CN109337829A - 哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物发酵技术领域。该固体发酵方法使用固体发酵罐进行发酵，通过限定固体发酵过程中的湿度、翻拌和通风的工艺参数，可以促进哈茨木霉菌的繁殖，减少杂菌污染，提高哈茨木霉菌的孢子数量。采用该固体发酵方法制备得到的哈茨木霉菌固体发酵产物用于哈茨木霉菌剂，不仅能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进葡萄生长和提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。此外，本发明还提供了哈茨木霉菌剂的制备方法，该方法可以充分利用固体发酵后的残留物，减少固体废弃物污染排放，节约成本，安全环保。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种哈茨木霉菌固体发酵方法、固体发酵产物、哈茨木霉菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
哈茨木霉(Trichoderma harzianum)按照传统分类系统属于无性型真菌(anamorphic fungi)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)、木霉属(Trichoderma sp.)中的一员。木霉属分布广泛，主要存在于森林、坡沟、农田和草地等潮湿的生境中，土壤、枯枝、落叶和腐木等植物残体以及其它真菌的子实体都是其生长基物，其物种丰富多样。木霉菌是一类重要的自然生物资源，具有较高的经济价值。木霉属中应用最多的是哈茨木霉，用哈茨木霉制成菌剂作为生物防治制剂已广泛使用，广泛地应用于农业、工业和环境保护等相关领域。在农业领域，国际上已有50余种木霉生防制剂或菌肥产品注册登记，并进行商业化生产，利用哈茨木霉Trichodermaharzianum Rifai和绿木霉T.virens Arx生产的商业制剂TRICHODEXXTM和Soil-GardTM被广泛用于各种植物真菌病害的防治。
农业上常用的哈茨木霉菌剂多为孢子制剂(活菌制剂)，哈茨木霉制成菌剂用于农业方面的关键在于该菌剂含孢子的数量，但在哈茨木霉生产过程中容易出现菌丝生长过于旺盛，而孢子产量不足的问题。木霉的传统发酵方式主要包括液体发酵和固体浅盘发酵，液体发酵主要产厚垣孢子，但产量极低，且产生的废水废渣容易污染环境；固体浅盘发酵属于半开放式，容易引起杂菌污染，且占地面积大，操作不便。
有鉴于此，特提出本发明以解决上述技术问题中的至少一个。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种哈茨木霉菌固体发酵方法，使用固体发酵罐进行发酵，通过限定固体发酵过程中的工艺参数，按时间段控制湿度、翻拌和通风情况，可以更好地促进哈茨木霉菌的繁殖，减少杂菌污染，提高哈茨木霉菌的孢子数量，克服了传统液体发酵和浅盘固体发酵存在的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种哈茨木霉菌固体发酵产物，采用上述哈茨木霉菌固体发酵方法制备得到，具有孢子数量多和杂菌少的优点。
本发明的第三目的在于提供一种哈茨木霉菌剂，包括上述哈茨木霉菌固体发酵产物。
本发明的第四目的在于提供一种哈茨木霉菌剂的制备方法，该制备方法将固体发酵后剩余的固体培养基粉碎成粉后也用于制备微生物菌剂，充分利用固体发酵后的残留物，减少固体废弃物污染排放，节约成本，安全环保。
本发明的第五目的在于提供上述哈茨木霉菌剂在防治植物霜霉病和灰霉病中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：哈茨木霉菌依次经种子活化、种子液制备、种子液培养和固体发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵的工艺条件包括：发酵pH为自然pH；发酵温度为26-32℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为80-90％，48h＜t≤108h湿度为70-80％，108h＜t≤168h湿度为60-70％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-3h/次，通风时间12-18min/次，通风量0.4-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-6h/次，通风时间17-23min/次，通风量0.1-0.3vvm，t代表发酵时间。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为82-88％，48h＜t≤108h湿度为70-75％，108h＜t≤168h湿度为62-68％；
优选地，所述湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为84-86％，48h＜t≤108h湿度为68-72％，108h＜t≤168h湿度为64-66％。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-2.8h/次，通风时间14-18min/次，通风量0.45-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-5.8h/次，通风时间18-22min/次，通风量0.15-0.3vvm；
优选地，通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2.3-2.6h/次，通风时间14-16min/次，通风量0.45-0.55vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5.3-5.6h/次，通风时间18-20min/次，通风量0.15-0.25vvm。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮30-40份，稻壳20-30份，秸秆25-35份，黄豆粉饼2-8份，钾源1-3份和镁源2-5份。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，种子活化包括以下步骤：将哈茨木霉菌接种于营养琼脂培养基，25-28℃培养3-5d，得到活化的哈茨木霉菌种子。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，种子液制备包括以下步骤：将活化的哈茨木霉菌种子接种于液体培养基，25-28℃培养24-48h，使菌丝浓度达到180-220g/L，得到哈茨木霉菌种子液。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，种子液培养包括以下步骤：将哈茨木霉菌种子液接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；种子液培养的接种量为1.5-2.5‰；
