CN113397081A - 一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种ε‑聚赖氨酸‑阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：（1）原料制备：取ε‑聚赖氨酸和阿拉伯胶粉末，溶解、过滤后稀释制得稀释液备用；（2）离子交联：取步骤（1）中ε‑聚赖氨酸和阿拉伯胶稀释液，放置于磁性搅拌器上室温混合搅拌；（3）热诱导：取步骤（2）离子交联后的ε‑聚赖氨酸‑阿拉伯胶溶液，进行水浴加热；（4）超声：取步骤（3）热诱导后的ε‑聚赖氨酸‑阿拉伯胶溶液，超声破碎制得纳米颗粒溶液；（5）干燥成品：取步骤（4）超声后的ε‑聚赖氨酸‑阿拉伯胶纳米颗粒溶液，喷雾干燥或冷冻干燥，即得所述ε‑聚赖氨酸‑阿拉伯胶纳米颗粒成品。通过本发明，提高了纳米颗粒的包封效率，改善了ε‑聚赖氨酸的利用率。
Description
技术领域
本发明涉及一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，属于纳米颗粒制备技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸是一种少见的天然阳离子聚酰胺，由25-30个L-赖氨酸残基组成。它是一种由丝状细菌和其他细菌菌株或真核生物产生的细胞外物质。ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母和霉菌具有广谱抗菌活性，并具有高安全性、水溶性、生物降解性和热稳定性，在食品和饮料产品中具有很大的应用潜力，可防止微生物生长引起的腐败。但是ε-聚赖氨酸的阳离子性质在一些食品和饮料体系中应用时可能会产生问题，如它在食品基质中与带有阴离子成分化合物形成不溶性沉淀，导致产品浑浊度增加或沉积物的形成。另外，其高吸湿性也使其在应用中遇到许多问题。阿拉伯胶具有高度异质性，它由多种阴离子多糖和少量蛋白质组分的混合物组成。阿拉伯胶的分子量为22～30万，它具有良好的成膜性能，可以在ε-聚赖氨酸表面形成保护膜，有助于保护其活性。
目前，解决ε-聚赖氨酸生物活性降低的方法也有相关报道，如专利CN112715644A，通过ε-聚赖氨酸与壳寡糖复配降低皇冠梨鸡爪病发病率；专利CN112126222A通过与季铵盐类化合物复配提高ε-聚赖氨酸产品稳定性。也有部分期刊论文报道了解决ε-聚赖氨酸生物活性降低的方法，如Chang等,基于阳离子ε-聚赖氨酸和阴离子阿拉伯胶静电复合物的抗菌传递系统[J]食品水胶体,2014,35,137-143；Zhang等,ε-聚赖氨酸与还原糖美拉德反应制备新型食品防腐剂及其性质研究[J],食品科学与技术,2019,54,1824-1835。但是以上方法虽然对ε-聚赖氨酸的稳定性有一定改善，但是对于ε-聚赖氨酸抗菌能力和抗吸湿能力的改善仍旧没有很好的解决方法。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有问题，提供一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，不仅保证了纳米颗粒中ε-聚赖氨酸的包封率，也可以提高ε-聚赖氨酸的抗菌能力和抗吸湿能力。
本发明的目的是这样实现的：一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)、原料制备：取ε-聚赖氨酸粉末和阿拉伯胶粉末，ε-聚赖氨酸粉末溶解、过滤后稀释制得ε-聚赖氨酸稀释液，阿拉伯胶粉末溶解、过滤后稀释制得阿拉伯胶稀释液；
(2)、离子交联：取步骤(1)中ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶稀释液，放置于磁性搅拌器上室温混合搅拌；
(3)、热诱导：取步骤(2)离子交联后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，进行水浴加热；
(4)、超声：取步骤(3)热诱导后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，超声破碎制得纳米颗粒溶液；
(5)、干燥成品：取步骤(4)超声后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒溶液，喷雾干燥或冷冻干燥，即得所述ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒成品。
所述步骤(1)中采用水进行稀释，所述水选自超纯水，稀释液浓度为10mg/mL。
所述步骤(2)中，离子交联条件：浓度比为，ε-聚赖氨酸:阿拉伯胶＝1:1～1:5；pH＝5～9；ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶稀释液在磁性搅拌器上室温混合搅拌时间为1～3h。
所述步骤(3)中，热诱导条件：水浴加热时，加热温度为60～90℃，加热时间为1～5h。
所述步骤(4)中，超声条件为500w、5～10min，超声3～5s，间隔3～5s。
所述步骤(5)中，喷雾干燥的条件为：进风温度120～180℃，出风温度55～85℃。
所述步骤(5)中，冷冻干燥的条件为：-22-18℃、100-200Pa。
本发明结合合理、使用方便，通过本发明，提供的一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，相对于现有技术，具有以下优点：
1.本发明利用ε-聚赖氨酸与阿拉伯胶的离子交联提高了纳米颗粒的包封效率，改善了ε-聚赖氨酸的利用率。
2.本发明利用离子交联联合热诱导方法改善了ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的结构，通过超声破碎使得纳米颗粒粒径大小适中、布分更均匀、结构更紧密。
