CN105255949A - 一种小规模木霉菌固态发酵方法 - Google Patents

一种小规模木霉菌固态发酵方法 Download PDF

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一种小规模木霉菌固态发酵方法，它涉及一种固态发酵方法。它要解决现有小规模发酵木霉菌存在产孢量少，发酵后期出现自溶现象的问题。方法：一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，培养后制备菌液；二、制备发酵料并灭菌；三、发酵料接菌，进行发酵，待孢子全部散出即完成。本发明无需严格控制生产条件，操作简单，且无需大型设备，无需设立单独的生产空间，适合于在实验室进行小规模生产，占地面积小，成本低；同时木霉菌产孢量少，发酵周期短，仅用10天左右即可完成，并且发酵后期不会出现自溶现象。

Description

一种小规模木霉菌固态发酵方法
技术领域
本发明涉及一种固态发酵方法。
背景技术
木霉(Trichoderma)属于半知菌亚门，丝孢目，木霉属真菌。兼具“木霉生物菌肥”，“木霉生物农药”，“木霉植物生长调节剂”三大特性。世界各国纷纷将木霉菌应用在农业生产中。木霉菌生长迅速，产孢需要大量的氧气和营养。小规模发酵，条件控制不好，常常导致发酵失败。一是产孢量达不到需要，二是发酵后期自溶现象经常发生，这些严重影响了后期田间试验菌肥效果的发挥。
发明内容
本发明目的是为了解决现有小规模发酵木霉菌存在产孢量少，发酵后期出现自溶现象的问题，而提供了一种小规模木霉菌固态发酵方法。
一种小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为108～1010个孢子/mL的菌液；
二、按重量百分比称取80％的稻壳、18％的麦麸、1％的玉米面和1％的黄豆粉，加入自来水至湿度为180％，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121℃灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
三、无菌托盘中装入150～160g灭菌后的发酵料，加入1mL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
本发明中小规模木霉菌固态发酵方法，无需严格控制生产条件，操作简单，且无需大型设备，无需设立单独的生产空间，适合于在实验室进行小规模生产；同时木霉菌产孢量少，发酵周期短，仅用10天左右即可完成，并且发酵后期不会出现自溶现象。
本发明中小规模木霉菌固态发酵方法，采用的发酵料配比合理，营养均衡，能够满足多数木霉菌的大量生长繁殖，且成本低。采用托盘装料后发酵，累叠摆放高至屋顶，充分利用室内空间，占地面积小，通风良好，托盘可反复使用，且不用购买培养架，节约成本。
附图说明
图1为实施例中托盘采用长、宽的朝向互换上下累叠摆放的图；
图2为实施例中发酵10天后孢子全部散出的图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为108～1010个孢子/mL的菌液；
二、按重量百分比称取80％的稻壳、18％的麦麸、1％的玉米面和1％的黄豆粉，加入自来水至湿度为180％，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121℃灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
三、无菌托盘中装入150～160g灭菌后的发酵料，加入1mL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
本实施方式步骤二中发酵料装入聚丙烯灭菌袋，装料要紧实，保证放入高压锅时，能直立，灭菌袋与灭菌袋之间形成缝隙，保证在高压锅中的高压热空气能够均匀分布，灭菌均匀彻底。
本实施方式步骤二中配制好的发酵料必须马上灭菌，避免杂菌生长，使发酵料的营养改变；灭菌后的发酵料在1～2天之内务必接菌，放置时间长，易污染。
本实施方式步骤二中灭菌后的发酵料若散发臭味或酸味，则是受到细菌或酵母菌污染，灭菌失败。
本实施方式步骤三中无菌托盘：托盘用洗洁精刷洗一遍，流水彻底冲洗，托盘倒扣摞在一起，避免室内杂菌落入，污染托盘，同时，托盘壁上的水珠容易流出，很快晾干。
本实施方式步骤三中的操作环境要求清洁，彻底擦净操作台，并将室内地面拖擦干净；戴上无菌一次性PE手套，将菌液与发酵料拌匀。
本实施方式步骤三中无菌托盘中装入150～160g灭菌后的发酵料，原因是发酵料太薄容易失水变干，太厚菌丝体长满之后透气性差，不容易产孢。
本实施方式步骤三中保鲜膜封口后，可以标记接菌时间及菌种的编号，便于后期观察。
本实施方式步骤三中接菌后的托盘采用长、宽的朝向互换上下累叠摆放。
本实施方式步骤三中扎孔目的是保证快速产孢需要的氧气，促使分生孢子迅速萌发，扎孔后即保证木霉生长环境的透气性，又不会产生杂菌污染；孔扩大目的是使发酵产物尽快干燥，避免自溶现象发生。
本实施方式步骤三中完成小规模木霉菌固态发酵的发酵周期：春夏8～10天，秋冬为11～13天；发酵完成后利用血球计数板测定孢子产量约16亿个活孢子/克发酵产物；无杂菌污染。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤一中PDA斜面培养基的配制：200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂和1000mL水，装入聚丙烯大试管中，每管20mL，115℃灭菌30min后摆斜面。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，步骤一中木霉菌为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)ACCC30536、加纳木霉(Trichodermaghanense)ACCC30153、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30588、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC31959、绿木霉(Trichodermavirens)ACCC32490或棘孢木霉(Trichodermaasperellum)CFCC88162。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
