CN106635824A - 一种哈茨木霉菌固态发酵方法 - Google Patents

一种哈茨木霉菌固态发酵方法 Download PDF

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Abstract

一种哈茨木霉菌固态发酵方法，它涉及一种固态发酵方法。它要解决现有的木霉菌发酵方法存在成本高，推广范围小的问题，以及稻草的再利用问题。方法：一、制备孢子悬浮液；二、制备发酵料并灭菌；三、发酵料接菌并发酵培养；四、发酵产物干燥，筛分，收集孢子粉即完成。本发明中哈茨木霉菌固态发酵方法，不仅很好的将稻草利用了起来，节约资源的同时也减少了烧荒带来的空气污染，有效的实施资源循环再利用，而且用最小的成本生产最多的有效木霉孢子粉，为后续木霉生物菌肥及生物农药剂型的制备提供原料。本发明中固态发酵方法，无需大型设备，无需严格控制生产条件，对操作环境要求低，流程简单易学，适合大范围推广使用，便于小规模生产。

Description

一种哈茨木霉菌固态发酵方法
技术领域
本发明涉及一种固态发酵方法。
背景技术
木霉（Trichoderma）属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，木霉属真菌。具抗病、促生长、改良土壤三大特性，世界各国纷纷将木霉应用在农林业生产中。木霉属中应用最广泛的是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。哈茨木霉的菌剂主要是孢子制剂，因此，大量生产木霉孢子粉才能保证制剂原料的供应。
木霉菌的小规模发酵，条件控制不好，常常导致发酵失败；而目前的发酵方法成本高、操作环境要求高，流程复杂的等问题，不适合大范围推广使用。
水稻是主要的粮食作物，种植面积广，水稻高产量的同时也产生了大量的农业废弃物—稻草，入冬的烧荒更是带来严重的空气污染，因此急需研究和推广稻草的再利用，更快更多的消耗这一农业废弃物，有效的实施资源循环再利用。
发明内容
本发明目的是为了解决现有的木霉菌发酵方法存在成本高，推广范围小的问题，以及稻草的再利用问题，而提供了一种哈茨木霉菌固态发酵方法。
一种哈茨木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种哈茨木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的哈茨木霉分生孢子，制备成浓度为107～108个孢子/mL的孢子悬浮液；
二、按重量百分比称取73.5%的稻草，25%的麦麸，0.5%的玉米面，0.5%的黄豆粉和0.5%的(NH4)2SO4，加入自来水至湿度为300%，搅匀后装入聚丙烯菌袋，每袋150g，使用透气性盖子封口，然后于121℃灭菌20min，获得灭菌后的发酵料；
三、向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，然后置于自然采光的培养室内，在温度为25～28℃，相对湿度为60%～80%的条件下培养15天；
四、培养15天后，对发酵产物进行干燥，然后通过筛分将发酵料与分生孢子分离，收集孢子粉并于4℃条件下保存，即完成哈茨木霉菌固态发酵。
本发明中哈茨木霉菌固态发酵方法，是一种有效经济可行的固态发酵方法，不仅很好的将稻草利用了起来，节约资源的同时也减少了烧荒带来的空气污染，有效的实施资源循环再利用，而且用最小的成本生产最多的有效木霉孢子粉，为后续木霉生物菌肥及生物农药剂型的制备提供原料。
本发明中哈茨木霉菌固态发酵方法，发酵料的配比合理，营养均衡，能够满足多数木霉菌的大量生长繁殖，且成本低；在发酵完成时，1000g发酵料可以产出约50g干孢子粉。
本发明中哈茨木霉菌固态发酵方法，无需大型设备，无需严格控制生产条件，对操作环境要求低，流程简单易学，适合大范围推广使用，便于小规模生产。
附图说明
图1为实施例中透气性盖子的示意图；
图2为实施例中使用透气性盖子封口后并接种了孢子悬浮液的菌袋图；
图3为实施例中发酵培养7天后的菌袋图；
图4为实施例中发酵培养15天后的菌袋图；
图5为实施例中发酵后收集的孢子粉的图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种哈茨木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种哈茨木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的哈茨木霉分生孢子，制备成浓度为107～108个孢子/mL的孢子悬浮液；
二、按重量百分比称取73.5%的稻草，25%的麦麸，0.5%的玉米面，0.5%的黄豆粉和0.5%的(NH4)2SO4，加入自来水至湿度为300%，搅匀后装入聚丙烯菌袋，每袋150g，使用透气性盖子封口，然后于121℃灭菌20min，获得灭菌后的发酵料；
三、向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，然后置于自然采光的培养室内，在温度为25～28℃，相对湿度为60%～80%的条件下培养15天；
四、培养15天后，对发酵产物进行干燥，然后通过筛分将发酵料与分生孢子分离，收集孢子粉并于4℃条件下保存，即完成哈茨木霉菌固态发酵。
本实施方式步骤二中聚丙烯菌袋，装料要紧实，保证放入高压锅时，能直立，灭菌袋与灭菌袋之间形成缝隙，保证在高压锅中的高压热空气能够均匀分布，灭菌均匀彻底。
本实施方式步骤二中配制好的发酵料必须马上灭菌，避免杂菌生长，使发酵料的营养改变；灭菌后的发酵料在1～2天之内务必接菌，放置时间长，易污染。
本实施方式步骤二中灭菌后的发酵料若散发臭味或酸味，则是受到细菌或酵母菌污染，灭菌失败。
本实施方式步骤二使用透气性盖子封口，保证了发酵过程中有足够的氧气供应。另外，封口的束口结构使接种时可以直接将孢子悬浮液打入菌袋内，无需将发酵料倒出，极大地降低了杂菌污染的可能性。
本实施方式步骤三中向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，由于菌袋空间小，通气量相对不足以满足整个菌袋内的发酵料同时发酵，并且搅拌后发酵料上层部分孢子数量变少，萌发有限，故不予以搅拌。不搅拌可以使接触空气较多的外侧萌发后很快产孢，同时菌丝向菌袋内部蔓延以达到整体发酵的效果。
本实施方式步骤三中发酵培养约两天后菌袋上层接触空气的发酵料开始逐渐萌发产生白色菌丝，5天后开始产孢，期间白色菌丝慢慢延伸至菌袋下方和内部，约15天后发酵完成。
本实施方式步骤三中发酵培养7天后，经血细胞计数板测孢子产量，产孢数达到0.2×109个孢子/g的发酵料，发酵培养15天后产孢数达到1.8×109个孢子/g的发酵料。
本实施方式步骤四中干燥的目的是防止木霉菌自溶。
