CN115568545B - 一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒及其制备方法和抗菌应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖修饰蛋清蛋白‑乳酸链球菌素纳米颗粒及其制备方法和抗菌应用。具体公开了壳聚糖修饰蛋清蛋白‑乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：S1)壁材制备：取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，并调节溶液pH，离心，制备蛋清蛋白溶液；S2)搅拌：取蛋清蛋白水溶液，调pH3.0加入乳酸链球菌素搅拌，制备蛋清蛋白‑乳酸链球菌素混合物；S3)凝胶：取搅拌后混合物加热使其凝胶化并冰浴10‑20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白‑乳酸链球菌素凝胶；S4)超声处理；S5)壳聚糖修饰；S6)冻干。还公开由此方法制备获得的纳米颗粒。本发明所制备的纳米颗粒具有包封率高、乳化性能好、自由基清除率高等特点。
Description
技术领域
本发明属于淡水鱼防腐保鲜技术领域，具体涉及一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒抗菌剂制备方法及应用。
背景技术
乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸乳球菌乳酸亚种产生的天然细菌素，俗称乳酸链球菌肽或尼生素。它属于小阳离子肽分子量3.5kDa，分子式C143H228N42O37S7，对革兰氏阳性菌和孢子菌有很强的抑制作用。乳酸链球菌素早已被世界卫生组织(WHO)和美国FDA认定为唯一的一种作为食品防腐剂的细菌素。乳酸链球菌素具有广泛的应用价值，常用作水产品、肉制品、果蔬、奶酪的防腐保鲜以及食品包装材料中。但乳酸链球菌素的抗菌活性极易受环境因素的影响如pH、温度、酶降解以及与食品组分相互作用等。其次，乳酸链球菌素具有不溶于水，只对革兰氏阳性菌有抑制作用，限制了乳酸链球菌素的应用范围。因此，迫切需要探寻一种提高乳酸链球菌素应用稳定性的方法，提高乳酸链球菌素的抗菌保鲜效果，拓宽乳酸链球菌素的应用范围，延长食品的货架期。目前，已有技术通过生物大分子如脂质体、多糖、蛋白质和聚合物包埋乳酸链球菌素制备成纳米颗粒的报道，但普遍存在包封率不高、添加化学乳化剂、制备工艺复杂等缺陷，在改善乳酸链球菌素不足方面较为单一。
蛋清蛋白含有多种蛋白具有优异的营养价值、消化率、自组装和两亲性质等特点，作为纳米载体材料具有潜在的应用前景。目前，已有研究利用蛋清蛋白作为功能营养成分的递送载体，但是对递送抗菌活性成分研究鲜有报道。
壳聚糖由β-(1-4)连接的葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺单元制成，是一种线性共聚物。因为壳聚糖具有独特的氨基结构，是唯一的天然碱性多糖和抑菌剂，被食品和药物管理局认定为食品添加剂。又因其具有良好的生物相容性、生物降解性、成膜性、来源丰富等特点，被广泛应用于医疗、医药和食品等领域。已有研究将壳聚糖包被蛋白用来递送生物活性化合物，如：壳聚糖包被玉米醇溶蛋白制成纳米颗粒递送姜黄素和胡椒碱活性化合物以防止降解和齐聚。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述技术问题，本发明提供了一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒抗菌剂的制备方法及应用。本发明通过将乳酸链球菌素包裹在蛋清蛋白中制成纳米颗粒，再经壳聚糖修饰，以增强乳酸链球菌素的抗菌活性，拓宽其抑菌谱，增加乳酸链球菌素的应用范围，提高其利用率，达到高效利用的目的。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒抗菌剂的制备方法及应用，本发明由壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒制成复合抗菌剂。
本发明一个方面提供了一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：
S1).壁材制备：取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，并调节溶液pH，离心，制备蛋清蛋白溶液；
S2).搅拌：取蛋清蛋白水溶液，调pH3.0加入乳酸链球菌素搅拌，制备蛋清蛋白-乳酸链球菌素混合物；
S3).凝胶：取搅拌后混合物加热使其凝胶化并冰浴10-20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
S4).超声：取破碎后样品进行超声处理；
S5).壳聚糖修饰：将制备好的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒滴加到壳聚糖溶液中，调pH3.0，搅拌1-3h。
S6).冻干：壳聚糖修饰后的样品于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
优选地，步骤S1中，蛋清蛋白水溶液浓度为2mg/mL-10mg/mL，溶液pH为2-5；例如蛋清蛋白水溶液浓度为3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL；例如溶液pH为3、4、5。
优选地，步骤S1中，蛋清蛋白离心条件为5000g-7000g，10-20min。
优选地，步骤S2中，乳酸链球菌素加入溶液的方式为在搅拌状态下以0.1-1mL/min的速度加到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为1-10mg/mL，并在20-30℃下搅拌1-3h；例如乳酸链球菌素浓度为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL
