CN1759684A

CN1759684A - 一种苏云金杆菌吸附剂型与制备方法

Info

Publication number: CN1759684A
Application number: CN 200510015282
Authority: CN
Inventors: 周学永
Original assignee: Tianjin University of Technology
Current assignee: Tianjin University of Technology
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2025-09-29
Also published as: CN100346699C

Abstract

本发明公开了一种苏云金杆菌吸附剂型及其制备方法。该吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：1∶50－5∶1。其制备方法通过纯化提取杀虫蛋白，配制杀虫蛋白溶液，制备微米级土壤矿物颗粒，制备土壤颗粒悬浮液和进行杀虫蛋白吸附得到产品。本发明制备苏云金杆菌吸附剂型的方法简便，材料易得。所得到的吸附剂型杀虫活性高，颗粒分散好，吸附牢固，抗紫外光降解，而且使用也不会产生环境安全问题，由于商业制剂是在作物表面使用，其降解速度比在土壤内部吸附的蛋白要快，通过控制吸附制剂中杀虫蛋白的吸附量以及制剂的使用剂量，就能将其残效期控制在合理的范围。

Description

一种苏云金杆菌吸附剂型与制备方法

【技术领域】

本发明涉及有害生物的生物防治技术领域，特别是一种微生物农药苏云金杆菌吸附剂型与制备方法。

【背景技术】

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种产生伴胞晶体、能寄生于昆虫体内引起昆虫发病的芽胞杆菌。自1901年日本石渡报道苏云金杆菌以来，国内外科研人员对其分类、生长谢、遗传学、生态学、伴胞晶体毒素的生物化学、作用机制、基因工程菌的构建、抗虫转基因植物以及产业化等进行了广泛研究。截止目前为止已有60多个国家登记了120多个品种，其产量占生物杀虫剂总量的90％～98％，成为当前世界上产量最大、应用最广、也是最有发展前途的一种生物杀虫剂，广泛用于防治农业、林业、贮藏害虫以及医学昆虫。

然而，苏云金杆菌制剂存在持效期短，防治效果易受阳光、温度、湿度、雨水等外界气候和生态条件制约等缺点。普通苏云金杆菌商业制剂含有伴胞晶体、芽胞和填料，其中伴胞晶体是主要的杀虫毒素。苏云金芽胞杆菌制剂在农作物上使用后，伴胞晶体毒素会迅速被钝化和降解，芽胞也不能在自然土壤中很好地生存。据国外研究，ThuricideA制剂在室内施用8天或14天后，毒力分别减少为最初的1/14和1/71，野外试验残效期一般为5-7天。苏云金杆菌田间应用残效期短，已成为制约该杀虫剂发展的瓶颈，如何提高其杀虫效果是苏云金杆菌科研单位和生产企业所共同面临的难题。目前延长残效期的方法主要有：添加紫外线吸收剂、制备微胶囊、与化学农药复配。这些方法具有一定的实际效果，但尚未成为一种经济、环保、高效兼顾的理想手段。

苏云金杆菌毒素是否会在环境中积累与以下三种因素有关：(1)使用的浓度；(2)昆虫消耗的速度；(3)紫外光及土壤、作物表面微生物群对其钝化和降解的速度。自1987年首例转苏云金杆菌晶体蛋白基因抗虫植物田间试验获得成功后，抗虫转基因棉花、马铃薯、玉米、水稻、烟草、番茄等50余种作物先后进入商品化生产。转Bt基因植物在生长期内持续不断的向环境释放杀虫毒素，而当作物成熟后往往只收获其有经济价值的部分，大部分含有毒素的秸杆丢弃到田间。因此，转基因作物产生的毒素往往比苏云金杆菌商业制剂在土壤中的浓度更高，作用更持久。研究发现，转基因作物释放的毒素一旦被环境中的土壤颗粒所吸附，就会对微生物分解产生抗性，被吸附蛋白的杀虫活性可持续存在180天或234天。红外光谱和X-射线衍射分析表明，吸附后毒素蛋白的结构仅有微小变化，且具有良好的抗微生物降解性能和杀虫活性。因此，杀虫毒素被土壤矿物吸附后残效期得以延长的实验证据，为苏云金杆菌长效制剂的研究开辟了新途径。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有微生物农药苏云金杆菌剂型所存在的缺陷，而提供一种苏云金杆菌吸附剂型与制备方法。该方法将苏云金杆菌杀虫蛋白提取、纯化后溶解于碱性溶液中，再加入土壤矿物微粒将杀虫蛋白吸附固定，从而得到性能稳定、杀虫活性高的苏云金杆菌吸附剂型。

