CN109439555B - 一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母 - Google Patents

一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用微生物进行环境或食品中污染物减除的领域，具体涉及一株从自然发酵红葡萄酒中分离出的对氯氰菊酯具有较高吸附能力的酿酒酵母。可有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株号为HP，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏；保藏号为CGMCC No.16134，保藏日期为2018年07月19日。该菌株除能吸附氯氰菊酯外，还对其它拟除虫菊酯类农药及其主要降解产物—3‑苯氧基苯甲基有一定吸附作用。本发明酿酒酵母HP可开发相应的生物制剂，用于环境和食品中拟除虫菊酯的脱除；或将该菌株开发成保健食品或药品，减少拟除虫菊酯类农药对人体暴露的危害。

Description

一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母
技术领域
本发明涉及利用微生物进行环境或食品中污染物减除的领域，具体涉及一株从自然发酵红葡萄酒中分离筛选出的对氯氰菊酯具有较高吸附能力的酿酒酵母。
背景技术
氯氰菊酯(Cypermethrin，CY)是常用的拟除虫菊酯农药之一，主要用于果蔬、棉花、茶叶、谷物等作物及多种卫生害虫的防治。氯氰菊酯对光、热稳定，半衰期长，自然降解速率缓慢，在空气、水体、土壤、果蔬、茶叶、食用菌、水产品中有较高的检出率和超标率。研究显示，拟除虫菊酯类农药对高等哺乳动物可能具有生殖毒性、神经毒性、细胞毒性和免疫毒性，因此有效地减少和脱除环境与食品中残留的拟除虫菊酯已成为目前的研究热点。
去除拟除虫菊酯类农药的常用方法有物理吸附法、化学降解法、生物降解法三种。上述方法均有局限性，如辐照法成本高，大孔吸附树脂使用过程繁琐，化学降解法、生物降解法可能会产生毒性更强的中间产物，很大程度上限制了其应用范围。
微生物吸附剂作为一种有效去除有毒有害物质的技术手段，因其种类繁多、来源广泛、绿色、高效、经济等优点，受到了学者的广泛关注。目前用于吸附的微生物主要有细菌、霉菌、酵母菌等。与其他微生物相比，酵母菌对外部环境耐受性强、吸附效果好。研究表明，酵母菌可用于吸附重金属、真菌毒素、染料、植物生长调节剂等有毒有害物质，但未见有酵母菌用于拟除虫菊酯类农药吸附的相关报道。酿酒酵母广泛应用于啤酒、白酒、葡萄酒酿造及面包制作，也是我国农业部允许使用的饲料添加剂，安全性高。因此，有必要筛选获得吸附拟除虫菊酯类农药酿酒母并用于农药的减除。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一株可有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) HP及其应用。
本发明所提供的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 菌株号HP，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.16134，保藏日期为2018年07月19日。
本发明提供吸附菌株的分离、筛选、鉴定。
取自然发酵红葡萄酒1 mL加入9 mL无菌生理盐水，混匀后进行10倍梯度稀释，取适宜稀释度样液100 μL涂布于PDA平板上，28℃培养48~72 h。挑取具有酵母菌典型菌落特征的单菌落进一步分离纯化，于PDA斜面培养基上培养后保存备用。
将上述获得的酵母菌进行高效吸附氯氰菊酯菌株的体外筛选，取斜面菌种一环接入5 mL的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中，28℃培养40~48 h，然后按2%接种量连续活化两次。将菌液于8000 r/min、4℃离心10 min，弃去上清液，收集菌体，用无菌水洗涤离心2次并重悬，调整细胞浓度为1.0×109 CFU/mL。
取1 mL上述菌悬液于8000 r/min、4℃离心10 min，弃去上清液，加入1 mL浓度为10 mg/L的氯氰菊酯溶液，混匀。将混合液于30℃振荡培养12 h，12000 r/min离心15 min，取上清液用高效液相色谱法(HPLC)测定氯氰菊酯浓度，以不含酵母菌细胞的10 mg/L 氯氰菊酯溶液作为空白对照，计算吸附率。
所述HPLC检测方法为：Agilent 1260-LC液相色谱仪，反相岛津InertSustain C18色谱柱规格为内径×长度=4.6 mm×250 mm、粒径=5 μm，乙腈:超纯水=85:15为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长210nm。
氯氰菊酯吸附率的计算公式为：
Figure 908997DEST_PATH_IMAGE001
式中：C 0为空白对照中氯氰菊酯的浓度(mg/L)；C为吸附体系中吸附后氯氰菊酯残留的浓度(mg/L)。
菌株形态鉴定：平板菌落呈圆形、白色、中央凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、有发酵香气。酵母细胞呈椭圆形，出芽繁殖，无假菌丝。
菌株生理生化鉴定：菌株发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不发酵乳糖、纤维二糖；可以同化葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，不能同化木糖、纤维二糖、山梨醇、甘露醇、柠檬酸；可以同化硫酸铵和尿素，不能同化硝酸钾。
