CN102732434A - 一株哈茨木霉菌株及其在防控马铃薯晚疫病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株哈茨木霉菌株及其在防控马铃薯晚疫病中的应用。本发明提供的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14，保藏号为CGMCC No.5990。所述哈茨木霉HNA-14可用于抑制病原菌、促进马铃薯植株生长、防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。本发明在可持续农业发展中应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一株哈茨木霉菌株及其在防控马铃薯晚疫病中的应用。
背景技术
马铃薯是世界第四大粮食作物，也是中国重要的粮、菜作物。由于它的经济价值高、营养丰富，为世界各国广泛栽培。我国现已成为世界第一大马铃薯生产国。我国马铃薯生产主要分布在西南、华北、西北、东北、华中、华东等地区。据统计，我国2010年马铃薯栽培面积已超过600万hm2，产量占世界的1/4。
马铃薯晚疫病是马铃薯生产上的一种毁灭性病害，全世界普遍发生，一般造成马铃薯减产20％～80％，重者可绝收。2O世纪8O年代后，晚疫病开始在世界各地频频发生。2O世纪9O年代后，晚疫病在我国马铃薯主产区普遍发生，危害呈上升趋势。
马铃薯晚疫病对生产造成的巨大损失引起了国际社会的极大关注，国际马铃薯中心(International Potato Center，简称CIP)于1992年将晚疫病列为CIP优先研究目标，并在1996年成立了国际马铃薯晚疫病研究协作网，以期能够减少马铃薯晚疫病带来的损失。目前，国内外对马铃薯晚疫病的防治中，化学防治占据重要的地位。由于化学防治成本较高和易污染环境，而且病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性。所以生物防治特别是利用木霉菌的生物防治逐渐成为人们所关注的焦点和热点。
发明内容
本发明的目的是提供一株哈茨木霉菌株及其在防控马铃薯晚疫病中的应用。
本发明提供的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14，已于2012年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5990。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14CGMCC No.5990简称哈茨木霉HNA-14。
所述哈茨木霉HNA-14可用于抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthoracapsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）。
所述哈茨木霉HNA-14可用于促进马铃薯植株生长。
所述哈茨木霉HNA-14可用于防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明还保护一种产品，它的活性成份为所述哈茨木霉HNA-14；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora cnpsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明还保护哈茨木霉HNA-14在制备产品中的应用；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明还保护所述哈茨木霉HNA-14的孢子液或发酵物。
所述孢子液具体可为5×106个孢子/mL的孢子悬浮液。
所述发酵物可为固体发酵物或液体发酵物。
所述液体发酵物的制备方法具体如下：收集哈茨木霉HNA-14孢子，接种到含有种子培养基的发酵罐中，发酵后得到浓度为6.5×108CFU/mL的液体发酵物（种子液）；所述发酵的条件为：溶解氧浓度20%左右，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min。
所述种子培养基（pH6.0-6.5）由溶质和水组成；所述溶质在种子培养基中的浓度如下：麦麸2g/100mL、葡萄糖1.0g/100mL、硫酸镁0.5g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、氯化钙0.3g/100mL。
所述固体发酵物的制备方法具体如下：将所述液体发酵物与固体培养基混合均匀（每克混合物中含有3.5×106CFU哈茨木霉HNA-14），然后进行发酵，然后风干至7-10%，得到固体发酵物；所述发酵的条件为：温度28-30℃，空气相对湿度95-100%，培养基厚度5-7cm，培养时间5-7天。
所述固体培养基是将麦麸和稻壳和水混合得到的，麦麸和稻壳的质量比为7：3，固体培养基的含水量为70%左右，pH6.0-6.5；121℃灭菌30min。
所述孢子液或所述发酵物的应用，为如下（1）至（3）中的至少一种：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明还保护一种产品，它的活性成份为所述孢子液或所述发酵物；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明还保护所述孢子液或所述发酵物在制备产品中的应用；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