种子液培养条件包括：pH为6.0-6.5，0＜t’≤12h通风量0.6-0.8vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量0.8-1.2vvm，罐压0.5-0.7kg/cm2，混合速度180-220r/min，t’代表种子液培养时间；
优选地，液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉1-3份，葡萄糖1-2.5份，黄豆粉饼2-5份，钾源0.04-0.05份，钠源0.2-0.5份，铵源0.4-0.6份和钙源0.2-0.5份。
第二方面，本发明提供了一种哈茨木霉菌固体发酵产物，采用上述哈茨木霉菌固体发酵方法制备得到。
第三方面，本发明提供了一种哈茨木霉菌剂，包括哈茨木霉菌固体发酵产物；
优选地，哈茨木霉菌剂还包括固体发酵培养基粉和载体。
第四方面，本发明提供了一种哈茨木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：将哈茨木霉菌固体发酵产物与固体发酵培养基粉、载体混合，得到哈茨木霉菌剂；固体发酵培养基粉是固体发酵结束后剩余的固体发酵培养基粉碎分离后得到。
第五方面，本发明提供了上述哈茨木霉菌剂在防治植物霜霉病和灰霉病中的应用；
优选地，所述植物包括葡萄、黄瓜、番茄、西瓜或茄子中的至少一种，进一步优选葡萄。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的哈茨木霉菌固体发酵方法，使用固体发酵罐进行发酵，通过限定固体发酵过程中的工艺参数，按时间段控制湿度、翻拌和通风情况，可以更好地促进哈茨木霉菌的繁殖，减少杂菌污染，提高哈茨木霉菌的孢子数量。此外，该固体发酵方法具有工艺简单，发酵周期短，产量高等优点。
(2)本发明提供的哈茨木霉菌固体发酵产物具有孢子数量多，杂菌少的优点。
(3)本发明提供的哈茨木霉菌剂可以作为生物农药，不仅能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进葡萄生长和提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该哈茨木霉菌剂具有孢子量多、环境适应性强、活性高和防治植物病害效果显著的优点。
(4)本发明提供的哈茨木霉菌剂的制备方法，将固体发酵后剩余的固体培养基粉碎成粉后也用于制备菌剂，充分利用固体发酵后的残留物，减少固体废弃物污染排放，节约成本，安全环保。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。
本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
根据本发明的第一个方面，提供了一种哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：哈茨木霉菌依次经种子活化、种子液制备、种子液培养和固体发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵的工艺条件包括：发酵pH为自然pH；发酵温度为26-32℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为80-90％，48h＜t≤108h湿度为70-80％，108h＜t≤168h湿度为60-70％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-3h/次，通风时间12-18min/次，通风量0.4-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-6h/次，通风时间17-23min/次，通风量0.1-0.3vvm，t代表发酵时间。
需要说明的是上述“自然pH”是指不需要单独调节pH。
哈茨木霉菌先经过种子活化恢复其繁殖活力，再经过种子液制备和种子液培养获得性能稳定，接种数量足够的、纯度较高的哈茨木霉菌种子液培养产物，最后再经过固体发酵培养得到活菌密度高、活性高和孢子数量多的哈茨木霉菌固体发酵产物。
发酵温度典型但非限制性的例如为26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃或32℃。
湿度控制过程中，0h＜t≤48h内，湿度典型但非限制性的例如为80％、82％、84％、86％、88％或90％；48h＜t≤108h内，湿度典型但非限制性的例如为70％、72％、74％、76％、78％或80％；108h＜t≤168h内，湿度典型但非限制性的例如为60％、62％、64％、66％、68％或70％，t代表发酵时间。
翻拌控制过程中，对翻拌的方式不作具体限定，可采用本领域常规的技术手段。
通风控制过程中，0h＜t≤24h内不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间典型但非限制性的例如为2h/次、2.5h/次或3h/次，通风时间典型但非限制性的例如为12min/次、15min/次、16min/次或18min/次，通风量典型但非限制性的例如为0.4vvm、0.45vvm、0.5vvm、0.55vvm或0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间典型但非限制性的例如为5h/次、5.5h/次或6h/次，通风时间典型但非限制性的例如为17min/次、19min/次、20min/次、21min/次或23min/次，通风量典型但非限制性的例如为0.1vvm、0.2vvm或0.3vvm。
通过限定固体发酵过程中的工艺参数，按时间段控制湿度、翻拌和通风情况，可以更好地促进哈茨木霉菌的繁殖，提高哈茨木霉菌的活菌数量。此外，该固体发酵方法的工艺简单，发酵周期短，产量高等优点。
在一种优选地实施方式中，湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为82-88％，48h＜t≤108h湿度为70-75％，108h＜t≤168h湿度为62-68％；
优选湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为84-86％，48h＜t≤108h湿度为68-72％，108h＜t≤168h湿度为64-66％。
优选固体发酵过程中的湿度控制情况，可以更好地调控固体发酵过程中的水分，更好地满足哈茨木霉菌发酵的所需的水分，促进哈茨木霉菌的生长。
在一种优选地实施方式中，通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-2.8h/次，通风时间14-18min/次，通风量0.45-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-5.8h/次，通风时间18-22min/次，通风量0.15-0.3vvm；
优选通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2.3-2.6h/次，通风时间14-16min/次，通风量0.45-0.55vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5.3-5.6h/次，通风时间18-20min/次，通风量0.15-0.25vvm。
优选固体发酵过程中通风控制情况，可以更好地调控固体发酵过程中的氧气含量，更好地满足哈茨木霉菌呼吸作用所需的氧气，促进哈茨木霉菌的生长。
