CN106479905B - 一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的应用 - Google Patents

一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的应用。该菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)SDL Tr35，是从五莲县感病蘑菇上分离获得的，已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6693。实验表明，本发明的哈茨木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在油用牡丹叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该哈茨木霉制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治油用牡丹病害，还能有效提高油用牡丹产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。

Description

一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治油用牡丹根腐病、红斑病的哈茨木霉及其用途，以及采用该哈茨木霉菌株制备的生物防治制剂。
背景技术
油用牡丹是我国独有植物，原生物种其种子可榨取食用油，研究表明，牡丹平均亩产籽250kg，出油率30％以上，其中α-亚麻酸含量达42.34％，具有极高的经济价值。油用牡丹具有良好的经济、生态和社会效益，大力发展油用牡丹产业，对于促进我国油料生产、保障粮油安全、优化国民膳食结构、提高健康水平、改善生态环境、增加农民收入、帮助贫困地区农民脱贫致富、建设美丽中国等都有重要意义。随着油用牡丹集约化种植面积的不断增加，其田间生态环境已发生较大变化，各种病害发生日趋严重。目前防治手段主要靠化学农药结合优化栽培管理。化学农药虽然可以防治油用牡丹主要病害，但是长期使用容易造成农药残留超标与环境污染，进而影响农民经济效益与群众身体健康。生物农药具有毒性较小、环境友好及不易产生抗药性等优点，通过研制防治油用牡丹主要病害的生物农药，实现生产过程无公害化，可以在保证较好防治效果同时解决农药残留超标及抗药性等问题，符合未来绿色农业发展的趋势。
木霉菌(Trichoderma spp.)在土壤、空气、枯枝落叶、各种发酵物、植物根圈、叶片及种子、球茎表面广泛分布。木霉菌是一种重要的生防菌株，通过产生抗生素、营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等多种机制，达到控制多种植物病害的目的。木霉菌的作用机理是复杂而多样的，不同的菌株生防机制的侧重点不同，菌株间的生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治油用牡丹根腐病、红斑病的新的哈茨木霉菌株。本发明的哈茨木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在油用牡丹叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)SDL Tr35，是从五莲县感病蘑菇上分离获得的，已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.6693。其具有以下微生物学特性：在PDA平板上25℃培养3天，菌落圆形，直径约8cm，中央灰白色带墨绿色，边缘白色，气生菌丝较短。分生孢子梗产生侧向分枝，分枝上轮生或对生短的产孢瓶体，瓶体与着生它们的分枝大致成直角；分生孢子单胞，球形，光滑。
本发明哈茨木霉菌菌株SDL Tr35的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB2 0.2g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；
(2)实验室液体培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB20.2g，蒸馏水1000mL；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为50：35：15的玉米芯、小麦秸秆和牡丹籽壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，氯霉素0.05％，剩余为水。
(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供了一种用于防治油用牡丹主要病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35。
本发明也提供了上述哈茨木霉菌株SDL Tr35或者上述生物防治制剂在防治油用牡丹病害中的用途，所述牡丹病害为牡丹根腐病、红斑病。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备所述哈茨木霉菌株SDL Tr35的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，26～30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：12～18的比例混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在室温26～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将哈茨木霉菌株SDL Tr35的孢子移植到液体培养基中，28℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；液体培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB20.2g，蒸馏水1000mL；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比15％的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比15％～30％的比例接种至发酵培养基，室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养7～8d。
步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8；其中所述固料由质量比为50：35：15的玉米芯、小麦秸秆和牡丹籽壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，氯霉素0.05％，剩余为水。
步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
并且，本发明还提供了一种用于防治油用牡丹根腐病、红斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向发病的油用牡丹根部、叶片施用上述哈茨木霉菌株SDL Tr35或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的哈茨木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在油用牡丹叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该哈茨木霉制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治油用牡丹病害，还能有效提高油用牡丹产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为防治油用牡丹病害的生物农药或生物肥料，防治多种油用牡丹红斑病、根腐病等。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、哈茨木霉菌(T.harzianum)SDL Tr35的分离与纯化
