WO2021230359A1 - 抗ウイルス剤 - Google Patents

抗ウイルス剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2021230359A1
WO2021230359A1 PCT/JP2021/018456 JP2021018456W WO2021230359A1 WO 2021230359 A1 WO2021230359 A1 WO 2021230359A1 JP 2021018456 W JP2021018456 W JP 2021018456W WO 2021230359 A1 WO2021230359 A1 WO 2021230359A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antiviral agent
bacillus
serine protease
antiviral
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/018456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
智美 中野
奈々 横田
雅子 日夏
純 平木
英明 福士
Original Assignee
Jnc株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jnc株式会社 filed Critical Jnc株式会社
Priority to JP2022522222A priority Critical patent/JPWO2021230359A1/ja
Publication of WO2021230359A1 publication Critical patent/WO2021230359A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/12—Aerosols; Foams
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to an antiviral agent containing a serine protease.
  • hypochlorous acid and sodium hypochlorite are used for inactivating non-enveloped viruses such as norovirus, but these inactivate effects deteriorate even when organic substances coexist or over time. It was easy to use, and in some cases a sufficient inactivating effect could not be obtained.
  • sodium hypochlorite cannot be used on fingers, and its use is restricted due to its metal corrosiveness.
  • the present inventors have previously found an antiviral agent that combines a natto extract peptide and a cationic polymer, and have shown that this antiviral agent has a virus inactivating effect on non-enveloped viruses (Patent Document 1). ..
  • natto-extracted peptide described in Patent Document 1 is presumed to be a peptide derived from subtilisin, which is a kind of serine protease produced by Bacillus bacteria, but is described in Subtilisin itself and Patent Document 1. Natto extract peptides are different.
  • the natto-extracted peptide which is one of the components of the antiviral agent, cannot inactivate the non-enveloped virus by itself (Patent Document 1), and the natto-extracted peptide is a peptide present in natto.
  • its content is as low as about 1%, and in order to obtain a natto-extracted peptide, it is necessary to extract and purify using natto as a starting material, so that there is a problem that the production cost is high.
  • the challenge is to provide an antiviral agent consisting of ingredients with high safety and low manufacturing cost.
  • an antiviral agent containing a serine protease such as zubutyricin, nattokinase, and trypsin has an inactivating effect on a non-enveloped virus, and the present invention.
  • a serine protease such as zubutyricin, nattokinase, and trypsin
  • An antiviral agent used against non-enveloped viruses including serine proteases.
  • An antiviral agent, wherein the serine protease is produced by a bacterium belonging to the genus Bacillus or a bacterium belonging to the genus Geobacillus, or is trypsin.
  • Bacteria belonging to the genus Bacillus is Bacillus licheniformis, Bacillus clausii, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, or a Bacillus amyloliquefaciens, or bacteria belonging to the Geobacillus sp is a Geobacillus stearothermophilus, the [1] The antiviral agent described.
  • the serine protease has an amino acid sequence that is 90% or more identical to a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 7 or an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the antiviral agent according to any one of [1] to [5] which is in the form of a spray agent.
  • a new antiviral agent containing a highly safe substance as an ingredient and having a low manufacturing cost is provided.
  • the antiviral agent of the present invention is an antiviral agent used against non-enveloped viruses, including serine proteases.
  • serine protease of the present invention examples include trypsin, subtilisin, nattokinase and the like.
  • a commercially available product containing a serine protease may be used as the serine protease
  • examples of commercially available products under the following trade names can be exemplified: Alcalase (registered trademark) 2.4LFG, Protamex (registered trademark) (above, manufactured by Novozymes Japan Co., Ltd.); Protin SD-AY10, Proteax (above, manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.); Bioplase® OP, Bioplase® 30G, Bioplase® 30L, Bioplase® AL-15FG, Bioplase® APL-30, Bioplase® SP-20FG, Bioplase ( Registered trademark) XL-416F, Protease CL-15 (all manufactured by Nagase ChemteX Corporation); Aloase (registered trademark) XA-10, Aloase (registered trademark) AP-10, Aloase (registered trademark) NP-10 (all manufactured by Yakult Pharmaceutical
  • serine proteases for example Bacillus licheniformis, Bacillus clausii, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, bacteria and belonging to the genus Bacillus such as Bacillus alcalophilus, bacteria belonging to the Geobacillus genus such as Geobacillus stearothermophilus It may be a serine protease produced by.
  • the bacteria that produce serine proteases are preferably Bacillus licheniformis, Bacillus clausii, Bacillus subtilis, and Bacillus amyloliquefaciens.
  • Bacillus subtilis is referred to as Bacillus subtilis var. Natto can be exemplified.
  • the serine protease may be a protein having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 7, or may be represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is Bacillus subtilis var.
  • the serine protease produced by natto the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is the serine protease produced by Bacillus subtilis, and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is produced by Bacillus licheniformis.
  • the serine protease and the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is the serine protease produced by Bacillus clausii
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the serine protease produced by Bacillus amyloliquefaciens.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a serine protease produced by Geobacillus theatermophilus.
  • a method for calculating the numerical value of the identity of the amino acid sequence a method known to those skilled in the art can be used, for example, it is calculated by the specified parameter of blastp used in the amino acid homology search provided by BLAST (registered trademark). Can be done.
  • the serine protease is preferably trypsin, subtilisin, and nattokinase. More preferably, it is a subtilisin-like serine protease, specifically subtilisin or nattokinase. Bacillus subtilis var. Subtilisin having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 produced by natto and Bacillus subtilis var. The amino acid sequence identity of nattokinase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 produced by natto is about 99%.
  • serine proteases such as zubutyricin and nattokinase can be mass-produced by an industrial method, they are superior in that the production cost is lower than that of a natto-extracted peptide that is not mass-produced by an industrial method.
  • Trypsin is a safe enzyme known to be usable in foods, and it can be mass-produced by industrial methods, so that it can be obtained at low cost.
  • the amino acid sequence of trypsin is not particularly limited, and may have any amino acid sequence.
  • the content of serine protease in the antiviral agent of the present invention is not particularly limited as long as the antiviral agent exerts an antiviral effect.
  • the final pH of the preparation containing the antiviral agent of the present invention is not particularly limited as long as the antiviral agent exerts an antiviral effect, but is preferably pH 7.0 or higher, more preferably pH 7.0 to 11.0, and even more preferably. Is pH 7.3 to 10.3. It may be appropriately adjusted according to the type and concentration of the target virus, or may be adjusted according to the intended use.
  • the antiviral agent of the present invention targets a non-enveloped virus for inactivation.
  • virus inactivation the infectivity of the virus can be diminished or the infection of the virus can be stopped.
  • the antiviral agent according to the present invention does not reduce its antiviral activity even in the coexistence of organic substances. It is also superior in that it has a much wider range of choices than hypochlorous acid.
  • the non-enveloped virus on which the antiviral agent of the present invention acts is not particularly limited, and examples thereof include norovirus, rotavirus, poliovirus, adenovirus, and feline calicivirus, and norovirus is preferable.
  • anti-virus activity is evaluated, for example, by a plaque assay method or a TCID 50 (median tissue culture infection dose) method known to those skilled in the art.
  • the sample has antiviral activity when the plaque forming unit (PFU) at the time of sample addition is smaller, more preferably 10 times smaller, still more preferably 100 times smaller than in the case of no sample addition. Is determined to have.
