CN112574895A - 一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用。本公开的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的保藏编号为CGMCC No.16794。本公开还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有如上所述的哈茨木霉菌作为有效成分。本公开还提供了如上所述的哈茨木霉菌及如上所述的微生物菌剂在防治葡萄霜霉病中的应用。通过上述技术方案，本公开可以更加有效地去除磺胺二甲嘧啶。

Description

一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用
技术领域
本公开属于微生物技术领域，具体涉及一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术
葡萄是一种既可鲜食又可加工成各种产品的全球性水果，不仅味美可口，而且营养价值很高，成熟的浆果中含糖量高达10～30％，且以葡萄糖为主，可被人体直接吸收，还含有矿物质钙、钾、磷、铁以及多种维生素和人体必需氨基酸。
葡萄霜霉病是一种世界性的葡萄病害。我国各葡萄产区均有分布，尤其在多雨潮湿地区发生普遍，是葡萄主要病害之一。葡萄霜霉病主要危害叶片，也能侵染新梢幼果等幼嫩组织。叶片发病时会形成斑点，病斑背面在潮湿天气会产生白色霜霉状物，即病菌的孢囊梗和孢子囊。发病严重时病叶早枯早落；幼果发病时会在受害处褪色变硬并下陷，产生白色霜霉，很易萎缩脱落。果粒半大时受害，病部褐色至暗色，软腐早落。果实着色后不再侵染。目前，葡萄霜霉病的防治药剂种类繁多，但大多需要在发病不同的时期多次施用，不但繁琐，而且多次施用增加环境污染，效果不理想。
发明内容
本公开的目的是提供一种哈茨木霉菌、微生物菌剂及其应用，该哈茨木霉菌能够防治葡萄霜霉病。
本发明的发明人分离了一株哈茨木霉菌，发现其可以有效地防治葡萄霜霉病，可以提高葡萄果实的产量，由此得到了本发明。
为了实现上述目的，本公开提供一种哈茨木霉菌，该哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)的保藏编号为CGMCC No.16794。
本公开第二方面提供一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌。
可选地，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌的活菌数为108-1010CFU。
可选地，所述培养基为马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)。
可选地，所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)的制备方法为：取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，在汁中加入2g葡萄糖、1.5g琼脂，加水至100ml，pH6.8-7.0，装入2个三角瓶，每个50ml，灭菌后制成斜面或平板；所述马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)的制备方法为：取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，在汁中加入2g葡萄糖，加水至100ml，pH6.8-7.0，装入2个三角瓶，每个50ml，灭菌。
本公开第三方面提供本公开第一方面所述的哈茨木霉菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在防治葡萄霜霉病中的应用。
通过上述技术方案，本公开的保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌能够有效地防治葡萄霜霉病，并且有助于提高葡萄的产量。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的哈茨木霉菌是本发明的发明人从新疆和布克赛尔县的土壤样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC No.16794，保藏日期为2018年11月27日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的发明人从新疆和布克赛尔县的土壤样品中分离培养出一种新的菌种，经鉴定该菌属于木霉属(Trichoderma)，被命名为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2018年11月27日，保藏编号为CGMCC No.16794。
本公开提供一种哈茨木霉菌，该哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的保藏编号为CGMCC No.16794。
本公开的哈茨木霉菌可以在常规的真菌培养基中存活并生长繁殖。本公开如上所述的哈茨木霉菌是一株非常优异的防治葡萄霜霉病菌株。
本公开第二方面提供一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，所述菌体含有保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌。
其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌的活菌数可以为108-1011CFU，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌的活菌数可以为109-1010CFU。
根据本公开，所述培养基为马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)。
其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床振荡培养48h，制成种子液待用。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐(以重量计，含有2.5％淀粉，1.5％酵母粉，5.0％玉米浆，0.4％的CaCO3，0.01％的ZnSO4、0.03％的MgSO4)，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂。
优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.16794的哈茨木霉菌的活菌数可以为107-1011CFU，更优选为109-1010CFU。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。
培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为哈茨木霉菌培养过程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为25-30℃，培养时间可以为1-2天。