菌株HP分子遗传学鉴定。
菌株HP经26S rDNA序列测定，获得如下序列：
CGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG
该菌株的26S rDNA 基因测序结果与 GenBank 数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Saccharomyces cerevisiae菌株基因序列高度同源，得到登录号为MH143598，结合形态学和生理生化指标，最终将菌株HP鉴定为酿酒酵母。
本发明所提供的高效吸附氯氰菊酯的菌株是从自然发酵红葡萄酒中分离筛选得到的，该菌株在一定温度和pH范围内均对氯氰菊酯有很好的吸附能力，吸附速度快，且灭活菌体同样具有氯氰菊酯吸附能力，在果蔬汁中脱除氯氰菊酯并不对果蔬汁色泽造成影响。
本发明所用培养基为：马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)：新鲜土豆去皮切块，称取200 g，加入500 mL蒸馏水煮沸20 min，过滤，加葡萄糖 20 g，再加蒸馏水至1000 mL，121℃灭菌20min。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：在PDB中加入2%琼脂即为PDA。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：首次从自然发酵红葡萄酒中筛选获得高效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母，酿酒酵母是食品工业常用的发酵菌种，也是农业部批准使用的饲料添加剂，该菌株来源安全，具有吸附快速、吸附能力强、操作简单等优点，可为环境和食品中残留氯氰菊酯的脱除提供良好菌源。
附图说明
图1为吸附菌株HP的菌落形态和细胞形态图。
图2为培养时间对菌株吸附氯氰菊酯的影响。
图3为培养温度对菌株吸附氯氰菊酯的影响。
图4为pH对菌株吸附氯氰菊酯的影响。
图5为菌体浓度对菌株吸附氯氰菊酯的影响。
具体实施方式
实例1：菌株HP对氯氰菊酯的吸附特性。
1) 培养时间对氯氰菊酯吸附率的影响 将细胞浓度为1×109 CFU/mL的菌株HP与10 mg/L 氯氰菊酯工作液在30℃下分别振荡培养15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h，测定不同培养时间下菌体对氯氰菊酯的吸附率。同时设置不含菌体的氯氰菊酯工作液为阳性对照，在相同时间点收集样品，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
2) 培养温度对氯氰菊酯吸附率的影响 将细胞浓度为1×109 CFU/mL的菌株HP与10 mg/L 氯氰菊酯工作液分别在10℃、20℃、30℃、37℃、42℃振荡培养2 h。以不同温度下不含菌体的氯氰菊酯工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
3) pH对氯氰菊酯吸附率的影响 将细胞浓度为1×109 CFU/mL的菌株HP与不同初始pH 分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的10 mg/L氯氰菊酯工作液在30℃振荡培养2 h。以不含菌体的不同初始pH的氯氰菊酯工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
4) 菌体浓度对氯氰菊酯吸附率的影响 调整菌体浓度为1×107、5×107、1×108、5×108、1×109 CFU/mL，与10 mg/L氯氰菊酯工作液在30℃下振荡培养2 h，以不含菌体的的氯氰菊酯工作液为阳性对照，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
菌株HP对氯氰菊酯的吸附特性结果：菌株HP对氯氰菊酯的吸附是一个快速的过程，15 min时吸附率为67.33%，2 h时达到了95%以上；氯氰菊酯吸附率在30~42℃范围内变化不大，10℃时吸附率较低；pH对氯氰菊酯的吸附率影响不明显，吸附率在98.15~99.44%之间；菌体浓度在1×107~5×108 CFU/mL范围内，吸附率增长明显，菌量为5×108 CFU/mL时，吸附率已达到95%左右，与菌量为1×109 CFU/mL时的吸附率无明显差异。这一研究结果可为菌株HP应用于环境和食品中残留氯氰菊酯的脱除提供了数据参考。
实例2：氯氰菊酯吸附菌株HP对其他拟除虫菊酯类农药的吸附效果。
将菌株HP悬浮于10 mg/L溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯工作液中，以不含酵母菌细胞的10 mg/L上述拟除虫菊酯类农药工作液作为空白对照，30℃振荡培养2 h，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
菌株HP对溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯均有较好的吸附能力，吸附率分别为77.92%、58.99%和71.11%。
实例3：氯氰菊酯吸附菌株HP对拟除虫菊酯类农药主要中间产物3-苯氧基苯甲酸的吸附效果。
将菌株HP悬浮于10 mg/L 3-苯氧基苯甲酸工作液中，以不含酵母菌细胞的10 mg/L 3-苯氧基苯甲酸工作液作为空白对照，30℃振荡培养2 h，12000 r/min离心15 min后取上清液，测定其对3-苯氧基苯甲酸的吸附率。色谱条件：Agilent 1260-LC液相色谱仪，反相岛津InertSustain C18色谱柱规格为内径×长度=4.6 mm×250 mm、粒径=5 μm，流动相为乙腈: pH 2.5磷酸水=55:45，流速为1.0 mL/min，柱温为 25℃，进样量为10 μL，检测器为二极管阵列检测器，检测波长210 nm。