  • the log TCID 50 value at the time of sample addition is smaller, more preferably 1 or more smaller, more preferably 2 or more smaller, that is, the antiviral activity value is larger than 0, as compared with the case where no sample is added. When it is preferably 1 or more, more preferably 2 or more, it is determined that the sample has antiviral activity.
  • Another aspect of the invention is the use of serine proteases for non-enveloped virus inactivation, wherein the serine proteases are produced by a bacterium belonging to the genus Bacillus or a bacterium belonging to the genus Geobacillus, or Trypsin, use.
  • Another aspect is the use of serine proteases in the production of antiviral agents for non-enveloped virus inactivation, wherein the serine protease is produced by a bacterium belonging to the genus Bacillus or a bacterium belonging to the genus Geobacillus. It is a thing, or it is a trypsin, it is a use.
  • Another aspect is the serine protease used for non-enveloped virus inactivation, wherein the serine protease is produced by a bacterium belonging to the genus Bacillus or a bacterium belonging to the genus Geobacillus, or trypsin. Is a serine protease.
  • Another aspect is a method of inactivating a non-enveloped virus in a subject, comprising applying a serine protease to the subject, wherein the serine protease is a bacterium belonging to the genus Bacillus or a bacterium belonging to the genus Geobacillus. A method of producing or being trypsin.
  • Applying serine proteases to a subject means, for example, ingesting serine protease as a food or drink composition into a mammal such as a human, contacting or mixing serine protease with food or drink, or applying serine protease to a textile product. For example, it may be applied to.
  • the antiviral agent of the present invention can be orally ingested, it can be contained in a food or drink composition.
  • Examples of the food and drink composition of the present invention include ordinary foods, beverages, food additives, foods with functional claims, foods with health claims such as foods for specified health use, supplements, and the like, and are not particularly limited.
  • the supplement may be, for example, a solid supplement such as a powder, a granule, a tablet, a capsule; or a liquid supplement such as a solution, a syrup, a suspension, or an emulsion.
  • the form of the food or drink composition may be liquid, paste-like, solid, powder or the like, and may be a tablet confectionery, liquid food, feed or the like.
  • components usually added during the production of foods and drinks such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavors, can be used in such a form.
  • Carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose; disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides; and polysaccharides such as common sugars such as dextrin, cyclodextrin and xylitol, sorbitol, etc. Examples include sugar alcohols such as erythritol.
  • a natural flavoring agent taumatin, stevia extract, etc.
  • a synthetic flavoring agent sacharin, aspartame, etc.
  • the food and drink composition is also added as an additive to ordinary foods and drinks such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, odorants, pH adjusters, and colorants. Further may be included.
  • excipients include sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannit, and sorbit; starch derivatives such as corn starch, horse bell starch, ⁇ -starch, dextrin, and carboxymethyl starch; crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, and the like.
  • Cellulose derivatives such as hydroxypropylmethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium; Arabic rubber; Dextran; Plulan; Silate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, magnesium aluminometasilicate; Phosphate derivatives such as calcium phosphate; Carbonated Carbonated carbonate derivatives such as calcium; sulfate derivatives such as calcium sulfate can be mentioned.
  • binder examples include gelatin; polyvinylpyrrolidone; macrogol, etc., in addition to the above-mentioned excipients.
  • disintegrant examples include, in addition to the above-mentioned excipients, chemically modified starch or cellulose derivatives such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • lubricant examples include talc; stearic acid; stearic acid metal salts such as calcium stearate and magnesium stearate; colloidal silica; waxes such as pea gum and gay wax; boric acid; glycol; carboxylic acids such as fumaric acid and adipic acid.
  • Carboxylic acid sodium salts such as sodium benzoate; sulfates such as sodium sulfate; leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; silicic acids such as anhydrous silicic acid and silicic acid hydrate; starch derivatives and the like. Be done.
  • the stabilizer examples include paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalconium chloride; anhydrous acetic acid; sorbic acid; divalent such as CaCl 2 and the like. Inorganic salts and the like can be mentioned.
  • flavoring agent and the flavoring agent examples include sweeteners, acidulants, and flavors.
  • the carrier used in the case of a liquid preparation is not particularly limited, and examples thereof include a solvent such as water.
  • the food and drink composition it may be contained in other general food and drink, for example, bread, macaroni, spaghetti, noodles, cake mix, fried flour, bread flour flour product; instant.
  • Instant foods such as noodles, cup noodles, retort / cooked foods, canned foods, microwave foods, instant soups / stews, instant miso soups / soups, canned soups, frozen / dried foods; canned agricultural products, canned fruits, jams / marmalades, pickles , Boiled beans, dried agricultural products, processed agricultural products such as cereals (processed grain products); canned fishery products, fish hams and sausages, kneaded fish products, marine delicacies, processed marine products such as boiled Tsukuda; canned livestock products, pastes, livestock meat Processed livestock products such as hams and sausages; processed milk, dairy beverages, yogurts, lactic acid bacteria beverages, cheese, ice creams, prepared powdered milks, creams, and other dairy products such as milk and dairy products; butter,
  • Combined seasonings and foods such as compound seasonings; frozen foods such as frozen foods, semi-cooked frozen foods, and cooked frozen foods; caramel, candy, chewing gum, chocolate, cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers , Japanese confectionery, rice confectionery, bean confectionery, dessert confectionery, etc .; carbonated beverage, natural fruit juice, fruit juice beverage, refreshing beverage with fruit juice, fruit meat beverage, fruit beverage with fruit grains, vegetable beverage, soy milk, soy milk beverage, coffee beverage , Tea beverages, powdered beverages, concentrated beverages, sports beverages, nutritional beverages, alcoholic beverages and other beverages; the antiviral agent of the present invention may be added to foods and drinks other than these.
  • a food cleaning treatment agent can be mentioned, which is used to apply antiviral treatment to foods and drinks including fresh foods to prevent the occurrence of food poisoning.
  • a mode of washing raw oysters contaminated with norovirus using a food cleaning treatment agent which is the food and drink composition of the present invention is preferably mentioned, and the treatment agent is washed away from the raw oysters at the time of washing.
  • the oysters may be added to water for use or the raw oysters may be immersed in water containing the treatment agent, and the present invention is not particularly limited.
  • the preferable intake of the food and drink composition of the present invention is not particularly limited as long as it can exert an antiviral effect.
  • the amount of serine protease per day is not limited. It is 0.01 mg to 10000 mg, preferably 0.1 mg to 10000 mg, and more preferably 1 mg to 5000 mg.
  • the preferable ingestion timing of the food and drink composition of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, before, after, or between meals.
  • the intake interval is not particularly limited.
  • the content of the antiviral agent of the present invention in the food and drink composition of the present invention is not particularly limited as long as it has antiviral activity, and may be arbitrary.
  • Another aspect of the invention is the use of serine proteases in the manufacture of food and beverage compositions.
  • Another aspect is a method of improving and / or preventing a viral infection, which comprises ingesting a serine protease or a food or drink composition containing the serine protease as an active ingredient.
  • the antiviral agent of the present invention can be in various forms such as daily necessities and sanitary goods.
  • the form at that time is not particularly limited, but may be the form of a spray agent.
  • the spray agent is used, for example, in the form of a spray, aerosol, or dry spray.
  • the spray is processed into a dosage form suitable for spraying and / or discharging with a compressed gas or pump.
  • the antiviral agent of the present invention may be dissolved or volatile in water, not particularly limited, but in a buffer solution having a pH of about 7.0 to 11.0, more preferably about 7.3 to 10.3, or a physiological saline solution. It is suspended in a solvent and formulated.