优选地，所述微生物菌剂的制备方法还可以包括：将在发酵培养基中进行培养后得到的物料与惰性固体载体和粘结剂混合；所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种；所述粘结剂包括麦芽糖和/或糊精。优选地，惰性固体载体和粘结剂的用量使得所述微生物菌剂中，惰性固体载体的含量为30-90重量％；所述粘结剂的含量为5-20重量％。其中，混合后的物料可以进一步干燥制粒为颗粒剂。
本公开第三方面提供本公开第一方面所述的哈茨木霉菌或本公开第二方面所述的微生物菌剂在防治葡萄霜霉病中的应用。
根据本公开，将保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌应用于防治葡萄霜霉病的方法可以包括：将保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌制备成可湿性粉剂并喷洒于染病的葡萄植株中。
以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中。
本实施例中使用的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)的制备方法为：取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，在汁中加入2g葡萄糖、1.5g琼脂，加水至100ml，pH6.8-7.0，装入2个三角瓶，每个50ml，灭菌后制成斜面或平板。
厚垣孢子发酵培养基的发酵罐的配方为：以重量计，含有2.5％淀粉，1.5％酵母粉，5.0％玉米浆，0.4％的CaCO3，0.01％的ZnSO4、0.03％的MgSO4。
实施例1
将上述保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂。所得到的可湿性粉剂中哈茨木霉菌的活菌数为5×109CFU/g，该可湿性粉剂即为本实施例的微生物菌剂。
对比例1
将购自山东绿陇生物科技有限公司的哈茨木霉T22株系从保藏斜面接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，使得哈茨木霉菌的活菌数为5×109CFU/g，所得到的可湿性粉剂即为本对比例的微生物菌剂。
对比例2～7
将与本申请的保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌一起分离的6株哈茨木霉菌分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)中，25℃培养箱培养7天，从中取3-4个菌块加入种子瓶。25℃、180rpm摇床上振荡培养48h，制成种子液。将种子液按1:150体积比加入种子发酵罐进行培养，然后按照1:20的体积比加入到厚垣孢子发酵培养基的发酵罐，28℃培养132小时，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到厚垣孢子发酵液；然后使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂，使得哈茨木霉菌的活菌数为5×109CFU/g，所得到的可湿性粉剂即为本对比例的微生物菌剂。
测试实施例
葡萄种植大田试验在山东省寿光市侯镇草碾村的葡萄园进行；
实验组；分别采用实施例1和对比例1～7的悬浮剂进行试验，选择树龄5年、长势一致、连年产量较相近的葡萄，每组20株，对照组不喷洒悬浮剂；田间管理等其他条件相同，试验过程中实验组和对照组均未发生葡萄霜霉病。
测定成熟葡萄的株产量、平均单粒重，结果列于表1。
表1
株产量/kg 平均单粒重/g
实施例1 18.2 12.7
对比例1 16.1 11.5
对比例2 16.5 11.9
对比例3 16.7 11.6
对比例4 16.9 11.7
对比例5 16.3 11.4
对比例6 16.1 11.8
对比例7 16.4 11.5
由表1数据可知，与对比例1-7相比，实施例1使用含有保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌的悬浮剂能够提高葡萄的株产量和单粒重量，防止发生葡萄霜霉病。
测试实施例2
测试实施例1和对比例1～7的悬浮剂对葡萄霜霉病的防治效果。试验在山东省寿光市侯镇草碾村的葡萄园进行。
按农业部药检所田间试验准则设计，分9个试验区；将实施例1和对比例1～7的悬浮剂分别用清水分别稀释成500倍液，清水对照。采用喷雾法施药，在下午16：00后进行，每组处理10株，3次重复，随机区组设计。每小区随机调查10个当年抽生新蔓，自上而下调查10片叶，记录各级病叶数。叶片分级标准同叶盘法。在田间有零星发病时开始施药，间隔7天用药1次，连续用药3次。在最后一次施药后5天调查药后病情指数，结果列于表2。
病情指数＝∑(病级叶数×该级代表值)/调查总叶数×发病最高级
防效(％)＝[1－(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100
表2
药前病情指数 药后病情指数 防效/％
实施例1 2.01 10.24 76.0
对比例1 2.04 18.44 57.5
对比例2 1.92 13.54 66.8
对比例3 2.15 15.53 66.0
对比例4 2.2 17.19 63.3
对比例5 2.02 12.88 70.0
对比例6 1.99 16.32 61.4
对比例7 1.96 14.17 66.0
对照区 2.10 44.65 -
由表2数据可知，与对比例1-7相比，实施例1使用保藏编号为CGMCC No.16794的哈茨木霉菌及微生物菌剂能够有效防治葡萄霜霉病。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (5)

1.一种哈茨木霉菌，其特征在于，该哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的保藏编号为CGMCC No.16794。
2.一种微生物菌剂，含有菌体和培养基，其特征在于，所述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.16794的哈茨木霉菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.16794的哈茨木霉菌的活菌数为108-1010CFU。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其中，所述培养基为马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)。
5.权利要求1所述的哈茨木霉菌或权利要求2～4中任意一项所述的微生物菌剂在防治葡萄霜霉病中的应用。
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