在一种优选地实施方式中，固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮30-40份，稻壳20-30份，秸秆25-35份，黄豆粉饼2-8份，钾源1-3份和镁源2-5份；
钾源包括但不限于KH2PO4、K2HPO4、KNO3或K2SO4；镁源包括但不限于MgSO4、MgCl2或Mg(NO3)2；
固体发酵的接种量是指接种的种子液培养产物与固体发酵培养基的重量比(wt％)。固体发酵的接种量典型但非限制性的例如为10％、11％、12％、13％、14％或15％。
麸皮、稻壳、秸秆和黄豆粉饼可以提供给微生物生长所需的碳源和氮源，钾源和镁源可以为微生物提供生长所需的微量元素，优选固体发酵培养基的组分和优选固体发酵的接种量可以有利于固体发酵过程的顺利进行，促进哈茨木霉菌的生长。
在一种优选地实施方式中，种子活化包括以下步骤：将哈茨木霉菌接种于营养琼脂培养基，25-28℃培养3-5d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
优选营养琼脂培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
种子活化的培养温度典型但非限制性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃；种子活化的培养时间典型但非限制性的例如为3d、4d或5d。
优选种子活化培养过程中的培养温度、培养时间和所用的培养基，可以有利于种子活化过程的顺利进行，提高哈茨木霉菌种子的活性。
在一种优选地实施方式中，种子液制备包括以下步骤：将活化的哈茨木霉菌种子接种于液体培养基，25-28℃培养24-48h，使菌丝浓度达到180-220g/L，得到哈茨木霉菌种子液；优选液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基。
种子液制备的培养温度典型但非限制性的例如为25℃、26℃、27℃或28℃；种子液制备的培养时间典型但非限制性的例如为24h、28h、32h、36h、40h或48h；菌丝浓度典型但非限制性的例如为180g/L、190g/L、200g/L、210g/L或220g/L。
优选种子液制备培养过程中的培养温度、培养时间、所用的培养基以及种子液达到的菌丝浓度，可以有利于种子液制备培养过程的顺利进行，获得菌种数量合适的种子液。
在一种优选地实施方式中，种子液培养包括以下步骤：将哈茨木霉菌种子液接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；优选种子液培养的接种量为1.5-2.5‰；
种子液培养条件包括：pH为6.0-6.5，0＜t’≤12h通风量0.6-0.8vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量0.8-1.2vvm，罐压0.5-0.7kg/cm2，混合速度180-220r/min，t’代表种子液培养时间；
种子液培养的接种量是指接种的种子液与液体发酵培养基的重量比(wt‰)。种子液培养的接种量典型但非限制性的例如为1.5‰、1.7‰、1.9‰、2‰、2.2‰、2.4‰或2.5‰。
种子液培养条件过程中，pH典型但非限制性的例如为6、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5；0＜t’≤12h内，通风量典型但非限制性的例如为0.6vvm、0.65vvm、0.7vvm、0.75vvm或0.8vvm；12h＜t’≤培养结束时间内，通风量典型但非限制性的例如为0.8vvm、0.9vvm、1vvm或1.2vvm；罐压典型但非限制性的例如为0.5kg/cm2、0.6kg/cm2或0.7kg/cm2；混合速度典型但非限制性的例如为180r/min、190r/min、200r/min、210r/min或220r/min。
优选液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉1-3份，葡萄糖1-2.5份，黄豆粉饼2-5份，钾源0.04-0.05份，钠源0.2-0.5份，铵源0.4-0.6份和钙源0.2-0.5份；
优选钾源包括但不限于KH2PO4、K2HPO4、KNO3或K2SO4；优选钠源包括但不限于NaCl、NaNO3或Na2SO4；优选铵源包括但不限于(NH4)2SO4、NH4NO3或(NH4)3PO4；优选钙源包括但不限于CaCO3、CaCl2或CaSO4。
优选种子液培养过程的工艺参数，如培养温度和时间、通风量、罐压和搅拌速度，可以更好地促进培养过程顺利地进行，更容易获得接种数量足够的、纯度较高的哈茨木霉菌种子液培养产物。优选液体发酵培养基可以更均衡且充足的提供给哈茨木霉菌生长所需的营养物质。
一种示例性的哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：
(a)种子活化：将哈茨木霉菌接种于营养琼脂培养基，25-28℃培养3-5d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
(b)种子液制备：将活化的哈茨木霉菌种子接种于液体培养基，25-28℃培养24-48h，菌丝浓度达到180-220g/L，得到哈茨木霉菌种子液；
(c)种子液培养：将哈茨木霉菌种子液接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；
种子液培养的接种量为1.5-2.5‰；
液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉1-3份，葡萄糖1-2.5份，黄豆粉饼2-5份，KH2PO4 0.04-0.05份，NaCl 0.2-0.5份，(NH4)2SO4 0.4-0.6份和CaCO3 0.2-0.5份；
种子液培养条件包括：pH为6.0-6.5，0＜t’≤12h通风量0.6-0.8vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量0.8-1.2vvm，罐压0.5-0.7kg/cm2，混合速度180-220r/min，t’代表种子液培养时间；
(d)固体发酵：将哈茨木霉菌种子液培养产物接种于固体发酵培养基，在固体发酵罐中进行发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵的接种量为10-15％；
固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮30-40份，稻壳20-30份，秸秆25-35份，黄豆粉饼2-8份，KH2PO41-3份和MgSO4 2-5份；
固体发酵的工艺条件包括：发酵pH为自然pH；发酵温度为26-32℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为80-90％，48h＜t≤108h湿度为70-80％，108h＜t≤168h湿度为60-70％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-3h/次，通风时间12-18min/次，通风量0.4-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-6h/次，通风时间18-22min/次，通风量0.1-0.3vvm，t代表发酵时间。
