【发明内容】
本发明的目的在于克服现有苏云金杆菌吸附剂型制备过程中杀虫蛋白在矿物上吸附量低的缺陷,提供一种增强Bt杀虫蛋白在矿物上吸附的方法。该方法通过在Bt杀虫蛋白与矿物颗粒混合体系中添加1价或2价金属阳离子,通过化学键的桥接作用使单位质量矿物颗粒对Bt杀虫蛋白的吸附量成倍增加。
为实现本发明的目的,本发明公开了一种增强苏云金杆菌杀虫蛋白在矿物载体上吸附的方法,其特征在于按照下列步骤操作:
(1)将苏云金杆菌原粉或发酵液中的孢晶混合物经碱溶、酸沉淀后制备杀虫蛋白;将上述原毒素或活性毒素杀虫蛋白溶解在pH为8-10的缓冲溶液中,配置成浓度0.3g/L-3.0g/L的杀虫蛋白溶液;
(2)取微米级土壤矿物颗粒用水配置成重量与体积比为1.0%-10.0%的土壤矿物悬浮液,再加入一价或二价金属离子的易溶于水的盐类,使金属离子在悬浮液中的浓度在0.1-5mmol/L;
(3)按照杀虫蛋白与土壤矿物颗粒质量比1:10-10:1的配比,将杀虫蛋白溶液与土壤矿物悬液混合,在摇床上进行吸附;
(4)吸附完成后离心脱出上清液,得到苏云金杆菌杀虫蛋白矿物吸附复合物;
(5)将苏云金杆菌杀虫蛋白矿物吸附复合物用去离子水洗涤,所得苏云金杆菌杀虫蛋白矿物吸附制剂低温冷冻保存。
所述将苏云金杆菌原粉或发酵液中的孢晶混合物经碱溶、酸沉淀后制备杀虫蛋白,是将苏云金杆菌原粉或发酵液中的孢晶混合物经NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后,用pH11-12的NaOH溶液提取4-5h,离心去沉淀,收集上清液加乙酸调节pH5-6,得到没有降解的原毒素杀虫蛋白沉淀;或将苏云金杆菌发酵液中的孢晶混合物用水配成重量与体积比为5%-15%的悬浮液,在30-60℃条件下加碱调节pH11-12溶解伴孢晶体4-5h,离心去沉淀,收集含有活性毒素杀虫蛋白的上清液,超滤除去分子量小于60kDa的物质,加酸调节pH5-6,得到活性毒素杀虫蛋白沉淀。
本发明制备苏云金杆菌吸附剂型,可使杀虫蛋白的吸附量较普通法提高0.2-3倍,该方法具有以下特点:
(1)吸附量高。普通方法制备苏云金杆菌杀虫蛋白吸附剂型,矿物对杀虫蛋白的吸附量在0.10-1.0g/g,而添加一价金属离子后,吸附量为0.24-1.25g/g,增幅在0.2-1.2倍之间。添加二价金属离子后,吸附量为0.31-1.62g/g,增幅在0.3-3.0倍之间。
(2)杀虫蛋白吸附百分率高。吸附百分率是指被矿物吸附的杀虫蛋白量与吸附体系中杀虫蛋白总量的比率。不添加金属离子时,土壤矿物对吸附体系中杀虫蛋白的吸附百分率在27.6%-45.4%之间,而添加一价金属离子后,土壤矿物对杀虫蛋白的吸附百分率提高到34.5%-49.5%,添加二价金属离子后吸附百分率提高到36.2%-70.0%。吸附体系中杀虫蛋白吸附百分率提高后,降低了上清液中游离蛋白浓度,减少了蛋白循环回收的次数,使生产成本降低。
(3)杀虫活性高。以矿物吸附剂型的单位质量计算,普通法制备的吸附剂型效价在10000-30000IU/mg之间,而采用金属离子增强的吸附制剂,效价在16000-40000IU/mg之间,后者的杀虫活性比前者提高0.6-3倍。
(3)吸附强度增加。金属离子可以提高矿物对杀虫蛋白的负载强度,被水和Tris缓冲液解吸的比例降低。无金属离子添加时,杀虫蛋白矿物吸附复合物的水解吸率在18.7%-66.7%,而添加金属离子时,杀虫蛋白矿物吸附复合物的水解吸率在0-29.0%之间,解吸率明显降低。
【具体实施方式】
本发明提出的一种增强苏云金杆菌杀虫蛋白在矿物载体上吸附的方法,是在微米级矿物对溶解态苏云金杆菌杀虫蛋白吸附过程中加入一价或二价金属离子的可溶性盐类。土壤矿物颗粒载体可以是蒙脱土、高岭土、凹凸棒土、累托石、红壤、棕壤中的一种或两种以上的混合物。苏云金杆菌杀虫蛋白可以是原毒素或活性毒素。一价金属离子可以是钠离子和钾离子,二价金属离子可以是钙离子和镁离子,盐类可以是氯化物、硝酸盐或硫酸盐。上述金属离子盐类可以是一种或两种或两种以上的混合物。二价金属离子的增强效果好于一价金属离子。
本发明一种提高苏云金杆菌杀虫蛋白在矿物载体上吸附量的方法可以通过以下步骤来实现:
(1)苏云金杆菌杀虫蛋白的提取:
苏云金杆菌杀虫蛋白的提取原料可以采用苏云金杆菌原粉或发酵液离心获取的孢晶混合物。孢晶混合物用经0.5-1mol/L NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤后,用pH11-12的NaOH溶液提取4-5h,离心去沉淀,收集上清液加乙酸调节pH5-6,得到没有降解的原毒素杀虫蛋白沉淀;或将苏云金杆菌孢晶混合物用水配成重量与体积比为5%-15%的悬浮液,在30-60℃条件下加碱调节pH11-12溶解伴孢晶体4-5h,离心去沉淀,收集含有活性毒素杀虫蛋白的上清液,超滤除去分子量小于60kDa的物质,加酸调节pH5-6,得到活性毒素杀虫蛋白沉淀;
(2)苏云金杆菌杀虫蛋白溶液制备:
苏云金杆菌杀虫蛋白溶解在碱性缓冲溶液,碱性缓冲溶液包括Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液,但最好采用Tris缓冲液,缓冲液pH值在9-10之间。碱液中杀虫蛋白浓度控制在0.3g/L-3.0g/L之间,浓度值采用福林—酚法测定。
(3)矿物悬浮液制备:
取微米级矿物颗粒用水配置成1.0%-10.0%(w/v)的悬浮液,超声波分散均匀。取一价或二价金属离子的氯化物,如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙;一价或二价金属离子的硝酸盐,如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁;一价或二价金属离子的硫酸盐,如硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁。取上述化合物中的一种或两种以上的混合物加入矿物悬浮液,使金属离子在悬浮液中的浓度在0.1-5mmol/L之间。
(4)矿物颗粒对杀虫蛋白的吸附:
按照杀虫蛋白与矿物质量比1:10-10:1的配比,将苏云金杆菌杀虫蛋白溶液与土壤矿物悬液混合,在温度0℃-50℃振摇吸附0.5-6h。
(5)吸附量的测算:
吸附完成后离心脱出上清液,采用福林—酚法检测上清液中苏云金杆菌杀虫蛋白浓度,利用吸附前后杀虫蛋白浓度之差计算吸附量。
(6)吸附复合物的解吸:
离心得到的苏云金杆菌杀虫蛋白矿物吸附复合物用去离子水洗涤,离心后测试洗涤液中杀虫蛋白浓度,计算解吸率。
(7)苏云金杆菌杀虫蛋白矿物吸附制剂在低温下冷冻保存。
实施例1:氯化钠增强的杀虫蛋白蒙脱土吸附剂型
苏云金杆菌原粉用水配成重量与体积比为10%的悬浮液,经0.5mol/L NaCl溶液和无菌去离子水分别洗涤3次后,用pH11-12的NaOH溶液提取4-5h,离心去沉淀,收集上清液加乙酸调节pH5-6,得到没有降解的原毒素蛋白沉淀,分子量130kDa。将原毒素杀虫蛋白用pH9的Tris缓冲液溶解,配制浓度1.0g/L溶液。
蒙脱土选自浙江省湖州市安吉县。将蒙脱土用蒸馏水配置2%(w/v)悬浮液。将10mL浓度1.0mg/mL的杀虫蛋白Tris缓冲溶液加入50mL塑料试管内(含纯蛋白10.0mg),加浓度2%(w/v)蒙脱土悬液0.5mL(含蒙脱土10.0mg),补加Tris缓冲液(pH9)至总体积20mL,在25℃条件下振摇吸附4h。取出吸附管放入离心机,15000r/min离心10min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,蒙脱土对杀虫蛋白的吸附量为0.364mg/mg,蛋白吸附率为36.4%。
将苏云金杆菌原毒素杀虫蛋白(130kDa)与蒙脱土按照1:1(质量比)混合,然后滴加1mol/L NaCl溶液,使吸附体系中NaCl的浓度为2mmol/L,在25℃条件下振摇吸附4h后离心,倾去上清液得到原毒素杀虫蛋白蒙脱土吸附复合物。在2mmol/L NaCl存在下,蒙脱土对原毒素杀虫蛋白的吸附量为0.476mg/mg,对原毒素杀虫蛋白的吸附率为47.6%。
实施例2:氯化钾增强的杀虫蛋白蒙脱土吸附剂型
