CN1632101A

CN1632101A - 药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法

Info

Publication number: CN1632101A
Application number: CN 200410036414
Authority: CN
Inventors: 张玉忠; 孙彩云; 宋晓妍; 解树涛; 陈秀兰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2004-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2005-06-29

Abstract

一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法，属于农业生物技术领域。制备方法包括：以哈茨木霉ACCC30371为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，发酵灌发酵制备生产用液体菌种；以秸粉、麸皮为原料，配以硫酸铵和水，高温高压灭菌，接种液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物；将木霉分生孢子培养物，烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得。本发明以高效生防用木霉为菌株，利用秸秆、麦麸等廉价原料，在近似GMP的无菌条件下，发酵生产木霉分生孢子制剂，做为土壤微生物菌剂，应用防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力。

Description

药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种新型药肥两用土壤微生物菌剂——木霉制剂的制备方法，属于农业生物技术领域。

(二)背景技术

农作物的虫害、病害始终是严重影响农作物产量的重要因素，病虫害的发生使得农作物严重减产，甚至绝收，因此，对病虫害的有效控制非常重要。长期以来，我国农业以化学农药、化学杀菌剂为主防治病虫害，近20年来，化学农药的使用为保障我国农业的安全生产发挥了重要的作用。我国从80年代初开始，土地分田到户，农民耕种自己的责任田，这一措施的实施，最大限度的发挥了农民的劳动积极性。但由此导致农业耕作的协调性和集约性降低，尤其在病虫害的防治方面，协调性很差，导致化学农药、化学杀菌剂的过量施用和滥用，在防治农作物虫害的同时，各种害虫的抗(耐)药性大大增强，为了进一步防治害虫，农药用量不断加大，从而形成了恶性循环。植物病原菌是否象畜禽的病原菌那样，也对抗生素为主的化学杀菌剂具有抗性，至今研究的还较少。农药的过量施用和滥用，导致农药在农产品、土壤中残留过多，污染了环境，严重影响农产品的食用安全，成为我国农产品进入国际市场的主要制约因素之一。相对于虫害的防治，各种植物病害(真菌病、细菌病、病毒病)的防治难度更大，尽管使用大量的化学杀菌剂，但防治效果并不理想，作物抗病育种取得了一定的效果，但没有从根本上解决问题。近年来，我国农作物病害有愈演愈烈之势。表现在原有的病害危害越来越严重，新的病害不断出现。因此，植物病害已经成为农业生产的重要影响因素之一。寻求新的病害生物防治防治措施，高效防治各种植物病害，较少化学农药的用量，降低农产品中农药的残留，是目前急需解决的生产中的难题。

近年来，农业栽培过程中，由于化学肥料的大量使用，土壤中硝酸盐、亚硝酸盐的大量残留，农产品中化学的残留量增加，这是影响农产品质量的另一重要问题。同时，土壤中大量硝酸盐、亚硝酸盐的流失，污染了水源，对生态环境造成极大的破坏。因此，寻求使用高效的生物肥料，提高肥料利用效率，减少化肥的使用量，降低农产品中化肥残留，促进无公害农产品的生产，是当今我国农业生产中的又一迫切需求。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法。

本发明的木霉制剂的制备方法如下：

(1)采用能够以纤维素为唯一碳源快速生长，且高产真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株——哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)为菌株，接种三角瓶液体菌种(二级菌种)，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；

(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料，配以硫酸铵和水，蒸球高温高压灭菌，接种步骤(1)所得的生产用液体菌种，转入无菌的固体发酵曲池，通无菌风，厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物；

(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物，低温(50-80℃)烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得到木霉制剂。

步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。

下面对本发明的木霉制剂的制备方法的各步骤具体说明如下：

(1)生产用液体菌种的制备

培养基：麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na₂HPO₄ 0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36小时，做为生产用液体菌种待用。

(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物

原料：玉米秸粉和/或小麦秸粉30～40份，麸皮60～70份，硫酸铵1～2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5～7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到木霉分生孢子的培养物。

该木霉分生孢子培养物，孢子数可达到5亿/g干品，发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)可达到150～200IU/g干品，木聚糖酶活性达到1200IU/g干品，哌珀霉素含量达到5～10mg/kg干品。

(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后，按重量份0.9～1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4～0.5份褐藻胶，做为保护剂，最后，经粉碎、质检、包装成品。

上述哈茨木霉的二级液体菌种制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤：

A. 斜面菌种(固体)

将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶(3～6)重量比，80±1℃浸泡1小时，或煮沸半小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)菌株，28～30℃培养。

B.二级菌种(液体)

培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～30℃下，摇床培养。

本发明以高效生防用木霉为菌株，利用玉米秸杆、麦秸、麦麸等廉价原料，利用液体深层发酵技术，发酵生产液体菌种，然后应用厚层通风固体发酵技术，在近似GMP的无菌条件下，发酵生产木霉分生孢子制剂，做为土壤微生物菌剂，应用防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力效果优良，可产生很好的经济社会效益。

