml的可湿性粉剂溶液进行灌根处理。每个处理组栽种一个花盆，每盆30株，每株幼苗灌根5ml，以无菌水为对照。
定期测定幼苗的株高、茎粗、地上和地下部鲜种子重以及须根数，调查发病率和病情指数，计算防病效果。
Figure BDA0001527706750000091
Figure BDA0001527706750000092
Figure BDA0001527706750000093
1.11 GY40菌株可湿性粉剂对防治小麦赤霉病效果
1.11.1供试小麦品种及其种植情况
实验在灌南县新安镇闸北村高效农业示范园进行，地势平坦，长势较好，前茬水稻秸秆全部还田，肥水管理统一。小麦品种为淮麦33，前茬为水稻，每亩基本苗约33万株，机械条播，基肥亩施45％复合肥30千克，尿素10千克；返青期亩施尿素5千克；拔节期亩施45％复合肥20千克，尿素5千克；孕穗肥亩施尿素5千克；灌浆期叶面喷肥。
1.11.2试验设计与结果调查
设小麦初花期、盛花期单独用药及初花期、盛花期两次用药3个处理，每个处理3次重复，各小区随机排列，每个小区面积66.7m2。以60％叶菌唑·福美双为对照药剂。
于2017年5月2日第一次用药，小麦处于扬花初期，每亩药量60克兑水30公斤用手动喷雾器喷雾，5月5日第二次用药，小麦处于扬花盛期。药后6小时内无阴雨。第一次施药后仅于5月4日出现降雨，第二次施药后天气以晴好天气为主，均未出现降雨。施药后待小麦赤霉病显症后即5月25日进行调查，采用三点取样法，每点选取一平方米统计病穗数、病级、总穗数，并计算病穗率、病指和防治效果。
赤霉病病级分级标准：出现穗腐症状(或由杆腐引起的白穗症状)的病小穗占全部小穗的比例。划分为5级。
0级：无病；
1级：病小穗占全部小穗的1/4以下；
2级：病小穗占全部小穗的1/4-1/2；
3级：病小穗占全部小穗的1/2-3/4；
4级：病小穗占全部小穗的3/4以上。
Figure BDA0001527706750000101
Figure BDA0001527706750000102
Figure BDA0001527706750000103
2结果与分析
2.1 GY40菌株的特性
2.1.1 GY40菌株及其发酵液对不同病菌的抑菌作用
表3 GY40菌株及其发酵液的抑菌谱测定结果抑菌带宽度(mm)
Figure BDA0001527706750000104
GY40菌株及其发酵液对供试的14种重要的植物病原真菌均有较好的抑制作用，抑菌带宽度均在15mm以上，其中对黄瓜枯萎病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌和青枯病菌抑菌作用最强，发酵液和菌体的抑菌带宽度均大于28mm，表明GY40菌株抑菌作用强且具有广谱性。结果见表3。
2.1.2 GY40菌株耐盐性测定结果
菌株GY40在不同盐度条件下发酵液细胞数目不同，盐浓度为3％时细胞增加速度快，28h菌体数目最高达2.08×109个/mL，盐浓度低于或高于3％，细胞数目增加缓慢，高于盐度为5％时仍能生长，说明GY40菌株适合海洋环境，能够耐受较高盐度。
表4 GY40菌株在不同盐浓度下的含菌量(个/mL)
Figure BDA0001527706750000111
2.2 GY40菌株产芽孢培养基优化
2.2.1产芽孢基础培养基筛选结果
海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株应用2号培养基进行发酵得到的发酵液的细菌数和芽孢产率最高，分别为1.86×109个细胞/mL和100％。其次是5号培养基，发酵液的细菌数和芽孢产率分别为1.58×109个细胞/mL和100％。3号培养基得到的发酵液的细菌数最少，为1.18×109个细胞/mL；4号培养基得到的发酵液的芽孢产率最少，为78％。因此选择2号培养基作为海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株培养基优化的基础培养基。
2.2.2 GY40菌株产芽孢培养基优化的单因素试验
(1)氮源种类筛选
海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株在含有不同氮源的培养基中细菌数量不同，但产芽孢率均达到了100％。以氮源A(豆饼粉)为氮源的发酵液的细菌数和芽孢率均为最高，分别为2.34×109个细胞/mL和100％，其次是含有4号氮源的培养基，发酵液的细菌数为1.42×109个细胞/mL。含有6号氮源的培养基得到的发酵液的细菌数最少，为4.5×108个细胞/mL。因此，选择豆饼粉作为GY40菌株产芽孢培养基的最佳氮源。
(2)氮源浓度筛选
GY40菌株在含有不同浓度氮源的培养基中，细菌数不同，芽孢产率均达到了100％。氮源的浓度在0.4％到1.0％的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数随着浓度的增大逐渐增加，浓度为1.0％时，细菌数和芽孢产率均达到最大，分别为2.02×109个细胞/mL和99％，浓度高于1.0％，GY40菌株发酵液的细菌数则随着浓度的增大逐渐减少。因此选择1.0％作为GY40菌株产芽孢培养基的最佳氮源浓度。