3.本发明利用构建了离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒，提高了ε-聚赖氨酸的抗菌能力，改善了ε-聚赖氨酸的抗吸湿能力，使得ε-聚赖氨酸在实际应用中有更好的生物活性和稳定性。
技术效果：相对于现有技术，本发明方法制备的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒粒径大小适中、稳定性好，具有良好的功能特性。产品除了具有ε-聚赖氨酸本身的抗菌能力外，阿拉伯胶的包埋改善了其抗菌稳定性，增强了抗菌能力和抗吸湿能力。不仅消除了因与食物中某些阴离子化合物相互作用带来的的ε-聚赖氨酸抗菌能力的降低，同时改善了由于ε-聚赖氨酸强吸湿性给应用带来的不便。
ε-聚赖氨酸是一种少见的天然阳离子聚酰胺，由25-30个L-赖氨酸残基组成。ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母和霉菌具有广谱抗菌活性，并具有高安全性、水溶性、生物降解性和热稳定性，在食品和饮料产品中具有很大的应用潜力，可防止微生物生长引起的腐败。但是，ε-聚赖氨酸在食品基质中与带有阴离子成分化合物形成不溶性沉淀，导致产品浑浊度增加或沉积物的形成。另外，其高吸湿性也使其在应用中遇到许多问题。本发明提供的离子交联-热诱导制备纳米颗粒的技术可以有效改善ε-聚赖氨酸的实际应用缺陷，改善其稳定性和强吸湿性，增强其抗菌能力，为ε-聚赖氨酸、阿拉伯胶在食品、药品等领域的应用提供了参考依据，并带来良好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶的不同配比对纳米颗粒的影响；
图中，上面一排自左向右瓶子的瓶内聚赖氨酸-阿拉伯胶配比分别为1:1-1:10；
下面下一排左向右瓶子的瓶内聚赖氨酸-阿拉伯胶配比分别为1:1-1:10。
图2为纳米颗粒的缓释分析。
图3不同变性剂对ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒浊度的影响。
图4为纳米颗粒的透射电镜图；
图中，A：PG0；B：PGH。
图5纳米颗粒的傅里叶红外光谱图。
图6为纳米颗粒对菌株生长的影响。
图7为样品吸湿状态变化。
图8为样品吸湿率变化。
图9为鱼肉储藏期间菌落总数的变化。
图10为鱼肉储藏期间脂肪氧化的变化。
图11为鱼肉储藏期间硬度的变化。
具体实施方法
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
实施例1
ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备与表征，具体包括如下步骤：
(1)纳米颗粒制备；
①原料制备：取ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶粉末，溶解、过滤后制得稀释液备用；
②离子交联：ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶稀释液，调整二者浓度比为1:4，pH为5，放置于磁性搅拌器上室温混合搅拌1h；
③热诱导：取离子交联后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，在90℃下进行水浴加热3h；
④超声：取热诱导后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，以500w的功率超声破碎10min制得纳米颗粒溶液；
⑤干燥成品：取超声后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒溶液，在-18℃、200Pa条件下冷冻干燥成粉末，即得所述ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒成品。
(2)包封率测定；
标准曲线绘制方法：配制2mg/mLε-聚赖氨酸溶液，用超纯水稀释至质量浓度为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液中。取0.2mL标准溶液，加入0.8mL 0.5mmol/L甲基橙溶液；30℃条件下振荡反应30min，8390g离心力离心10min；上清稀释10倍，用紫外分光光度计在465nm测定吸光值；以超纯水作为空白对照。
样品前处理：取样品8390g离心10min，弃去沉淀，将上清液倒入10KDa超滤管中，8000g离心20min，得到滤过液进行包封率测定。
测定样品包封率：0.2mL待测样品混入0.8mL 0.5mmol/L甲基橙溶液；30℃振荡30min，吸光度测定方法同上；参照标准曲线计算ε-聚赖氨酸含量。每组样品进行三次测量。
包封率(％)＝(C0-C1)/C0×100％。(1)
式中：C0是初始ε-聚赖氨酸浓度；C1是所测上清液ε-聚赖氨酸浓度。
(3)粒径和多分散性指数(PDI)的测定方法
利用粒度分析仪Zetasizernanoos 90测定晶粒粒径、多分散性系数(PDI)和zeta电位。将1mL样品置于Marvin测量池中，温度设置为25℃。由相关函数得到尺寸分布，使用Malvern Zetasizer软件7.03进行数据分析。对于所有的实验，测量是在三次；每次测量包括12个独立的运行，持续10s，平衡时间120s前测量。
(4)缓释能力测定；
考察两种纳米颗粒中ε-聚赖氨酸在不同贮藏时间的释放情况，并以不同时间段溶液中的ε-聚赖氨酸浓度为考察指标。
(5)实验结果；
表1配比对ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的影响
由图1可知，ε-聚赖氨酸：阿拉伯胶超过6以后，纳米颗粒溶液24h储存会出现沉淀现象。这表明阿拉伯胶添加过多，会导致纳米颗粒稳定性下降。
右表1可知，ε-聚赖氨酸：阿拉伯胶在1:4、1:5时，其PDI小于0.3，分散稳定性较好，而此时纳米颗粒的粒径为202.3、265.6nm。包封率基本都在90％左右。