本实施方式中棘孢木霉(Trichodermaasperellum)ACCC30536,购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；加纳木霉(Trichodermaghanense)ACCC30153，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30588，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC31959，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；绿木霉(Trichodermavirens)ACCC32490，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心；棘孢木霉(Trichodermaasperellum)CFCC88162，购买自中国林业微生物菌种保藏管理中心。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，步骤一中聚丙烯大试管的规格：3cm口径×24cm长。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，步骤一中制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养5天。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，步骤一中制备成浓度为109个孢子/mL的菌液。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，步骤二中聚丙烯灭菌袋的规格：15cm×40cm。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是，步骤三中无菌托盘中装入155g灭菌后的发酵料。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是，步骤三中托盘的规格：口部外径：长×宽×高＝42cm×29.5cm×6.5cm，底部内径：长*宽＝36cm×23.5cm；托盘的材质：厚度为1.5mm的透明亚克力。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
小规模木霉菌固态发酵方法，按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养5天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为109个孢子/mL的菌液；
二、按重量百分比称取80％的稻壳、18％的麦麸、1％的玉米面和1％的黄豆粉，加入自来水至湿度为180％，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121℃灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
三、无菌托盘中装入150g灭菌后的发酵料，加入1mL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
本实施例步骤一中木霉菌为棘孢木霉，其保藏编号ACCC30536,购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
本实施例步骤二中发酵料装入聚丙烯灭菌袋，装料要紧实，保证放入高压锅时，能直立，灭菌袋与灭菌袋之间形成缝隙，保证在高压锅中的高压热空气能够均匀分布，灭菌均匀彻底。
本实施例步骤二中配制好的发酵料必须马上灭菌，避免杂菌生长，使发酵料的营养改变；灭菌后的发酵料在1～2天之内务必接菌，放置时间长，易污染。
本实施例步骤二中灭菌后的发酵料若散发臭味或酸味，则是受到细菌或酵母菌污染，灭菌失败。
本实施例步骤三中无菌托盘：托盘用洗洁精刷洗一遍，流水彻底冲洗，托盘倒扣摞在一起，避免室内杂菌落入，污染托盘，同时，托盘壁上的水珠容易流出，很快晾干。
本实施例步骤三中的操作环境要求清洁，彻底擦净操作台，并将室内地面拖擦干净；戴上无菌一次性PE手套，将菌液与发酵料拌匀。
本实施例步骤三中无菌托盘中装入150～160g灭菌后的发酵料，原因是发酵料太薄容易失水变干，太厚菌丝体长满之后透气性差，不容易产孢。
本实施例步骤三中保鲜膜封口后，可以标记接菌时间及菌种的编号，便于后期观察。
本实施例步骤三中接菌后的托盘采用长、宽的朝向互换上下累叠摆放(见图1)。
本实施例步骤三中扎孔目的是保证快速产孢需要的氧气，促使分生孢子迅速萌发，扎孔后即保证木霉生长环境的透气性，又不会产生杂菌污染；孔扩大目的是使发酵产物尽快干燥，避免自溶现象发生。
本实施例步骤三中完成小规模木霉菌固态发酵的发酵周期：春季，10天，孢子全部散出(见图2)；发酵完成后利用血球计数板测定孢子产量约16亿个活孢子/克发酵产物；无杂菌污染；可见，采用本实施例的方法产孢量大，且发酵后期出现自溶现象。
市场价格：稻壳0.2元/公斤，麦麸1.8元/公斤，玉米面2元/公斤,黄豆粉6元/公斤。
按本实施例发酵料的配方，每公斤发酵料成本：
稻壳：0.8×0.2元＝0.16元
麦麸：0.18×1.8元＝0.324元
玉米面：0.01×2元＝0.02元
黄豆粉：0.01×6元＝0.06元
发酵料总价格：0.16+0.324+0.02+0.06＝0.564元/公斤。
稻壳质地疏松，透气性能远高于锯末，能够满足木霉生长透气的需要；玉米面提供木霉生长所需要的C源，麦麸和黄豆粉提供N源；可见，本实施例中发酵料的配比合理，营养均衡，能够满足多数木霉菌的大量生长繁殖，且成本低。
本实施例中托盘的规格：口部外径：长×宽×高＝42cm×29.5cm×6.5cm，底部内径：长*宽＝36cm×23.5cm；托盘的材质：厚度为1.5mm的透明亚克力；可见，本实施例中透明亚克力托盘可保证产孢所需的光照要求，且托盘大小适中，避免了过大的托盘操作搬运不便，托盘太小，效率低的问题，且能够保证操作简单高效。此外，托盘可以上下累叠摆放，不用购买培养架，节约成本，不仅占地面积小，而且通风良好。
首先，托盘装料后，累叠摆放高至屋顶，充分利用室内空间。能够满足实验室小规模发酵的需求，采用本实施例的方法完成500公斤之内的实验室小规模木霉发酵，无需设立单独的生产空间，有效利用实验室的剩余空间即可实现。
以室内面积20平方米(长4m×宽5m×高3m)的实验室为例，一批次的木霉发酵产量按照如下方法计算：
实验室室内地面面积为：长4m×宽5m＝20m2
托盘上下两个交错累叠摆放，单个托盘占用面积0.42m×0.42m≈0.18m2
单层20m2/0.18m2≈100盘
托盘高度6.5cm＝0.065m3m/0.065m＝46层
室内完全摆满托盘可容纳的托盘数为：100盘×46层＝4600盘
如果将托盘占用的四分之一的面积用于管理人员的走动空间，则该房间一批次的生产量为：4600/4×3＝3450盘
按每托盘容纳发酵料0.150公斤计算，一批次的生产量为：3450盘×0.150公斤≈500公斤
其次，累叠摆放的托盘之间留有空间来保证良好通风，提供给菌丝体和分生孢子生长发育所需的氧气。