优选地，步骤S3中，加热的条件为85-95℃，20-40min。
优选地，步骤S4中，超声的条件为600-900W超声处理10-20min。
优选地，步骤S5中，蛋清蛋白-乳酸链球菌素加入到壳聚糖溶液的方式为在搅拌状态下以0.1-1mL/min的速度滴加到壳聚糖溶液中，并在20-30℃下搅拌1-3h。
优选地，步骤S5中，蛋清蛋白；乳酸链球菌素：壳聚糖的浓度比为10:5:5，10:5:4，10:5:3，10:5:2，10:5:1。
优选地，步骤S5中，将制备好的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒滴加到壳聚糖溶液后，壳聚糖的浓度为1mg/mL以上，例如为1.5mg/mL-3mg/mL、2-2.5mg/mL。
本发明另一个方面提供了上述制备方法制备获得的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒。
优选地，所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的粒径为150nm-600nm，例如150nm，200nm，250nm，300nm，350nm，400nm，450nm，500nm，550nm，600nm。
本发明再一个方面提供了一种抗菌剂，所述的抗菌剂中包含上述壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒。
优选地，所述抗菌剂为用于食品的抗菌剂。
优选地，所述抗菌剂为用于蛋白质的抗菌剂。
优选地，所述的抗菌剂为用于水产品的抗菌剂。
优选地，所述抗菌剂中还包含水或水溶液、1％的乙酸溶液。
优选地，所述抗菌剂中不包含乳化剂或表面活性剂。
本发明最后提供了所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒作为抗菌剂的应用。
优选地，作为用于食品的抗菌剂。
优选地，作为用于蛋白质的抗菌剂。
优选地，作为用于水产品的抗菌剂。
有益效果
1.本发明通过将壳聚糖自组装修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒制成复合型抗菌剂，整个制备方法及制备过程简单快捷，蛋清蛋白和壳聚糖具有来源广泛，可生物降解和安全性等特点，制备周期短、分散性好、产率高。
2.针对乳酸链球菌素抗菌谱窄，合理利用壳聚糖修饰蛋清蛋白系统包埋，不仅解决乳酸链球菌素抗菌谱窄的问题，而且对乳酸链球菌素的抗菌活性具有一定的增强作用。
3.本发明通过壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒，不仅对乳酸链球菌素起到了保护作用，减少了其因环境因素造成的降解，提高了其生物利用率，并且使纳米颗粒具有更多的应用性能。
4.本发明充分利用壳聚糖自组装修饰的特性与蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒结合，不添加化学乳化剂，绿色安全。
5.本发明充分利用壳聚糖和蛋清蛋白资源，不仅拓宽了乳酸链球菌素的应用价值，而且为提高蛋清蛋白这一优质资源的附加价值，提供了新的出路。
附图说明
图1为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的样品图；其中A：乳酸链球菌素；B：壳聚糖；C：蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn)；D：2.5mg/mL壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn-CS2.5)。
图2为不同壳聚糖浓度修饰对乳酸链球菌素包封率的影响。
图3为壳聚糖修饰前后样品的粒径图。
图4为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的透射电镜图。
图5为壳聚糖包被蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒对S.aureus和E.coli抑菌直径的影响。其中A为不同浓度配比的纳米颗粒的统计结果，B为抑菌环照片。1：CS2.5；2：NIS；3：AH-NEn；4：AH-NEn-CS0.5；5：AH-NEn-CS1.0；6：AH-NEn-CS1.5；7：AH-NEn-CS2.0；8：AH-NEn-CS2.5；9：空白不同字母表示不同组间差异显著(p<0.05)
图6为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌率的影响。
图7为不同壳聚糖浓度修饰对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒乳化性及乳化稳定性的影响。
图8为不同壳聚糖浓度修饰对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒抗氧化性的影响。
图9为在4℃条件下壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒对鱼肉中菌落总数的影响。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
实施例1为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液浓度为10mg/mL，并调节溶液pH5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.取10mL超声后样品以0.1mL/min的速度滴加到相同体积，浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液中，调pH至3.0，搅拌2h后制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶，即复合物凝胶中各组分的浓度分别为蛋清蛋白5mg/mL、乳酸链球菌素2.5mg/mL、壳聚糖2.5mg/mL。