本发明提供的哈茨木霉HNA-14，经室内对峙拮抗实验、盆栽防治实验和大田防治试验发现，该菌株对多种病原菌（特别是马铃薯晚疫病菌）具有良好的抑菌效果，并且利用木霉菌制剂防治植物病害具有对人畜无毒、产品无农药残留、不污染环境等优点。本发明在可持续农业发展中应用前景广阔。
本发明的社会效益：推广应用生物制剂可减少化学农药的使用量，保护生态环境平衡发展，增强农业生产的可持续性；提高农产品品质及减低农产品中有害物质残留，增强农产品的市场竞争力；保障食品安全和生态安全，加快我国绿色农业生产资料的产业化，促进绿色农业产业化的快速发展。
本发明的经济效益：生物防治能提高疫病防治效果，降低防治成本，可减少化学农药使用量；能有效实现农产品安全生产及显著降低农产品农药残留，提升农产品的经济附加值，扩大我国农副产品外销市场，推进绿色产业的发展，这对发展农村经济、增加农民收入具有重要推进作用。
附图说明
图1为菌株HNA-14的PDA平板培养形态。
图2为菌株HNA-14的分生孢子梗及分生孢子。
图3为哈茨木霉HNA-14和马铃薯晚疫病菌对峙培养72小时后的照片。
图4为哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病菌的重寄生作用。
图5为哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病菌的重寄生作用。
图6为哈茨木霉HNA-14挥发性代谢物对马铃薯晚疫病菌在平板上的抑制作用。
图7为哈茨木霉HNA-14非挥发性代谢物对马铃薯晚疫病菌在平板上的抑制作用
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g，蒸馏水1000ml；121℃灭菌20min后备用。
木霉菌半选择性培养基（TSM培养基）：MgSO4(7H20)0.2g、K2HPO40.9g、KCl 0.15g、NH4NO31.0g、葡萄糖3.0g、玫瑰红0.15g、60%敌克松可湿性粉剂0.3克、PCNB 0.2g、琼脂20g，蒸馏水950ml；121℃灭菌20min备用。
马铃薯晚疫病菌（phytophthora infenstans）：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Daayf F,Adam L and Fernando WGD(2003)Comparative screening ofbacteria for biological control of potato late blight(strainUS-8)using invitro,detached leaves,and whole plant testing systems.Canadian Journal ofPlant Pathology,25:276–284。
辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Ahmed AS,Sanchez CP and Candela ME(2000)Evaluation of induction ofsystemic resistance in pepper plants(Capsicum annuum)to Phytophthora capsiciusing Trichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation.European Journal of Plant Pathology 106:817–824。
辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：刘丽云．刘晓林，刘志恒，等．辣椒根腐病菌生物学特性研究．沈阳农业大学学报，2007，38(1)：54-58。
实施例中的孢子悬浮液都是收集孢子并重悬于水得到的。
实施例中所用的马铃薯品种为均为费乌瑞它：重庆市马铃薯工程技术研究中心。
实施例1、哈茨木霉HNA-14的获得和鉴定
一、菌株HNA-14的获得
1、样品采集
样品为采集自河南安阳马铃薯农作物田间表层根际土壤。
用取土器材拨开田间3-5cm的表土层，将土壤连同植物的根系一起挖出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。
2、菌株HNA-14的获得
将粘附土壤的根系稍风干，轻拍根系，使粘附在上面的土壤脱落，用无菌水梯度稀释，分别吸取0.1mL稀释液滴入TSM培养基平板上，用灭菌的L形涂布棒涂布均匀，置于25-28℃的恒温培养箱中培养3-4天。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到PDA平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到PDA斜面上。
获得一株菌株，将其命名为HNA-14。
二、菌株HNA-14的鉴定
在PDA培养基上20℃培养5d的菌落直径为9.0cm，生长速度很快，蛛丝状至羊毛状，白色，散生光下由于产孢表面呈绿色，背面无色，后期由于产孢量大使菌落呈稍绿色；多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的菌丛；主枝宽4-5μm，侧枝多，形成金字塔形；侧生瓶梗可达5个，成拟轮状排列或单个沿小侧枝不规则排列；侧生瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶梗，5-7×3-3.5μm；顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细，13-18×2.5-3.5μm；瓶梗大多以大角度在其载体上着生，有时略弯向顶端；瓶梗孢子呈球状分生孢子头，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡绿色，2.8-3.2×2.5-2.8μm。图1为菌株HNA-14的PDA平板培养形态。图2为菌株HNA-14的分生孢子梗及分生孢子。