(3)碳源种类筛选
海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株在含有不同碳源1的培养基中芽孢产率和细菌数均有所不同，GY40菌株在含有B碳源(玉米粉)的培养基中发酵液的细菌数和芽孢产率均为最高，分别为1.97×109个细胞/mL和100％。其次为1号碳源发酵液的细菌数为1.56×109个细胞/mL，1号和2号碳源发酵液的细菌数较低，因此，选择3号碳源玉米粉作为GY40菌株产芽孢培养基中的碳源1。
在筛选出一种碳源后在分别添加碳源2，配制成不同组合碳源培养基，测定不同组合培养基中的细菌数和产芽孢率。
在含有4号碳源2葡萄糖的发酵液的细菌数和芽孢产率均达到最高的，分别为2.18×109个细胞/mL和100％。含有1号碳源2的发酵液的细菌数较高，但芽孢产率最低，分别为1.79×109个细胞/mL和85％，含有3、6、7号碳源2的发酵液的芽孢产率也达到了100％，但细菌数明显低于其他碳源2。因此，选择4号碳源2葡萄糖作为GY40菌株产芽孢培养基的碳源。
(3)碳源浓度筛选结果
GY40菌株在含有不同浓度碳源1玉米粉和碳源2葡萄糖的培养基中细菌数有所不同，芽孢产率均达到了100％。
碳源1玉米粉的浓度在0.6％到1.2％的范围内，发酵液的细菌数随着浓度的增大逐渐增加，浓度为1.2％时，发酵液的细菌数和芽孢产率均达到最大，分别为1.92×109个细胞/mL和100％，浓度高于1.2％细菌数则随着浓度的增大逐渐减少。因此选择1.2％作为GY40菌株产芽孢培养基的碳源1玉米粉的浓度。
碳源2葡萄糖的浓度在0.1％到0.2％的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数随着浓度的增大逐渐增加，浓度为0.2％时发酵液的细菌数和芽孢产率均达到最大，分别为2.47×109个细胞/mL和97％，浓度高于0.2％，发酵液的细菌数则随着浓度的增大逐渐减少。因此选择0.2％作为GY40菌株产芽孢培养基的碳源2葡萄糖的最佳浓度。
(4)无机盐种类筛选结果
不同无机盐种类对海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株发酵液的芽孢产率和细菌数的影响程度不同。GY40菌株在含有无机盐D(硫酸镁)的培养基的发酵液的细菌数和芽孢产率均为最大，分别为2.21×109个细胞/mL和100％。其次为9号无机盐，发酵液的细菌数和芽孢产率分别为1.63×109个细胞/mL和98.1％。6号无机盐发酵液的细菌数最少，为6.2×108个细胞/mL，1号无机盐的发酵液的芽孢产率最低，为7％。因此，选择硫酸镁作为GY40菌株产芽孢培养基的最佳无机盐。
(5)无机盐浓度筛选结果
GY40菌株在含有不同浓度硫酸镁的培养基中细菌数不同，但芽孢产率均达到了100％。硫酸镁的浓度在0.1％到0.3％的范围内，发酵液的细菌数随着浓度的增大逐渐增加，浓度为0.3％时细菌数和芽孢产率均达到最大，分别为2.23×109个细胞/mL和100％，浓度高于0.3％后，GY40菌株发酵液的细菌数则随着浓度的增大逐渐减少。因此选择0.3％作为GY40菌株产芽孢培养基的最佳硫酸镁浓度。
2.2.3 GY40菌株产芽孢培养基优化正交试验结果
通过但因素试验筛选出的氮源豆饼粉(A)、碳源1玉米粉(B)、碳源2葡萄糖(C)、和无机盐硫酸镁(D)种类及其浓度，设计表4所示的因素与水平进行正交试验。
表5 GY40菌株产芽孢培养基优化正交试验因素与水平
Figure BDA0001527706750000131
正交试验中培养基成分的不同组发酵液的细菌数明显不同，但芽孢产率均达到了100％。组合6发酵液的细菌数最高，为2.69×109个细胞/mL，与其他组合差异达显著水平，认为正交试验的最优的组合为组合6，结果见表6。因此选择组合6(A豆饼粉(％)0.8％，玉米粉B 1.4％，C葡萄糖0.2％，D硫酸镁0.3％)作为GY40菌株产芽孢发酵培养基。统计分析表明，培养基不同组分对GY40菌株发酵液细菌数的影响主次顺序为：D＞B＞C＞A。
表6 GY40菌株产芽孢培养基优化正交设计L9(34)及试验结果
Figure BDA0001527706750000141
2.3海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株摇瓶发酵条件优化
2.3.1产芽孢时间曲线
发酵液的细菌数在0-4h菌体数目增加缓慢，为迟滞期，4-20h随着发酵时间的延长菌体数目快速增加，为对数生长期，20h时发酵液的细菌数达到最高，为3.0×109个细胞/mL，进入稳定期，20-40h为稳定期，40h进入衰退期。从22h开始产生芽孢，22-40h发酵液中的芽孢产率随着发酵时间的增加逐渐增加，40h时发酵液的芽孢产率达到了最高，为100％，其后芽孢率无明显变化。
