CN109173946A - 一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制备方法 - Google Patents

一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制备方法，属于食品工程技术领域。该方法为将Nisin与海藻酸钠混合后，滴入氯化钙溶液中制成海藻酸钙微胶囊，随后加入聚赖氨酸和壳聚糖混合溶液中进行二次包埋，并再次在海藻酸钠溶液中包埋，以柠檬酸钠溶液液化囊心，制备得到含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊。本发明制备的微胶囊化含有聚赖氨酸、Nisin和壳聚糖的复合抗菌产品与游离态和单一的聚赖氨酸、Nisin和壳聚糖相比，对pH、温度和酶的耐受性增强、防腐效果增加，可随着食品一起加工，不影响发酵食品发酵工程。

Description

一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制 备方法
技术领域
本发明属于食品工程技术领域，具体涉及一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制备方法。
背景技术
聚赖氨酸是一种含有25—30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，具有很好的杀菌能力和热稳定性。目前已被批准作为防腐剂添加于食品中，广泛用于方便米饭、湿熟面条、熟菜、海产品、酱类、酱油、鱼片和饼干的保鲜防腐中，其能在人体内分解为赖氨酸，可完全被人体消化吸收，而赖氨酸又是人体所必需的8种氨基酸之一允许在食品中强化使用。同时还发现聚赖氨酸和其他天然抑菌剂配合使用，有明显的协同增效作用，可以提高其抑菌能力。
Nisin可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。
公开号为CN 102429005 A的中国发明专利，公开了一种肠衣生物保鲜剂及其应用，其该肠衣生物保鲜剂由壳聚糖、聚赖氨酸、乳酸链球菌素组成，其中壳聚糖、聚赖氨酸、乳酸链球菌素的质量比为2：5：3。上述肠衣生物保鲜剂的应用，在肠衣上盐腌制阶段，将质量比为 2：5 ：3的壳聚糖、聚赖氨酸、乳酸链球菌素组成的肠衣生物保鲜剂，添加至肠衣盐中，肠衣生物保鲜剂的用量为肠衣质量的 0.04-0.06%，优选0.05%。虽然该肠衣生物保鲜剂能够对起到保鲜作用，但是其中的壳聚糖、聚赖氨酸、乳酸链球菌素通过简单地混合在一起，其对pH、温度和酶的耐受性差，防腐效果一般。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊及其制备方法的技术方案。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：将Nisin与海藻酸钠混合后，滴入氯化钙溶液中制成海藻酸钙微胶囊，随后加入聚赖氨酸和壳聚糖混合溶液中进行二次包埋，并再次在海藻酸钠溶液中包埋，以柠檬酸钠溶液液化囊心，制备得到含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于具体包括以下工艺步骤：
（1） 海藻酸钠溶液的制备：制备0.8～2 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2） Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:5～1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤（2）中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.0～2.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为20～50 ℃，静置时间为20～100 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有0.5～1.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：制备0.2～2.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用0.5～2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成0.2～2.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:1～1:10比例混合；
（8）二次包埋：将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入30～70 mL步骤（7）中所述混合液溶液，振摇10～100 min，除去上清液并用含有 0.5～1.5 wt％Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤（8）中投入步骤（1）中海藻酸钠溶液中振摇10～100 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.2～2.0 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心5～60 min，用生理盐水洗涤，即得包裹Nisin海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖-海藻酸钠复合膜微胶囊。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中制备1.5～2 wt％的海藻酸钠水溶液
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中取与海藻酸钠质量比1:10～1:15添加Nisin至海藻酸钠水溶液。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中反应温度为30～40 ℃，静置时间为30-80 min。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（7）中将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:4～1:6比例混合。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（8）中将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入40～50 mL步骤（7）中所述混合液溶液。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊，其特征在于通过以下步骤制得：将Nisin与海藻酸钠混合后，滴入氯化钙溶液中制成海藻酸钙微胶囊，随后加入聚赖氨酸和壳聚糖混合溶液中进行二次包埋，并再次在海藻酸钠溶液中包埋，以柠檬酸钠溶液液化囊心，制备得到含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊。
所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊，其特征在于具体通过以下步骤制得：
（1） 海藻酸钠溶液的制备：制备0.8～2 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2） Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:5～1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤（2）中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.0～2.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为20～50 ℃，静置时间为20～100 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有0.5～1.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：制备0.2～2.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用0.5～2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成0.2～2.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:1～1:10比例混合；
（8）二次包埋：将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入30～70 mL步骤（7）中所述混合液溶液，振摇10～100 min，除去上清液并用含有 0.5～1.5 wt％Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤（8）中投入步骤（1）中海藻酸钠溶液中振摇10～100 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.2～2.0 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心5～60 min，用生理盐水洗涤，即得包裹Nisin海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖-海藻酸钠复合膜微胶囊。
本发明制备的微胶囊化含有聚赖氨酸、Nisin和壳聚糖的复合抗菌产品与游离态和单一的聚赖氨酸、Nisin和壳聚糖相比，对pH、温度和酶的耐受性增强、防腐效果增加，可随着食品一起加工，不影响发酵食品发酵工程，而加工中的高温高压亦可使得微胶囊快速释放Nisin和聚赖氨酸，从而解除了包埋壁材对聚赖氨酸和Nisin抑菌效果的影响。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1：
（1）海藻酸钠溶液的制备：制备2.0g的海藻酸钠溶解于250ml蒸馏水中溶解；
