CN1632101A - 药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法,属于农业生物技术领域。制备方法包括:以哈茨木霉ACCC30371为菌株,接种三角瓶液体菌种,以麸皮汁为培养基,发酵灌发酵制备生产用液体菌种;以秸粉、麸皮为原料,配以硫酸铵和水,高温高压灭菌,接种液体菌种,转入无菌的固体发酵曲池,厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物;将木霉分生孢子培养物,烘干,粉碎,加入分生孢子的保护剂,即得。本发明以高效生防用木霉为菌株,利用秸秆、麦麸等廉价原料,在近似GMP的无菌条件下,发酵生产木霉分生孢子制剂,做为土壤微生物菌剂,应用防治多种植物土传病害,同时,该菌剂能够促进植物生长,提高肥料利用率,诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种新型药肥两用土壤微生物菌剂——木霉制剂的制备方法,属于农业生物技术领域。
(二)背景技术
农作物的虫害、病害始终是严重影响农作物产量的重要因素,病虫害的发生使得农作物严重减产,甚至绝收,因此,对病虫害的有效控制非常重要。长期以来,我国农业以化学农药、化学杀菌剂为主防治病虫害,近20年来,化学农药的使用为保障我国农业的安全生产发挥了重要的作用。我国从80年代初开始,土地分田到户,农民耕种自己的责任田,这一措施的实施,最大限度的发挥了农民的劳动积极性。但由此导致农业耕作的协调性和集约性降低,尤其在病虫害的防治方面,协调性很差,导致化学农药、化学杀菌剂的过量施用和滥用,在防治农作物虫害的同时,各种害虫的抗(耐)药性大大增强,为了进一步防治害虫,农药用量不断加大,从而形成了恶性循环。植物病原菌是否象畜禽的病原菌那样,也对抗生素为主的化学杀菌剂具有抗性,至今研究的还较少。农药的过量施用和滥用,导致农药在农产品、土壤中残留过多,污染了环境,严重影响农产品的食用安全,成为我国农产品进入国际市场的主要制约因素之一。相对于虫害的防治,各种植物病害(真菌病、细菌病、病毒病)的防治难度更大,尽管使用大量的化学杀菌剂,但防治效果并不理想,作物抗病育种取得了一定的效果,但没有从根本上解决问题。近年来,我国农作物病害有愈演愈烈之势。表现在原有的病害危害越来越严重,新的病害不断出现。因此,植物病害已经成为农业生产的重要影响因素之一。寻求新的病害生物防治防治措施,高效防治各种植物病害,较少化学农药的用量,降低农产品中农药的残留,是目前急需解决的生产中的难题。
近年来,农业栽培过程中,由于化学肥料的大量使用,土壤中硝酸盐、亚硝酸盐的大量残留,农产品中化学的残留量增加,这是影响农产品质量的另一重要问题。同时,土壤中大量硝酸盐、亚硝酸盐的流失,污染了水源,对生态环境造成极大的破坏。因此,寻求使用高效的生物肥料,提高肥料利用效率,减少化肥的使用量,降低农产品中化肥残留,促进无公害农产品的生产,是当今我国农业生产中的又一迫切需求。
(三)发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种药肥两用土壤微生物菌剂木霉制剂的制备方法。
本发明的木霉制剂的制备方法如下:
(1)采用能够以纤维素为唯一碳源快速生长,且高产真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株——哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)为菌株,接种三角瓶液体菌种(二级菌种),以麸皮汁为培养基,液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种;
(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料,配以硫酸铵和水,蒸球高温高压灭菌,接种步骤(1)所得的生产用液体菌种,转入无菌的固体发酵曲池,通无菌风,厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物;
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物,低温(50-80℃)烘干,粉碎,加入分生孢子的保护剂,即得到木霉制剂。
步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。
下面对本发明的木霉制剂的制备方法的各步骤具体说明如下:
(1)生产用液体菌种的制备
培养基:麸皮9~11份、土豆4~6份,水100份,均为重量份,下同。煮沸,过滤,加蛋白胨0.41~0.6份、Na2HPO4 0.4~0.5份、KH2PO4 0.03~0.04份、灭菌,冷却,接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种,5~10份,通风搅拌,培养24~36小时,做为生产用液体菌种待用。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物