2.3.2发酵初始pH值优化结果
不同的pH值对海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株发酵液的细菌数有不同的影响，但芽孢产率基本一致，均达到100％。
pH值在5到7的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数随着pH值的增大逐渐增加，当pH值为7时，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率都达到了最大值，分别为4.34×109个细胞/mL和100％。当pH值高于7后，GY40菌株发酵液的细菌数随着pH值的增大逐渐减少。因此选择7作为GY40菌株摇瓶发酵初始pH值。
2.3.3培养温度优化结果
不同培养温度下，海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率有所差异。培养温度在24℃到30℃的范围内，细菌数和产芽胞率均随着温度的升高逐渐增加，当温度为30℃时，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率均达到最大值，分别为3.32×109个细胞/mL和100％。温度高于30℃细菌数和产芽胞率随着温度的升高逐渐减少。因此选择30℃作为GY40菌株摇瓶发酵培养温度。
2.3.4接种量优化结果
不同的接种量对海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株发酵液的细菌数有不同的影响，GY40菌株发酵液的芽孢产率基本达到100％。
接种量在2％到6％的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数随着接种量的增加逐渐增加。当接种量为6％时，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率都达到了最大值，分别为3.34×109个细胞/mL和100％。当接种量高于6％后，GY40菌株发酵液的细菌数随着接种量的增加逐渐减少。综上分析，选择6％作为GY40菌株摇瓶发酵最佳接种量。
2.3.5装液量优化结果
海洋多粘类芽孢杆菌菌GY40菌株在有不同的装液量的250mL三角瓶中培养得到的发酵液的细菌数变化较明显，GY40菌株发酵液的芽孢产率基本达到100％。装液量在30mL到60mL的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数和产芽孢率均随着装液量的增加逐渐增加。当装液量为60mL时，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率都达到了最大值，分别为3.21×109个细胞/mL和100％。当装液量高于60mL后，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率随着装液量的增加逐渐减少。因此认为60mL为GY40菌株摇瓶发酵最佳装液量。
2.3.6摇床转速优化结果
海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株在不同的转速下培养得到的发酵液的细菌数有较明显的不同，GY40菌株发酵液的芽孢产率基本达到100％。转速在140r/min到200r/min的范围内，GY40菌株发酵液的细菌数随着转速的增加逐渐增加。当转速为200r/min时，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率都达到了最大值，分别为4.12×109个细胞/mL和100％。当转速高于200r/min后，GY40菌株发酵液的细菌数随着转速的增加逐渐减少。因此选择200r/min作为GY40菌株摇瓶发酵转速。
2.4 GY40菌株产芽孢培养基和发酵条件优化验证试验
GY40菌株在优化后的产芽孢发酵培养基配方和最佳的摇瓶发酵条件下进行发酵，以优化前的基础培养基和发酵条件为对照，结果，经过培养基和发酵条件的优化，GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率都有显著的提高，细菌数由9×108个细胞/mL增加到4.4×109个细胞/mL，芽孢产率达到了100％。
海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株和解淀粉芽孢杆菌GY30菌株在4种不同培养基中的菌体数量和芽孢率明显不同。GY40菌株在本实验优化的培养基(1号)中发酵液的细菌数和芽孢产率最高，分别为4.2×109个细胞/mL和99％，明显高于其他培养基；对照GY30菌株在2号培养基发酵液的细菌数最高，但芽孢产率仅为71％，结果见表7。说明本实验优化的培养基配方对于GY40菌株具有特异性。
表7优化前后GY40菌株发酵液的细菌数和芽孢产率
Figure BDA0001527706750000161
