CN107668473A - 一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品抗菌添加剂领域，具体涉及一种高稳定性、高抗菌性的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒及其制备方法。本发明利用带电型天然聚合物特性，采用静电自组装技术，制备包埋Nisin的聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，可防止Nisin在实际应用中与食品成分发生键合或酶解反应，可有效维持Nisin的稳定性和生物活性。本发明涉及到的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒制备工艺简单、产品稳定性好、粒径分布均匀、包封率和载药量均较高，对模拟炼乳培养基中的单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)均具有显著的抗菌效果。

Description

一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于食品抗菌添加剂领域，具体涉及一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)，也称为乳酸链球肽或尼生素，是一种由乳酸乳球菌乳酸亚种产生的多肽类物质，属于微生物类抗菌物质。对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌效果，且天然安全高效。Nisin作为一种多肽类物质，若将其直接应用到食品中，会与食品成分发生键合或酶解反应，从而降低其稳定性与生物活性。

近年来，纳米颗粒作为药物运输载体，因其粒径小、比表面积大等特点，受到研究人员的广泛关注。生物聚合物(如聚谷氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖、和果胶等)由于价格低廉、安全性高、生物兼容性好、可生物降解等优点被广泛用于纳米颗粒的制备。目前，国内已有一些关于纳米颗粒方面的专利申请。专利公开号为CN1462763A的中国专利公开了一种多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用。其实质是在阴离子型淀粉纳米内核表层修饰有阳离子型多聚赖氨酸核壳。专利公开号为CN104920584A的中国专利公开了一种壳聚糖-Nisin核壳微球及其制备方法与应用，即在酸性条件下对Nisin进行包埋形成包合物，提高其稳定性，增强其抗菌活力。

聚赖氨酸(PLL)是由链霉菌(Streptomyces)产生的一种由L-赖氨酸残基的ε-氨基和α-羧基形成的酰胺键连接而成的天然可生物降解聚合物。PLL是一种聚合阳离子肽，等电点为9.0，在水溶液中带正电荷，能够与阴离子物质通过静电相互作用而结合。聚谷氨酸(γ-PGA)，也称纳豆胶，是一种阴离子天然聚合物，由D-谷氨酸或者L-谷氨酸通过α-胺基与γ-羧基，通过γ-酰胺键结合形成的同型聚酰胺。带负电荷的γ-PGA在水溶液中可以与带正电荷的PLL通过静电自组装形成纳米颗粒。而且由于PLL的存在使得抗菌纳米颗粒表面带正电荷，因此能够迅速定位表面带负电荷的细菌细胞，与其发生静电相互作用，吸附并破坏细菌细胞的膜结构，阻断细胞内的能量转换和信息传递，抑制细菌的增殖甚至杀死细菌这也使得PLL具有一定的抗菌效果。

本发明充分利用γ-PGA和PLL的天然特性，通过静电自组装技术，对Nisin 进行包埋，形成Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，提高Nisin在食品中的稳定性，保持其生物活性。体系中PLL的引入，一方面可以使纳米颗粒表面携带正电荷，有利于与细菌细胞结合；另一方面PLL具有一定的抗菌效果，可以与Nisin起到协同抗菌的效果。

发明内容

本发明的目的是公开一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒及其制备方法。其实质为利用带电型天然聚合物通过静电自组装技术将Nisin进行包埋，形成抗菌纳米颗粒，提高Nisin在食品中的稳定性，保持其生物活性。

本发明所述抗菌纳米颗粒的制备方法为静电自组装技术，具体步骤如下：首先将Nisin溶液和γ-PGA溶液等体积混合，室温下将混合液置于磁力搅拌器上搅拌后向混合液中逐滴加入与Nisin溶液等体积的PLL溶液，继续搅拌过夜后形成抗菌纳米颗粒浊液，最后将抗菌纳米颗粒浊液离心分离，去掉上清液，收集沉淀物并重悬于磷酸缓冲液中，即可制得Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒。