该示例性的哈茨木霉菌固体发酵方法，限定了哈茨木霉菌依次经过种子活化、种子液制备、种子液培养和固体发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物整个过程中的工艺参数和所用的原料，清楚地显示了各工艺步骤的顺序关系，有利于哈茨木霉菌固体发酵过程的顺利进行。
根据本发明的第二个方面，提供了一种哈茨木霉菌固体发酵产物，采用上述哈茨木霉菌固体发酵方法制备得到；优选哈茨木霉菌固体发酵产物的活菌数为150-200亿/g。
该哈茨木霉菌固体发酵产物具有孢子数量多和杂菌少的优点。
根据本发明的第三个方面，提供了一种哈茨木霉菌剂，包括上述哈茨木霉菌固体发酵产物。
优选哈茨木霉菌剂还包括固体发酵培养基粉和载体；优选载体包括膨润土、硅藻土或腐植酸中的至少一种。
哈茨木霉制成菌剂用于农业方面的关键在于该菌剂含孢子的数量，数量高，菌剂货架期就会比较长，此外孢子数量高的菌剂能够在田间迅速萌发定殖，形成优势菌落，进而产生代谢产物，作用于植株和植株的生长微环境，从而起到生防和促进植株生长作用。因此，孢子的产量与菌剂的质量密切相关。
上述哈茨木霉菌剂可以作为生物农药，不仅能高效地防治葡萄霜霉病和葡萄灰霉病，还能有效促进作物生长和提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该哈茨木霉菌剂具有孢子量多、环境适应性强、活性高和防治植物病害效果显著的优点。
根据本发明的第四个方面，提供了一种哈茨木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：哈茨木霉菌固体发酵产物经干燥分离得到哈茨木霉菌孢子粉，再与固体发酵培养基粉、载体混合，得到哈茨木霉菌剂；固体发酵培养基粉是固体发酵结束后剩余的固体发酵培养基粉碎分离后得到。
优选哈茨木霉菌孢子粉:固体发酵培养基粉和载体总量比为1:(10-20)。
哈茨木霉菌孢子粉:固体发酵培养基粉和载体总量比典型但非限制性的例如为1:10、1:12、1:14、1:16、1:18或1:20。
需要说明的是，哈茨木霉菌固体发酵产物的粒度较粗，直接制备微生物菌剂是不适合在田间滴灌使用的，而且保存时间较短；所以将哈茨木霉菌固体发酵产物先进行干燥后分离孢子，得到孢子粉来制备微生物菌剂。
优选干燥方式为使用烘干房静态干燥。
该哈茨木霉菌剂的制备方法，将固体发酵后剩余的固体培养基粉碎成粉后也用于制备菌剂，充分利用固体发酵后的残留物，减少固体废弃物污染排放，节约成本，安全环保。
一种示例性的哈茨木霉菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)将哈茨木霉菌固体发酵产物干燥后分离孢子，得到干燥的哈茨木霉菌孢子粉；
(b)将剩余的固体发酵培养基粉碎，150-250目过筛，得到固体发酵培养基粉；
(c)将干燥的哈茨木霉菌孢子粉与固体发酵培养基粉、载体混合，得到哈茨木霉菌剂。
过筛目数典型但非限制性的例如为150目、160目、170目、180目、190目、200目、210目、220目、230目、240目或250目。
优选固体发酵培养基粉碎后的过筛目数，所用的载体，哈茨木霉菌孢子粉与固体发酵培养基粉和载体总量的重量比，可以使制备得到的哈茨木霉菌剂孢子数量多，活性高和防治植物病害效果显著的优点更加突出。
根据本发明的第五个方面，提供了哈茨木霉菌剂在防治植物霜霉病和灰霉病中的应用；
优选地，所述植物包括葡萄、黄瓜、番茄、西瓜或茄子中的至少一种，进一步优选葡萄。
哈茨木霉菌剂在防治植物霜霉病和灰霉病的使用过程中，可以采用叶面喷施、底施或二者结合使用的方式，具体哈茨木霉菌剂的施用方式可以按照实际需要进行选择。
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明方法和效果做进一步详细的说明。本发明涉及的各原料均可通过商购获取。下述实施例和对比例所使用的培养基均经灭菌后使用，采用本领域常规的手段灭菌。
实施例1
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将哈茨木霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，25℃培养5d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
(2)种子液制备：将活化的哈茨木霉菌种子接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，28℃培养24h，菌丝浓度达到180g/L，得到哈茨木霉菌种子液；
(3)种子液培养：将哈茨木霉菌种子液按1.5‰接种量接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；
液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉1份，葡萄糖2.5份，黄豆粉饼2份，KH2PO4 0.05份，NaCl 0.2份，(NH4)2SO4 0.6份和CaCO3 0.2份；
种子液培养条件：pH6.0，0＜t’≤12h通风量0.6vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量0.8vvm，罐压为0.5kg/cm2，混合速度为180r/min，t’代表种子液培养时间；
(4)固体发酵：将哈茨木霉菌种子液培养产物按10％接种量接种于固体发酵培养基，在固体发酵罐中进行发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮30份，稻壳30份，秸秆25份，黄豆粉饼8份，KH2PO4 1份和MgSO4 5份；
固体发酵的工艺条件：发酵pH为自然pH，发酵温度为26℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为80％，48h＜t≤108h湿度为70％，108h＜t≤168h湿度为60％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2h/次，通风时间18min/次，通风量0.4vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5h/次，通风时间22min/次，通风量0.1vvm，t代表发酵时间。
实施例2
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将哈茨木霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养3d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
(2)种子液制备：将活化的哈茨木霉菌种子接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，25℃培养48h，菌丝浓度达到220g/L，得到哈茨木霉菌种子液；
(3)种子液培养：将哈茨木霉菌种子液按2.5‰接种量接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；