本实施方式步骤四中收集孢子粉并于4℃条件下保存，方便后续剂型的制备。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤一中PDA斜面培养基的配制：200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂和1000mL水，装入聚丙烯大试管中，每管20mL，115℃灭菌30min后摆斜面。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，步骤一中室温培养5天。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，步骤一中聚丙烯大试管的规格：3cm口径×24cm长。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，步骤一中哈茨木霉菌为哈茨木霉菌株ACCC31959，购买自中国农业微生物菌种保藏中心；哈茨木霉菌株ACCC30371，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，步骤二中稻草的规格为5cm的小段。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，步骤二中聚丙烯菌袋的规格：15cm×40cm。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是，步骤三中在温度为26℃，相对湿度为70%的条件下培养15天。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是，步骤三中培养期间通风：夏季开窗通风2h/d，冬季开窗通风0.5h/d。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
本实施方式中培养期间通风的目的是保证正常发酵所需氧气量。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是，步骤四中干燥温度为38～42℃。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
一种哈茨木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种哈茨木霉菌，室温培养5天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的哈茨木霉分生孢子，制备成浓度为107个孢子/mL的孢子悬浮液；
二、按重量百分比称取73.5%的稻草，25%的麦麸，0.5%的玉米面，0.5%的黄豆粉和0.5%的(NH4)2SO4，加入自来水至湿度为300%，搅匀后装入聚丙烯菌袋，每袋150g，使用透气性盖子封口，然后于121℃灭菌20min，获得灭菌后的发酵料；
三、向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，然后置于自然采光的培养室内，在温度为26℃，相对湿度为70%的条件下培养15天；
四、培养15天后，对发酵产物进行干燥，然后通过筛分将发酵料与分生孢子分离，收集孢子粉并于4℃条件下保存，即完成哈茨木霉菌固态发酵。
本实施例步骤一中哈茨木霉菌为哈茨木霉菌株ACCC30371，购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
本实施例步骤一中聚丙烯大试管的规格：3cm口径×24cm长。
本实施例步骤二中稻草的规格为5cm的小段。步骤二中聚丙烯菌袋的规格：15cm×40cm。
本实施例步骤二中聚丙烯菌袋，装料要紧实，保证放入高压锅时，能直立，灭菌袋与灭菌袋之间形成缝隙，保证在高压锅中的高压热空气能够均匀分布，灭菌均匀彻底。
本实施例步骤二中配制好的发酵料必须马上灭菌，避免杂菌生长，使发酵料的营养改变；灭菌后的发酵料在1～2天之内务必接菌，放置时间长，易污染。
本实施例步骤二中灭菌后的发酵料若散发臭味或酸味，则是受到细菌或酵母菌污染，灭菌失败。
本实施例步骤二使用透气性盖子封口（见图1），保证了发酵过程中有足够的氧气供应。另外，封口的束口结构使接种时可以直接将孢子悬浮液打入菌袋内（见图2），无需将发酵料倒出，极大地降低了杂菌污染的可能性。
本实施例步骤三中向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，由于菌袋空间小，通气量相对不足以满足整个菌袋内的发酵料同时发酵，并且搅拌后发酵料上层部分孢子数量变少，萌发有限，故不予以搅拌。不搅拌可以使接触空气较多的外侧萌发后很快产孢，同时菌丝向菌袋内部蔓延以达到整体发酵的效果。并且接种时无需在超净工作台中进行，大大提高可操作性。可见，本实施例中的发酵对操作环境要求低，流程简单易学，便于小规模生产。
本实施例步骤三中培养期间通风：夏季开窗通风2h/d，冬季开窗通风0.5h/d。培养期间通风的目的是保证正常发酵所需氧气量。
本实施例步骤三中发酵培养约两天后菌袋上层接触空气的发酵料开始逐渐萌发产生白色菌丝，5天后开始产孢，期间白色菌丝慢慢延伸至菌袋下方和内部，约15天后发酵完成。
本实施例步骤三中发酵培养7天后，经血细胞计数板测孢子产量，产孢数达到0.2×109个孢子/g的发酵料（见图3），发酵培养15天后产孢数达到1.8×109个孢子/g的发酵料（见图4）。
本实施例步骤四中干燥的目的是防止木霉菌自溶。
本实施例步骤四中收集孢子粉（见图5）并于4℃条件下保存，方便后续剂型的制备。发酵完成时，1000g发酵料可以产出约50g干孢子粉。
本实施例中发酵料的配比合理，营养均衡，能够满足多数木霉菌的大量生长繁殖，且成本低。
市场价格：稻草0.05元/kg，麦麸1.8元/kg，玉米面2.0元/kg，黄豆粉6.0元/kg，(NH4)2SO41.3元/kg。按以上各原料成本计算，稻草制成的菌肥干料约为0.54元/kg。
稻草来源广，价格便宜，甚至不花钱，稻草表面积较大，便于木霉菌丝附着生长，并且结构疏松，透气性好，可以为木霉发酵提供充足的氧气，相较于稻壳、玉米芯等其他农业废弃物更加适合被用作木霉菌袋发酵的主要发酵料。稻草及玉米面提供碳源，麦麸与黄豆粉提供有机氮源，(NH4)2SO4提供无机氮源。
菌袋为食用菌菌袋，价格约为0.08元/个，并且由于发酵料灭菌时使用菌袋分装，所以发酵时继续使用实际上是菌袋的二次利用，更加节约成本。
本实施例中发酵方法节约空间：计算以在5m（长）×5m（宽）×3m（高）的发酵培养室为例，通气良好、行走无碍的情况下，可以放下0.8m（长）×0.6m（宽）×2.5m（高）、10层（层高0.25m）的架子共15个，每个架子每层可以摆放约70个发酵袋，则屋子里可以放10500袋，每袋发酵料约0.15kg，则该屋子一个周期可以发酵约1600kg的哈茨木霉发酵产物。