6.将壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
实施例2
实施例2为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液浓度为10mg/mL，并调节溶液pH5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.取10mL超声后样品以0.1mL/min的速度滴加到相同体积，浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液中，调pH至3.0，搅拌2h后制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶，即复合物凝胶中各组分的浓度分别为蛋清蛋白5mg/mL、乳酸链球菌素2.5mg/mL、壳聚糖2mg/mL。
6.将壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
实施例3
实施例3为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液浓度为10mg/mL，并调节溶液pH5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.取10mL超声后样品以0.1mL/min的速度滴加到相同体积，浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液中，调pH至3.0，搅拌2h后制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶，即复合物凝胶中各组分的浓度分别为蛋清蛋白5mg/mL、乳酸链球菌素2.5mg/mL、壳聚糖1.5mg/mL。
6.将壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
实施例4
实施例4为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液浓度为10mg/mL，并调节溶液pH5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.取10mL超声后样品以0.1mL/min的速度滴加到相同体积，浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液中调pH至3.0，搅拌2h后制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶，即复合物凝胶中各组分的浓度分别为蛋清蛋白5mg/mL、乳酸链球菌素2.5mg/mL、壳聚糖1mg/mL。
6.将壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
实施例5
实施例5为壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液浓度为10mg/mL，并调节溶液pH至5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.取10mL超声后样品以0.1mL/min的速度滴加到相同体积，浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液中，调pH至3.0，搅拌2h后制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶，即复合物凝胶中各组分的浓度分别为蛋清蛋白5mg/mL、乳酸链球菌素2.5mg/mL、壳聚糖0.5mg/mL。
6.将壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末。
对比例1制备蛋清蛋白-乳酸链球菌素粉末
1.取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，使蛋清蛋白水溶液质量浓度为1％，并调节溶液pH至5.0，离心6000g，15min取上清，制备蛋清蛋白溶液；
2.取蛋清蛋白水溶液，以0.1mL/min的速度加入乳酸链球菌素到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为5mg/mL，并在30℃下搅拌2h；
3.取搅拌后混合物在90℃下加热30min使其凝胶化并冰浴20min，于4℃过夜，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
4.取蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于600W超声处理15min；
5.将蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶于-80℃冷冻干燥12-48h，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素粉末。
本文所描述的具体实施仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
对于上述实施例1、2、3、4、5制得的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒和对比例1的各项指标进行检测，测得的各项技术指标如下表所示：其中，实施例1、2、3、4、5的产品分别用AH-NEn-CS2.5、AH-NEn-CS2.0、AH-NEn-CS1.5、AH-NEn-CS1.0、AH-NEn-CS0.5表示，对比例以AH-NEn表示。
一、壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的包封率