本发明所用PLL溶液需要逐滴加入到溶液体系中，滴加速度为1.0mL/min。

所述Nisin溶液、γ-PGA溶液和PLL溶液的浓度分别为：2.0mg/mL、3.0 mg/mL和2.0mg/mL。

所述在磁力搅拌器上搅拌的时间为2h，转速200rpm。

所述继续搅拌的转速200rpm，时间大于12h。

所述离心分离的条件为：8000rpm,10min。

所述磷酸缓冲液的浓度为0.03M,pH值为7.4。

本发明想法新颖，产品结构特殊，充分发挥了各组分的优越性，制备出一种高稳定性、高抗菌性的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，本发明制得的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒具体优点如下：

(1)采用静电自组装技术制备Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，该方法充分利用了γ-PGA和PLL这两种带电型天然聚合物的特点，制备工艺简单，安全无毒无害。且该抗菌纳米颗粒粒径小，产品稳定性好，载药量和包封率均较高。

(2)抗菌纳米颗粒的包埋作用，避免Nisin与食品成分发生反应，使其能够维持良好的稳定性以及生物活性，从而保证在食品中更好的发挥长效抗菌的作用。

(3)由于PLL的存在，该抗菌纳米颗粒的表面携带正电荷，因此能够迅速定位表面带负电荷的细菌细胞，与其发生静电相互作用，吸附并破坏细菌细胞的膜结构，阻断细胞内的能量转换和信息传递，抑制细菌的增殖甚至杀死细菌。

(4)该抗菌纳米颗粒对Nisin具有一定的缓释作用，从而可提高Nisin的生物利用度，发挥长效抗菌效果。

附图说明

表1Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的参数表征。

图1是Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒中Nisin的释放示意图。

图2 Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒对李斯特菌(L.monocytogenes)的抗菌效果示意图。

图3 Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌效果示意图。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。实施例1Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备

1实验材料

Nisin 效价1100IU/mg 洛阳奇泓生物科技有限公司

γ-PGA Mw 50,000-100,000 山东福瑞达生物科技有限公司

PLL Mw 150,000-300,000 上海源叶生物科技有限公司

2实验方法

Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒制备步骤如下：

①使用去离子水配制Nisin溶液(2.0mg/mL)、γ-PGA溶液(3.0mg/mL)和 PLL溶液(2.0mg/mL)。

②将Nisin溶液(2.0mg/mL)和γ-PGA溶液(3.0mg/mL)等体积混合，室温下将混合液置于磁力搅拌器上搅拌(200rpm)2h。

③向混合液中逐滴加入等体积(与Nisin溶液等体积)的PLL溶液(2.0mg/mL)，继续搅拌过夜(200rpm，多于12h)，即可初步形成抗菌纳米颗粒浊液。

④最后将混合浊液离心分离(8000rpm,10min)，去掉上清液，收集沉淀物并重悬于磷酸缓冲液(PBS,0.03M,pH 7.4)中，即可制得Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒。

实施例2Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的表征

1实验材料

Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒

2实验材料与仪器

3实验方法

①采用激光粒度仪(Nano ZS90)测定Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的粒径和多分散系数(PDI)。抗菌纳米颗粒的Zeta电势采用电位仪(Nano ZS90Zeta)进行测定。

②使用BCA法微量蛋白检测试剂盒间接测定该抗菌纳米颗粒中Nisin的包封率。在Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒制备过程中，收集上清液，使用BCA法微量蛋白检测试剂盒测定上清液中Nisin的浓度(即为纳米颗粒中未被包封的Nisin的浓度)。利用以下公式计算抗菌纳米颗粒中Nisin的包封率：

③将一定质量的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，超声(100Hz,3h)破碎，离心(12000rpm,10min)分离取上清液，使用BCA法微量蛋白检测试剂盒测定上清液中的 Nisin的浓度。载药量(％)计算公式如下：

4Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的表征

表1Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的参数表征

Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的各表征参数如表1所示。该抗菌纳米颗粒的粒径为329nm，粒径小便于药物运输。PDI用于表征纳米颗粒粒径分布情况， PDI介于0～0.3之间时，表示其粒径分布窄，颗粒具有良好的均一性。该抗菌纳米颗粒PDI为0.214，,表明粒径分布比较集中，颗粒比较均一。Zeta电势是用于表征纳米颗粒体系稳定性的参数，Zeta电势较高(>|30|mV)的纳米颗粒相对较稳定。因此，该发明制得的纳米颗粒稳定性好，且由于PLL的存在使得该抗菌纳米颗粒表面带正电荷。该抗菌纳米颗粒包封率为51.4％，载药量为9.75％，该结果表明产品性能较好。