液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉3份，葡萄糖1份，黄豆粉饼5份，KH2PO4 0.04份，NaCl 0.5份，(NH4)2SO4 0.4份和CaCO3 0.5份；
种子液培养条件包括：pH6.5，0＜t’≤12h通风量0.8vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量1.2vvm，罐压为0.7kg/cm2，混合速度为220r/min，t’代表种子液培养时间；
(4)固体发酵：将哈茨木霉菌种子液培养产物按15％接种量接种于固体发酵培养基，在固体发酵罐中进行发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮40份，稻壳20份，秸秆35份，黄豆粉饼2份，KH2PO4 3份和MgSO4 2份；
固体发酵的工艺条件：发酵pH为自然pH；发酵温度为32℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为90％，48h＜t≤108h湿度为80％，108h＜t≤168h湿度为70％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间3h/次，通风时间12min/次，通风量0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间6h/次，通风时间18min/次，通风量0.3vvm，t代表发酵时间。
实施例3
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，包括以下步骤：
(1)种子活化：将哈茨木霉菌接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，27℃培养4d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
(2)种子液制备：将活化的哈茨木霉菌种子接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，27℃培养36h，菌丝浓度达到200g/L，得到哈茨木霉菌种子液；
(3)种子液培养：将哈茨木霉菌种子液按2‰接种量接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；
液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉2份，葡萄糖1.5份，黄豆粉饼3.5份，KH2PO4 0.045份，NaCl 0.35份，(NH4)2SO4 0.5份和CaCO3 0.2-0.5份；
种子液培养条件包括：pH6.3，0＜t’≤12h通风量0.7vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量1vvm，罐压为0.6kg/cm2，混合速度为200r/min，t’代表种子液培养时间。
(4)固体发酵：将哈茨木霉菌种子液培养产物按13％接种量接种于固体发酵培养基，在固体发酵罐中进行发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮35份，稻壳25份，秸秆30份，黄豆粉饼5份，KH2PO4 2份和MgSO4 3.5份；
固体发酵的工艺条件包括：发酵pH为自然pH，发酵温度为28℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为85％，48h＜t≤108h湿度为75％，108h＜t≤168h湿度为65％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2.5h/次，通风时间15min/次，通风量0.5vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5.5h/次，通风时间20min/次，通风量0.2vvm，t代表发酵时间。
实施例4
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，湿度控制过程条件：0h＜t≤48h湿度为80％，48h＜t≤108h湿度为70％，108h＜t≤168h湿度为60％，t代表发酵时间，其余均相同。
实施例5
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，通风控制过程条件：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间3h/次，通风时间12min/次，通风量0.4vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间6h/次，通风时间18min/次，通风量0.1vvm，t代表发酵时间，其余均相同。
实施例6
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，固体发酵培养基组分含量不同，本实施例的固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮50份，稻壳10份，秸秆50份，黄豆粉饼1份，KH2PO4 5份和MgSO4 1份。
实施例7
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，固体发酵培养基组分中KNO3替代KH2PO4，MgCl2替代MgSO4。
实施例8-11
一种哈茨木霉菌剂，实施例8-11的哈茨木霉菌剂分别独立地采用实施例3-6提供的哈茨木霉菌固体发酵产物；
实施例8-11的哈茨木霉菌剂的优选的制备方法，包括以下步骤：
(1)将哈茨木霉菌固体发酵产物40-50℃干燥分离，得到干燥的哈茨木霉菌孢子粉；
(2)将剩余的固体发酵培养基粉碎，200目过筛，得到固体发酵培养基粉；
(3)将干燥的哈茨木霉菌孢子与固体发酵培养基粉、膨润土混合，得到哈茨木霉菌剂；干燥的哈茨木霉菌孢子粉:固体发酵培养基粉和膨润土混合物的重量比为1:15。
对比例1
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，湿度控制过程条件：0h＜t≤48h湿度为70％，48h＜t≤108h湿度为60％，108h＜t≤168h湿度为50％，t代表发酵时间，其余均相同。
对比例2
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，翻拌控制过程条件：0h＜t≤48h不翻拌，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌，t代表发酵时间，其余均相同。
对比例3
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，通风控制过程条件：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间4h/次，通风时间10min/次，通风量0.3vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间3h/次，通风时间15min/次，通风量0.05vvm，t代表发酵时间。