对于壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒，将制备好的样品过0.22μm的膜，取少量样品加入到10kDa超滤管中，在4℃条件下，以10000rpm离心10min，取滤过液，用紫外分光光度计分别在波长215nm和225nm测滤过液的吸光值取之间的差代入线性回归方程y＝0.0002x+0.1213，R2＝0.999(x为乳酸链球菌素的质量浓度μg/mL，y为吸光值)以测定游离的乳酸链球菌素的浓度。通过公式(1)计算得出壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的包封率(EE)：
包封率(％)＝总乳酸链球菌素浓度-游离的乳酸链球菌素浓度/总乳酸链球菌素×100(1)
结果如图2所示：随着壳聚糖浓度的增加，对乳酸链球菌素的包封率也随之增加。当壳聚糖浓度达到2.5mg/mL(实施例1)时，包封率达到了95％左右，这可能是因为随着壳聚糖的加入与乳酸链球菌素发生聚合反应，从而减少了游离在的乳酸链球菌素。实验结果说明壳聚糖浓度的提高可以提高乳酸链球菌素的包封率，且当浓度提高到2.0mg/mL以上时，可以实现90％以上的包封率，远远高于不经过壳聚糖修饰的。
二、壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的粒径、PDI和电位
粒径和PDI是蛋白质纳米颗粒均匀性及其在食品工业中应用效果的重要指标。纳米颗粒的PDI越小说明纳米颗粒分散性越好，当PDI小于0.3时，表示纳米颗粒具有优良的均匀性和分散性。如表1和图3-4所示，蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn)平均粒径为144.73nm(不含壳聚糖)随着壳聚糖浓度的增加，粒径达到547.33nm(含壳聚糖)，PDI从0.26增加到0.58(含壳聚糖)，电位从19mV增加到35mV。说明壳聚糖浓度对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒粒径、PDI和Zate电位均有影响。
表1不同浓度壳聚糖修饰后对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的粒径、PDI和Zeta电位的影响
注：AH-NEn：蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(乳酸链球菌素终浓度5mg/mL)；AH-NEn-CS0.5：0.5mg/mL的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(乳酸链球菌素终浓度5mg/mL)，同理下。平均值±标准差(n＝3)，同一列不同上标字母表示差异显著(p<0.05)。
三、抑菌活性
(1)抑菌圈
将活化好的S.aureus CICC21600用无菌生理盐水稀释至10-1梯度，待其培养基的温度不烫手时，取1mL稀释好的菌液接种到100mL的S1培养基中充分混匀。用灭过菌的镊子，将牛津杯摆在平板中，每个平板中分别倒入约20mL的培养基，待其凝固时，取出牛津杯，加入100μL的样品后，放在无菌操作台上扩散1h后，再将其放置4℃冰箱中过夜，其目的是为了使样品得到充分的扩散，降低扩散不完全对样品抑菌效果的影响。最后，将平板放置37℃中培养12h后，取出统计结果，实验做三次平行对照。
采用牛津杯法测定样品对S.aureus和E.coli的抑制作用。通过抑菌圈直径的大小表示样品的抑菌效果。从图5-B中可以看出：各样品均表现出对S.aureus具有良好的抑制作用，并且抑菌作用均高于对E.coli的抑制作用。在同浓度下的乳酸链球菌素和壳聚糖，乳酸链球菌素对S.aureus的抑制效果要比壳聚糖的好，乳酸链球菌素对S.aureus的抑菌圈直径达到了21mm左右，而壳聚糖抑菌圈直径为19mm左右。然而，壳聚糖对E.coli的抑制效果要比乳酸链球菌素的好。这是因为乳酸链球菌素只对革兰氏阳性菌有抑制作用，而壳聚糖具有广谱抗菌性。蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒中主要起到抗菌作用的是乳酸链球菌素，因此蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒也只针对S.aureus有抑制作用。经过不同浓度壳聚糖与蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒复合后，赋予了蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒对革兰氏阴性菌的抑制作用，拓宽了抑菌谱。
(2)抗菌率的测定
将乳酸链球菌素、壳聚糖(CS)、蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn)和壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn-CS)样品加入含有LB液体培养基试管中，使乳酸链球菌素和壳聚糖(CS)终浓度均为0.125mg/mL，待其充分混匀后放入37℃培养4h，取出涂布数菌落，抗菌率计算公式如下：
抗菌率(％)＝(空白对照组的菌落个数-加入抗菌剂组的菌落个数)/空白对照组的菌落个数×100
结果由图6可知，壳聚糖修饰后的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒对S.aureus和E.coli均有抑制作用，并且抗菌率达到了98％。而单独的壳聚糖对S.aureus和E.coli的抗菌率只有88％。游离的乳酸链球菌素和蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒只对S.aureus有抑制作用，抗菌率分别为60％和65％，而对E.coli的抗菌率为15％左右。说明经壳聚糖修饰后提高了蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的抗菌率和拓宽了抗菌谱。
四、壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的应用性能