  • the spray can be directly administered to a living body such as an oral spray or a nasal spray, can be applied to textile products such as face masks and clothing, or can be sprayed indoors with a humidifier or the like.
  • Textile products include synthetic fibers, recycled or natural fibers, or garments processed from blends thereof, hygiene products, bedding, films, interior products and the like.
  • textile products include, for example, shirts, cloaks, trousers, skirts, nightwear, underwear, socks, gloves, hats, lab coats, nursing clothes, nursing clothes, work clothes, face masks, etc. Examples thereof include sheets, pillowcases, carpets, duvets, cushions, wallpaper, various filters, curtains, and carpets.
  • the textile product according to the present invention may be applied, for example, to the textile product or the fiber before processing the product by a method such as spraying, dipping, impregnating, or coating the antiviral agent of the present invention.
  • the antiviral agent of the present invention When the antiviral agent of the present invention is in the form of various products (including food and drink compositions), it can be arbitrarily used in combination with an appropriate component as long as the effect of the present invention is not impaired.
  • the combined component may be appropriately selected depending on the dosage form of the product and the like. For example, water; lower alcohols having 5 or less carbon atoms such as ethanol and isopropanol; glycerin, polyethylene glycol, butylene glycol, propylene glycol and dipropylene glycol.
  • At least one selected from the group consisting of water, lower alcohol and polyhydric alcohol is preferable as a concomitant ingredient, and is selected from the group consisting of lower alcohol and polyhydric alcohol from the viewpoint of imparting antibacterial properties. At least one is more preferred.
  • pH adjusters such as citric acid, sodium citrate, sodium hydroxide and triethanolamine, antioxidants such as tocopherol acetate, thickeners such as carboxyvinyl polymer and hydroxyethyl cellulose, ethylenediamine tetraacetic acid, Aminocarboxylic acid-based chelating agents such as nitrilotriacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid, triethylenetetraminehexacetic acid, cyclohexanediaminetetraacetic acid, hydroxyethylidene diphosphonic acid, nitrilotris (methylenephosphonic acid), phosphonobutane.
  • pH adjusters such as citric acid, sodium citrate, sodium hydroxide and triethanolamine
  • antioxidants such as tocopherol acetate
  • thickeners such as carboxyvinyl polymer and hydroxyethyl cellulose, ethylenediamine tetraace
  • Additives such as phosphonic acid-based chelating agents such as tricarboxylic acid and ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid, and amine-based chelating agents such as triethanolamine and polyamines are also preferably mentioned as concomitant components.
  • Example 1 Anti-feline calicivirus activity test when subtilisin or nattokinase was used (evaluation by plaque assay method) Feline calicivirus (Feline Calicivirus F-9 ATCC VR-782) was diluted to cells to a predetermined concentration. A diluted virus solution was added to CRFK cells (ATCC CCL-94) whose surface was washed with phosphate buffered saline (PBS (-) (pH 7.4)). Add 5 mL of cell proliferation medium (2% fetal bovine serum-added Dalveco modified Eagle's medium, Nakarai Techno) and culture under 37 ° C. and 5% CO 2 by CO 2 incubator until cytopathic effect (CPE) is confirmed.
  • CRFK cells ATCC CCL-94
  • PBS (-) phosphate buffered saline
  • CRFK cells infected cells
  • tissue culture 12-well plates True Line cell culture plate TR5001
  • CO 2 incubator 37 ° C., 5% CO 2 culture conditions for 1 day.
  • Inoculate 1-well cells with 0.3 mL each of the serial diluted solution incubate again in a CO 2 incubator under the culture conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 hour, and wash twice with 1 mL of cell growth medium.
  • Laminated medium 1% CMC-added 2% bovine fetal serum-added Dalveco-modified Eagle's medium, Nakarai Techno
  • Example 2 Anti-feline calicivirus activity test when subtilisin or nattokinase was used (evaluation at log TCID 50 value) It was confirmed whether subtilisin or nattokinase has anti-feline calicivirus activity. This test was performed multiple times and samples were prepared at the mixed concentrations shown in Table 3 or 4, respectively. The virus stock solution of the feline calicivirus solution used in Example 1 was appropriately diluted with PBS (-) (pH 7.4) so that the dilution ratio was 10 times or less and the log TCID 50 value of the negative control did not fall below 6. , Virus stock solution and serine protease solution were mixed in a volume ratio of 1: 9 and incubated for 30 minutes at room temperature.
  • Infected cells CRFK cells ATCC CCL-94
  • a cell growth medium 5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich.
  • the cells were seeded in 2 ⁇ 10 4 cells per well (0.05 mL of cell growth medium) in a flat bottom, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 under culture conditions.
  • the cells were inoculated with the virus solution by adding 0.05 mL of the serial diluted solution per well and mixing without removing the medium of each well.
  • subtilisin was used, the log TCID 50 value was reduced by 2.9 compared to the negative control.
  • nattokinase was used, the log TCID 50 value was reduced by a maximum of 1.5 as compared with the negative control (Table 6, nattokinase (1000 ppm)). That is, it was shown that subtilisin and nattokinase alone have antiviral activity.
  • Example 3 Anti-feline calicivirus activity test when trypsin was used (evaluation with log TCID 50 value) It was investigated whether trypsin has anti-feline calicivirus activity. Trypsin, derived from porcine spleen (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product number 209-19182, lot number SEG1875) was prepared with Tris-HCl solution (10 mM, pH 7.4) to 500 ⁇ g / mL. The virus stock solution of the feline calicivirus solution used in Example 1 was appropriately diluted with PBS (-) (pH 7.4) so that the dilution ratio was 10 times or less and the log TCID 50 value of the negative control did not fall below 6.
  • PBS -
  • Virus stock solution and serine protease solution were mixed in a volume ratio of 1: 9, and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the culture supernatant after incubation PBS (-) (pH7.4) was diluted with and create 10 0-9-fold serial dilutions.
  • Infected cells CRFK cells ATCC CCL-94
  • CRFK cells ATCC CCL-94 were previously prepared in 96-well plates for tissue culture (IWAKI microplate polystyrene for cell culture) using a cell growth medium (5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich).
  • the cells were seeded in 2 ⁇ 10 4 cells per well (0.05 mL of cell growth medium) in a flat bottom, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 under culture conditions. After incubation, the cells were inoculated with the virus solution by adding 0.05 mL of the serial diluted solution per well and mixing without removing the medium of each well.
  • cytopathic was confirmed by microscopy by methods known to those skilled in the art, to determine the log TCID 50 values. As shown in Table 7, the log TCID 50 value when trypsin was used was 3.9, which was 2.9 lower than that of the negative control (6.8), and trypsin alone had antiviral activity. Shown to have.
  • Example 4 Cell toxicity test Subbutyricin used in Example 1 was appropriately diluted with 10% fetal bovine serum-added Dalveco-modified Eagle's medium to a concentration of 0.5 to 5000 ⁇ g / mL, and cultured in a 48-well plate. It was added to the culture supernatant of RAW264.7 cells. After 72 hours, cell numbers were counted and a 50% cytotoxic concentration (CC 50 ) was determined by methods known to those of skill in the art. When the average value of the two cell count measurements was used, the CC 50 was 4.6 ⁇ g / mL for subtilisin.
  • Example 5 Anti-murine norovirus activity test Subtilisin used in Example 1 was diluted with PBS (-) (pH 7.4) to prepare a 4-fold diluted solution having the final concentration.
  • the stock solution of murine norovirus was prepared by the following method.