表2加热时间对ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的影响
由表2可知，不同发加热时间对纳米颗粒的影响不同，包封率都在90％以上，粒径在179.4～268.2nm之间，PDI在加热3h时最小，为0.165。
表3加热温度对ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的影响
由表3可知，加热温度超过70℃后，包封率在90％以上；粒径变化区间为169.3～253.6nm；PDI在90℃时最小。
缓释情况如图2所示，纳米颗粒中ε-聚赖氨酸随着时间的延长不断释放，在196h时，两种颗粒分别释放59.3％、52.6％，证明纳米颗粒具有一定的缓释能力。
实施例2
ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备与表征，具体包括如下步骤：
(1)纳米颗粒制备；
按照实例1中方法制备ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒溶液。
(2)分子间作用力分析；
通过测量浊度的方法，比较不同变性剂处理后纳米颗粒溶液的浊度变化。
结果如图3所示，在不添加变性剂的情况下，制备的纳米颗粒PG0、PGH溶液浊度较高，为94.3％、95.5％。加入变性剂后，DTT处理组的PG0、PGH基本没有变化，而尿素、NaCl和SDS处理组浊度发生了显著变化，浊度分别为4.6％、27.5％、39.3％，14.1％、40.6％、52.4％；说明纳米颗粒PG0、PGH的主要作用力为氢键、静电相互作用和疏水相互作用，其中氢键起主导作用，而且PGH作用力强度要高于PG0。
(3)TEM观察ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒；
应用透射电子显微镜(TEM，Tecnai 12，Philips)观察纳米颗粒的微观结构。样品在100千伏加速电压下进行，样品用1.5％磷钨酸水溶液染色，将样品分散液滴在铜栅格上进行TEM观察。
透射电镜如图4所示，图A是离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒，图B是离子交联的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒，经过热诱导的纳米颗粒形状规则，分布均匀，结构紧密，具有核壳结构。
(4)傅里叶红外光谱；
应用FT-IR分光光度计(Nicolet Nexus 670)对纳米颗粒化学组成进行分析。
结果如图5所示，ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PGH)在3350cm-1、2940cm-1、1050cm-1处的峰值偏移、增强。证明纳米颗粒的成功制备。
实施例3
ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的抗菌实验，具体包括如下步骤：
(1)制备菌液；
将沙门氏菌接种于LB液体培养基中，于37℃摇床200rpm条件下震荡培养24h，获取对数生长期的菌悬液。
(2)纳米颗粒制备；
按照实例1中方法制备ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒溶液。
(3)最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)测定；
通过使用微量肉汤稀释法对4株细菌菌株计算最小抑菌浓度、最小杀菌浓度，将MIC评估为抑制细菌生长的最低ε-聚赖氨酸浓度，MBC评估为完全杀死细菌的最低ε-聚赖氨酸浓度。
(4)时间抑菌曲线测定；
细菌悬液在LB肉汤中稀释至浓度为5×105CFU/mL，加入1MIC纳米颗粒溶液，然后在37℃下孵育。分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h和24h监测培养过程中细菌计数的变化。
(5)实验结果；
表1纳米颗粒对四株细菌的MIC、MBC；
结果如表1所示，离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PGH)的MIC、MBC在四株菌的实验中，相较于游离ε-聚赖氨酸明显下降，证明其抗菌活性要强于游离ε-聚赖氨酸。
结果如图6所示，当初始接种量为105CFU/mL时，离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒抗菌效果显著优于其他处理组。与游离ε-聚赖氨酸(ε-PL)和离子交联的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PG0)相比，离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PGH)的抗菌活性更持久。添加纳米颗粒后，培养24h后细菌不生长，离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒对沙门氏菌有较强的抑制作用。
实施例4
ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的抗吸湿能力、pH稳定性测定，具体包括如下步骤：
(1)纳米颗粒制备；
按照实例1中方法制备ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒粉末。
(2)抗吸湿性测定；
恒温恒湿箱中调节温度25±1℃，相对湿度(RH)控制在60％。精确测量ε-聚赖氨酸、阿拉伯胶，纳米颗粒PG0和PGH，并加入称重瓶中。分别在放置后的12h、24h、36h、48h不同时间点将样品放入上述烘干机中测量质量。计算吸湿率：
吸湿率(％)＝100×(Mn-M0)/M0。(2)