对比例4
一种哈茨木霉菌固体发酵方法，与实施例3的区别在于，步骤(4)中固体发酵方式不同。
本对比例的固体发酵包括以下步骤：将固体发酵培养基放入浅盘内，加水得到浅盘湿固体培养基，浅盘湿固体培养基水含量85％；将哈茨木霉菌种子液培养产物按13％接种量接种于浅盘湿固体培养基中，搅拌均匀，培养温度28℃，培养时间168h，得到固体发酵产物。
对比例5-8
一种哈茨木霉菌剂，对比例5-8的哈茨木霉菌剂分别独立地采用对比例1-4提供的哈茨木霉菌固体发酵产物；
对比例5-8的哈茨木霉菌剂的制备方法与实施例8-11的制备方法相同。
对比例9
市售美国拜沃牌哈茨木霉叶部专用微生物菌剂。
为进一步验证上述实施例和对比例的效果，特设以下实验例。
实验例1固体发酵产物活菌和孢子产量(镜检孢子数量)
对实施例1-7和对比例1-4得到的固体发酵产物进行活菌计数和孢子计数。
活菌计数和孢子计数：采用本领域常规的血球计数板方法。具体的方法如下：
(1)制备菌液，称取1g样品加入三角瓶中，摇床上混匀30min，150r/min，将样品稀释到10-2，吸取1mL稀释液加入到9mL无菌水空白管中，依次稀释至10-3、10-4、10-5；
(2)加样前，先对计数板进行清洗镜检确定无污物和菌体后，用滤纸轻轻擦干或用吹风机吹干；
(3)将清洁干燥的计数板盖上盖玻片，再用毛细滴灌将稀释好摇匀的菌悬液由盖玻片边缘加样，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自由渗入计数室；
(4)加样后静止一会儿，然后计数板置于显微镜的载物台上进行计数，一般样品稀释度要求每小格内5-10个菌体为宜，对于线上的菌体计数时，一般是计上不计下，计左不计右；
(5)25*16的计数板：每g样品的活菌数或孢子数＝(计数总数/5×25×10×1000)/稀释倍数。
杂菌率＝杂菌数/总菌数*100％。
实验结果如表1所示。
表1
| 样品 | 孢子数(亿/g) | 杂菌率(％) |
| 实施例1 | 120 | 6.3 |
| 实施例2 | 126 | 6.1 |
| 实施例3 | 155 | 5.0 |
| 实施例4 | 137 | 5.8 |
| 实施例5 | 139 | 6.0 |
| 实施例6 | 148 | 5.3 |
| 实施例7 | 150 | 5.5 |
| 对比例1 | 115 | 8.1 |
| 对比例2 | 109 | 8.9 |
| 对比例3 | 114 | 8.6 |
| 对比例4 | 97 | 10.4 |
由表1可以看出，本发明的固体发酵方法制备的哈茨木霉的固体发酵产物中孢子数可达110亿/g以上，且杂菌率低于6.5％。
实验例2对山东地区葡萄灰霉病的防控效果及对果实品质的影响
一、实验选址和设计
试验选在山东省德州市临邑县葡萄园区进行，设置实验检验哈茨木霉微生物菌剂对葡萄灰霉病的防控效果及对果实品质的影响。11月进行预防试验，试验共设5个处理，每个处理设5个小区，小区随机排列，每小区20株。
二、供试药剂
以实施例8提供的哈茨木霉菌剂分别稀释800倍(A1)和稀释500倍(A2)，对比例5提供的哈茨木霉菌剂分别稀释800倍(A3)和稀释500倍(A4)，A1-A4为实验组。清水喷施作为对照组(CK)，常用的化学药剂吡唑醚菌酯(B1)及对比例9提供的哈茨木霉菌剂(B2)作为防治效果对比组。具体试验处理组见表2。
三、药剂施用情况
实验施用方式完全按照产品建议倍数。将各处理喷施葡萄果穗及叶片上，每半个月喷施1次，整个生长季喷施5次，以喷清水为对照。1月初调查各处理发病情况，并计算发病率和防治效果，具体结果见表3；以及统计对葡萄果实品质的影响，具体结果见表4。
发病率(％)＝发病穗数/总穗数×100％
防治效果(％)＝(对照区发病率-处理区发病率)/对照区发病率×100％
表2供试药剂对葡萄灰霉病的防控试验处理
| 编号 | 处理 |
| CK | 清水对照 |
| A1 | 实施例8稀释800倍 |
| A2 | 实施例8稀释500倍 |
| A3 | 对比例5稀释800倍 |
| A4 | 对比例5稀释500倍 |
| B1 | 吡唑醚菌酯稀释1000倍 |
| B2 | 对比例9稀释300倍 |
表3供试药剂对山东地区葡萄灰霉病的防控试验结果
实验防治效果的结果在葡萄灰霉病发病盛期调查，表3的结果表明，实施例8稀释500倍的防治效果与吡唑醚菌酯、市售哈茨木霉菌剂的防治效果没有明显差异。实施例8稀释800倍处理组的发病率明显低于对照组，可见本发明实施例8提供的哈茨木霉菌剂具有防治葡萄灰霉病的功效，且与吡唑醚菌酯防治效果无明显差异。
对比例5分别稀释500倍和800倍的防治效果都明显不如实施例8分别稀释500倍和800倍的防治效果好，对比例5与实施例8的区别是固体发酵过程中的湿度条件不同，且不在本发明保护的范围之内。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的湿度控制条件会影响哈茨木霉菌剂对葡萄灰霉病的防治效果。
表4供试药剂对山东地区葡萄果实品质的影响
表4的结果表明，实施例8提供的哈茨木霉微生物菌剂对葡萄果实穗重和穗长有明显的促进作用，且穗重受稀释倍数影响较大；稀释倍数降低，穗重明显增加，但稀释倍数对果实穗长影响不明显。对比例9的哈茨木霉菌剂和吡唑醚菌酯促进作用都不如实施例8哈茨木霉稀释800倍的效果好。
对比例5分别稀释500倍和800倍对葡萄果实穗重和穗长的促进作用都明显不如实施例8分别稀释500倍和800倍的效果好。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的湿度控制条件会影响哈茨木霉菌剂对葡萄果实穗重和穗长促进作用的效果。
综上所述，实施例8的哈茨木霉菌剂稀释500倍不仅对葡萄灰霉病有较好的防治效果，而且可以有效促进葡萄果实品质和经济指标，明显优于普通常用化学农药和市售哈茨木霉微生物菌剂。
实验例3对山东地区葡萄霜霉病的防控效果及对果实品质的影响
一、实验选址和设计
试验选在山东省德州市临邑县葡萄园区进行，设置实验检验哈茨木霉微生物菌剂对葡萄霜霉病的防控效果及对果实品质的影响。11月进行预防试验，试验共设5个处理，每个处理设5个小区，小区随机排列，每小区20株。每小区随机调查20个当年抽生的新蔓，每个枝蔓自上而下调查10片叶，记录各级病叶数。
二、供试药剂
以本发明实施例9提供的哈茨木霉菌剂分别稀释600倍(A1)和稀释300倍(A2)，对比例6提供的哈茨木霉菌剂分别稀释600倍(A3)和稀释300倍(A4)，A1-A4为实验组。清水喷施作为对照组(CK)，常用的化学药剂氰霜唑(B1)及对比例9的哈茨木霉菌剂(B2)作为防治效果对比组，具体试验处理组见表5。
三、药剂施用情况
实验施用方式完全按照产品建议倍数。在田间葡萄上有零星发病时开始喷药，施药前调查病情指数。每隔施药一次，共施药4次，第4次施药后10天，调查病情指数，计算此时防治效果，具体结果见表6；以及统计对葡萄果实品质的影响，具体结果见表7。
发病率(％)＝调查病叶数/调查总叶数×100
病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数值)/(对照区调查叶总叶×最高病级值)]×100
防治效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100