本发明的优良效果在于：选用能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长，并且高产植物病原真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株，利用液固两相结合发酵工程技术，在近似GMP的无菌环境中，发酵生产木霉分生孢子制剂。该菌株能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长，使得该菌株施用后能够在土壤中快速定植，这是菌剂在土壤中发挥作用的先决条件。菌株高产CWDEs，可高效抑制多种土传的植物病原真菌，高产抗生素派珀霉素，从而可高效抑制多种土传的植物病原细菌和真菌，CWDEs和peptaibols原位协同作用，可进一步加强该木霉菌株对植物病原菌的抑制作用。该木霉制剂，能够提高化肥用量，促进植物生长，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力，从而可减少化肥和化学农药的用量，降低农产品中化肥和农药的残留，符合目前对无公害农产品生产的迫切需求。农作物秸杆是储量巨大的农业废弃物资源之一，到目前为止，因为没有有效的资源化利用技术，使得这一资源的利用率很大，每年的大量秸杆被焚烧，不仅浪费了资源，而且对空气造成了严重的污染，成为我国目前亟待解决的问题。该工艺在开发利用秸杆资源的的同时，无三废排出，避免秸杆焚烧对环境造成的的严重污染，是一条农业废弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。

(四)具体实施方式

实施例1：哈茨木霉的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下：

A.斜面菌种(固体)

将土豆去皮洗净，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶4重量比，80℃浸泡1小时，用滤布煮沸过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加糖2份，琼脂1.5份，自然pH值，8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)菌株，28～30℃培养。

B.二级菌种(液体)

培养基配方同斜面，只不加琼脂，自然pH值，装瓶，8磅灭菌，接上述斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～30℃摇床培养。

实施例2：木霉制剂的制备

(1)生产用液体菌种的制备

培养基：麸皮10份、土豆5份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.5份、Na₂HPO₄ 0.45份、KH₂PO₄ 0.035份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种6份，通风搅拌，培养30小时，做为生产用液体菌种待用。

哈茨木霉的二级液体菌种的制备如实施例1所述。

(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物

原料：玉米秸粉10份和小麦秸粉20份，麸皮65份，硫酸铵1份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种6份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24小时翻曲一次，发酵4天，即得到木霉分生孢子的培养物。

该木霉分生孢子培养物，孢子数5亿/g干品，发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)180IU/g干品，木聚糖酶活性达到1200IU/g干品，哌珀霉素含量达到6mg/kg干品。

(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经75℃干燥后，按重量份1份木霉分生孢子培养物添加0.4份褐藻胶做为保护剂，经粉碎、质检、包装成品。

实施例3：木霉制剂的制备

如实施例2所述，所不同的是：

(1)生产用液体菌种的制备

培养基：麸皮11份、土豆6份，水100份，均为重量份，下同。煮沸，过滤，加蛋白胨0.6份、Na₂HPO₄ 0.5份、KH₂PO₄0.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种10份，通风搅拌，培养34小时，做为生产用液体菌种待用。

(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物

原料：小麦秸粉35份，麸皮70份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶3.0(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种7份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，25小时翻曲一次，发酵4.5天，即得到木霉分生孢子的培养物。

其他同实施例2。

实施例4：木霉制剂的制备

如实施例2所述，所不同的是：

步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物

原料：玉米秸粉20份和小麦秸粉20份，麸皮70份，硫酸铵2份，均为重量份，润水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5.5份(重量)，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，28小时翻曲一次，发酵5天，即得到木霉分生孢子的培养物。

实施例5：木霉制剂的制备

如实施例2所述，所不同的是步骤(3)是：将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经80℃干燥后，按重量份1.1份木霉分生孢子培养物添加0.5份褐藻胶做为保护剂，最后，经粉碎、质检、包装成品。

Claims

1、一种木霉制剂的制备方法，包括步骤如下：

(1)以纤维素为唯一碳源快速生长，且高产真菌细胞壁降解酶和抗生素哌珀霉素的哈茨木霉ACCC30371为菌株，接种三角瓶液体菌种，以麸皮汁为培养基，液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种；

(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物，50-80℃烘干，粉碎，加入分生孢子的保护剂，即得木霉制剂。

2、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。

3、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(1)生产用液体菌种的制备具体如下：

培养基：麸皮9～11份、土豆4～6份，水100份，煮沸，过滤，加蛋白胨0.41～0.6份、Na₂HPO₄ 0.4～0.5份、KH₂PO₄ 0.03～0.04份、灭菌，冷却，接种哈茨木霉ACCC30371的二级液体菌种，5～10份，通风搅拌，培养24～36小时，做为生产用液体菌种待用，以上均为重量份。

4、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物具体如下：

原料：玉米秸粉和/或小麦秸粉30～40份，麸皮60～70份，硫酸铵1～2份，润水，原料∶水＝1∶2.8～3.0，重量比，灭菌，冷却，接种步骤(1)的生产用液体菌种5～7份，以上均为重量份，转入无菌固体发酵曲池中，通以无菌风，在25～28℃，空气相对湿度80～85％下发酵，24～30小时翻曲一次，发酵4～5天，即得到木霉分生孢子的培养物。

5、如权利要求1或2所述的木霉制剂的制备方法，其特征在于步骤(3)具体如下：将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后，按重量份0.9～1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4～0.5份褐藻胶，做为保护剂，经粉碎、包装成品。