Claims (10)

1.一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于它按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种哈茨木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的哈茨木霉分生孢子，制备成浓度为107～108个孢子/mL的孢子悬浮液；
二、按重量百分比称取73.5％的稻草，25％的麦麸，0.5％的玉米面，0.5％的黄豆粉和0.5％的(NH4)2SO4，加入自来水至湿度为300％，搅匀后装入聚丙烯菌袋，每袋150g，使用透气性盖子封口，然后于121℃灭菌20min，获得灭菌后的发酵料；
三、向灭菌后的发酵料中加入2mL步骤一中的孢子悬浮液，然后置于自然采光的培养室内，在温度为25～28℃，相对湿度为60％～80％的条件下培养15天；
四、培养15天后，对发酵产物进行干燥，然后通过筛分将发酵料与分生孢子分离，收集孢子粉并于4℃条件下保存，即完成哈茨木霉菌固态发酵。
2.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中PDA斜面培养基的配制：200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂和1000mL水，装入聚丙烯大试管中，每管20mL，115℃灭菌30min后摆斜面。
3.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中室温培养5天。
4.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中聚丙烯大试管的规格：3cm口径×24cm长。
5.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中哈茨木霉菌为哈茨木霉菌株ACCC31959，购买自中国农业微生物菌种保藏中心；哈茨木霉菌株ACCC30371，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
6.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤二中稻草的规格为5cm的小段。
7.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤二中聚丙烯菌袋的规格：15cm×40cm。
8.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤三中在温度为26℃，相对湿度为70％的条件下培养15天。
9.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤三中培养期间通风：夏季开窗通风2h/d，冬季开窗通风0.5h/d。
10.根据权利要求1所述的一种哈茨木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤四中干燥温度38～42℃。
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