  • the RAW264.7 cells of 1 ⁇ 10 6 cells / mL, in addition to the 100mm dish (10mL per dish), the CO 2 incubator, 37 ° C., and cultured under culture conditions of 5% CO 2.
  • As the medium DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum was used.
  • a virus solution of murine norovirus (MNV S7-PP3 strain) was prepared at 0.1 PFU / cell, 1 mL per dish was added to the above cells, and the cells were infected at room temperature for 1 hour.
  • Maintenance medium (DMEM with 1% fetal bovine serum) was added in 5 mL per dish, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. under 5% CO 2 culture conditions.
  • CPE cytopathic effect due to virus infection
  • the supernatant was appropriately (0.1 to 1 mL) dispensed into a 1.5 mL microtube to prepare a virus stock solution, which was stored at ⁇ 80 ° C.
  • the virus stock solution was diluted with PBS ( ⁇ ) (pH 7.4) to prepare a virus titer of 2 ⁇ 10 5 PFU / mL.
  • PBS ⁇
  • subtilisin alone reduced the number of plaques after 1 hour as compared with the negative control. That is, it was shown that subtilisin alone has an antiviral effect.
  • Anti-feline calicivirus activity test when a commercially available enzyme preparation containing a serine protease is used (evaluation at log TCID 50 value) It was confirmed whether a commercially available enzyme preparation containing a serine protease has anti-feline calicivirus activity.
  • the serine protease solution was prepared with purified water using the enzyme preparations shown in Tables 9 to 11 so as to have a predetermined final concentration (volume fraction concentration) of each test group in the table. This test was performed multiple times, and samples were prepared at the concentrations shown in Tables 9 to 11, respectively.
  • the virus stock solution of the cat calicivirus solution used in Example 1 was appropriately diluted with purified water so that the dilution ratio was 10 times or less and the log TCID 50 value of the negative control did not fall below 6, and the virus stock solution and serine protease were appropriately diluted.
  • the solutions were mixed in a 1: 9 volume ratio and incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the culture supernatant after incubation PBS (-) (pH7.4) was diluted with and create 10 0-9-fold serial dilutions.
  • Infected cells CRFK cells ATCC CCL-94 were previously prepared in 96-well plates for tissue culture (IWAKI microplate polystyrene for cell culture) using a cell growth medium (5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich). The cells were seeded in 2 ⁇ 10 4 cells per well (0.05 mL of cell growth medium) in a flat bottom, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 under culture conditions. After incubation, the cells were inoculated with the virus solution by adding 0.05 mL of the serial diluted solution per well and mixing without removing the medium of each well.
  • a cell growth medium 5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich
  • Example 7 Anti-feline calicivirus activity test at each pH (evaluation at log TCID 50 value) The anti-feline calicivirus activity at each pH of a commercially available enzyme preparation containing subtilisin or serine protease was confirmed.
  • the serine protease solution was prepared using the enzyme preparation shown in Table 15 or 16 and adjusted to the pH shown in the table so as to have the predetermined final concentration (volume fraction concentration) of each test group in the table. It was prepared with PBS (-) (pH 6.0, pH 7.0 to 7.5, pH 9.0). This test was performed multiple times and samples were prepared at the concentrations shown in Tables 15 and 16, respectively.
  • the virus stock solution of the feline calicivirus solution used in Example 1 was appropriately diluted with PBS (-) (pH 7.4) so that the dilution ratio was 10 times or less and the log TCID 50 value of the negative control did not fall below 6.
  • Virus stock solution and serine protease solution were mixed in a volume ratio of 1: 9, and incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the culture supernatant after incubation PBS (-) (pH7.4) was diluted with and create 10 0-9-fold serial dilutions.
  • Infected cells CRFK cells ATCC CCL-94 were previously prepared in 96-well plates for tissue culture (IWAKI microplate polystyrene for cell culture) using a cell growth medium (5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich). The cells were seeded in 2 ⁇ 10 4 cells per well (0.05 mL of cell growth medium) in a flat bottom, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 under culture conditions. After incubation, the cells were inoculated with the virus solution by adding 0.05 mL of the serial diluted solution per well and mixing without removing the medium of each well.
  • a cell growth medium 5% bovine fetal serum-added eagle minimum essential medium, Sigma Aldrich
  • the log TCID 50 value decreased by 1.5 or more at pH 7.3 as compared with the negative control, and decreased by 3.0 or more at pH 7.5 or more (Table 18). That is, in the case of subtilisin, it can be effectively used at a pH of 7.0 or higher, more preferably about 7.3 to 9.0, and has antiviral activity in a commercially available enzyme preparation containing various serine proteases and various serine proteases. It was shown that it is preferable to adjust the pH appropriately and to select a serine protease preparation according to the application because the optimum range of pH for the above is different.
  • a novel antiviral agent that exerts an inactivating effect against non-enveloped viruses and is highly safe and can be applied to fingers or taken orally is provided, which is extremely useful. Is.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)

Abstract

ズブチリシンやナットウキナーゼ、トリプシン等のセリンプロテアーゼ含む抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化作用があることを明らかにした結果、安全性が高く、製造コストが安価な成分からなる、ウイルス不活化能が高い抗ウイルス剤を見出した。