三、菌株HNA-14的保藏
通过步骤二的鉴定，菌株HNA-14属于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。
哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14，已于2012年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.5990。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14CGMCC No.5990简称哈茨木霉HNA-14。
实施例2、哈茨木霉HNA-14对病原菌的抑制作用
实验组：在同一PDA平板上接种哈茨木霉HNA-14菌饼和病原菌菌饼进行对峙培养（两个菌饼中心的垂直距离为3cm，两个菌饼的直径均为5mm）；以只接种病原菌菌饼的PDA平板作为对照组；25℃黑暗培养3天后测量病原菌的菌落直径（最长直径和最短直径的平均值）并计算抑制率。抑制率=（对照组病原菌的菌落直径-实验组病原菌的菌落直径）/对照组病原菌的菌落直径*100%。每种致病菌设置三个重复处理，对照设置三个重复处理，结果取平均值。
病原菌分别为辣椒疫病菌、马铃薯晚疫病菌、辣椒根腐病菌。
结果见表1（三次试验的平均值）。哈茨木霉HNA-14和马铃薯晚疫病菌对峙培养3天后的照片见图3。结果表明，哈茨木霉HNA-14对病原菌对各个病原菌均具有抑制作用。
表1各个培养时间后哈茨木霉HNA-14对各个病原菌的抑菌率（%）
| 病原菌 | 抑菌率 |
| 辣椒疫病菌 | 75 |
| 马铃薯晚疫病菌 | 74.3 |
| 辣椒根腐病菌 | 56.5 |
实施例3、哈茨木霉HNA-14的温室生防效果实验
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种于培养钵，每钵10粒；在温室中（25-30℃）培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组：每株马铃薯幼苗接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）和15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
对照组：每株马铃薯幼苗接种15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
接种孢子悬浮液14天后调查发病率（马铃薯晚疫病分级调查标准见表2）并计算病情指数。
表2马铃薯晚疫病分级调查标准
| 病级 | 分级标准 |
| 0 | 健康，地上部叶片无症状，病叶枯萎面积小于1%； |
| 1 | 每一个病株约有1-25%的叶片发病枯萎； |
| 2 | 植株地上部分有26-50%的叶片枯萎； |
| 3 | 地上部分有51-75%的叶片枯萎； |
| 4 | 只有少数叶片仍呈绿色，76-89%的叶片枯萎； |
| 5 | 90%以上的叶片枯死，茎部枯死或正在枯死中。 |
结果见表3（三次试验的平均值）。结果表明，哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病具有显著的生防效果。
表3哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病的温室防治效果
| 处理 | 病株率（%） | 病情指数 | 相对防效（%） |
| 实验组 | 25 | 3.2 | 60.0 |
| 对照组 | 75 | 7.8 | ----- |
实施例4、哈茨木霉HNA-14对马铃薯植株的促生能力
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种于培养钵，每钵10粒；在温室中（25-30℃）培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组1：每株马铃薯幼苗接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
实验组2：每株马铃薯幼苗接种15mL水；接种方式为将水用注射器注入根围土壤；
实验组3：每株马铃薯幼苗接种15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
接种孢子悬浮液30天后测量马铃薯植株的株高、干重及鲜重。结果见表4（三次试验的平均值）。结果表明，哈茨木霉HNA-14可以促进马铃薯植株生长。
表4哈茨木霉HNA-14对马铃薯植株的促生作用
实施例5、哈茨木霉HNA-14的大田防治效果试验
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种，每667m2播种3500穴；培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组1：每株马铃薯幼苗浇灌200毫升哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（5×106个/mL），10天后每株马铃薯幼苗再浇灌200毫升哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（5×106个/mL）；