(1)乳化性及乳化稳定性
通过比浊法测定EAI和ESI，图7为不同壳聚糖浓度对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒乳化性(EAI)及乳化稳定性(ESI)的影响。结果发现经过壳聚糖修饰后蛋清蛋白-乳酸链球菌素的乳化性及乳化稳定性得到改善和提高。
(2)抗氧化性
采用DPPH自由基清除法，研究了不同浓度壳聚糖修饰对蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的抗氧化活性影响。将壳聚糖与蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒发生复合反应，可以赋予蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒抗氧化功能。结果如图8所示：蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒自身存在一定的抗氧化性能，经过壳聚糖的修饰后，抗氧化性能得到提高，并且随着壳聚糖浓度的增加，抗氧化性能也随之增加。实施例1的复合物自由基清除率达到了60％以上，远远高于对比例1组。
五、壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒在鱼肉中的应用
称取10g鱼肉并切碎，加入90mL的无菌生理盐水溶液中混合2min。菌落计数根据国家确定的标准GB4789.2-2016进行测定。将鱼肉分别浸泡在乳酸链球菌素、壳聚糖(CS)、蛋清蛋白和乳酸链球菌素物理混合(A-NEn)、酸热诱导的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn)和壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的溶液中10min取出，晾干。使各样品中乳酸链球菌素的终浓度均保持在2.5mg/mL，壳聚糖终浓度也保持在2.5mg/mL水平上。随后分别从0、1、3、5、7、11d中取出鱼肉块放入装有90mL无菌生理盐水的均质袋中，拍打使肉样中的微生物均匀分散，进行梯度稀释。将固体培养基倒入培养皿中，待其凝固后，再加入100μL的样品稀释液进行涂布。实验结果如图9显示，与空白对照组相比，壳聚糖修饰后的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒(AH-NEn-CS)说明壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒在鱼肉中有良好的应用。
Claims (9)
1.一种壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1).壁材制备：取蛋清蛋白粉，以去离子水作为溶剂，并调节溶液pH，离心，制备蛋清蛋白溶液；
S2).搅拌：取蛋清蛋白水溶液，调pH并加入乳酸链球菌素搅拌，制备蛋清蛋白-乳酸链球菌素混合物；
S3).凝胶：取搅拌后混合物加热使其凝胶化并降温到0-8℃，制得蛋清蛋白-乳酸链球菌素凝胶；
S4).超声：取S3)得到的凝胶样品600-900W超声处理10-20min；
S5).壳聚糖修饰：将制备好的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒滴加到壳聚糖溶液中，调pH3.0，搅拌1-3h；
S6).冻干：壳聚糖修饰后的样品于-80℃冷冻干燥12-48h，制得壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素复合物粉末；
步骤S5中，将制备好的蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒滴加到壳聚糖溶液后，壳聚糖的浓度为1-2.5mg/mL；
步骤S5中，蛋清蛋白：乳酸链球菌素：壳聚糖的浓度比为10:5:5，10:5:4，10:5:3，10:5:2或10:5:1；
步骤S1中，蛋清蛋白水溶液浓度为2mg/mL-10mg/mL，溶液pH为2-5；
步骤S2中，乳酸链球菌素加入溶液的方式为在搅拌状态下以0.1-1mL/min的速度加到蛋清蛋白溶液中，使乳酸链球菌素浓度为1-10mg/mL，并在20-30℃下搅拌1-3h；
步骤S3中，加热的条件为85-95℃，20-40min。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备获得的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒；所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒的粒径为150nm-600nm。
3.一种抗菌剂，其特征在于，所述的抗菌剂中包含权利要求2所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒；所述抗菌剂为用于食品的抗菌剂。
4.一种抗菌剂，其特征在于，所述的抗菌剂中包含权利要求3所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒；所述抗菌剂为用于蛋白质的抗菌剂或用于水产品的抗菌剂。
5.根据权利要求3或4所述的抗菌剂，所述抗菌剂中还包含水、水溶液或1％的乙酸溶液。
6.根据权利要求4所述的抗菌剂，其特征在于，所述抗菌剂中不包含乳化剂或表面活性剂。
7.权利要求2所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒作为用于食品的抗菌剂的应用。
8.权利要求2所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒作为用于蛋白质的抗菌剂的应用。
9.权利要求2所述的壳聚糖修饰蛋清蛋白-乳酸链球菌素纳米颗粒作为用于水产品的抗菌剂的应用。
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