Description

抗ウイルス剤
　本発明は、セリンプロテアーゼを含む、抗ウイルス剤に関する。
　通常、ノロウイルスをはじめとするノンエンベロープ型ウイルスの不活化には、次亜塩素酸や次亜塩素酸ナトリウムが用いられるが、これらは有機物が共存する場合や経時的にも不活化効果が劣化しやすく、使用時において十分な不活化効果が得られないことがあった。また安全性の観点から、次亜塩素酸ナトリウムは手指に使用することができず、さらには金属腐食性もあり使用方法が制限されていた。
　本発明者等は、これまでに納豆抽出ペプチドとカチオン性ポリマーを組み合わせた抗ウイルス剤について見出し、この抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対するウイルス不活化作用があることを示した（特許文献１）。これにより、ノンエンベロープ型ウイルスに対して不活化効果を発揮し、かつ手指への適用や経口摂取も可能な安全性の高い、抗ウイルス剤を提供した。
　なお、特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは、バチルス属細菌が産生するセリンプロテアーゼの一種であるズブチリシンより派生するペプチドであると推定されているが、ズブチリシンそのものと特許文献１に記載される納豆抽出ペプチドは異なるものである。
　しかしながら、抗ウイルス剤の成分の１つである納豆抽出ペプチドは、単独ではノンエンベロープ型ウイルスを不活化することができず（特許文献１）、さらに納豆抽出ペプチドは、納豆中に存在するペプチドであるがその含量は１％程度と少なく、納豆抽出ペプチドを得るためには納豆を出発材料として抽出および精製を行なう必要があるため、製造コストが高いという問題点があった。
特開２０１９－１４７７７８号公報
　そのため、安全性が高く、かつウイルス不活化能が高い抗ウイルス剤を、その製造コストを抑えつつ製造することが求められていた。
　上記状況に鑑み、安全性が高く、製造コストが安価な成分からなる、抗ウイルス剤を提供することを課題とする。
　本発明者等は、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ズブチリシンやナットウキナーゼ、トリプシン等のセリンプロテアーゼを含む抗ウイルス剤がノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化作用があることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、この出願は、以下の発明を提供するものである。
［１］セリンプロテアーゼを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤であって、
　前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、抗ウイルス剤。
［２］前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである、または
　前記Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである、［１］に記載の抗ウイルス剤。
［３］前記セリンプロテアーゼが、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質である、［１］又は［２］に記載の抗ウイルス剤。
［４］前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシンまたはナットウキナーゼである、［１］～［３］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［５］前記ノンエンベロープ型ウイルスが、ノロウイルスである、［１］～［４］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［６］噴霧剤の形態である、［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤。
［７］［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤を塗布してなる、繊維製品。
［８］［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、飲食品組成物。
［９］［１］～［５］の何れかに記載の抗ウイルス剤を含有する、食品洗浄処理剤。
　安全性が高い物質を成分とする、製造コストが安価な、新規抗ウイルス剤が提供される。
＜抗ウイルス剤＞
　本発明の抗ウイルス剤は、セリンプロテアーゼを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤である。
　本発明のセリンプロテアーゼは、例えば、トリプシン、ズブチリシン、ナットウキナーゼ等が挙げられる。
　本発明においてセリンプロテアーゼは市販されているセリンプロテアーゼを含有する製品を使用してもよく、以下の商品名で市販されているものを例示できる：
　アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ、プロタメックス（登録商標）（以上、ノボザイムジャパン株式会社製）；
　プロチンＳＤ－ＡＹ１０、プロテアックス（以上、天野エンザイム株式会社製）；
　ビオプラーゼ（登録商標）ＯＰ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｇ、ビオプラーゼ（登録商標）３０Ｌ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＬ－１５ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＡＰＬ－３０、ビオプラーゼ（登録商標）ＳＰ－２０ＦＧ、ビオプラーゼ（登録商標）ＸＬ－４１６Ｆ、プロテアーゼＣＬ－１５（以上、ナガセケムテックス株式会社製）；
　アロアーゼ（登録商標）ＸＡ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０、アロアーゼ（登録商標）ＮＰ－１０（以上、ヤクルト薬品工業株式会社製）；
　オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ、（以上、エイチビィアイ株式会社製）；
　マキシプロＢＡＰ、マキシプロＮＰＵ、ＢａｋｅＺｙｍｅ（登録商標）Ｂ５００ＢＧ（以上、ＤＳＭニュートリション　ジャパン株式会社製）；
　エンチロンＳＡ－１００、エンチロンＳＡ－１５０Ｐ、エンチロンＮＢＳ－１００（以上、洛東化成工業株式会社製）；
　ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ　２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｍ　２０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ　３０２０、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標）Ｐ　１５０、Ｏｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）ＰＲ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＰＲ　６Ｌ（以上、ダニスコジャパン株式会社製）。
　また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌や、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等のＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するセリンプロテアーゼであってもよい。
　本発明において、セリンプロテアーゼを産生する菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。さらに好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉであり、これらの菌が産生するプロテアーゼは、強く安定した抗ウイルス活性を示す。またＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓとしてはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏを例示することが出来る。
　また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、または、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、好ましくは９５％以上同一のアミノ酸配列を有し、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質であってもよい。
　配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓが産生するセリンプロテアーゼであり、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが産生するセリンプロテアーゼである。
　なお、アミノ酸配列の同一性の数値を算出する方法については、当業者に既知の方法を用いる事ができ、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）が提供するアミノ酸ホモロジー検索で用いるｂｌａｓｔｐの規定パラメーターにより算出することができる。
　また特に限定されないが、本発明において、セリンプロテアーゼは、好ましくはトリプシン、ズブチリシン、ナットウキナーゼである。さらに好ましくはズブチリシン様セリンプロテアーゼであり、具体的にはズブチリシンまたはナットウキナーゼである。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏが産生する配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するズブチリシンおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｖａｒ．　ｎａｔｔｏが産生する配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するナットウキナーゼのアミノ酸配列の同一性は約９９％である。ズブチリシンやナットウキナーゼといったセリンプロテアーゼは工業的手法によって大量生産可能であるため、工業的手法による大量生産が行われていない納豆抽出ペプチドと比較して製造コストが安くなるという点が優れている。
　トリプシンは食品にも利用できることが知られている安全な酵素であり、また工業的手法によって大量生産可能であるため安価に入手することが可能である。またトリプシンの有するアミノ酸配列は特に限定されることなく、いずれのアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　本発明の抗ウイルス剤におけるセリンプロテアーゼの含有量は、抗ウイルス剤が抗ウイルス効果を発揮する限り特に限定されない。
　本発明の抗ウイルス剤を含む製剤の最終ｐＨは、抗ウイルス剤が抗ウイルス効果を発揮する限り特に限定されないが、好ましくはｐＨ７．０以上、より好ましくはｐＨ７．０～１１．０、さらに好ましくはｐＨ７．３～１０．３である。適宜、対象となるウイルスの種類や濃度などに合わせて調整してもよく、また用途に応じて調整してもよい。
　本発明の抗ウイルス剤は、ノンエンベロープ型ウイルスを不活化の対象とするものである。ウイルス不活化の結果、ウイルスの感染力を減弱化またはウイルスの感染を阻止することができる。本発明に係る抗ウイルス剤は、次亜塩素酸または次亜塩素酸ナトリウムと異なり、有機物の共存下であっても抗ウイルス活性が低下しないため、適用し得る対象、条件、環境、形態等についての選択の幅が次亜塩素酸よりも格段に広い点でも優れる。
　本発明の抗ウイルス剤が作用するノンエンベロープ型ウイルスは、特に限定されないが、例えばノロウイルス、ロタウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、ネコカリシウイルスが挙げられ、好ましくはノロウイルスである。
　なお、本明細書において、「抗ウイルス活性」は、例えば、当業者に既知の方法であるプラークアッセイ法またはＴＣＩＤ５０（ｍｅｄｉａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｏｓｅ、５０％組織培養感染量）法によって評価される。
　プラークアッセイ法の場合、試料未添加の場合と比べて、試料添加時のプラーク形成単位（ＰＦＵ）が小さい、より好ましくは１０倍小さく、さらに好ましくは１００倍小さいときに、該試料は抗ウイルス活性を有する、と判断する。