2.5海洋多粘类芽孢杆菌GY40菌株产芽孢发酵工艺扩大
2.5.1温度对GY40菌株在1吨发酵罐中发酵的影响
GY40菌株在温度为30℃和32℃两种条件下的菌体生长情况及其芽孢形成情况。在30℃条件下，延滞期为0～24h，发酵周期为50h，生物量为4.42×109个/mL，芽孢率为100％；在32℃时延滞期为0～12h，发酵周期为36h，生物量为4.67×109个/mL，芽孢率达到96％，比30℃发酵周期减少了14h。说明提高温度，能缩短延滞期，加快了该菌株的生长速度，发酵周期变短。
2.5.2接种量对GY40菌株在1吨发酵罐中发酵的影响
GY40菌株在接种量为0.75％和10％两种条件下的菌体生长情况及其芽孢形成情况。接种量为0.75％时，生物量为4.67×109个/mL，芽孢率为96％，发酵周期为36h；接种量为10％时，生物量为2.25×109个/mL，芽孢率为100％，发酵周期为20h，发酵周期比接种量为0.75％时缩减了16h。但接种量为10％时的最终生物量仅是接种量为0.75％时最终生物量的一半。可能是由于提高接种量后，在对数生长期时发酵液中营养不足，导致生物量不高，下一步将检测提高物料浓度对GY40菌株发酵水平的影响。
2.5.3物料浓度对GY40菌株在1吨发酵罐中发酵的影响
由实验结果可知，物料浓度提高20％后GY40菌株发酵至12h生物量达到最大，生物量为4.44×109个/mL；至26h时芽孢率达到95％。生物量明显高于对照组的生物量2.32×109个/mL，但芽孢形成时间变长。说明发酵物料浓度对GY40菌株的发酵水平有显著影响。
综合2.5.1、2.5.2、2.5.3的实验结果，认为GY40菌株在1吨发酵罐中的发酵条件为：接种量为5％-10％，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量为30m3/h，发酵时间为36h。发酵培养基配方为葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。
2.6海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂加工载体与助剂的筛选
2.6.1载体的筛选
(1)不同载体与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定
从表8可看出，添加载体硅藻土、皂土、凹凸棒土和膨润土的发酵液中的活菌数均明显大与空白对照组，说明这些载体对海洋细菌GY40菌株的生长表现出明显的促进作用，与菌株的生物相容性较好。而添加载体活性白土、高岭土和碳酸氢钙的处理组发酵液中活菌数比空白对照少，则说明其抑制了海洋细菌GY40菌株的生长，与海洋细菌GY40菌株的生物相容性较差。
添加载体B(皂土)的发酵液中的活菌数最高，为1.22×1010CFU/mL，约为空白对照组的7倍，说明在试验所测定的所有载体中，载体B与海洋细菌GY40菌株的生物相容性最好。此外，载体硅藻土和凹凸棒土与GY40菌株也有较好的生物相容性，发酵液中活菌数分别为6.98×109CFU/mL、3.07×109CFU/mL。
表8添加不同载体的海洋细菌GY40菌株发酵24h的菌落数
Figure BDA0001527706750000171
(2)不同载体对海洋细菌GY40菌株吸附量的影响
添加不同载体对海洋细菌GY40菌株吸附量的测定结果如表9。本试验中所选载体所选载体对海洋细菌GY40的吸附效果有显著差异，吸附效果由大到小依次为：皂土＞硅藻土＞活性白土＞膨润土＞高岭土＞凹凸棒土＞碳酸氢钙。其中皂土对海洋细菌GY40菌液的吸附效果最好，平均吸附量可达2.333mL/g，其吸附量明显多于其他载体。
表9不同载体对海洋细菌GY40发酵液吸附量的影响
Figure BDA0001527706750000181
(2)不同载体对海洋细菌GY40菌株制剂的润湿性和悬浮率的影响
添加不同载体的润湿时间由短到长依次为：碳酸氢钙＞高岭土＞凹凸棒土＞硅藻土＞皂土＞膨润土＞活性白土，其中添加碳酸氢钙的制剂润湿时间最短，为25s，而添加活性白土的润湿时间最长，为107s；添加不同载体的悬浮率由小到大依次为：凹凸棒土＞硅藻土＞膨润土＞活性白土＞皂土＞高岭土＞碳酸氢钙，碳酸氢钙的悬浮率也最高，为87％，添加凹凸棒土的悬浮率较低，为66％。上述结果说明添加载体碳酸氢钙的制剂润湿性和悬浮性较好。
表10不同载体对海洋细菌GY40菌株制剂的润湿性和悬浮率的影响
Figure BDA0001527706750000182
Figure BDA0001527706750000191
结合不同载体与海洋细菌GY40菌株的生物相容性，不同载体对海洋细菌GY40菌株的吸附量以及不同载体对制剂性质的影响，本试验选择载体皂土作为海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的载体。
2.6.2稳定剂的筛选
(1)稳定剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定结果
