CN107484547B - 一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，将营养价值和药用价值都很高的乌饭树叶做为蛹虫草的培养基的重要原料，对蛹虫草进行驯化并培养，采用紫外诱变法对驯化好的蛹虫草进行诱变，诱变出高活性多糖和高活性虫草素的蛹虫草新菌种，并使得菌种内含有丰富的乌饭树叶内的营养成分，对蛹虫草的人工培育研究具有重要意义。

Description

一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法
技术领域
本发明涉及蛹虫草技术领域，具体涉及一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法。
背景技术
蛹虫草又名北虫草，蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种，世界性分布天然资源数量很少。古医书记载及现代研究表明北冬虫夏草药用价值与冬虫夏草相似,具有滋补作用和多种药效,可以与人参、鹿茸相媲美,既是一种珍稀的食用菌,又是一种珍贵的中药材。虫草是含有多种营养物质的常用中药，主要成分有：虫草酸、粗蛋白和谷氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸和饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸及维生素B12等物质。虫草的功能为增强人体免疫力，补虚损，益精气。补肺益肾，治肾虚咳喘、咯血、腰膝酸痛、阳痿早泄、遗精、病后久虚、自汗、盗汗等虚证。
伴随着社会科技的进步和人们生活水平的不断提高，人们逐渐开始追求药食同源的保健型食品，对于像蛹虫草这类人们生活中常备的营养果蔬人们也越来越重视其各种新产品的的开发，蛹虫草泡的酒，饮料、酸乳，功能型调配乳也受到越来越多的消费者的喜爱。
这其中如何培养营养成分更高的蛹虫草以及如何提高蛹虫草的产量，是目前研究的重点。培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的具有多种营养成分的混合物。培养基的组成对微生物的生长繁殖、生物合成、分离纯化以及产品的质量和产量都有重要影响。研究表明，不同培养基所培养的蛹虫草的子实体和菌丝体的质量和生物活性成分有很大差别。培养基中的碳源、氮源、矿物质和维生素等营养条件的种类和比例对蛹虫草的生长和体内虫草素形成均有重要影响。因此，如何提供一种培养基并辅助培养方法来提高蛹虫草的产量以及营养功能是需要重点研究的方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种含有高活性多糖和高活性虫草素的蛹虫草新菌种，并使得菌种内含有丰富的乌饭树叶内的营养成分的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为4～10％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为8～14％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为11％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯150～250份、葡萄糖15～25份、KH2P040.5～1.5份、琼脂15～25份、水900～1100份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为20～30％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖15～25份、黄豆8～12份、磷酸二氢钾2～4份、硫酸镁0.3～0.5份、味精0.08～0.12份、食盐0.2～0.4份、维生素B0.5～0.6份、水800～1200份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为25～35％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米88～96份、葡萄糖1～3份、蛋白胨1～3份、蚕蛹粉2～3份、柠檬酸铵0.2～0.4份、硫酸镁0.1～0.3份、维生素0.01～0.02份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为20～30％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为20～28小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在18～26℃，培养时间为5～9天。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为24～30小时，摇床培养的振荡频率为90～110r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在18～26℃，培养时间为5～8天。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为25～30小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在18～26℃，培养时间为6～12天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为3～5分钟，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
本发明中采用的蛹虫草是含有多种营养物质的常用中药，主要成分有：虫草酸、粗蛋白和谷氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸和饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸及维生素B12等物质。虫草的功能为增强人体免疫力，补虚损，益精气。补肺益肾，治肾虚咳喘、咯血、腰膝酸痛、阳痿早泄、遗精、病后久虚、自汗、盗汗等虚证。蛹虫草不但对人体各种脏器的功能具有调节作用，还存在某些直接抗病功能：调节免疫系统功能、直接抗肿瘤作用、提高细胞能量、抗疲劳、调节心脏功能、调节呼吸系统功能、调节肾脏功能、调节造血功能、调节血脂，并且冬虫夏草还具有直接抗病毒、调节中枢神经系统功能、调节性功能等作用。蛹虫草发酵液中存在大量的虫草菌素，具有抗病毒、抑菌、明显抑制肿瘤生长，与环磷酰胺有明显的协同作用，并有降血糖的作用，除其药用外又具有滋补、保健作用。虫草多糖无色无味,水溶且稳定性好,没有毒副作用,不仅可以提高机体免疫力,抑制肿瘤,而且对一些毒副作用较大的抗肿瘤化疗药物有增效减毒作用。
而乌饭树叶中含有磷、钙、铁、铜、锰、硒。其中铁、锰的含量很高，硒的含量也大大高于一般食品，锰是近年来发现的人体必需微量元素,它与铁有协同生血作用，能促进铜的吸收。锰缺乏时粘多糖合成障碍，骨有机质形成减少，可致广泛性骨骼畸形，容易骨折，乌饭树叶有强筋骨养颜之功效。乌饭树叶中维生素B1、维生素C的含量较高，维生素B1有防治脚气、保护心脏的功能，而维生素C能防癌、解毒、防止动脉硬化，促进伤口愈合，提高机体对铁的利用率。
目前蛹虫草的固体栽培培养基主要是大米和小麦，由于乌饭树叶富含蛋白质、糖类、维生素、无机盐等蛹虫草需要的营养源，其鲜叶粗蛋白为9.63％，比一般植物高许多，特别乌饭树叶中的铁、锰的含量很高,硒的含量也大大高于一般食品，用乌饭树叶浸渍煮成的乌饭,其氨基酸总量为8.09％，比糯米中含量要高，尤其是必需氨基酸中亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸含量高。乌饭中蛋白含量比糯米中高1％～2％，且含有大量的维生素B12、维生素E，硒含量为5μg/g。将乌饭树叶作为蛹虫草培养基的主要原料，配合蛹虫草的培养基对蛹虫草进行驯化栽培，乌饭树叶的成分将被虫草菌丝吸收利用,促进菌丝体及其次生代谢产物的性质和功效产生了质的变化。同时，蛹虫草菌丝在生长过程中分泌出的各种酶，将会促进了乌饭树叶的分解，最后被菌体利用。这种双向调节、协同作用，将会形成了新成分、新功能的药用菌质。