（2）Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:5添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤(2)中所述混合液滴入含250μL Tween80的1.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为20℃，静置时间为20 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有0.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：0.2 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用0.5%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成0.2wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤(5)溶液和步骤(6)溶液以1:1比例混合；
（8）二次包埋：将步骤(3)和（4）制备1g/干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入30mL步骤(7)中所述混合液溶液，振摇10 min，除去上清液并用含有 0.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤(收集截留物)洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤(8)中投入步骤(1)中海藻酸钠溶液中振摇10 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.2 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心5 min，用生理盐水洗涤，即得包裹nisin海藻酸钠—聚赖氨酸/壳聚糖—海藻酸钠复合膜微胶囊；
（11）检测与应用结果：此配方制得的Nisin包埋率为70%，聚赖氨酸为60%。经高温蒸汽灭菌15 min后，采用纸片扩散法测定其效价，与游离态 Nisin相比，其抑菌活性提高 1.2倍，与游离态聚赖氨酸相比，其抑菌活性提高 1.1倍。将其按加入0.05%加入面粉一起制作广式月饼，货架期可以延长30天，同时不影响月饼的制作过程。
实施例2：
（1）海藻酸钠溶液的制备：制备1wt％的海藻酸钠水溶液；
（2）Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:10添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤(2)中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.5% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为30 ℃，静置时间为40 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有1.0 wt％的Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：1.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用1%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成1.0wt%壳聚糖溶液，
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤(5)溶液和步骤(6)溶液以1:5比例混合；
（8）二次包埋：将步骤(3)和（4）制备1g/干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入50 mL步骤(7)中所述混合液溶液，振摇60 min，除去上清液并用含有1.0 wt％的 Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤(收集截留物)洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤(8)中投入步骤(1)中海藻酸钠溶液中振摇40 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.6 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心20 min，用生理盐水洗涤，即得包裹nisin海藻酸钠—聚赖氨酸/壳聚糖—海藻酸钠复合膜微胶囊；
（11）检测与应用结果：此配方制得的nisin包埋率为80%，聚赖氨酸为70%。经高温蒸汽灭菌15 min后，采用纸片扩散法测定其效价，与游离态 Nisin相比，其抑菌活性提高 1.8倍，与游离态聚赖氨酸相比，其抑菌活性提高 1.5倍。将其按加入0.03%加入面粉一起制作广式月饼，货架期可以延长20天，同时不影响月饼的制作过程。
实施例3：
（1）海藻酸钠溶液的制备：制备2 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2）Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤(2)中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的2.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为50 ℃，静置时间为100min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有1.5 wt％的Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：2.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成2.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤(5)溶液和步骤(6)溶液以1:10比例混合；
（8）二次包埋：将步骤(3)制备1g/干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入70 mL步骤(7)中所述混合液溶液，振摇00 min，除去上清液并用含有1.5 wt％的 Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤(收集截留物)洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤(8)中投入步骤(1)中海藻酸钠溶液中振摇100 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以2.0 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心60 min，用生理盐水洗涤，即得包裹nisin海藻酸钠—聚赖氨酸/壳聚糖—海藻酸钠复合膜微胶囊；
（11）检测与应用结果：此配方制得的Nisin包埋率为82%，聚赖氨酸为73%。经高温蒸汽灭菌15 min后，采用纸片扩散法测定其效价，与游离态 Nisin相比，其抑菌活性提高 1.5倍，与游离态聚赖氨酸相比，其抑菌活性提高 1.4倍。将其按加入0.05%加入面粉一起制作广式月饼，货架期可以延长25天，同时不影响月饼的制作过程。
实施例4：
（1）海藻酸钠溶液的制备：制备1 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2）Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤(2)中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.5% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为30 ℃，静置时间为30 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有1.2 wt％的Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：1.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用1.2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成1.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤(5)溶液和步骤(6)溶液以1:5比例混合；
（8）二次包埋：将步骤(3)和（4）制备 1g/干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入50 mL步骤(7)中所述混合液溶液，振摇20 min，除去上清液并用含有1.2 wt％的 Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤(收集截留物)洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤(8)中投入步骤(1)中海藻酸钠溶液中振摇20 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.5 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心10 min，用生理盐水洗涤，即得包裹Nisin海藻酸钠—聚赖氨酸/壳聚糖—海藻酸钠复合膜微胶囊；
（11）检测与应用结果：此配方制得的Nisin包埋率为75%，聚赖氨酸为80%。经高温蒸汽灭菌15 min后，采用纸片扩散法测定其效价，与游离态 Nisin相比，其抑菌活性提高2.2倍，与游离态聚赖氨酸相比，其抑菌活性提高 2.1倍。将其按加入0.025%加入面粉一起制作广式月饼，货架期可以延长20天，同时不影响月饼的制作过程。