Claims (9)

1.一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于它按以下步骤进行：
一、制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养4～6天，然后用灭菌水洗下PDA斜面培养基上的木霉分生孢子，制备成浓度为108～1010个孢子/mL的菌液；
二、按重量百分比称取80％的稻壳、18％的麦麸、1％的玉米面和1％的黄豆粉，加入自来水至湿度为180％，搅匀后装入聚丙烯灭菌袋，然后于121℃灭菌2.5h，获得灭菌后的发酵料；
三、无菌托盘中装入150～160g灭菌后的发酵料，加入1mL步骤一中的菌液并拌匀，然后用保鲜膜封口，室温，自然光下培养至木霉菌菌丝体布满发酵料，然后用镊子在保鲜膜表面扎孔，托盘的4个角，每个角扎两个孔，待发酵料上布满木霉分生孢子后，将孔扩大2倍，继续发酵至孢子全部散出，即完成小规模木霉菌固态发酵。
2.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中PDA斜面培养基的配制：200g马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂和1000mL水，装入聚丙烯大试管中，每管20mL，115℃灭菌30min后摆斜面。
3.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中木霉菌为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)ACCC30536、加纳木霉(Trichodermaghanense)ACCC30153、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30588、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC30371、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)ACCC31959、绿木霉(Trichodermavirens)ACCC32490或棘孢木霉(Trichodermaasperellum)CFCC88162。
4.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中聚丙烯大试管的规格：3cm口径×24cm长。
5.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中制备PDA斜面培养基并接种木霉菌，室温培养5天。
6.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤一中制备成浓度为109个孢子/mL的菌液。
7.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤二中聚丙烯灭菌袋的规格：15cm×40cm。
8.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤三中无菌托盘中装入155g灭菌后的发酵料。
9.根据权利要求1所述的一种小规模木霉菌固态发酵方法，其特征在于步骤三中托盘的规格：口部外径：长×宽×高＝42cm×29.5cm×6.5cm，底部内径：长*宽＝36cm×23.5cm；托盘的材质：厚度为1.5mm的透明亚克力。
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