本发明的哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35是从五莲县蘑菇上采用平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)木霉菌株的分离纯化：取受害严重的蘑菇菌包，先用75％的酒精局部处理1min，再在超净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量木霉菌孢子，在PDA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转至PDA试管斜面保存备用。
(2)油用牡丹根腐病、红斑病高效拮抗木霉菌株的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、油用牡丹根腐病菌、红斑病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，28℃恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过上述大量筛选工作得到一株能够高效防治油用牡丹根腐病、红斑病，且耐温性、耐酸碱性、耐药性较好的哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35。其实验结果如下。
初筛实验结果：对峙培养2d，SDL Tr35菌株和油用牡丹红斑病菌、根腐病菌菌丝恰好接触，SDL Tr35菌株以营养竞争为主。5d后，SDL Tr35菌丝已经在油用牡丹红斑病菌、根腐病菌的菌落表面生长，且已经到达培养皿边缘，而油用牡丹红斑病菌、根腐病菌基本停止生长。
复筛实验结果如下所示(表1)：
28℃下，72h SDL Tr35菌株已经长满培养皿，菌落直径为8.53cm。该菌株的耐低温能力较强，5℃下菌株11d时开始生长；在10℃和35℃下SDL Tr35菌落的特征和28℃下几乎没有区别。
SDL Tr35菌株耐酸性较好，具有一定的耐碱性。pH为5、6时，菌丝生长最快、产孢量最大；pH为4时，SDL Tr35菌株的菌丝生长速度、菌落形态基本接近于pH为6时；pH为9时，SDLTr35菌丝生长速度和菌落形态没有大的变化，但是pH为10时，菌落形态特点和菌丝生长规律有较大的变化。
表1SDL Tr35菌株对温度、酸碱性和杀菌剂耐性
SDL Tr35菌株属于中等耐药性菌株，在含有0.01mg/L、0.1mg/L多菌灵的PDA平板上，菌丝生长速度和菌落形态影响不大，菌落直径为8.50cm，在1mg/L的多菌灵平板上，菌株生长非常缓慢，但菌落形态发生改变，菌丝稀疏。
实验证明，该哈茨木霉SDL Tr35在防治油用牡丹病害试验中，对油用牡丹根腐病和红斑病都显示出非常高效的防治效果。因而，本发明的哈茨木霉是具有广泛应用前景的哈茨木霉新菌株，可以用于制备防治油用牡丹病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在PDA平板上25℃培养3天，菌落圆形，直径约8cm，中央灰白色带墨绿色，边缘白色，气生菌丝较短。分生孢子梗产生侧向分枝，分枝上轮生或对生短的产孢瓶体，瓶体与着生它们的分枝大致成直角；分生孢子单胞，球形，光滑。
(2)分子生物学特性：
菌株SDL Tr35的rDNA ITS包括18S区部分，ITS1、5.8S、ITS2的全序列及28S区部分序列片段(SEQ-1)：
5’-GAAGTAAAAAATCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTTTTGTATACCCCCTCGCGGGTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCTCTCGTAGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTTAGCGGGTGGCCGTCTCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCATCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA-3’。
菌株SDL Tr35的分生孢子、产孢结构等特征分别符合Trichoderma harzianum种的描述，菌株SDL Tr35的rDNA ITS序列与GenBank中Trichoderma harzianum的序列HQ608036和序列EU280077相似性均为99％。鉴于以上结果，将菌株SDL Tr35鉴定为哈茨木霉Trichoderma harzianum。此菌株已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.6693。
其中，PDA培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL。
实施例2
1、哈茨木霉菌发酵过程
普通培养保存培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB20.2g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；
实验室液体培养基配方：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB20.2g，蒸馏水1000mL；
固体培养基配方(质量百分含量)：
固料：玉米芯50％，小麦秸秆35％，牡丹籽壳15％。
无机盐溶液：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，氯霉素0.05％，剩余为水。
固液比为1:1.8(质量比)。
哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将哈茨木霉菌(T.harzianum)SDL Tr35从试管斜面中挑取少量孢子，移至液体培养基中，28℃摇床振荡培养2～3d，此为种子液；
②固体生产菌种的培养：将种子液按15％的质量比接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按质量比1:15稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比按体积比20％接种于发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养7～8d，期间要翻动3～5次，增加氧气量，即可得到木霉菌原粉，其菌活为≥30亿/g。
④制备可湿性粉剂：按质量比，哈茨木霉菌SDL Tr35原粉(菌活为30亿/g)7，白炭黑38，葡萄糖41，淀粉10，湿润剂十二烷基磺酸钠5，分散剂NNO 2，CMC(羧甲基纤维素钠)2，将上述原料混合均匀，控制加工温度0-50℃，在生物质料粉碎机中，粉碎到150筛目以上水分控制在6-8％，得到2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂。
实施例3
本实施例提供了2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂对油用牡丹红斑病防病增产的相关实验。
1、供试药剂
2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂(实施例2中制备)；
50％多菌灵可湿性粉剂(市售)。
2、供试作物与防治对象
供试作物为油用牡丹，品种为凤丹；
防治对象为红斑病。
3、试验地情况
试验地设在山东省菏泽市牡丹区牡丹研究所种植基地，该基地油用牡丹红斑病近几年发生严重，且防治困难，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时红斑病处于发病初期。