添加不同稳定剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定结果如表11所示，结果表明，不同的稳定剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性有明显差异。
其中添加稳定剂B(海藻酸钠)钙的发酵液活菌数最高，为1.76×1010CFU/mL，说明稳定剂海藻酸钠对海洋细菌GY40菌株的生长有明显的促进作用，与海洋细菌GY40菌株生物相容性较好；而其余稳定剂与海洋细菌GY40菌株的生物相容性较差添加后发酵液中的活菌数与空白对照相比显著减少。
表11添加不同稳定剂的海洋细菌GY40菌株发酵24h的菌落数
Figure BDA0001527706750000192
(2)不同稳定剂对制剂性能影响
不同稳定剂对制剂性能有明显的影响，添加不同稳定剂的润湿时间由短到长的顺序为：海藻酸钠＜硬脂酸钙＜荧光素钠＜腐殖酸＜硬脂酸锌＜黄原胶，添加海藻酸钠的润湿时间最短，为63s，硬脂酸钙、荧光素钠次之；海藻酸钠的悬浮率最高，为81％，悬浮效果最佳，其次是荧光素钠、硬脂酸钙。综合考虑润湿效果和悬浮效果，海藻酸钠＞硬脂酸钙＞荧光素钠。综合考虑稳定剂与海洋细菌GY40菌株的生物相容性、润湿效果和悬浮效果，选择海藻酸钠作为制剂的稳定剂。
表12不同稳定剂对制剂性能影响的测定结果
Figure BDA0001527706750000193
Figure BDA0001527706750000201
(3)稳定剂配比的筛选结果
由表13可看出，菌粉与稳定剂海藻酸钠的配比不同，保存相同天数活菌数的减少量也不同。存放15d时，不添加稳定剂海藻酸钠的制剂中活菌数最少，为9.07×108CFU/g，添加不同配比稳定剂海藻酸钠的制剂活菌数均明显高于空白对照，说明添加稳定剂海藻酸钠提高了制剂的稳定性。且当菌粉与稳定剂的配比为5∶1时，制剂存放15d时活菌数最多，说明当菌粉与稳定剂的配比为5∶1时，此时稳定性最佳。
因此可以确定菌粉与稳定剂B的最优配比为5∶1。
表13加入不同比例海藻酸钠的GY40菌株制剂存放不同时间的活菌数(CFU/g)
Figure BDA0001527706750000202
2.6.3湿润剂、分散剂、展着剂的筛选结果
(1)湿润剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定结果
从表14可看出，添加湿润剂的发酵液中的活菌数与空白对照相比都有明显增加。说明供试的湿润剂对海洋细菌GY40菌株的生长都有一定的促进作用，与海洋细菌GY40菌株的生物相容性较好。蔗糖脂肪酸酯＞木质素磺酸钠＞吐温80＞脂肪醇聚氧乙烯醚25＞十二烷基苯磺酸钠＞乙氧基化烷基硫酸钠＞空白对照，其中添加蔗糖脂肪酸酯的发酵液中的活菌数最高，为8.98×109CFU/mL，是空白对照的5倍左右。说明蔗糖脂肪酸酯与海洋细菌GY40菌株的生物相容性最好。
表14添加不同湿润剂的海洋细菌GY40菌株发酵24h的菌落数
Figure BDA0001527706750000203
Figure BDA0001527706750000211
(2)不同湿润剂对制剂性质的影响
表15不同湿润剂对制剂性质的影响
Figure BDA0001527706750000212
添加不同湿润剂对制剂的湿润时间和悬浮率有明显影响(表15)。添加不同湿润剂的湿润时间由长到短依次为：乙氧基化烷基硫酸钠＞木质素磺酸钠＞蔗糖脂肪酸酯＞脂肪醇聚氟乙烯醚25＞吐温80＞十二烷基苯磺酸钠。添加不同湿润剂的悬浮率由高到低的顺序为：十二烷基苯磺酸钠＞脂肪醇聚氟乙烯醚25＞乙氧基化烷基硫酸钠＞蔗糖脂肪酸酯＞木质素磺酸钠＞吐温80，其中添加十二烷基苯磺酸钠时润湿时间最短，润湿时间为9s，悬浮率也最高，为80％。说明十二烷基苯磺酸钠的润湿效果和悬浮效果都明显好于其他湿润剂。
综上所述，本试验选择十二烷基苯磺酸钠作为制剂的湿润剂。
(3)分散剂与海洋细菌GY40菌株生物相容性的测定结果
不同分散剂与海洋细菌GY40菌株的生物相容性有明显的不同。由表16可以看出，供试分散剂聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠和柱层层析硅胶与海洋细菌GY40菌株有较好的生物相容性，对菌株的生长都表现了一定的促进作用；而薄层层析硅胶与海洋细菌GY40菌株的生物相容性较差。
表16添加不同分散剂的海洋细菌GY40菌株发酵24h的菌落数
Figure BDA0001527706750000213
(4)不同分散剂对制剂性质的影响
从表17可以看出，添加不同分散剂的制剂的悬浮率均比较高，表明分散剂能显著提高GY40可湿性粉剂的悬浮性。添加分散剂聚乙烯醇的悬浮率最高，为80％，悬浮时间最短，为10s；其次是羧甲基纤维素钠。添加展着剂柱层层析硅胶和薄层层析硅胶的悬浮率较低，湿润时间较长，湿润性差。因此在制剂制备的过程中不添加展着剂。
综合考虑以上筛选结果，选择聚乙烯醇作为GY40可湿性粉剂的的分散剂。