Claims (9)

1.一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：将Nisin与海藻酸钠混合后，滴入氯化钙溶液中制成海藻酸钙微胶囊，随后加入聚赖氨酸和壳聚糖混合溶液中进行二次包埋，并再次在海藻酸钠溶液中包埋，以柠檬酸钠溶液液化囊心，制备得到含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊。
2.如权利要求1所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于具体包括以下工艺步骤：
（1） 海藻酸钠溶液的制备：制备0.8～2 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2） Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:5～1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤（2）中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.0～2.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为20～50 ℃，静置时间为20～100 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有0.5～1.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：制备0.2～2.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用0.5～2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成0.2～2.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:1～1:10比例混合；
（8）二次包埋：将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入30～70 mL步骤（7）中所述混合液溶液，振摇10～100 min，除去上清液并用含有 0.5～1.5 wt％Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤（8）中投入步骤（1）中海藻酸钠溶液中振摇10～100 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.2～2.0 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心5～60 min，用生理盐水洗涤，即得包裹Nisin海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖-海藻酸钠复合膜微胶囊。
3.如权利要求2所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中制备1.5～2 wt％的海藻酸钠水溶液。
4.如权利要求2所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中取与海藻酸钠质量比1:10～1:15添加Nisin至海藻酸钠水溶液。
5.如权利要求2所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中反应温度为30～40 ℃，静置时间为30-80 min。
6.如权利要求2所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（7）中将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:4～1:6比例混合。
7.如权利要求2所述的一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤（8）中将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入40～50 mL步骤（7）中所述混合液溶液。
8.一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊，其特征在于通过以下步骤制得：将Nisin与海藻酸钠混合后，滴入氯化钙溶液中制成海藻酸钙微胶囊，随后加入聚赖氨酸和壳聚糖混合溶液中进行二次包埋，并再次在海藻酸钠溶液中包埋，以柠檬酸钠溶液液化囊心，制备得到含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊。
9.一种含有聚赖氨酸和Nisin的海藻酸钠壳聚糖微胶囊，其特征在于具体通过以下步骤制得：
（1） 海藻酸钠溶液的制备：制备0.8～2 wt％的海藻酸钠水溶液；
（2） Nisin海藻酸钠溶液的制备：取与海藻酸钠质量比1:5～1:20添加Nisin至海藻酸钠水溶液，混合均匀后过滤；
（3）微胶囊成囊：利用静电液滴发生装置将步骤（2）中所述混合液滴入含0.1%(v/v)Tween 80的1.0～2.0% (w/v)氯化钙溶液中，发生凝胶化反应，温度为20～50 ℃，静置时间为20～100 min，形成Nisin海藻酸钙微球乳液；
（4）洗涤与干燥：再经含有0.5～1.5 wt％Tween-80的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤，收集截留物，以除去未包埋的Nisin与壁材后，真空干燥或者真空冷冻干燥备用；
（5）聚赖氨酸溶液制备：制备0.2～2.0 wt%聚赖氨酸水溶液；
（6）壳聚糖乳液制备：用0.5～2%(v/v) 醋酸溶液将壳聚糖溶解配制成0.2～2.0wt%壳聚糖溶液；
（7）聚赖氨酸和壳聚糖混合液制备：将步骤（5）溶液和步骤（6）溶液以1:1～1:10比例混合；
（8）二次包埋：将步骤（4）制备的 1g干燥Nisin海藻酸钙微胶囊投入30～70 mL步骤（7）中所述混合液溶液，振摇10～100 min，除去上清液并用含有 0.5～1.5 wt％Tween-80 的蒸馏水溶液对微胶囊进行洗涤3 次；
（9）3次包埋：步骤（8）中投入步骤（1）中海藻酸钠溶液中振摇10～100 min，除去上清液并用生理盐水洗涤；
（10）洗涤与干燥：最后以1.2～2.0 wt%柠檬酸钠溶液液化囊心5～60 min，用生理盐水洗涤，即得包裹Nisin海藻酸钠-聚赖氨酸/壳聚糖-海藻酸钠复合膜微胶囊。
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