表5供试药剂对葡萄灰霉病的防控试验处理
| 编号 | 处理 |
| CK | 清水对照 |
| A1 | 实施例9稀释600倍 |
| A2 | 实施例9稀释300倍 |
| A3 | 对比例6稀释600倍 |
| A4 | 对比例6稀释300倍 |
| B1 | 氰霜唑稀释2000倍 |
| B2 | 对比例9稀释300倍 |
表6供试药剂对山东地区葡萄霜霉病的防控试验结果
| 编号 | 发病率％ | 病情指数 | 防治效果(％) |
| CK | 55.26 | 27.58 | / |
| A1 | 38.42 | 18.56 | 32.70 |
| A2 | 25.65 | 12.54 | 54.53 |
| A3 | 42.14 | 20.57 | 25.41 |
| A4 | 27.31 | 14.82 | 46.27 |
| B1 | 26.98 | 12.35 | 55.22 |
| B2 | 26.56 | 13.47 | 51.16 |
表6的结果表明，实施例9稀释300倍的防控效果与氰霜唑的防控效果没有明显差异，对比例9的哈茨木霉稀释300倍对葡萄霜霉病防治效果不如实施例9稀释300倍液的效果好。实施例9稀释600倍处理组的发病率和病情指数也明显低于对照组，可见本发明实施例9提供的哈茨木霉菌剂对葡萄霜霉病具有较好的控病效果，且与市场上现售的化学药剂和对比例9的哈茨木霉菌剂的防治效果无明显差异。
对比例6分别稀释600倍和300倍的防治效果都明显不如实施例9分别稀释300倍和600倍的防治效果，对比例6与实施例9的区别是固体发酵过程中翻拌情况不同，且不在本发明保护的范围之内。可见哈茨木霉菌固体发酵中的翻拌情况会影响哈茨木霉菌剂对葡萄霜霉病的防治效果。
表7供试药剂对山东地区葡萄果实品质的影响
表7的结果表明，实施例9提供的哈茨木霉微生物菌剂对葡萄果实穗重和穗长有明显的促进作用，且穗重受稀释倍数影响较大，稀释倍数降低，穗重明显增加，且稀释300倍对果实穗长影响显著高于稀释600倍。对比例9的哈茨木霉菌剂也可有效促进葡萄果实品质，与哈茨木霉600倍液促进效果相当，氰霜唑对葡萄果实穗重和穗长促进作用明显不如实施例9的哈茨木霉微生物菌剂。
对比例6分别稀释600倍和300倍的对葡萄果实穗重和穗长的促进作用都明显不如实施例9分别稀释600倍和300倍的效果好。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的翻拌情况会影响哈茨木霉菌剂对葡萄果实穗重和穗长促进作用的效果。
实验例4对新疆地区葡萄灰霉病的防控效果及对果实品质的影响
一、实验选址和设计
试验选在新疆阿克苏市红旗坡葡萄园区进行。试验共设5个处理，每个处理设5个小区，小区随机排列，每小区15株。
二、供试药剂
以本发明实施例10提供的哈茨木霉菌剂分别稀释500倍+底施25kg/亩(A1)和稀释500倍(A2)，对比例7提供的哈茨木霉菌剂分别稀释500倍+底施25kg/亩((A3)和稀释500倍(A4)，A1-A4为实验组。清水喷施作为对照组(CK)，常用的化学药剂嘧菌环胺(B1)及对比例9哈茨木霉菌剂的(B2)作为防治效果对比组，具体试验处理组见表8。
三、药剂施用情况
实验施用方式完全按照产品建议倍数。将各处理喷施葡萄果穗及叶片上，每半个月喷施1次，整个生长季喷施5次，以喷清水为对照。2个月后调查各处理发病情况，并计算发病率和防治效果，具体结果见表9；统计对葡萄果实品质的影响，具体结果见表10。
表8供试药剂对葡萄灰霉病的防控试验处理
| 编号 | 处理 |
| CK | 清水对照 |
| A1 | 实施例10稀释500倍+底施25kg/亩 |
| A2 | 实施例10稀释500倍 |
| A3 | 对比例7稀释500倍+底施25kg/亩 |
| A4 | 对比例7稀释500倍 |
| B1 | 嘧菌环胺稀释800倍 |
| B2 | 对比例9稀释300倍 |
表9供试药剂对新疆地区葡萄灰霉病的防控试验结果
表9的结果表明，实施例10稀释500倍的防治效果与嘧菌环胺、市售哈茨木霉菌剂的防治效果没有明显差异。另外，由于哈茨木霉微生物菌剂可以底施和叶喷综合防治，综合施用下葡萄灰霉病发病率显著降低，综合防治效果达64.18％。
对比例7分别稀释500倍+底施25kg/亩和500倍的防治效果都明显不如实施例8分别稀释500倍+底施25kg/亩和800倍的防治效果好，对比例7与实施例8的区别是固体发酵过程中的通风情况不同，且不在本发明保护的范围之内。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的通风控制条件会影响哈茨木霉菌剂对葡萄灰霉病的防治效果。
表10供试药剂对新疆地区葡萄果实品质的影响
表10的结果表明，实施例10提供的哈茨木霉微生物菌剂对葡萄果实穗重和穗长有明显的促进作用，且底施和喷施综合防治下，葡萄果实各项经济指标具有明显增加，并显著高于其他几个处理。单独喷施哈茨木霉与市售哈茨木霉菌剂也可有效促进葡萄果实品质。
对比例7分别稀释500倍+底施25kg/亩和500倍对葡萄果实穗重和穗长的促进作用都明显不如实施例8分别稀释500倍+底施25kg/亩和500倍的效果好。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的通风控制条件会影响哈茨木霉菌剂对葡萄果实穗重和穗长的促进作用的效果。
综上所述，哈茨木霉菌剂对葡萄灰霉病有较好的防治效果，而且可以有效促进葡萄果实品质和经济指标，底施和叶面喷施综合施用下，防治效果明显优于普通常用化学农药和市售哈茨木霉微生物菌剂。
实验例5对新疆地区葡萄霜霉病的防控效果及对果实品质的影响
一、实验选址和设计
试验选在新疆阿克苏市红旗坡葡萄园区进行。其他实验设计与实验例3相同。
二、供试药剂
以本发明实施例11提供的哈茨木霉菌剂分别稀释300倍+底施25kg/亩(A1)和稀释300倍(A2)，对比例8提供的哈茨木霉菌剂分别稀释300倍+底施25kg/亩(A3)和稀释300倍(A4)，A1-A4为实验组。清水喷施作为对照组(CK)，常用的化学药剂靓果安(B1)及对比例9的哈茨木霉菌剂(B2)作为防治效果对比组，具体试验处理组见表11。
三、药剂施用情况
药剂施用情况与实验例3相同。计算防治效果，具体结果见表12；以及统计对葡萄果实品质的影响，具体结果见表13。
表11供试药剂对葡萄霜霉病的防控试验处理
表12供试药剂对新疆地区葡萄霜霉病的防控试验结果
| 编号 | 发病率％ | 病情指数 | 防治效果(％) |
| CK | 62.23 | 32.55 | / |
| A1 | 28.65 | 12.54 | 61.47 |
| A2 | 35.45 | 17.37 | 46.64 |
| A3 | 30.71 | 14.65 | 54.99 |
| A4 | 37.34 | 17.97 | 44.79 |
| B1 | 33.58 | 16.58 | 49.06 |
| B2 | 33.86 | 17.11 | 47.43 |
表12的结果表明，实施例11稀释300倍的防治效果与靓果安、对比例9的哈茨木霉菌剂的防治效果没有明显差异。但实施例11稀释300倍+底施25kg/亩的处理组中，底施和叶面喷施综合防治下，防治效果显著高于其它几个处理，防治效果达61.47％。