　ＴＣＩＤ５０法の場合、試料未添加の場合に比べて試料添加時のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値が小さい、より好ましくは１以上小さい、さらに好ましくは２以上小さいとき、すなわち抗ウイルス活性値が０より大きい、好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上であるときに、該試料は抗ウイルス活性を有する、と判断する。
　なお、ノンエンベロープ型ウイルスに対する不活化試験において、ヒトノロウイルスの培養は困難であることから、一般的に代替試験として使用されているネコカリシウイルスに対する試験によって評価することができる。また、ヒトノロウイルスではなくマウスノロウイルスを代替試験として使用することもできる。
　本発明の別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のための、セリンプロテアーゼの使用であって、前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、使用である。
　また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のための抗ウイルス剤の製造における、セリンプロテアーゼの使用であって、前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、使用である。
　また、別の側面は、ノンエンベロープ型ウイルス不活化のために用いられる、セリンプロテアーゼであって、前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、セリンプロテアーゼである。
　また、別の側面は、セリンプロテアーゼを対象に適用することを含む、該対象におけるノンエンベロープ型ウイルスの不活化方法であって、前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、方法である。セリンプロテアーゼを対象に適用することとは、例えば、セリンプロテアーゼを飲食品組成物としてヒト等の哺乳動物に経口摂取させること、セリンプロテアーゼを飲食品と接触若しくは混合させること、又はセリンプロテアーゼを繊維製品に塗布することなどが挙げられる。
＜飲食品組成物＞
　本発明の抗ウイルス剤は、経口摂取することが可能であるため、飲食品組成物に含有させる態様とすることができる。
　本発明の飲食品組成物の態様としては、通常の食品、飲料、食品添加物、機能性表示食品、特定保健用食品等の保健機能食品、サプリメント等が挙げられ、特に限定されない。サプリメントとしては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形のサプリメントであってもよく；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液状のサプリメントであってもよい。
　飲食品組成物の形態としては、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、また錠菓、流動食、飼料等としてもよい。
　かかる形態にする際には、本発明の抗ウイルス剤の他に、飲食品製造時に通常添加される成分、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味料及び香味料等を用いることができる。炭水化物としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及び、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味料としては、天然香味料（タウマチン、ステビア抽出物等）及び合成香味料（サッカリン、アスパルテーム等）を使用することができる。
　　また、飲食品組成物は、添加物として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤、ｐＨ調整剤、着色剤等の通常飲食品にも添加されるものをさらに含んでもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α－デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
　結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
　安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸；ＣａＣｌ２等の二価の無機塩類等が挙げられる。
　矯味剤及び矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
　なお、液剤の場合に使用する担体としては、特に限定されないが水等の溶剤等が挙げられる。
　また、飲食品組成物の一形態として、他に一般の飲食品に含有させる態様であってもよく、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品等の即席食品；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子等の菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料等の飲料類；これら以外の飲食品等に、本発明の抗ウイルス剤を添加してもよい。
　また、飲食品組成物の一形態として、食品洗浄処理剤が挙げられ、これは生鮮食品を含む飲食品に対して抗ウイルス処理を施し、食中毒の発生を予防するために使用するものである。例えば、ノロウイルスに汚染された生カキ等に対して、本発明の飲食品組成物である食品洗浄処理剤を用いて洗浄する態様が好ましく挙げられ、洗浄の際に該処理剤を生カキの洗い流し用の水に添加したり、該処理剤を含む水に生カキを浸漬したりすればよく、特に限定されない。
　本発明の飲食品組成物の好ましい摂取量は、抗ウイルス効果を発揮できる限り特に限定されず、例えば、約６０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日あたり、セリンプロテアーゼ量として０．０１ｍｇ～１００００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ～１００００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ～５０００ｍｇである。
　本発明の飲食品組成物の好ましい摂取タイミングは特に限定されず、例えば、食前、食後または食間のいずれでもよい。また、摂取間隔は特に限定されない。
　本発明の飲食品組成物における、本発明の抗ウイルス剤の含有量は、抗ウイルス活性を有する限り特に限定されず、任意で良い。
　本発明の別の側面は、飲食品組成物の製造における、セリンプロテアーゼの使用である。
　また、別の側面は、セリンプロテアーゼ又はこれを有効成分として含有する飲食品組成物を摂取することを含む、ウイルス感染症を改善及び／又は予防する方法である。
＜他の製品の態様＞
　その他に、本発明の抗ウイルス剤は、日用品、衛生用品など、種々の態様とすることができる。
　その際の形態としては、特に限定されないが、噴霧剤の形態とすることができる。噴霧剤は、例えば、スプレー、エアロゾル、または乾燥噴霧の形態で使用される。噴霧剤は、圧縮ガスやポンプによる噴霧および／または吐出に適した剤型に加工される。例えば水、特に限定されないがｐＨ７．０～１１．０程度、より好ましくはｐＨ７．３～１０．３程度の緩衝液、または生理食塩水等に本発明の抗ウイルス剤を溶解させたり、揮発性溶媒に懸濁して製剤化したりする。噴霧剤は、口腔用噴霧剤や鼻腔噴霧剤など、生体に直接投与できる他、フェイスマスクや衣類などの繊維製品に塗布したり、加湿器等により室内に霧散させたりして使用できる。
　また、本発明の抗ウイルス剤を塗布してなる繊維製品も、本発明に包含される。
　繊維製品は、合成繊維、再生繊維もしくは天然繊維、またはこれらの混紡を加工した衣類、衛生用品、寝装品、フイルム類、およびインテリア用品等である。特に限定されるものではないが、繊維製品としては、例えば、シャツ、外套、ズボン、スカート、ナイトウェア、下着類、靴下、手袋、帽子、白衣、看護衣、介護衣、作業着、フェイスマスク、シーツ、枕カバー、カーペット、布団、座布団、壁紙、各種フィルター類、カーテン、およびカーペット等が例示できる。
　本発明に係る繊維製品は、例えば、繊維製品または製品加工前の繊維に、本発明の抗ウイルス剤をスプレー、浸漬、含浸、またはコーティング等の方法により塗布すればよい。
　本発明の抗ウイルス剤を種々の製品（飲食品組成物も含む）の態様とする場合には、本発明の効果を損なわない限りにおいて、適当な成分と任意に併用することができる。
　かかる併用成分は、製品の剤型等に応じて適宜選択すればよく、例えば、水；エタノール、イソプロパノール等の炭素数５以下の低級アルコール；グリセリン、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール；グリシン、有機酸、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、デヒドロ酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化アルキルジアミノエチルグリシン、ヨードチンキ、ポピドンヨード、セチル酸化ベンザルコニウム、トリクロサン、クロルキシレノール、イソプロピルメチルフェノール、ラクトフェリン、ナイシン、バクテリオシン、ウド抽出物、エゴノキ抽出物、カワラヨモギ抽出物、酵素分解ハトムギ抽出物、しらこタンパク抽出物、ツヤプリシン、ペクチン分解物等の抗菌剤などが挙げられ、特に限定されない。これらのうち、水、低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種が併用成分として好ましく、抗菌性をも付与しうる観点から低級アルコール及び多価アルコールからなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
　この他にも、クエン酸、クエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤、トコフェロール酢酸エステル等の酸化防止剤、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース等の増粘剤、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、シクロヘキサンジアミン四酢酸等のアミノカルボン酸系キレート剤、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、ホスホノブタントリカルボン酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸等のホスホン酸系キレート剤、トリエタノールアミン、ポリアミン類等のアミン系キレート剤などの添加剤も、併用成分として好ましく挙げられる。
　以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例のみに限定されないことは言うまでもない。
＜実施例１＞ズブチリシンまたはナットウキナーゼを使用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（プラークアッセイ法での評価）
　ネコカリシウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ　Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ　Ｆ－９　ＡＴＣＣ　ＶＲ－７８２）を細胞に対して、所定の濃度に希釈した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４））で表面を洗浄したＣＲＦＫ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９４）に希釈したウイルス液を添加した。細胞増殖用培地（２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を５ｍＬ加え、細胞変性効果（ＣＰＥ）が確認されるまで、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養した。懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、細胞をペレット化するために遠心分離した（３０００ｒｐｍ、１０分間）。遠心分離して得られた上澄み液をバイアル瓶に分注してウイルスストック液とし、－８５℃で保管した。
　ズブチリシン（シグマアルドリッチ社、製品番号Ｐ４８６０、酵素活性≧２．４Ｕ／ｇ、組成（重量体積パーセント）：酵素９％；グリセロール５０％；水４１％）とナットウキナーゼ（富士フイルム和光純薬株式会社、製品番号１４７－０８８０１、活性≧２５０ＩＵ／ｇ、分子量約３１，０００、実験時に１００ｍｇ／ｍＬ　ＤＭＳＯに溶解）はそれぞれ、表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように精製水で調製した。
　試料０．４５ｍＬに０．０５ｍＬのウイルスストック液を加えて室温にて３０分間静置した後、細胞増殖用培地（１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）で１０倍希釈した後、同様に１０２から１０６倍まで細胞増殖用培地で段階希釈した。この段階希釈して得られた液を段階希釈液として用いた。