实验组2：每株马铃薯幼苗浇灌200毫升福美双溶液（0.02g/mL），培养10天后每株马铃薯幼苗再浇灌200毫升福美双溶液（0.02g/mL）；
对照组：每株马铃薯幼苗浇灌200毫升水，培养10天后每株马铃薯幼苗再浇灌200毫升水。
统计发病率和病情指数，方法同实施例3。
第一年度试验的结果见表5（三次试验的平均值），第二年度试验的结果见表6（三次试验的平均值）。结果表明，哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病具有显著的生防效果。
表5哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病的田间防治效果（第一年度试验）
表6哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病的田间防治效果（第二年度试验）
实施例6、哈茨木霉HNA-14的根部定殖实验
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种于培养钵，每钵10粒；在温室中（25-30℃）培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组1：每株马铃薯幼苗接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
实验组2：每株马铃薯幼苗接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）和15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
接种孢子悬浮液30天后采用平板稀释法（TSM培养基）检测根际土壤中哈茨木霉HNA-14的含量，结果见表7（三次试验的平均值）。
表7每克根际土壤中哈茨木霉HNA-14的含量（CFU）
| 7天 | 14天 | 28天 | |
| 实验组1 | 1.5×106 | 7.5×105 | 7.0×103 |
| 实验组2 | 8.5×105 | 2.8×105 | 2.5×103 |
实施例7、哈茨木霉HNA-14能促进马铃薯植株的光合荧光效应
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种于培养钵，每钵10粒；在温室中（25-30℃）培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组1：每株马铃薯幼苗接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
实验组2：每株马铃薯植株接种15mL哈茨木霉HNA-14孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）和15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
实验组3：每株马铃薯植株接种15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
实验组4：每株马铃薯植株接种15mL水；接种方式为将水用注射器注入根围土壤。
接种孢子悬浮液30天后查马铃薯植株的光和及荧光变化情况。结果见表8（三次试验的平均值）。
表8哈茨木霉HNA-14对马铃薯植株的光合及荧光影响
| A | gs | Fv/Fm | ΦPSII | Fv′/Fm′ | qp | |
| 实验组1 | 13.70 | 0.33 | 0.71 | 0.58 | 0.69 | 0.83 |
| 实验组2 | 9.30 | 0.17 | 0.70 | 0.53 | 0.67 | 0.76 |
| 实验组3 | 6.39 | 0.07 | 0.70 | 0.52 | 0.64 | 0.76 |
| 实验组4 | 7.50 | 0.24 | 0.70 | 0.55 | 0.67 | 0.77 |
实施例8、哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病菌的重寄生能力
在PDA平板上对峙培养哈茨木霉HNA-14和马铃薯晚疫病菌，用5mm的打孔器取菌丝块，将其分别接种于PDA平板上的lcm×3cm玻璃纸条两端，25℃对峙培养。当两菌丝接触后，在电镜下观察哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病菌菌丝的重寄生作用。
电镜下观察到供试的木霉菌丝以缠绕或平行生长等方式寄生于病菌菌丝上，病菌菌丝生长受到限制，菌丝变形和扭曲。在平板上培养1周后，木霉HNA-14菌落能完全覆盖致病疫霉菌落，并大量产生绿色孢子。哈茨木霉HNA-14对马铃薯晚疫病菌的重寄生作用见图4和图5。
实施例9、哈茨木霉HNA-14代谢物的检测
一、哈茨木霉HNA-14的非挥发性代谢物的检测
实验组：在PDA平板培养基上平铺直径略大于l0cm的双层无菌玻璃纸膜片，在平板中央接种直径为5mm的哈茨木霉HNA-14菌饼，25℃恒温培养至菌落直径达5cm；揭去玻璃纸膜片，在平板中央接种直径为5mm马铃薯晚疫病菌菌饼，25℃恒温培养；
对照组：在PDA平板培养基中央接种直径为5mm马铃薯晚疫病菌菌饼，25℃恒温培养。
从接种开始计时，培养一定时间后测量菌落直径并计算抑制率，方法同实施例2。结果见表9。
哈茨木霉HNA-14挥发性代谢物对马铃薯晚疫病菌在平板上的抑制作用见图6。
二、哈茨木霉HNA-14的挥发性代谢物的检测
实验组：在PDA平板中央接种直径为5mm的哈茨木霉HNA-14菌饼，25℃恒温培养至菌落直径达5cm；在其上方蒙上双层直径略大于10cm的圆形无菌玻璃纸，上方对扣一个相等大小、中央接种直径为5mm的马铃薯晚疫病菌菌饼，25℃恒温培养；