将苏云金杆菌原毒素杀虫蛋白(130kDa)与蒙脱土按照1:1(质量比)混合,然后滴加1mol/L KCl溶液,使吸附体系中KCl的浓度为2mmol/L,在25℃条件下振摇吸附4h后离心,倾去上清液得到原毒素杀虫蛋白蒙脱土吸附复合物。在2mmol/L KCl存在下,蒙脱土对原毒素杀虫白的吸附量为0.483mg/mg,对原毒素杀虫蛋白的吸附率为48.3%。
实施例3:氯化钙增强的杀虫蛋白累托石吸附剂型
累托石选自湖北钟祥。将累托石用蒸馏水配置3%(w/v)悬浮液,苏云金杆菌原毒素杀虫蛋白(130kDa)用pH9的Tris缓冲液溶解,配制浓度1.0g/L溶液。将20mL浓度1.0mg/mL的苏云金杆菌原毒素杀虫蛋白Tris缓冲溶液(pH9)加入50mL塑料试管内(含纯蛋白20.0mg),加浓度3%累托石悬液335μL(含累托石10.0mg),在25℃条件下振摇吸附5h。将离心管放入离心机,在15000r/min离心10min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中原毒素杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,累托石对原毒素杀虫蛋白的吸附量为0.64mg/mg,蛋白吸附率为32.0%。
将原毒素杀虫蛋白与累托石按照2:1(质量比)混合,然后滴加1mol/L CaCl2溶液,使吸附体系中CaCl2的浓度为0.5mmol/L,在25℃条件下振摇吸附5h后离心,倾去上清液得原毒素杀虫蛋白累托石吸附复合物。在0.5mmol/L CaCl2存在下,累托石对原毒素杀虫蛋白的吸附量为0.87mg/mg,对原毒素杀虫蛋白吸附率为43.5%。
实施例4:氯化镁增强的杀虫蛋白凹凸棒土吸附剂型
苏云金杆菌发酵液离心得到孢晶混合物,将孢晶混合物用水配成重量与体积比为10%的悬浮液,在37℃条件下加碱调节pH11-12溶解伴孢晶体4-5h,离心去沉淀,收集含有活性毒素蛋白的上清液,超滤除去分子量小于60kDa的物质,加酸调节pH5-6,得到活性毒素杀虫蛋白(分子量65kDa)沉淀。将活性毒素杀虫蛋白用pH9的Tris缓冲液溶解,配制浓度2.0g/L溶液。
凹凸棒土购于江苏盱眙县。将凹凸棒土用蒸馏水配置1%(w/v)悬浮液。将5mL浓度2.0mg/mL的活性毒素杀虫蛋白Tris缓冲溶液(pH9)加入50mL塑料试管内(含纯蛋白10.0mg),加浓度1%凹凸棒土悬液5mL(含凹凸棒土50.0mg),补加Tris缓冲液(pH9)至总体积20mL,在25℃条件下振摇吸附3h。将离心管放入离心机,在15000r/min离心10min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中活性毒素杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,凹凸棒土对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.09mg/mg,蛋白吸附率为45.4%。
将活性毒素杀虫蛋白与凹凸棒土按照1:5(质量比)混合,然后滴加1mol/LMgCl2溶液,使吸附体系中MgCl2的浓度为4mmol/L,在25℃条件下振摇吸附3h后离心,倾去上清液得到活性毒素杀虫蛋白凹凸棒土吸附复合物。在4mmol/LMgCl2存在下,累托石对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.14mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为70.0%。
实施例5:氯化钙增强的杀虫蛋白高岭土吸附剂型
高岭土购于广西北海市。将高岭土样品悬浮于水中,配成1.5%(w/v)悬浮液。将10mL浓度1.5mg/mL的活性毒素杀虫蛋白Tris缓冲溶液(pH9)加入50mL塑料试管内(含纯蛋白15.0mg),加浓度1.5%高岭土悬液0.5mL(含高岭土7.5mg),补加Tris缓冲缓冲液(pH9)至总体积20mL,在25℃条件下振摇吸附3h。将离心管放入离心机,在15000r/min离心10min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中活性毒素杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,高岭土对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.59mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为29.4%。