表17不同的分散剂、展着剂对制剂性质的影响
Figure BDA0001527706750000221
(5)湿润剂与分散剂的质量配比对制剂性质的影响
随着分散剂聚乙烯醇与湿润剂十二烷基苯磺酸钠质量配比的增加，制剂的悬浮率随着提高，同时制剂的润湿时间也随着变长(表18)。说明湿润剂与分散剂的质量配比对制剂性质有显著影响，分散剂质量的增加显著提高了制剂的悬浮率，同时湿润剂质量的减少显著延长了湿润时间。
综合考虑润湿性与悬浮性，选择分散剂与湿润剂的质量配比为5∶5。
表18不同湿润剂和分散剂对制剂性质的影响
Figure BDA0001527706750000222
(6)湿润剂与分散剂的用量对制剂性质的影响
湿润剂与分散剂的用量对制剂性质有明显的影响(表19)。由结果可知，随着湿润剂和分散剂添加量的增加，制剂的悬浮率随之提高，润湿时间变短。说明增加湿润剂与分散剂的用量将提高制剂的悬浮性和润湿性。同时考虑到湿润剂和分散剂用量的增加将导致制剂有效成分含量的减少，在本试验中，选择湿润剂与分散剂的用量为16％，此时制剂的悬浮率为82％，润湿时间为20s。
表19湿润剂与分散剂的用量对制剂性质的影响
Figure BDA0001527706750000223
Figure BDA0001527706750000231
根据对载体、稳定剂、润湿剂、分散剂的筛选与优化试验结果，确定海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的配方为：以皂土为载体的菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂十二烷基苯磺酸钠8％，分散剂聚乙烯醇8％。
2.7海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的制备及性质测定
2.7.1海洋细菌GY40菌株菌粉的制备
海洋细菌GY40菌株在1吨发酵罐中按优化的发酵条进行发酵，用筛选出的载体并增加絮凝作用的物质进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到菌粉。结果如表20。制备的菌粉含菌量达37.7×1010CFU/g，含水率6％。
表20 GY40菌株1吨发酵罐发酵记录
Figure BDA0001527706750000232
2.7.2海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的制备及其性质检测
按照优化海洋细菌GY40菌株的菌粉与助剂比例加入优化出的稳定剂、湿润剂和分散剂，混合均匀，粉碎后过325目筛，得到海洋细菌GY40可湿性粉剂。测得该制剂的润湿时间为48s，悬浮率为75％，含水量6％，制剂100％通过325目筛，活菌数为23.6×1010CFU/g，杂菌率为0。达到了国家农药可湿性粉剂的质量要求。活菌数明显高于已报道的多粘类芽孢杆菌制剂。
2.7.3海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂稳定性的测定结果
将制得的海洋细菌GY40可湿性粉剂存放于室温条件下(25℃)，每隔15d测定1次制剂中的活菌数。
表21海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂保存不同时间的活菌数
Figure BDA0001527706750000241
由表20可以看出，海洋细菌GY40菌株可湿性粉剂的活菌含量随着储存时间的延长有所下降，但减少的速度较缓慢，保存120d后活菌数减少较少，说明该菌株的可湿性粉剂稳定性较好。
2.8 GY40菌株可湿性粉剂对2种病原真菌的毒力测定
将不同质量的GY40菌株可湿性粉剂加入到装有70mL PDA的三角瓶中，混合均匀，制成不同浓度的含药平板，接种2种植物病原真菌，测定含有不同浓度GY40菌株可湿性粉剂平板的菌落直径，计算抑菌率。
2.8.1对小麦赤霉病菌的毒力测定
在1-500μg/L浓度范围内GY40菌株可湿性粉剂的浓度对数与对小麦赤霉病菌的抑菌率几率值呈直线关系，其毒力回归方程为y＝0.506x+4.583
相关系数为R2＝0.905，根据该方程计算的EC50值为6.874μg/L，EC90值为2272.48μg/L。结果见表22。
表22 GY40菌株可湿性粉剂对小麦赤霉病菌的毒力测定结果
Figure BDA0001527706750000242
2.8.2对黄瓜枯萎病菌的毒力测定
在0.5-50μg/L浓度范围内GY40菌株可湿性粉剂的浓度对数与对黄瓜枯萎病菌的抑菌率几率值呈直线关系，其毒力回归方程为y＝1.01x+4.023，相关系数为R2＝0.921，根据该方程计算的EC50值为9.27μg/L，EC90值为172.15μg/L。结果见表23。
表23 GY40菌株可湿性粉剂对黄瓜枯萎病菌的毒力测定结果
Figure BDA0001527706750000251