为实现本发明的目的，本发明公开了一种苏云金杆菌吸附剂型。其特征在于所说的吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：1∶50-5∶1。

本发明还公开了这种苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作：

(1)将苏云金芽胞杆菌原粉用NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后，用pH11-12的NaOH溶液提取4-5小时，离心去沉淀后得到杀虫蛋白碱溶液，乙酸沉淀。将杀虫蛋白溶解在pH为9-11的碱溶液中，配置成浓度0.05％-0.25％(W/V)的碱溶液。

(2)制备微米级土壤矿物颗粒：将经过研磨并过100目筛的干燥土壤加去离子水配成含固量1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液，充分搅拌后沉降，然后取出沉降后的上层悬浮液，重复进行上述操作，直至沉降后上层悬液澄清。收集取出的上层悬浮液，用0.5mol/L氯化钙絮凝，再收集沉淀，烘干后研碎，得到在水中分散颗粒＜2微米的颗粒；

(3)制备土壤颗粒悬浮液：取微米级土壤矿物颗粒用水配置成1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液；

(4)杀虫蛋白在土壤颗粒上吸附处理：按杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比：1∶50-5∶1的比例，在温度-10℃-50℃，摇床振摇条件下吸附0.5-10小时；

(5)吸附完成后离心脱出上清液，即为土壤矿物颗粒吸附剂型，冷冻保存。

本发明制备苏云金杆菌吸附剂型的方法简便，材料易得。所得到的吸附剂型具有以下特点：

(1)杀虫活性高。效价20000IU/mg的苏云金杆菌可湿性粉剂对棉铃虫三龄幼虫的半数致死浓度(LC₅₀)为38.77μg/ml，而土壤胶粒吸附剂型的LC₅₀在1.02～3.36μg/ml(以被吸附的杀虫蛋白计，以下同)，后者的杀虫活性比前者提高11～38倍。与未被吸附的纯杀虫蛋白(LC₅₀为10μg/ml)相比，土壤胶粒吸附剂型的杀虫活性提高3～10倍；

(2)颗粒分散好。土壤胶粒吸附杀虫蛋白前后胶粒粒径没有明显变化，且在水中分散性能良好；

(3)吸附牢固。被土壤胶粒吸附的杀虫蛋白不容易被水和碳酸盐缓冲液解吸掉。去离子水连续解吸三次，总解吸率为24.66％～40.54％；碳酸盐缓冲液连续解吸三次，总解吸率为15.37％～38.81％；

(4)抗紫外光降解。经紫外光照射1小时，苏云金杆菌原粉杀虫活性下降21.55％，未被吸附的纯毒素下降23.66％，而膨润土吸附剂型仅下降8.11％，红壤胶体吸附剂型下降14.07％。

此外，这种制剂被土壤吸附的杀虫蛋白不仅作用时间延长，杀虫活性提高，而且使用也不会产生环境安全问题，由于商业制剂是在作物表面使用，其降解速度比在土壤内部吸附的蛋白要快，通过控制吸附制剂中杀虫蛋白的吸附量以及制剂的使用剂量，就能将其残效期控制在合理的范围。

【具体实施方式】

本发明的一种苏云金杆菌吸附剂型，以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解状态的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：1∶50-5∶1。上述的土壤矿物可以是南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒棕壤、棕钙土、暗棕壤、褐土、黑钙土，西部的黑垆土和高山草甸土，以及膨润土、高岭土中的一种或两种或两种以上的混合物。

本发明一种苏云金杆菌吸附剂可以通过以下方法制备：

(1)苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的制备：

取苏云金芽胞杆菌原粉用0.5mol/L NaCl洗涤三次，再用无菌去离子水洗涤三次，10000r/min离心10min去上清液。将沉淀配成1％-5％(W/V)的水悬液，用0.5-1mol/L NaOH调pH11-12，4-5小时后离心去沉淀，清液以25％乙酸调pH4.4，15000r/min离心10min得杀虫活性蛋白沉淀。