对照组：在PDA平板中央上方蒙上双层直径略大于10cm的圆形无菌玻璃纸，上方对扣一个相等大小、中央接种直径为5mm的马铃薯晚疫病菌菌饼，25℃恒温培养。
从接种开始计时，培养一定时间后测量菌落直径并计算抑制率，方法同实施例2。结果见表9。
哈茨木霉HNA-14非挥发性代谢物对马铃薯晚疫病菌在平板上的抑制作用见图7。
表9哈茨木霉HNA-14的代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制率（%）
| 24小时 | 48小时 | 72小时 | |
| 非挥发性代谢物 | 23.6 | 26.7 | 36.8 |
| 挥发性代谢物 | 0.9 | 3.6 | 8.2 |
实施例10、哈茨木霉HNA-14的培养
一、固体培养物的制备
1、斜面菌种
采用固体PDA培养基，将哈茨木霉HNA-14接种到斜面PDA培养基上，在培养箱中28℃条件下培养3-4天。
2、茄瓶菌种
采用固体PDA培养基，将试管斜面培养基中的哈茨木霉HNA-14接种到茄瓶内PDA培养基上，于28℃条件下，在摇床上培养3-4天。
3、液体菌种
种子培养基（pH6.0-6.5）由溶质和水组成；所述溶质在种子培养基中的浓度如下：麦麸2g/100mL、葡萄糖1.0g/100mL、硫酸镁0.5g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、氯化钙0.3g/100mL；121℃湿热灭菌30min。
将茄瓶中的哈茨木霉HNA-14孢子用无菌水冲下，接种到中型发酵罐中（含种子培养基），培养得到浓度为6.5×108CFU/mL的种子液。发酵过程保持溶解氧浓度20%左右，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min。
4、固体培养基培养
固体培养基是将麦麸和稻壳和水混合得到的，麦麸和稻壳的质量比为7：3，固体培养基的含水量为70%左右，pH6.0-6.5；121℃灭菌30min。
将1体积份步骤3得到的种子液与9体积份固体培养基混合均匀（每克混合物中含有3.5×106CFU哈茨木霉HNA-14），接种完毕后转移到固体培养室内培养。培养室温度控制在28-30℃，空气相对湿度控制在95-100%，培养基厚度为5-7cm，培养时间为5-7天。培养完毕后，将培养物自然风干，成品含水量控制在7-10%，得到木霉HNA-14菌株固体培养物。
二、固体培养物的应用
马铃薯薯块催芽后，挑选长势一致的发芽种薯播种于培养钵，每钵10粒；在温室中（25-30℃）培养直至幼苗两片复叶展平，分组进行如下操作（每组3个培养钵）：
实验组：每株马铃薯幼苗接种15mL固体培养物溶液（将0.1g固体培养物溶于10mL水得到的）和15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；
对照组：每株马铃薯幼苗接种15mL马铃薯晚疫病菌孢子悬浮液（孢子浓度为5×106个/mL）；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
接种孢子悬浮液14天后调查发病率并计算病情指数（方法同实施例3）。
实验组的发病率为18%，病情指数为2.8。对照组的发病率为65%，病情指数为7.8。
Claims (10)
1.哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HNA-14，它的保藏编号为CGMCC No.5990。
2.权利要求1所述哈茨木霉HNA-14在抑制病原菌中的应用；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）。
3.权利要求1所述哈茨木霉HNA-14在促进马铃薯植株生长中的应用。
4.权利要求1所述哈茨木霉HNA-14在防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病中的应用。
5.一种产品，它的活性成份为权利要求1所述哈茨木霉HNA-14；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
6.权利要求1所述哈茨木霉HNA-14在制备产品中的应用；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
7.权利要求1所述哈茨木霉HNA-14的孢子液或发酵物。
8.权利要求7所述孢子液或发酵物的应用，为如下（1）至（3）中的至少一种：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
9.一种产品，它的活性成份为权利要求7所述孢子液或发酵物；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
10.权利要求7所述孢子液或发酵物在制备产品中的应用；所述产品为具有如下（1）至（3）中的至少一种功能的产品：
（1）抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种：马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infenstans）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌（Fusarium oxysporum）；
（2）促进马铃薯植株生长；
（3）防控马铃薯植株发生马铃薯晚疫病。
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