试验结果表明，GY40菌株可湿性粉剂对小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制作用在低浓度时抑菌作用随浓度的提高而提高较快，但浓度增加到一定程度抑菌作用增加缓慢。
2.9 GY40菌株可湿性粉剂对黄瓜生长的促进作用和对黄瓜枯萎病的防治作用
2.9.1拌种处理
幼苗三叶期时测量幼苗的地上、地下部分鲜重及其须根数以及株高和茎粗，结果见表23。不同浓度的GY40菌株可湿性粉剂拌种处理对黄瓜幼苗生长均具有明显的促进作用，所测定的各项指标均明显高于对照，浓度为5％时，幼苗的各项指标均最高，其次是浓度3％，均显著高于对照和其他浓度处理。
表24拌种处理黄瓜种子后黄瓜幼苗生长的影响
Figure BDA0001527706750000252
不同浓度的GY40菌株可湿性粉剂拌种处理对黄瓜枯萎病具有明显防治作用，不同处理浓度和不同调查时间防病效果不同，处理浓度为5％时防病效果最好，一叶期和二叶期防病效果最高，分别为62.67％和60.23％。结果见表25。从表25的结果可以看出，子叶期防病效果较低，一叶期最高，二叶期较高，三叶期防病效果下降，说明GY40菌株可湿性粉剂种子处理后需要一定时间后才能发挥防病作用，但时间延长防病作用会下降，表明单纯依靠种子处理防治枯萎病具有一定的时限，后期需要与其它方法结合才能达到较好的防治效果。
表24拌种处理对黄瓜枯萎病的防病效果(％)
Figure BDA0001527706750000261
2.9.2拌土处理
不同浓度的GY40菌株可湿性粉剂拌土处理对黄瓜幼苗生长均具有明显的促进作用，所测定的各项指标均明显高于对照，浓度为0.3％时，幼苗的各项指标均最高，其次是浓度0.25％和0.35％，均显著高于对照和其他浓度处理。结果见表26。
表26拌土处理对黄瓜幼苗生长的影响
Figure BDA0001527706750000262
不同浓度的GY40菌株可湿性粉剂拌土处理对黄瓜枯萎病具有明显防治作用，不同处理浓度和不同调查时间防病效果不同，处理浓度为0.3％时防病效果最好，二叶期和三叶期防病效果最高，分别为82.58％和78.23％。结果见表26。从表26的结果可以看出，子叶期防病效果较低，一叶期后防病效果明显提高最高，二叶期最高高，其次为三叶期，说明GY40菌株可湿性粉剂拌土处理后需要在土壤中经过一定时间定殖后才能发挥防病作用，但时间延长防病作用会下降。
表27拌土处理对枯萎病的防病效果(％)
Figure BDA0001527706750000271
2.9.3灌根浓度处理对黄瓜枯萎病的防治效果
不同浓度灌根处理对黄瓜枯萎病的防病效果见表27。不同浓度的GY40菌株可湿性粉剂灌根处理对黄瓜枯萎病具有明显防治作用，不同处理浓度和不同调查时间防病效果不同，处理浓度为0.33％时防病效果最好，子叶期和一叶期防病效果最高，分别为82.45％和72.22％，其后防病效果下降，随着时间的延长，对黄瓜枯萎病的防病效果逐渐下降，三叶期的防病效果为61.34％，使用过程中应考虑增加灌根次数，保证后期防病效果。处理浓度低于0.33％时防病效果较低。
表28灌根处理对黄瓜枯萎病的防病效果(％)
Figure BDA0001527706750000272
2.10 GY40菌株可湿性粉剂对小麦赤霉病的防治效果
试验结果表明，GY40菌株可湿性粉剂对小麦赤霉病具有明显的防治效果，初花期1次用药和初花期、盛花期2次用药的防病效果分别达到57.14％和70.59％，高于60％叶菌唑·福美双1次用药和2次用药的效果。初花期和盛花期用药一次的效果明显低于2次用药的效果。说明该制剂用于防治小麦赤霉病需要用药2次或3次连续用药。
表29 GY40菌株可湿性粉剂对小麦赤霉病的防治效采
Figure BDA0001527706750000273
Figure BDA0001527706750000281
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1、本发明提供了一种新的来自海洋的菌株，该菌株具有陆源微生物不具有的较强耐盐性，生长温度低、抑菌作用强的优点；
2、本发明所提供的产芽孢发酵方法配方简单，原料主要为农产品下脚料，价格低廉，来源广泛，菌株生长速度快，发酵温度低，发酵时间短，发酵条件易于控制，发酵芽孢产量高，减少了原料成本，降低了发酵能耗，提高了发酵生产效率，发酵产生物量为4.44×109个/mL，芽孢率达到95％。
3、本发明方法制得的菌粉和可湿性粉剂配方简单，芽孢含量高，杂菌含量低，保质期长，菌株可湿性粉剂的活菌数为23.6×1010CFU/g，明显高于已报道制剂的活菌数，润湿时间为48s，悬浮率为75％，含水量6％，制剂100％通过325目筛，杂菌率为0。达到了国家农药可湿性粉剂的质量要求。