乌饭树叶首先进行烘干，保证其含水量在8～14％之间，避免过多的水分对培养基的成分造成影响，从而减缓蛹虫草的培养速度以及降低蛹虫草的产量，其最佳含水量为11％。
蛹虫草菌种首先进行复壮，对已衰退的菌种群体进行纯种分离和选择性培养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重新成为纯种群体，保证蛹虫草菌种的活性以及纯度。
本发明提供的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，将营养价值和药用价值都很高的乌饭树叶做为蛹虫草的培养基的重要原料，对蛹虫草进行驯化并培养，采用紫外诱变法对驯化好的蛹虫草进行诱变，诱变出高活性多糖和高活性虫草素的蛹虫草新菌种，其不仅富含较高的虫草素与多糖，而且其硒含量也很高，使得菌种内含有丰富的乌饭树叶内的营养成分，对蛹虫草的人工培育研究具有重要意义。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例，具体实施方式如下：
蛹虫草菌种采用市场购置的常见的蛹虫草菌种，香菇菌种市场购置的香菇菌种。
实施例一：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为8.5％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为21％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为26％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为21％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为190秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例二：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为9％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为22％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为27％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为22％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为200秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例三：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为9.5％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为23％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为28％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为23％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为210秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例四：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为10％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为24％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为29％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为24％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为220秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例五：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为10.5％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为25％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为30％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为25％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为230秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例六：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为7％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为11％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为26％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为31％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为26％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为240秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
实施例七：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为5％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为12％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为27％；形成PH自然的PDA培养基。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为32％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为27％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为250秒，照射的时间为菌种开始培养后的第10小时。
实施例八：
本实施例提供了一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种抢将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为9％。
进一步的，所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为13％。
进一步的，所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、KH2P041份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭叶浆占PDA培养基重量的百分比为29％。
进一步的，所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为34％。