原料:玉米秸粉和/或小麦秸粉30~40份,麸皮60~70份,硫酸铵1~2份,均为重量份,润水,原料∶水=1∶2.8~3.0(重量比),灭菌,冷却,接种步骤(1)的生产用液体菌种5~7份(重量),转入无菌固体发酵曲池中,通以无菌风,在25~28℃,空气相对湿度80~85%下发酵,24~30小时翻曲一次,发酵4~5天,即得到木霉分生孢子的培养物。
该木霉分生孢子培养物,孢子数可达到5亿/g干品,发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)可达到150~200IU/g干品,木聚糖酶活性达到1200IU/g干品,哌珀霉素含量达到5~10mg/kg干品。
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后,按重量份0.9~1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4~0.5份褐藻胶,做为保护剂,最后,经粉碎、质检、包装成品。
上述哈茨木霉的二级液体菌种制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤:
A. 斜面菌种(固体)
将土豆去皮洗净,切成小片,放在水中,土豆∶水=1∶(3~6)重量比,80±1℃浸泡1小时,或煮沸半小时,用滤布煮沸过滤,滤液加水稀释至原来的体积。再加糖1~2份,琼脂1.5~2份,自然pH值,8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum RifaiACCC30371)菌株,28~30℃培养。
B.二级菌种(液体)
培养基配方同斜面,只不加琼脂,自然pH值,装瓶,8磅灭菌,接斜面菌种的菌悬液3~5%重量百分比,28~30℃下,摇床培养。
本发明以高效生防用木霉为菌株,利用玉米秸杆、麦秸、麦麸等廉价原料,利用液体深层发酵技术,发酵生产液体菌种,然后应用厚层通风固体发酵技术,在近似GMP的无菌条件下,发酵生产木霉分生孢子制剂,做为土壤微生物菌剂,应用防治多种植物土传病害,同时,该菌剂能够促进植物生长,提高肥料利用率,诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力效果优良,可产生很好的经济社会效益。
本发明的优良效果在于:选用能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长,并且高产植物病原真菌细胞壁降解酶(CWDEs)和抗生素哌珀霉素(peptaibols)的木霉菌株,利用液固两相结合发酵工程技术,在近似GMP的无菌环境中,发酵生产木霉分生孢子制剂。该菌株能够以纤维素、半纤维素为唯一碳源快速生长,使得该菌株施用后能够在土壤中快速定植,这是菌剂在土壤中发挥作用的先决条件。菌株高产CWDEs,可高效抑制多种土传的植物病原真菌,高产抗生素派珀霉素,从而可高效抑制多种土传的植物病原细菌和真菌,CWDEs和peptaibols原位协同作用,可进一步加强该木霉菌株对植物病原菌的抑制作用。该木霉制剂,能够提高化肥用量,促进植物生长,诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力,从而可减少化肥和化学农药的用量,降低农产品中化肥和农药的残留,符合目前对无公害农产品生产的迫切需求。农作物秸杆是储量巨大的农业废弃物资源之一,到目前为止,因为没有有效的资源化利用技术,使得这一资源的利用率很大,每年的大量秸杆被焚烧,不仅浪费了资源,而且对空气造成了严重的污染,成为我国目前亟待解决的问题。该工艺在开发利用秸杆资源的的同时,无三废排出,避免秸杆焚烧对环境造成的的严重污染,是一条农业废弃物资源化、高值化、生态化利用的有效途径。
(四)具体实施方式
实施例1:哈茨木霉的二级液体菌种的制备,具体操作步骤如下:
A.斜面菌种(固体)
将土豆去皮洗净,切成小片,放在水中,土豆∶水=1∶4重量比,80℃浸泡1小时,用滤布煮沸过滤,滤液加水稀释至原来的体积。再加糖2份,琼脂1.5份,自然pH值,8磅灭菌。划线接种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)菌株,28~30℃培养。
B.二级菌种(液体)
培养基配方同斜面,只不加琼脂,自然pH值,装瓶,8磅灭菌,接上述斜面菌种的菌悬液3~5%重量百分比,28~30℃摇床培养。
实施例2:木霉制剂的制备
(1)生产用液体菌种的制备
培养基:麸皮10份、土豆5份,水100份,均为重量份,下同。煮沸,过滤,加蛋白胨0.5份、Na2HPO4 0.45份、KH2PO4 0.035份、灭菌,冷却,接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种6份,通风搅拌,培养30小时,做为生产用液体菌种待用。
哈茨木霉的二级液体菌种的制备如实施例1所述。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物