4、试验设计及安排
本试验设2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍、400倍、500倍以及50％多菌灵可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区60株。施药时间2015年3月29日，每隔7天施一次药，共3次施药，将植株叶片上下喷洒均匀，喷药时用塑料布遮挡，喷药器械为工农-16型喷雾器。
5、试验调查及计算方法
(1)气象条件
第1次施药(2015年3月29日)当日晴，风力2～3级，最高气温为19℃，最低气温为11℃，相对湿度为75％。第2次施药(2015年4月6日)，晴，风力2级，最高气温为21℃，最低气温为10℃，相对湿度为70％；第3次施药(2015年4月13日)，当日晴转多云，风力2级，最高气温为20℃，最低气温为10℃，相对湿度为75％。
(2)药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每小区采用5点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察油用牡丹的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
分级方法(以叶片为单位)：
0级：无病斑
1级：茎基部10cm范围内斑点数量在3个以下，上部茎有零星小点，全株25％以下叶片发病，平均每个复叶上的病斑数在2个以下，病斑不连成片。
3级：茎基部10cm范围内有3～5个斑点，上部茎斑点稀疏；25％～50％叶片发病，平均每个复叶上有3～5个病斑。
5级：茎基部10cm范围内有6～10个斑点，上部茎斑点较密；50％～75％叶片发病，平均每个复叶上有6～10个病斑；斑点密集，30％以上叶片枯焦。
7级：茎基部10cm范围内有10个以上斑点，上部茎斑点密集；75％以上叶片发病，平均每个复叶上有10个以上病斑；斑点密集并相连成片，50％以上叶片枯焦。；
(3)调查时间和次数
施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。
(4)药效计算方法
药效按式(1)、(2)计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理后施药前病情指数；
PT1————药剂处理后施药后病情指数；
(5)对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。
6、结果
(1)供试药剂对油用牡丹红斑病的防治效果
表2结果显示，2亿/g哈茨木霉可湿性粉剂对油用牡丹红斑病具有较好的防治效果，其中2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍的防治效果为78.25％，500倍的防治效果为74.61％，700倍的防治效果为68.59％，50％多菌灵可湿性粉剂对油用牡丹红斑病为80.56％。2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍防治效果与50％多菌灵可湿性粉剂600倍的防治效果在P<0.01水平上无显著性差异，其次为500倍液，防治效果仍在70％以上。
表2各个处理后油用牡丹红斑病的病情指数及防治效果
注：处理1为2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍，处理2为500倍，处理3为700倍，处理4为50％多菌灵600倍。
(2)油用牡丹安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，油用牡丹生长正常，无药害产生，说明哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂在供试浓度对油用牡丹安全。
实施例4
本实施例提供了哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂对油用牡丹根腐病防病增产的相关实验。
1)供试药剂
2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂；
70％代森锰锌可湿性粉剂(市售)。
2)供试作物与防治对象：
供试作物为油用牡丹，品种为凤丹；
防治对象：根腐病。
3)试验地情况
试验地设在山东省菏泽市牡丹区油用牡丹种植基地，该地块根腐病近几年发生严重，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时根腐病处于发病初期。
4)试验设计及安排
本试验设2亿/g哈茨木霉SDL Tr35可湿性粉剂300倍、500倍、700倍、70％代森锰锌可湿性粉剂700倍液及不施药清水作对照共4个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区60株。施药方法：在牡丹周围挖10cm深以上的穴，按使用剂量稀释1000倍，均匀倒入穴中，埋土，共施药4次，时间为2015年3月31日、4月29日、6月2日、6月30日，9月13日检查药效。
5)试验调查及计算方法
(1)气象条件
第1次施药(2015年3月31日)当日晴，风力2级，最高气温为19℃，最低气温为10℃，相对湿度为75％。第2次施药(2015年4月29日)，晴，风力2～3级，最高气温为21℃，最低气温为11℃，相对湿度为70％；第3次施药(2015年6月2日)，当日晴转多云，风力3～4级，最高气温为24℃，最低气温为13℃，相对湿度为65％。第4次施药(2015年6月30日)，当日多云，风力3级，最高气温27℃，最低气温16℃，相对湿度75％。
(2)药效及安全性调查
药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用5点取样法，每点查20株，调查油用牡丹叶片、根部情况，调查发病率。
分级方法：
0级：根部健康；
1级：有25％以下的根腐烂，主根发病很轻；
3级：有25％-50％的根腐烂，主根发病较轻；
5级：有50％-75％的根腐烂，主根发病较重；
7级：有75％以上的根腐烂，主根腐烂，甚至全株死亡；
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察油用牡丹的安全性。
(3)调查时间和次数
施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。
(4)药效计算方法
药效按式(1)、(2)计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理后施药前病情指数；
PT1————药剂处理后施药后病情指数；
(5)对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。并记录对作物的其他影响。
6)结果
(1)供试药剂对油用牡丹根腐的防治效果
表3结果显示，2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍、400倍和500倍对油用牡丹根腐病的防治分别为78.06％、72.96％和71.86％，显著高于对照处理70％代森锰锌可湿性粉剂600倍的防治效果。
表3各处理防治油用牡丹根腐病试验效果表
注：处理1为2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍，处理2为400倍，处理3为500倍，处理4为70％代森锰锌600倍。
(2)安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，油用牡丹生长正常，无药害产生，说明2亿/g哈茨木霉SDL Tr35可湿性粉剂供试浓度对油用牡丹安全。从防治效果来看，发病初期采用SDL Tr35可湿性粉剂可以有效的控制油用牡丹根腐病的发生，且对油用牡丹安全性较高，不存在农药残留问题。建议在油用牡丹根腐病发病初期采用2亿/g哈茨木霉SDL Tr35可湿性粉剂300～500倍进行防治。