　あらかじめ細胞増殖用培地を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞）を組織培養用１２ウェルプレート（Ｔｒｕｅ　Ｌｉｎｅ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ　ＴＲ５００１）内で１ウェル当たり４×１０５の細胞数に播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１日間培養した。
　段階希釈液を０．３ｍＬずつ１ウェルの細胞に接種し、再度ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で１時間培養し、１ｍＬの細胞増殖用培地で２回洗浄後、積層用培地（１％ＣＭＣ加２％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地、ナカライテクノ）を重層させた。
　ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２日間培養した後、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で固定および染色を行い、プラーク数を測定した。測定したプラーク数を式（（ウェルあたりのプラーク数／ウェルあたりの測定検体の体積（ｍＬ））×希釈倍率＝ＰＦＵ／ｍＬ）に当てはめ、ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。
　表１に示す通り、ズブチリシンを投与することによって（試料＃２）、ズブチリシンを投与しないものと比較して（試料＃１）、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。さらに、表２に示す通り、ナットウキナーゼを投与することによって（試料＃４）、ズブチリシンを投与しないものと比較して（試料＃３）、ウイルス力価が大きく低下することが分かった。
　つまり、ズブチリシンおよびナットウキナーゼは、それぞれ単独で抗ウイルス効果を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例２＞ズブチリシンまたはナットウキナーゼを使用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値での評価）
　ズブチリシンまたはナットウキナーゼが、抗ネコカリシウイルス活性を有するかを確認した。
　この試験は複数回行っており、それぞれ表３または４で示される混合濃度で試料を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、３０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
　あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　細胞培養用マイクロプレート　ポリスチレン製　平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値を測定した。
　ズブチリシンを用いた場合、陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は２．９低下した。また、ナットウキナーゼを用いた場合も、陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は最大で１．５低下した（表６、ナットウキナーゼ（１０００ｐｐｍ））。すなわち、ズブチリシンとナットウキナーゼは単独で抗ウイルス活性を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実施例３＞トリプシンを使用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値での評価）
　トリプシンが、抗ネコカリシウイルス活性を有するか調べた。トリプシン、ブタ脾臓由来（富士フイルム和光純薬、製品番号２０９－１９１８２、ロット番号ＳＥＧ１８７５）を、５００μｇ／ｍＬになるようにＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で調製した。
　実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、１時間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
　あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　細胞培養用マイクロプレート　ポリスチレン製　平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値を測定した。
　表７に示す通り、トリプシンを使用した場合のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は３．９であり、陰性対照（６．８）と比較して２．９低下しており、トリプシンは単独で抗ウイルス活性を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜実施例４＞細胞毒性試験
　実施例１で用いたズブチリシンを０．５～５０００μｇ／ｍＬの濃度となるように、１０％ウシ胎仔血清加ダルベッコ改変イーグル培地で適宜希釈し、４８ウェルプレートで培養したＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清中に添加した。７２時間後に、細胞数を測定し、当業者に既知の方法により５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を求めた。
　２回の細胞数測定値を平均した値を用いた場合のＣＣ５０は、ズブチリシンが４．６μｇ／ｍＬであった。
＜実施例５＞抗マウスノロウイルス活性試験
　実施例１で用いたズブチリシンをＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈することにより、最終濃度の４倍希釈液に調製した。
　マウスノロウイルスのストック液は次の方法により調製した。１×１０６細胞／ｍＬのＲＡＷ２６４．７細胞を、１００ｍｍディッシュ（１ディッシュあたり１０ｍＬ）に加えて、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。培地は、１０％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭを使用した。翌日、マウスノロウイルス（ＭＮＶ　Ｓ７－ＰＰ３株）のウイルス液を０．１ＰＦＵ／細胞に調製し、上記の細胞に１ディッシュあたり１ｍＬ加え、室温で１時間感染させた。維持培地（１％ウシ胎仔血清加ＤＭＥＭ）を１ディッシュあたり５ｍＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。翌日、ＣＰＥ（ウイルス感染による細胞変性効果）が細胞全体に出現していることを確認の上、懸濁液を５０ｍＬチューブに入れ、４℃で１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。その上清を１．５ｍＬのマイクロチューブに適宜（０．１～１ｍＬ）分注してウイルスストック液とし、－８０℃で保存した。
　ウイルスストック液をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈して２×１０５ＰＦＵ／ｍＬのウイルス力価に調製した。
　９６ウェルプレートの各ウェルに、上記調製したズブチリシンまたはＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）を４０μＬ、および上記調製したウイルスストック液を４０μＬ（計８０μＬ／ウェル）加え、室温で３０分間～１時間放置した。その後、各ウェルから１０μＬ取り出し、すぐにＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で１００倍希釈し、１００μＬ回収した。その希釈液を２４ウェルプレートに単層状に培養したＲＡＷ２６４．７細胞に接種し、プラーク用培地を重層した。当業者に既知の方法により、培養２日後に細胞を固定し、ゲンチアナ紫（クリスタルバイオレット）溶液で染色し、その後プラーク数を測定した。表８に示す通り、ズブチリシンを単独で使用することにより、陰性対照と比較して、１時間後のプラーク数が少なくなることが分かった。
　つまり、ズブチリシンは単独で抗ウイルス効果を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜実施例６＞セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤を使用した時の抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値での評価）
　セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤が、抗ネコカリシウイルス活性を有するかを確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表９から１１で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように精製水で調製した。
　この試験は複数回行っており、それぞれ表９から１１で示される濃度で試料を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜精製水で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、１０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
　あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　細胞培養用マイクロプレート　ポリスチレン製　平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値を測定した。
　各種セリンプロテアーゼ製剤を用いた場合、陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は２．２以上の低下を示し、プロチンＳＤ－ＡＹ１０では最大で４．０低下した（表１２～１４）。すなわち、市販の各種セリンプロテアーゼ製剤は単独で抗ウイルス活性を有することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
＜実施例７＞各ｐＨにおける抗ネコカリシウイルス活性試験（ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値での評価）
　ズブチリシンあるいはセリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤の、各ｐＨにおける抗ネコカリシウイルス活性を確認した。セリンプロテアーゼ溶液は、表１５または１６で示される酵素製剤を用い、それぞれ表中の各試験区の所定の終濃度（体積パーセント濃度）になるように、それぞれ表中に記載のｐＨに調整済みのＰＢＳ（－）（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０～７．５、ｐＨ９．０）で調製した。
　この試験は複数回行っており、それぞれ表１５および１６で示される濃度で試料を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　実施例１で使用したネコカリシウイルス液のウイルスストック液を、希釈率１０倍以下かつ陰性対照のｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値が６を下回らないように、適宜ＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）で希釈し、ウイルスストック液とセリンプロテアーゼ溶液を１：９の体積比で混合し、１０分間室温でインキュベートした。インキュベート後の培養上清をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）によって希釈し、１００～９倍の段階希釈液を作成した。
　あらかじめ細胞増殖用培地（５％ウシ胎仔血清加イーグル最小必須培地、シグマアルドリッチ社）を用いて、感染細胞（ＣＲＦＫ細胞ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－９４）を組織培養用９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　細胞培養用マイクロプレート　ポリスチレン製　平底）内で１ウェル（細胞増殖用培地０．０５ｍＬ）当たり２×１０４の細胞数になるよう播種し、ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した。インキュベート後、各ウェルの培地を取り除かずに、段階希釈液を１ウェルあたり０．０５ｍＬずつ添加して混合することでウイルス液を細胞に接種した。ＣＯ２インキュベーターによって、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で２～３日間培養し、顕微鏡によって細胞変性を確認し、当業者に既知の方法により、ｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値を測定した。