4、本发明方法中，发酵液、菌粉和可湿性粉剂对小麦赤霉病、黄瓜枯萎病具有很好的防治作用，可以用于小麦和黄瓜种植。对小麦赤霉病菌的毒力回归方程为y＝0.506x+4.583，相关系数为R2＝0.905，根据该方程计算的EC50值为6.874μg/L，EC90值为2272.48μg/L。对小麦赤霉病的防效达70.59％。对黄瓜枯萎病菌毒力回归方程为y＝1.01x+4.023，相关系数为R2＝0.921，根据该方程计算的EC50值为9.27μg/L，EC90值为172.15μg/L。通过种子处理、拌土和灌根处理，能够促进黄瓜生长，对枯萎病的防效达80％以上。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)GY40菌株，其保藏号为：CGMCC NO.14481。
所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，其步骤如下：
(1)将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；
(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量调整为30m3/h，发酵时间为26h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。
将多粘类芽孢杆菌GY40菌株在发酵罐中以上所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY40菌粉。其中：吸附所加入的氯化钙为发酵液体积的2％，所加入的磷酸氢二钠按为发酵液体积的3％。
取按以上所述的方法制得的GY40菌粉，按以下质量百分比向GY40菌粉中加入助剂：GY40菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂十二烷基苯磺酸钠8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到GY40菌株可湿性粉剂。
以上所述的方法所制得的发酵液、GY40菌粉、GY40菌株可湿性粉剂均可以作为有效成份用来制造防治小麦赤霉病的药物或者药物组合物，或者作为有效成份用来制造防治黄瓜枯萎病的药物或者药物组合物。

Claims (7)

1.一种源自海洋的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)GY40菌株，其特征在于，其保藏号为：CGMCC NO.14481。
2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株的产芽孢发酵培养方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将GY40菌株接种到PDA培养基上活化24h，在无菌条件下用接种环挑取GY40菌株于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为109个细胞/mL，作发酵用种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖20g/L、马铃薯200g/L、水1L；
(2)将种子液按接种量为5％-10％接种于装有发酵培养基的发酵罐进行产芽孢发酵培养，搅拌速度为150r/min，在0～12h时通气量为14m3/h，12h后通气量调整为30m3/h，发酵时间为26h，得发酵液；发酵培养基配方为：葡萄糖0.24％，豆饼粉0.96％，玉米粉1.68％，硫酸镁0.36％，初始pH 7.0。
3.利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备GY40菌粉的方法，其特征在于，其步骤如下：将多粘类芽孢杆菌GY40菌株在发酵罐中按权利要求2所述的方法进行产芽孢发酵培养，得到的发酵液用皂土为载体，并增加氯化钙和磷酸氢二钠进行吸附，板框过滤后，得到菌饼，干燥后得到GY40菌粉。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：吸附所加入的氯化钙为发酵液体积的2％，所加入的磷酸氢二钠按为发酵液体积的3％。
5.利用权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌GY40菌株制备可湿性粉剂的方法，其特征在于，其步骤如下：取按权利要求3或4所述的方法制得的GY40菌粉，按以下质量百分比向GY40菌粉中加入助剂：GY40菌粉70％，稳定剂海藻酸钠14％，湿润剂十二烷基苯磺酸钠8％，分散剂聚乙烯醇8％；混合均匀，粉碎后过300目筛，得到GY40菌株可湿性粉剂。
6.权利要求2所述的方法所制得的发酵液、权利要求3或4所述的方法所制得的GY40菌粉或者权利要求5所述的方法所制得的GY40菌株可湿性粉剂作为有效成份在制造防治小麦赤霉病的药物或者药物组合物中的用途。
7.权利要求2所述的方法所制得的发酵液、权利要求3或4所述的方法所制得的GY40菌粉或者权利要求5所述的方法所制得的GY40菌株可湿性粉剂作为有效成份在制造防治黄瓜枯萎病的药物或者药物组合物中的用途。
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