(3)哈茨木霉原粉对油用牡丹增产效果
表4 2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂对油用牡丹增产效果分析表
注：小区面积60株；处理1为哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂300倍，处理2为400倍，处理3为500倍，处理4为对照组。
由表4结果可知，在油用牡丹上穴施2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂，300倍液～400倍液处理区比对照区每亩牡丹籽增产分别为18kg、13.78kg，增产率分别为11.04％、8.45％；效果十分明显。说明2亿/g哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35可湿性粉剂的防病增产作用非常明显。
因此，从病情指数和防治效果来看，哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35对油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，防效可达70％以上，明显好于对照药剂，差异显著。从油用牡丹增产效果看，哈茨木霉(T.harzianum)SDL Tr35对油用牡丹具有明显的促生增产效果，300倍液处理后增产率为11.04％。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省林业科学研究院
<120> 一株哈茨木霉及其在油用牡丹上的应用
<130> 0
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 644
<212> DNA
<213> 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）SDL Tr35的rDNA ITS序列
<400> 1
gaagtaaaaa atcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60
ttacaactcc caaacccaat gtgaacgtta ccaaactgtt gcctcggcgg gatctctgcc 120
ccgggtgcgt cgcagccccg gaccaaggcg cccgccggag gaccaaccaa aactcttttt 180
gtataccccc tcgcgggttt tttataatct gagccttctc ggcgcctctc gtaggcgttt 240
cgaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 300
agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 360
cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgtcc gagcgtcatt tcaaccctcg 420
aacccctccg gggggtcggc gttggggatc ggccctccct tagcgggtgg ccgtctccta 480
aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc ctgcgcagta gtttgcacac tcgcatcggg 540
agcgcggcgc gtccacagcc gttaaacacc caacttctga aatgttgacc tcggatcagg 600
taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagccgga ggaa 644

Claims (10)

1.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株SDL Tr35，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.6693。
2.权利要求1所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35在防治油用牡丹根腐病、油用牡丹红斑病方面的用途。
3.权利要求1所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35在提高油用牡丹产量方面的用途。
4.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35。
5.权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，
(1)制备哈茨木霉菌株SDL Tr35的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，26～30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物按质量比1：12～18的比例加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在室温26～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养；
步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8；其中固料由质量比为50：35：15的玉米芯、小麦秸秆和牡丹籽壳组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：3.5％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.5％硫酸钙，4％硫酸铵，氯霉素0.05％，剩余为水；
步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
6.如权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，
(1)将哈茨木霉菌株SDL Tr35的孢子移植到液体培养基中，28℃摇床振荡培养2～3d得到种子液；所述液体培养基为：葡萄糖15g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾1g，硝酸钾1g，VB2 0.2g，蒸馏水1000mL；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比15％的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物按质量比1：15的比例加入无菌水混合，过滤，将滤液按体积比15％～30％接种至发酵培养基，室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养7～8d。
7.权利要求4所述的生物防治制剂在防治油用牡丹根腐病、油用牡丹红斑病方面的用途。
8.权利要求4所述的生物防治制剂在提高油用牡丹产量方面的用途。
9.一种用于防治油用牡丹根腐病的生物防治方法，其特征是，所述生物防治方法包括向发病的油用牡丹根部施用权利要求1所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35或者权利要求4的生物防治制剂。
10.一种用于防治油用牡丹红斑病的生物防治方法，其特征是，所述生物防治方法包括向发病的油用牡丹叶片施用权利要求1所述的哈茨木霉菌株SDL Tr35或者权利要求4的生物防治制剂。
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