进一步的，所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭叶浆占斜面培养基重量的百分比为29％。
进一步的，所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时。
进一步的，所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准。
进一步的，所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min。
进一步的，所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准。
进一步的，所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时。
进一步的，所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天。
进一步的，所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
进一步的，所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为270秒，照射的时间为菌种开始培养后的第14小时。
实施例一至实施例六的紫外线照射功率以及固体培养基培养时的接种量不产生变化，而对乌饭树叶含水量、乌饭树叶在各个培养基中的添加量以及紫外线照射时长进行改变，对最终培养的菌种测量按照每100g来计算获得的干重，并对虫草素、多糖以及硒的含量进行测量。得出如下表格：
Figure GDA0002332675120000131
其中，实施例六的干重最大，虫草素、多糖以及硒的含量最高，效果最好。乌饭树叶的成分将被虫草菌丝充分吸收利用，促进菌丝体及其次生代谢产物的性质和功效产生了质的变化。同时蛹虫草菌丝在生长过程中分泌出的各种酶，促进了乌饭树叶的分解，最后被菌体利用，最合适的配比使得每一步的反应都恰到好处，最终的蛹虫草效果最佳。

Claims (9)

1.一种以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、将乌饭树叶进行打浆，制成乌饭树叶浆；
S2、原菌种的驯化：用蛹虫草菌种作为出发菌种，菌种复壮后，以PDA培养基为母种斜面基础培养基，添加乌饭树叶浆，进行菌种的驯化；
S3、斜面菌种的制备：将驯化好的菌种再转接到添加乌饭树叶浆后的斜面培养基上，接种量为6％，放在恒温培养箱中培养，待菌丝布满整个斜面时从恒温培养箱中取出；
S4、液体菌种的驯化：将乌饭树叶浆添加到液体培养基中制成含乌饭树叶的液体培养基，将驯化好的斜面菌种转接到液体培养基中进行摇床培养，进行液体菌种的驯化；
S5、液体菌种的培养制备：将驯化好的斜面菌种转接到添加乌饭树叶浆后的液体培养基中进行摇床培养，接种量为6％，待形成均匀小球后即可用于栽培；
S6、固体菌种的驯化：将乌饭树叶浆添加到固体培养基中制成含乌饭树叶的固体培养基，用接种枪 将液体菌种打入栽培瓶中进行培养，进行固体菌种的驯化；
S7、固体培养基的接种与培养：将培养好的液体菌种接种到添加乌饭树叶浆后的固体培养基中进行培养栽培，接种量为4～10％；
所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为8～14％；
所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射。
2.如权利要求1所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为3～5分钟，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
3.如权利要求1或2所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯150～250份、葡萄糖15～25份、KH2P040.5～1 .5份、琼脂15～25份、水900～1100份，所述PDA培养基中添加的乌饭树叶浆占PDA培养基重量的百分比为20～30％。
4.如权利要求3所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖15～25份、黄豆8～12份、磷酸二氢钾2～4份、硫酸镁0 .3～0 .5份、味精0 .08～0 .12份、食盐0 .2～0 .4份、维生素B 0 .5～0 .6份、水800～1200份，所述斜面培养基中添加的乌饭树叶浆占斜面培养基重量的百分比为25～35％。
5.如权利要求4所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米88～96份、葡萄糖1～3份、蛋白胨1～3份、蚕蛹粉2～3份、柠檬酸铵0.2～0 .4份、硫酸镁0.1～0.3份、维生素0 .01～0.02份；所述斜面培养基中添加的乌饭树叶浆占斜面培养基重量的百分比为20～30％。
6.如权利要求5所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：
所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为20～28小时；
所述S3中斜面菌种培养的温度保持在18～26℃，培养时间为5～9天。
7.如权利要求6所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为24～30小时，摇床培养的振荡频率为90～110r/min；
所述S5中液体菌种培养的温度保持在18～26℃，培养时间为5～8天。
8.如权利要求7所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在18～26℃，培养时间为25～30小时；
所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在18～26℃，培养时间为6～12天。
9.如权利要求8所述的以乌饭树叶为主料制成培养基培养蛹虫草的方法，其特征在于：所述S1中需要打浆的乌饭树叶含水量为11％；
所述PDA培养基由如下重量份的材料制成：马铃薯200份、葡萄糖20份、 KH2P04 1份、琼脂20份、水1000份，所述PDA培养基中添加的乌饭树叶浆占PDA培养基重量的百分比为26％；
所述斜面培养基由如下重量份的材料制成：葡萄糖20份、黄豆10份、磷酸二氢钾3份、硫酸镁0.4份、味精0.1份、食盐0.3份、维生素B 0.52份、水1000份，所述斜面培养基中添加的乌饭树叶浆占斜面培养基重量的百分比为31％；
所述固体培养基由如下重量份的材料制成：大米93份、葡萄糖2份、蛋白胨2份、蚕蛹粉2.5份、柠檬酸铵0.3份、硫酸镁0.2份、维生素0.015份；所述斜面培养基中添加的乌饭树叶浆占斜面培养基重量的百分比为26％；
所述S2中原菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为24小时；
所述S3中斜面菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以菌丝布满整个斜面时为准；
所述S4中液体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为27小时，摇床培养的振荡频率为100r/min；
所述S5中液体菌种培养的温度保持在22℃，培养时间以形成均匀小球后为准；
所述S6中固体菌种的驯化培养的温度保持在22℃，培养时间为28小时；
所述S7中固体培养基接种后培养的温度保持在22℃，培养时间为9天；
所述S3中恒温培养箱在对驯化好的菌种进行培养时，加入紫外线照射；
所述紫外线照射所采用的紫外线灯功率为20W，所述紫外线灯设置在斜面培养基上方35厘米处，照射时长为240秒，照射的时间为菌种开始培养后的第12小时。
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