原料:玉米秸粉10份和小麦秸粉20份,麸皮65份,硫酸铵1份,均为重量份,润水,原料∶水=1∶2.8(重量比),灭菌,冷却,接种步骤(1)的生产用液体菌种6份(重量),转入无菌固体发酵曲池中,通以无菌风,在25~28℃,空气相对湿度80~85%下发酵,24小时翻曲一次,发酵4天,即得到木霉分生孢子的培养物。
该木霉分生孢子培养物,孢子数5亿/g干品,发酵物纤维素酶活性(CMC酶活性)180IU/g干品,木聚糖酶活性达到1200IU/g干品,哌珀霉素含量达到6mg/kg干品。
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经75℃干燥后,按重量份1份木霉分生孢子培养物添加0.4份褐藻胶做为保护剂,经粉碎、质检、包装成品。
实施例3:木霉制剂的制备
如实施例2所述,所不同的是:
(1)生产用液体菌种的制备
培养基:麸皮11份、土豆6份,水100份,均为重量份,下同。煮沸,过滤,加蛋白胨0.6份、Na2HPO4 0.5份、KH2PO40.04份、灭菌,冷却,接种哈茨木霉(Trichodermaharzianum Rifai ACCC30371)的二级液体菌种10份,通风搅拌,培养34小时,做为生产用液体菌种待用。
(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物
原料:小麦秸粉35份,麸皮70份,硫酸铵2份,均为重量份,润水,原料∶水=1∶3.0(重量比),灭菌,冷却,接种步骤(1)的生产用液体菌种7份(重量),转入无菌固体发酵曲池中,通以无菌风,在25~28℃,空气相对湿度80~85%下发酵,25小时翻曲一次,发酵4.5天,即得到木霉分生孢子的培养物。
其他同实施例2。
实施例4:木霉制剂的制备
如实施例2所述,所不同的是:
步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物
原料:玉米秸粉20份和小麦秸粉20份,麸皮70份,硫酸铵2份,均为重量份,润水,原料∶水=1∶2.8(重量比),灭菌,冷却,接种步骤(1)的生产用液体菌种5.5份(重量),转入无菌固体发酵曲池中,通以无菌风,在25~28℃,空气相对湿度80~85%下发酵,28小时翻曲一次,发酵5天,即得到木霉分生孢子的培养物。
实施例5:木霉制剂的制备
如实施例2所述,所不同的是步骤(3)是:将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经80℃干燥后,按重量份1.1份木霉分生孢子培养物添加0.5份褐藻胶做为保护剂,最后,经粉碎、质检、包装成品。
Claims (5)
1、一种木霉制剂的制备方法,包括步骤如下:
(1)以纤维素为唯一碳源快速生长,且高产真菌细胞壁降解酶和抗生素哌珀霉素的哈茨木霉ACCC30371为菌株,接种三角瓶液体菌种,以麸皮汁为培养基,液体发酵灌发酵制备生产用液体菌种;
(2)以玉米秸粉、小麦秸粉、麸皮为主要原料,配以硫酸铵和水,蒸球高温高压灭菌,接种步骤(1)所得的生产用液体菌种,转入无菌的固体发酵曲池,通无菌风,厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物;
(3)将步骤(2)的木霉分生孢子培养物,50-80℃烘干,粉碎,加入分生孢子的保护剂,即得木霉制剂。
2、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法,其特征在于步骤(3)中所述的分生孢子的保护剂选自褐藻胶。
3、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法,其特征在于步骤(1)生产用液体菌种的制备具体如下:
培养基:麸皮9~11份、土豆4~6份,水100份,煮沸,过滤,加蛋白胨0.41~0.6份、Na2HPO4 0.4~0.5份、KH2PO4 0.03~0.04份、灭菌,冷却,接种哈茨木霉ACCC30371的二级液体菌种,5~10份,通风搅拌,培养24~36小时,做为生产用液体菌种待用,以上均为重量份。
4、如权利要求1所述的木霉制剂的制备方法,其特征在于步骤(2)厚层通风发酵制备木霉分生孢子发酵培养物具体如下:
原料:玉米秸粉和/或小麦秸粉30~40份,麸皮60~70份,硫酸铵1~2份,润水,原料∶水=1∶2.8~3.0,重量比,灭菌,冷却,接种步骤(1)的生产用液体菌种5~7份,以上均为重量份,转入无菌固体发酵曲池中,通以无菌风,在25~28℃,空气相对湿度80~85%下发酵,24~30小时翻曲一次,发酵4~5天,即得到木霉分生孢子的培养物。
5、如权利要求1或2所述的木霉制剂的制备方法,其特征在于步骤(3)具体如下:将步骤(2)的木霉分生孢子培养物经50-80℃干燥后,按重量份0.9~1.1份木霉分生孢子培养物添加0.4~0.5份褐藻胶,做为保护剂,经粉碎、包装成品。
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