(2)苏云金杆菌杀虫蛋白溶液的制备：

将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白溶解于碱溶液，碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、Huber缓冲液(0.1mol/LNa₂CO₃-HCl，含25mmol/L二硫苏糖醇，pH9.5)，但最好采用碳酸盐缓冲液(由碳酸盐和碳酸氢盐组成)。碱液pH值在9-11之间，最好在9.5-10.5之间。不溶成分采用离心法去除，碱液中杀虫蛋白浓度在0.05％-0.25％(W/V)之间，浓度值采用紫外分光光度法测定。

(3)微米级土壤矿物颗粒的制备：

取土壤样品如南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒棕壤、棕钙土、暗棕壤、褐土、黑钙土，西部的黑垆土和高山草甸土，以及膨润土、高岭土中的一种或两种或两种以上的混合物，加水配成固含量1％-10％(W/V)的悬浮液，但最好为1％～5％。将悬浮液转入烧杯中，液面高度保持15cm，充分搅拌后自由沉降，根据斯托克斯沉降定律计算出直径2微米以下土壤颗粒沉降10cm所需要的时间，并按预定时间从烧杯底部5cm以上吸出上层悬浮液。上述操作反复进行，直至沉降后上层悬液澄清为止。收集取出的上层悬浮液，用0.5mol/L氯化钙絮凝。收集沉淀，烘干后研碎，过100目筛，即得在水中分散颗粒＜2微米的土壤样品。

(4)土壤颗粒悬浮液的制备：

取上述微米级土壤矿物颗粒用水配置成1.0％-10.0％(W/V)的悬液，最好为1.0％-5.0％，超声波分散后备用。配制土壤悬液所用的水为蒸馏水或去离子水，但最好采用无菌去离子水。

(5)苏云金杆菌杀虫蛋白的吸附：

将浓度为0.1％-0.25％(W/V)的杀虫蛋白溶液置于100ml塑料管内，土壤悬液的加入体积按照下面规定的杀虫蛋白与土壤颗粒的质量比例计算得出。杀虫蛋白与土壤胶粒的质量比例控制在1∶50-5∶1之间，但最好控制在1∶5-2∶1之间。在温度-10℃-50℃下，在振荡器上振匀后转入恒温(25℃)摇床，振摇速度100-300r/min，0.5-10小时后取出，于高速离心机上18000r/min离心20min，吸附完成。将上清液转入另一无菌试管，采用紫外吸收法于280nm处测定吸光度，根据吸附前后杀虫蛋白浓度的变化，可以计算出土壤颗粒吸附的杀虫蛋白量。

(6)将土壤胶粒-杀虫蛋白复合物置于冰箱，-18℃冷冻保存。

实施例1：膨润土吸附剂型

取苏云金芽胞杆菌原粉20克，用0.5mol/L NaCl洗涤三次，再用无菌去离子水洗涤三次，10000r/min离心10min去上清液。将沉淀配成5％的水悬液，用1mol/L NaOH调pH11-12，4-5小时后离心去沉淀，清液以25％乙酸调pH4.4，15000r/min离心10min得杀虫活性蛋白沉淀1.3克。将杀虫蛋白1.3克溶于650ml碳酸钠缓冲液(pH9.5)，经紫外分光光度法测定，杀虫蛋白浓度1.93mg/ml。

膨润土选自河南信阳。将50克土壤样品悬浮于2000ml水中，经过沉降离心法制得粒径＜2微米的膨润土颗粒3.5克，取1克用无菌去离子水配置1％(W/V)悬浮液。杀虫蛋白的吸附实验按照杀虫蛋白与膨润土按1∶1(质量比)进行。将20ml浓度1.93mg/ml的杀虫蛋白碳酸盐溶液加入100ml塑料试管内(含纯蛋白38.6mg)，加浓度1％膨润土悬液3.86ml(含膨润土38.6mg)，补加碳酸盐缓冲液(pH9.5)15ml进行稀释。恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇5h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液，得膨润土-杀虫蛋白复合物。膨润土-杀虫蛋白复合物(即膨润土吸附剂型)的LC₅₀为1.02μg/ml。紫外光照1小时后，LC₅₀为1.11μg/ml，下降8.11％。

实施例2：膨润土吸附剂型

将粒径＜2微米的膨润土胶粒配置5％(W/V)的无菌水悬浮液。将杀虫蛋白与膨润土按1∶5(质量比)混合，恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇3h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液。膨润土吸附剂型的LC₅₀为2.12μg/ml。