实施例3Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒中Nisin的释放性能评价

1实验材料

Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒

2实验仪器

BCA微量蛋白检测试剂盒 / 南京建成生物工程有限公司

透析袋 7000Da 北京索莱宝科技有限公司

3实验方法

称取一定量的Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，装入到透析袋中(分子截留量7000Da)，再将透析袋放于100.0mL PBS中，置于磁力搅拌器上缓慢旋转(100 rpm)。每隔一段时间，取出500μL的样品，取样后再加入等量PBS以维持恒定的溶液体积。取出的样品离心(6000rpm/min)15min，取上清液，使用BCA法微量蛋白检测试剂盒测定上清液中的Nisin的浓度。累积释放率(％)计算公式如下：

4Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒中Nisin的释放性能评价

由图1可以看出，Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒具有很好的缓释效果，可持续28h，累积释放量可达70％左右，从而可以保证抗菌纳米颗粒能够发挥长效抗的菌作用。

实施例4Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的抗菌性能评价

1实验材料

抗菌剂：Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒

模式菌种：李斯特菌(L.monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)

应用对象：炼乳

2实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅 HVE50 日本Hirayama株式会社

生化培养箱 LRH 上海一恒科学仪器有限公司

3实验方法

本实验采用平板菌落计数法，以李斯特菌(L.monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)为模式菌种，对Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的抗菌性能进行评价。具体方法步骤如下：

①以李斯特菌(L.monocytogenes)为例，将L.monocytogenes接种到液体培养基中，置于37℃空气摇床(150rpm)中震荡培养24h，获得对数生长期的菌悬液。取适量处于对数期的L.monocytogenes加入装有模拟炼乳培养基(炼乳与水以2:1混合)的试管中(此时细菌浓度约为10^5～6CFU/mL)。

②然后向试管中加入Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒(20％，v/v)或Nisin(2％)，不添加任何抗菌性物质的一组作空白对照，将各试管均置于37℃的恒温培养箱中培养。每隔24h取样，采用平板菌落计数法分别测定各样品中的残存菌数。实验重复三次，结果取平均值。Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒对金黄色葡萄球菌 (S.aureus)的抗菌性能评价实验过程同耐药性李斯特菌(L.monocytogenes)。 4Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒在炼乳中的抗菌性能评价

由图2和图3可以看出，培养24h后，相比于空白组和聚赖氨酸处理组，单纯Nisin和Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒处理的样品组中的残存菌数均有显著减少。但是48h过后，单纯Nisin处理的样品中的残存菌数不但没有继续减少反而有增加的趋势，而Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒处理的样品中的残存菌数继续减少，因此，相比于单纯Nisin来说，Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的抗菌效果更稳定更持久。这充分纳米颗粒可以有效提高Nisin的稳定性，防止其与食品成分发生反应，从而发挥更好的抗菌效果。

Claims (7)

1.一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，其特征在于：利用阴离子型天然多聚物聚谷氨酸(γ-PGA)和阳离子型天然多聚物聚赖氨酸(PLL)通过静电自组装技术，将Nisin进行包埋，形成Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒，提高Nisin在食品中的稳定性，保持其生物活性。

2.如权利要求1所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

首先将Nisin溶液和γ-PGA溶液等体积混合，室温下将混合液置于磁力搅拌器上搅拌后向混合液中逐滴加入与Nisin溶液等体积的PLL溶液，继续搅拌过夜后形成抗菌纳米颗粒浊液，最后将抗菌纳米颗粒浊液离心分离，去掉上清液，收集沉淀物并重悬于磷酸缓冲液中，即可制得Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒。

3.如权利要求2所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所用PLL溶液需要逐滴加入到溶液体系中，滴加速度为1.0mL/min。

4.如权利要求2所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述Nisin溶液、γ-PGA溶液和PLL溶液的浓度分别为：2.0mg/mL、3.0mg/mL和2.0mg/mL。

5.如权利要求2所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述在磁力搅拌器上搅拌的时间为2h，转速200rpm；所述继续搅拌的转速200rpm，时间大于12h。

6.如权利要求2所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述离心分离的条件为：8000rpm,10min。

7.如权利要求2所述的一种Nisin聚赖氨酸抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的浓度为0.03M,pH值为7.4。