式中：Mn是放置恒温恒湿箱n小时后样品重量；M0是放置恒温恒湿箱前的重量。
如图7、图8所示，随着时间的推移，ε-聚赖氨酸(ε-PL)吸收的水分越来越多，最终导致凝结现象的发生，由粉末状变成块状，吸湿率达到87％；阿拉伯胶(GA)具有很强的抗吸湿性，在48h时含水率仅为5.3％，仍保持干粉状态；离子交联的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PG0)和离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒(PGH)粉末在不同贮存时间后的吸水率与ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶存在差异，随着时间的变化，在48h时的含水率分别为为13.2％、15.6％。
(3)纳米颗粒pH稳定性
调整纳米颗粒溶液的pH，测定其在不同pH条件下的残留率、粒径、PDI来反应纳米颗粒的稳定性。
表4 pH对ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的影响
由表4可知，pH≥7以后，纳米颗粒内的ε-聚赖氨酸释放速率加快，在pH＝11时，ε-聚赖氨酸残留率仅为34.2％，而酸性条件下，纳米颗粒的残留率还是在90％以上；而碱性条件下的PDI普遍大于0.3，只有pH＝5时PDI为0.182，粒径也最小为203.6nm。
实施例5
ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的鱼肉保鲜能力测定，具体包括如下步骤：
(1)纳米颗粒制备；
按照实例1中方法制备ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒。
(2)鱼肉保鲜实验；
通过测定鱼肉中微生物菌落总数的变化、鱼肉脂肪氧化的变化和鱼肉硬度的变化，确定鱼肉的腐败情况。鱼肉切成约2g的鱼块，储藏条件为4℃，实验组鱼块分别浸渍于1MICε-聚赖氨酸、纳米颗粒PG0和PGH溶液中，对照组浸渍于无菌水中。微生物菌落总数采用平板涂布计数，脂肪氧化利用比色法，硬度利用质构仪测定。
(3)实验结果；
结果如图9所示，添加纳米颗粒的处理组的菌落总数在第7天时为5.7log CFU/g，仍未超过水产品中二级品的标准，而游离ε-聚赖氨酸处理组和对照组的菌落总数分别为10、7.02log CFU/g，已经不满足新鲜鱼肉的标准；如图10所示，对照组和游离ε-聚赖氨酸处理组相比，添加纳米颗粒的处理组TBARS值分别下降0.219、0.189mg/kg，其鱼肉脂肪氧化的变化更加缓慢；如图11所示，对照组和游离ε-聚赖氨酸处理组硬度分别下降123.1N、105.8N，添加纳米颗粒的处理组，其鱼肉硬度在7天内下降45.8N。证明离子交联-热诱导的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒可以对鱼肉起到一定的防腐保鲜作用。
Claims (7)
1.一种ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、原料制备：取ε-聚赖氨酸粉末和阿拉伯胶粉末，ε-聚赖氨酸粉末溶解、过滤后稀释制得ε-聚赖氨酸稀释液，阿拉伯胶粉末溶解、过滤后稀释制得阿拉伯胶稀释液；
（2）、离子交联：取步骤（1）中ε-聚赖氨酸稀释液和阿拉伯胶稀释液，放置于磁性搅拌器上室温混合搅拌；
（3）、热诱导：取步骤（2）离子交联后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，进行水浴加热；
（4）、超声：取步骤（3）热诱导后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶溶液，超声破碎制得纳米颗粒溶液；
（5）、干燥成品：取步骤（4）超声后的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒溶液，喷雾干燥或冷冻干燥，即得所述ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒成品。
2. 根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中采用水进行稀释，所述水选自超纯水，稀释液浓度为10 mg/mL。
3. 根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，离子交联条件：浓度比为，ε-聚赖氨酸:阿拉伯胶=1:1~1:5；pH=5~9；ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶稀释液在磁性搅拌器上室温混合搅拌时间为1~3 h。
4. 根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，热诱导条件：水浴加热时，加热温度为60~90℃，加热时间为1~5 h。
5. 根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，超声条件为500 w、5~10 min，超声3~5 s，间隔3~5s。
6.根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，喷雾干燥的条件为：进风温度120~180℃，出风温度55~85℃。
7. 根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸-阿拉伯胶纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，冷冻干燥的条件为：-22-18℃、100-200 Pa。
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