实施例3：膨润土吸附剂型

将粒径＜2微米的膨润土胶粒配置3％(W/V)的无菌水悬浮液。将杀虫蛋白与膨润土按2∶1(质量比)混合，恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇1h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液。膨润土吸附剂型的LC₅₀为1.93μg/ml。

实施例4：红壤胶体吸附剂型

红壤选自湖南郴州。将土壤样品悬浮于水中，经过沉降离心法制得粒径＜2微米的颗粒，无菌水配置1％(W/V)悬浮液。将杀虫蛋白与膨润土按1∶10(质量比)比例混合，恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇0.5h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液。红壤胶体吸附剂型的LC₅₀为3.36μg/ml。紫外光照1小时后，LC₅₀为3.91μg/ml，下降14.07％。

实施例5：高岭土吸附剂型

高岭土购于上海五四化学试剂厂。将土壤样品悬浮于水中，经过沉降离心法制得粒径＜2微米的颗粒，无菌水配置1％(W/V)悬浮液。将杀虫蛋白与膨润土按1∶1.25(质量比)比例混合，恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇3h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液。高岭土吸附剂型的LC₅₀为2.33μg/ml。

实施例6：黄棕壤吸附剂型

黄棕壤选自湖北应城。将土壤样品悬浮于水中，经过沉降离心法制得粒径＜2微米的胶粒，无菌水配置10％(W/V)悬浮液。将杀虫蛋白与黄棕壤按1∶15(质量比)比例混合，恒温摇床(25±1℃)300r/min振摇3h后取出，18000r/min离心10min，倾去上清液。黄棕壤吸附剂型的LC₅₀为3.02μg/ml。

Claims

1一种苏云金杆菌吸附剂型，其特征在于所说的吸附剂型以微米级的土壤矿物颗粒为载体，载体上吸附固定有溶解处理后的杀虫蛋白，杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比为：1∶50-5∶1。

2按照权利要求1所述的方法，其特征在于所说的土壤矿物是南方的红壤、赤红壤、砖红壤、黄壤、黄棕壤，北方的棕壤、寒棕壤、棕钙土、暗棕壤、褐土、黑钙土，西部的黑垆土和高山草甸土，以及膨润土、高岭土中的一种或两种或两种以上的混合物。

3一种权利要求1所述的苏云金杆菌吸附剂型的制备方法，其特征在于按照下列步骤操作：

(1)将苏云金芽胞杆菌原粉用NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后，用pH11-12的NaOH溶液提取4-5小时，离心去沉淀后得到杀虫蛋白碱溶液，乙酸沉淀；将杀虫蛋白溶解在pH为9-11的碱溶液中，配置成浓度0.05％-0.25％(W/V)的碱溶液；

(2)制备微米级土壤矿物颗粒：将经过研磨并过100目筛的干燥土壤加去离子水配成含固量1.0％-10.0％(W/V)的悬浮液，充分搅拌后沉降，然后取出沉降后的上层悬浮液，重复进行上述操作，直至沉降后上层悬液澄清；收集取出的上层悬浮液，用0.5mol/L氯化钙絮凝，再收集沉淀，烘干后研碎，得到在水中分散颗粒＜2微米的颗粒；

4按照权利要求3所述的方法，其特征在于所说的步骤(1)溶解杀虫蛋白的碱溶液是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、Huber缓冲液、碳酸盐缓冲液，碱液pH最好在9.5-10.5。

5按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于所说的步骤(3)将土壤颗粒配制成的悬浮液，含固量最好为1.0％-5.0％(W/V)；所用水为蒸馏水或去离子水，最好为无菌去离子水。

6按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于所说的步骤(4)杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比最好在1∶5-2∶1。

7按照权利要求5所述的方法，其特征在于所说的步骤(4)杀虫蛋白与土壤矿物颗粒的质量比最好在1∶5-2∶1。

8按照权利要求3或4或7所述的方法，其特征在于所说的步骤(4)杀虫蛋白的吸附温度最好为-4℃-30℃，吸附时间最好为0.5-3小时。

9按照权利要求5所述的方法，其特征在于所说的步骤(4)杀虫蛋白的吸附温度最好为-4℃-30℃，吸附时间最好为0.5-3小时。

10按照权利要求6所述的方法，其特征在于所说的步骤(4)杀虫蛋白的吸附温度最好为-4℃-30℃，吸附时间最好为0.5-3小时。