结果表明，菌株HP对3-苯氧基苯甲酸的吸附率为62.15%。
实例4：氯氰菊酯吸附菌株HP对黄瓜汁中氯氰菊酯的吸附效果。
黄瓜汁制备：取新鲜市售黄瓜，清洗、切块、按w:v =1:2加入超纯水，打浆，10000r/min离心20 min，取上清液加入一定量的氯氰菊酯，使黄瓜汁中的氯氰菊酯终浓度为10mg/L，85℃灭菌15 min。
取一定量的菌株HP培养液于121℃下加热灭活20 min，离心收集菌体，用无菌水离心清洗沉淀，重悬于氯氰菊酯浓度为10 mg/L的黄瓜汁中，使菌体浓度为5×108 CFU/mL，于30℃振荡处理2 h，以不加入菌体的黄瓜汁为空白对照。离心取上清液，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
采用全自动色差仪对吸附前后的黄瓜汁进行色差测定，根据
Figure 901224DEST_PATH_IMAGE002
计算色泽变化，ΔE越大则表示颜色变化越大。
菌株HP对黄瓜汁中氯氰菊酯的吸附率可达96.80%。经计算，ΔE小于2，可认为色泽未出现可见变化。说明菌株HP失活菌体可用于黄瓜汁中氯氰菊酯的去除，且不会引起黄瓜汁色泽发生明显变化。
实例5：氯氰菊酯吸附菌株HP对苹果汁中氯氰菊酯的吸附效果。
苹果汁制备：取新鲜市售苹果，清洗、切块、按w:v =1:2加入超纯水，打浆，10000r/min离心20 min，取上清液添加柠檬酸、VC至质量浓度为0.2%、0.4%，混匀，再加入一定量的氯氰菊酯，使苹果汁中的氯氰菊酯终浓度为10 mg/L，85℃灭菌15 min。
取一定量的菌株HP培养液于121℃下加热灭活20 min，离心收集菌体，用无菌水离心清洗沉淀，重悬于氯氰菊酯浓度为10 mg/L的苹果汁中，使菌体浓度为5×108 CFU/mL，于30℃振荡处理2 h，以不加入菌体的苹果汁为空白对照。离心取上清液，用[0011]和[0012]所述方法测定氯氰菊酯吸附率。
采用全自动色差仪对吸附前后的苹果汁进行色差测定，根据
Figure 331068DEST_PATH_IMAGE002
计算色泽变化，ΔE越大则表示颜色变化越大。
菌株HP对苹果汁中氯氰菊酯的吸附率可达96.67%。经计算，ΔE小于2，可认为色泽未出现可见变化。说明菌株HP失活菌体可用于苹果汁中氯氰菊酯的去除，且不会引起苹果汁色泽发生明显变化。
以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母
<140> 201811427636.9
<141> 2018-11-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 552
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
cgagtgaagc ggcaaaagct caaatttgaa atctggtacc ttcggtgccc gagttgtaat 60
ttggagaggg caactttggg gccgttcctt gtctatgttc cttggaacag gacgtcatag 120
agggtgagaa tcccgtgtgg cgaggagtgc ggttctttgt aaagtgcctt cgaagagtcg 180
agttgtttgg gaatgcagct ctaagtgggt ggtaaattcc atctaaagct aaatattggc 240
gagagaccga tagcgaacaa gtacagtgat ggaaagatga aaagaacttt gaaaagagag 300
tgaaaaagta cgtgaaattg ttgaaaggga agggcatttg atcagacatg gtgttttgtg 360
ccctctgctc cttgtgggta ggggaatctc gcatttcact gggccagcat cagttttggt 420
ggcaggataa atccatagga atgtagcttg cctcggtaag tattatagcc tgtgggaata 480
ctgccagctg ggactgagga ctgcgacgta agtcaaggat gctggcataa tggttatatg 540
ccgcccgtct tg 552

Claims (4)

1.一株有效吸附氯氰菊酯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HP，其特征在于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏号为CGMCC No.16134，保藏日期为2018年07月19日。
2.根据权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HP的应用，其特征在于：吸附氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯，吸附氯氰菊酯的降解中间产物3-苯氧基苯甲酸。
3.根据权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HP的应用，其特征在于：该菌株的灭活菌体用于非发酵果蔬汁中残留氯氰菊酯的脱除。
4.根据权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)HP的应用，其特征在于：制备具有吸附拟除虫菊酯功能的发酵食品或药品。
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