　ズブチリシンを用いた場合、ｐＨ７．１において陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．３以上では３．８以上低下した（表１７）。また、プロチンＳＤ－ＡＹ１０を用いた場合、ｐＨ７．１において陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は１．１以上の低下を示し、ｐＨ７．２以上では２．１以上低下した（表１７）。さらに、ビオプラーゼＯＰを用いた場合、ｐＨ７．３において陰性対照と比較してｌｏｇ　ＴＣＩＤ５０値は１．５以上の低下を示し、ｐＨ７．５以上では３．０以上低下した（表１８）。すなわち、ズブチリシンの場合、好ましくはｐＨ７．０以上、より好ましくはｐＨ７．３～９．０程度で効果的に使用でき、各種セリンプロテアーゼおよび各種セリンプロテアーゼを含有する市販の酵素製剤において、抗ウイルス活性に対するｐＨの至適領域が異なるため、適宜ｐＨを調整すること、用途に応じてセリンプロテアーゼ製剤を選定することが好ましいことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　本発明によれば、ノンエンベロープ型ウイルスに対して不活化効果を発揮し、かつ手指への適用や経口摂取も可能な安全性の高い、新規な抗ウイルス剤が提供されるため、非常に有用である。

Claims (9)

  1. 　セリンプロテアーゼを含む、ノンエンベロープ型ウイルスに対して使用される、抗ウイルス剤であって、
    　前記セリンプロテアーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌またはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が産生するものである、またはトリプシンである、抗ウイルス剤。
  2. 　前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである、または
    　前記Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌が、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓである、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
  3. 　前記セリンプロテアーゼが、配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１～７の何れかで表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列を有し、かつ抗ウイルス活性を有するタンパク質である、請求項１又は２に記載の抗ウイルス剤。
  4. 前記セリンプロテアーゼが、ズブチリシンまたはナットウキナーゼである、請求項１～３の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
  5. 前記ノンエンベロープ型ウイルスが、ノロウイルスである、請求項１～４の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
  6. 噴霧剤の形態である、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ウイルス剤。
  7. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を塗布してなる、繊維製品。
  8. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を含有する、飲食品組成物。
  9. 請求項１～５の何れか一項に記載の抗ウイルス剤を含有する、食品洗浄処理剤。
PCT/JP2021/018456 2020-05-15 2021-05-14 抗ウイルス剤 WO2021230359A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022522222A JPWO2021230359A1 (ja) 2020-05-15 2021-05-14

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020086140 2020-05-15
JP2020-086140 2020-05-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021230359A1 true WO2021230359A1 (ja) 2021-11-18

Family

ID=78524567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/018456 WO2021230359A1 (ja) 2020-05-15 2021-05-14 抗ウイルス剤

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021230359A1 (ja)
WO (1) WO2021230359A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04500518A (ja) * 1988-09-08 1992-01-30 パブリツク　ヘルス　ラボラトリー　サービス　ボード ウィルス感染の治療と予防の方法および組成物
JP2005095112A (ja) * 2003-08-19 2005-04-14 Mitsubishi Heavy Ind Ltd ウイルス不活化剤およびウイルス不活化方法、該不活化剤を備えたフィルター、並びに該フィルターを具備する空気調和機
CN1860870A (zh) * 2006-06-07 2006-11-15 南京医科大学 胰蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用
JP2016013976A (ja) * 2014-07-01 2016-01-28 小林製薬株式会社 経口組成物
JP2021500935A (ja) * 2018-12-01 2021-01-14 浙江大学Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ トリプシン含有止血織物及びその製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04500518A (ja) * 1988-09-08 1992-01-30 パブリツク　ヘルス　ラボラトリー　サービス　ボード ウィルス感染の治療と予防の方法および組成物
JP2005095112A (ja) * 2003-08-19 2005-04-14 Mitsubishi Heavy Ind Ltd ウイルス不活化剤およびウイルス不活化方法、該不活化剤を備えたフィルター、並びに該フィルターを具備する空気調和機
CN1860870A (zh) * 2006-06-07 2006-11-15 南京医科大学 胰蛋白酶作为有机杀虫剂降解剂的应用
JP2016013976A (ja) * 2014-07-01 2016-01-28 小林製薬株式会社 経口組成物
JP2021500935A (ja) * 2018-12-01 2021-01-14 浙江大学Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ トリプシン含有止血織物及びその製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NIKOLIC TANJA, MILANOVIC JOVANA, KRAMAR ANA, PETRONIJEVIC ZIVOMIR, MILENKOVIC LJUBISA, KOSTIC MIRJANA: "Preparation of cellulosic fibers with biological activity by immobilization of trypsin on periodate oxidized viscose fibers", CELLULOSE, SPRINGER NETHERLANDS, NETHERLANDS, vol. 21, no. 3, 1 June 2014 (2014-06-01), Netherlands , pages 1369 - 1380, XP055871969, ISSN: 0969-0239, DOI: 10.1007/s10570-014-0171-0 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021230359A1 (ja) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2540307B1 (en) Antibacterial auxiliary agent comprising kombu extract as active ingredient, antibacterial composition, and food or beverage
KR101761379B1 (ko) 다기능 신규 균주 락토바실러스 사케이 k040706 및 이의 배양 방법
KR101870960B1 (ko) 락토바실러스 사케이 k040706을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물
JP4874532B2 (ja) 睡眠改善剤
JP2020515296A (ja) 終末糖化産物の低減活性を有する新規な菌株およびその用途
KR101959730B1 (ko) 항균 활성을 갖는 스타필로코커스 갈리나럼 균주 및 이의 항균 용도
KR101806720B1 (ko) 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 황기 뿌리 배양액의 리스테리아 항균조성물
KR101869740B1 (ko) 최종당화산물 저감 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 파라카제이 균주 및 이의 용도
WO2005007640A1 (ja) ウィルス感染症の予防または治療用組成物
KR101467698B1 (ko) 백수오 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도
KR102178350B1 (ko) 항균 활성을 갖는 바실러스 사펜시스 균주 및 이의 항균 용도
KR101865461B1 (ko) 항균 활성을 가지는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 조성물
WO2021230359A1 (ja) 抗ウイルス剤
KR101869739B1 (ko) 최종당화산물 저감 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 펜토서스 균주 및 이의 용도
WO2006132223A1 (ja) 抗高血圧組成物
KR102159379B1 (ko) 장 부착능 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 srcm101371 균주 및 이의 용도
JP7327661B2 (ja) 抗ウイルス剤
WO2019167789A1 (ja) 抗ウイルス剤
KR101776511B1 (ko) 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 향나무 열매 배양액의 리스테리아 항균조성물
JP6661597B2 (ja) α−グルコシダーゼ阻害剤
EP4317173A1 (en) Peptide and composition containing peptide as active ingredient
JP2004083526A (ja) 抗ウイルス組成物
JP7231313B2 (ja) 血圧を降下させるための組成物
KR101915304B1 (ko) 아이스플랜트 추출물을 포함하는 식중독균 저해용 항균 조성물
KR101959729B1 (ko) 항균 활성을 갖는 바실러스 퍼밀러스 균주 및 이의 항균 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21804326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022522222

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21804326

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1