对比例8分别稀释300倍+底施25kg/亩和300倍的防治效果都明显不如实施例11分别稀释300倍+底施25kg/亩和300倍的防治效果，对比例8与实施例11的区别是固体发酵过程中的固体发酵方式不同，对比例8为固体浅盘发酵。可见，哈茨木霉菌固体发酵过程中的固体发酵方式会影响哈茨木霉菌剂对葡萄灰霉病的防治效果。
表13供试药剂对新疆地区葡萄果实品质的影响
表13的结果表明，实施例11提供的哈茨木霉微生物菌剂对葡萄果实穗重和穗长有明显的促进作用，且底施和喷施综合防治下，葡萄果实各项经济指标具有明显增加，并显著高于其他几个处理。单独喷施哈茨木霉与市售哈茨木霉菌剂也可有效促进葡萄果实品质。
对比例8分别稀释300倍+底施25kg/亩和300倍的防治效果都明显不如实施例11分别稀释300倍+底施25kg/亩和300倍的防治效果，对比例8固体发酵采用浅盘固体发酵，采用浅盘固体发酵产物制备的哈茨木霉菌剂不如本发明的哈茨木霉菌剂对葡萄果实穗重和穗长的促进作用的效果好。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：哈茨木霉菌依次经种子活化、种子液制备、种子液培养和固体发酵，得到哈茨木霉菌固体发酵产物；
所述固体发酵的工艺条件包括：发酵pH为自然pH；发酵温度为26-32℃；
湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为80-90％，48h＜t≤108h湿度为70-80％，108h＜t≤168h湿度为60-70％；
翻拌控制过程包括：0h＜t≤24h不翻拌，24h＜t≤48h翻拌一次，48h＜t≤96h翻拌一次，96h＜t≤168h不翻拌；
通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-3h/次，通风时间12-18min/次，通风量0.4-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-6h/次，通风时间17-23min/次，通风量0.1-0.3vvm，t代表发酵时间。
2.按照权利要求1所述的哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，所述湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为82-88％，48h＜t≤108h湿度为70-75％，108h＜t≤168h湿度为62-68％；
优选地，所述湿度控制过程包括：0h＜t≤48h湿度为84-86％，48h＜t≤108h湿度为68-72％，108h＜t≤168h湿度为64-66％；
优选地，所述通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2-2.8h/次，通风时间14-18min/次，通风量0.45-0.6vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5-5.8h/次，通风时间18-22min/次，通风量0.15-0.3vvm；
进一步优选地，所述通风控制过程包括：0h＜t≤24h不通风；24h＜t≤108h间歇通风，间歇时间2.3-2.6h/次，通风时间14-16min/次，通风量0.45-0.55vvm；108h＜t≤168h间歇通风，间歇时间5.3-5.6h/次，通风时间18-20min/次，通风量0.15-0.25vvm。
3.按照权利要求1所述的哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，固体发酵培养基包括重量份数的如下组分：麸皮30-40份，稻壳20-30份，秸秆25-35份，黄豆粉饼2-8份，钾源1-3份和镁源2-5份；
优选地，所述钾源包括KH2PO4、K2HPO4、KNO3或K2SO4中的至少一种；
优选地，所述镁源包括MgSO4、MgCl2或Mg(NO3)2中的至少一种；
优选地，所述固体发酵的接种量为10-15％。
4.按照权利要求1-3任一项所述的哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，所述种子活化包括以下步骤：将哈茨木霉菌接种于营养琼脂培养基，25-28℃培养3-5d，得到活化的哈茨木霉菌种子；
优选地，所述营养琼脂培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
5.按照权利要求1-3任一项所述的哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，所述种子液制备包括以下步骤：将活化的哈茨木霉菌种子接种于液体培养基，25-28℃培养24-48h，使菌丝浓度达到180-220g/L，得到哈茨木霉菌种子液；
优选地，所述液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基。
6.按照权利要求1-3任一项所述的哈茨木霉菌固体发酵方法，其特征在于，所述种子液培养包括以下步骤：将哈茨木霉菌种子液接种于液体发酵培养基，在种子罐中培养，得到哈茨木霉菌种子液培养产物；
优选地，所述种子液培养的接种量为1.5-2.5‰；
种子液培养条件包括：pH为6.0-6.5，0＜t’≤12h通风量0.6-0.8vvm，12h＜t’≤培养结束时通风量0.8-1.2vvm，罐压0.5-0.7kg/cm2，混合速度180-220r/min，t’代表种子液培养时间；
优选地，所述液体发酵培养基包括重量份数的如下组分：玉米粉1-3份，葡萄糖1-2.5份，黄豆粉饼2-5份，钾源0.04-0.05份，钠源0.2-0.5份，铵源0.4-0.6份和钙源0.2-0.5份；
优选地，所述钾源包括KH2PO4、K2HPO4、KNO3或K2SO4中的至少一种；
优选地，所述钠源包括NaCl、NaNO3或Na2SO4中的至少一种；
优选地，所述铵源包括(NH4)2SO4、NH4NO3或(NH4)3PO4中的至少一种；
优选地，所述钙源包括CaCO3、CaCl2或CaSO4中的至少一种。
7.一种哈茨木霉菌固体发酵产物，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的哈茨木霉菌固体发酵方法制备得到；
优选地，所述哈茨木霉菌固体发酵产物的活菌数为150-200亿/g。
8.一种哈茨木霉菌剂，其特征在于，包括权利要求7所述的哈茨木霉菌固体发酵产物；
优选地，所述哈茨木霉菌剂还包括固体发酵培养基粉和载体；
优选地，所述载体包括膨润土、硅藻土或腐植酸中的至少一种。
9.一种哈茨木霉菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：哈茨木霉菌固体发酵产物经干燥分离得到哈茨木霉菌孢子粉，再与固体发酵培养基粉、载体混合，得到哈茨木霉菌剂；
所述固体发酵培养基粉是固体发酵结束后剩余的固体发酵培养基粉碎分离后得到；
优选地，哈茨木霉菌孢子粉:固体发酵培养基粉和载体总量的重量比为1:(10-20)。
10.一种权利要求8所述的哈茨木霉菌剂或权利要求9所述的哈茨木霉菌剂的制备方法制备得到的哈茨木霉菌剂在防治植物霜霉病和灰霉病中的应用；
优选地，所述植物包括葡萄、黄瓜、番茄、西瓜或茄子中的至少一种，进一步优选葡萄。
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