将活性毒素杀虫蛋白与高岭土按照2:1(质量比)混合,然后滴加1mol/L CaCl2溶液,使吸附体系中CaCl2的浓度为3mmol/L,在25℃条件下振摇吸附5h后离心,倾去上清液得到活性毒素杀虫蛋白高岭土吸附复合物。在3mmol/L CaCl2存在下,高岭土对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.86mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为43.2%。
实施例6:硝酸镁增强的杀虫蛋白红壤吸附剂型
红壤选自湖南郴州。将红壤用蒸馏水配置3%(w/v)悬浮液。将5mL浓度2.0mg/mL的活性毒素杀虫蛋白Tris缓冲溶液(pH9)加入50mL塑料试管内(含纯蛋白10.0mg),加浓度3%红壤悬液667μL 3mL(含红壤20.0mg),补加Tris缓冲缓冲液(pH9)至总体积20mL,在25℃条件下振摇吸附5h。将离心管放入离心机,在20000r/min离心15min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中活性毒素杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,红壤对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.17mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为33.9%。
将杀虫蛋白与红壤按照1:2(质量比)混合,然后滴加1mol/L Mg(NO3)2溶液,使吸附体系中Mg(NO3)2的浓度为1.5mmol/L,在25℃条件下振摇吸附5h后离心,倾去上清液得到活性毒素杀虫蛋白红壤吸附复合物。在1.5mmol/L Mg(NO3)2存在下,红壤对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.27mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为53.6%。
实施例7:硝酸钙增强的杀虫蛋白纳米氧化硅吸附剂型
纳米氧化硅购自浙江舟山。将纳米氧化硅用蒸馏水配置3%(w/v)悬浮液。将5mL浓度2.0mg/mL的活性毒素杀虫蛋白Tris缓冲溶液(pH9)加入50mL塑料试管内(含纯蛋白10.0mg),加3%(w/v)纳米氧化硅悬液667μL(含纳米氧化硅20.0mg),补加Tris缓冲缓冲液(pH9)至总体积20mL,在25℃条件下振摇吸附5h。将离心管放入离心机,在20000r/min离心15min,倾去上清液,用福林—酚法检测上清液中活性毒素杀虫蛋白浓度。在没有金属离子添加的情况下,纳米氧化硅对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.186mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为37.3%。
将活性毒素杀虫蛋白与纳米氧化硅按照1:2(质量比)混合,然后滴加1mol/LCa(NO3)2溶液,使吸附体系中Ca(NO3)2的浓度为3.5mmol/L,在25℃条件下振摇吸附5h后离心,倾去上清液得到活性毒素杀虫蛋白纳米氧化硅吸附复合物。在3.5mmol/L Ca(NO3)2存在下,纳米氧化硅对活性毒素杀虫蛋白的吸附量为0.277mg/mg,对活性毒素杀虫蛋白吸附率为55.4%。
表1二价镁离子对矿物吸附活性杀虫蛋白(65kDa)的增强效果
表2添加钙离子对活性杀虫蛋白(65kDa)吸附复合物水洗解吸率的影响