CN115777862A - 一种ε-聚赖氨酸包覆方法、ε-聚赖氨酸包覆物及抗菌应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品添加剂领域，具体涉及一种ε‑聚赖氨酸包覆方法、ε‑聚赖氨酸包覆物及抗菌应用。所公开的方案主要为采用大豆卵磷脂和胆固醇膜材对ε‑聚赖氨酸包覆，之后利用壳聚糖乙酸水溶液进行修饰。本发明使用天然抗菌物质和无毒材料制得，利用脂质体的封装保护和控制ε‑聚赖氨酸释放特性，减少果汁食品成分与ε‑聚赖氨酸的相互作用，发挥其长效抑菌性能，且提高了果汁产品的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种ε-聚赖氨酸包覆方法、ε-聚赖氨酸包覆物及抗菌应用。
背景技术
ε-聚赖氨酸(Epsilon-poly-lysine，EPL)为白色链霉菌需氧发酵产生的一种阳离子肽，由25～35个赖氨酸单体在α-羧基和ε-氨基间形成酰胺键，脱水缩合而成。其外观为白色或淡黄色粉末，水溶性好，热稳定性强。由于ε-聚赖氨酸安全性高，同时具有高效和广谱抑菌性，因此常作为防腐剂应用于食品保鲜中。
目前已有相关报道证明，ε-聚赖氨酸可以用于乳制品、肉制品、谷物和果蔬制品中以防止细菌、霉菌和酵母等多种微生物污染。但当其应用于液态食品如果汁中时，易与产品中的活性成分相互作用而产生沉淀，且抗菌效果不理想。
发明内容
针对现有技术的缺陷补不足，本发明方面提供了一种ε-聚赖氨酸包覆方法。
为此，本发明所提供的ε-聚赖氨酸包覆方法包括：
步骤一，将大豆卵磷脂和胆固醇溶于乙醇中混匀后去除乙醇形成磷脂薄膜材；
步骤二，将ε-聚赖氨酸和步骤一所制得的磷脂薄膜材溶于水中超声处理后得到ε-聚赖氨酸中间包覆物；
步骤三，将步骤二所制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物中加入壳聚糖乙酸水溶液并混匀。
可选的方案中，所述ε-聚赖氨酸中间包覆物以滴加的方式加入壳聚糖乙酸水溶液中。
可选的方案中，以质量百分比100％计，所制备的ε-聚赖氨酸包覆物中各物质的含量为，ε-聚赖氨酸：0.02％～0.1％，大豆卵磷脂：1.6％～2％，胆固醇：0％～0.4％，壳聚糖：0.025％～0.1％，其余为水。
可选的方案中，所述的大豆卵磷脂和胆固醇在乙醇中两者的质量和浓度为10mg/mL，步骤二中ε-聚赖氨酸在水中的质量浓度为0.2～1.0mg/mL，所述的壳聚糖乙酸水溶液中壳聚糖的质量浓度为0.5～2mg/mL，乙酸水溶液质量百分比浓度1％。
本发明还涉及上述方法制备的ε-聚赖氨酸包覆物以及该ε-聚赖氨酸包覆物作为食品抗菌剂的应用。
本发明进一步提供了一种果汁。所提供的果汁中添加有本发明的ε-聚赖氨酸包覆物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明针对ε-聚赖氨酸抗菌活性的问题，引入改性壳聚糖，充分利用两种天然抗菌资源的协同抑菌效果，提高脂质体的抗菌能力；同时，改性壳聚糖分子通过静电相互作用吸附在脂质体表面，显著提高了脂质体的稳定性，进一步拓展了其应用范围。
(2)本发明针对ε-聚赖氨酸应用于果汁体系中产生沉淀的问题，合理利用脂质体系统封装，减少了ε-聚赖氨酸与果汁成分直接作用，在一定程度上对ε-聚赖氨酸起到保护与控制释放作用。
附图说明
图1：本发明实施例制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物的表观形貌(a)及原子力显微镜微观结构(b)；
图2：本发明实施例制备的ε-聚赖氨酸包覆物及相关对照结果表征图谱；
图3：本发明实施例制备的未修饰ε-聚赖氨酸包覆物(a)和ε-聚赖氨酸包覆物(b)的透射电镜形貌表征；
图4：本发明实施例游离ε-聚赖氨酸、未修饰ε-聚赖氨酸包覆物、和ε-聚赖氨酸包覆物的缓释效果对比；
图5：本发明实施例游离ε-聚赖氨酸(a)、未修饰ε-聚赖氨酸包覆物(b)和ε-聚赖氨酸包覆物(c)对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3923的生长抑制情况；
图6：本发明实施例未修饰ε-聚赖氨酸包覆物和ε-聚赖氨酸包覆物添加量对果汁透光率的影响；
图7：本发明实施例未修饰ε-聚赖氨酸包覆物和ε-聚赖氨酸包覆物添加量对果汁离心沉淀率的影响。
具体实施方式
除非有特殊说明，本文中的科学与技术术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但不是用来限制本发明的范围。需要说明的是，以下实施例涉及的温度、浓度是近似值，用于说明目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施，但下文描述了部分适合的方法和材料。另外，所述物料用量、温度、溶剂和反应时长等仅是示例性的，而并不意欲进行限制。具体方案中，本领技术人员可以根据本发明所公开内容采用常规实验时段对方法中所涉及的物质配比、浓度、温度、溶剂、反应物加入顺序、物料加入方式进行优化以实现本发明的目的。如无特别说明，以下实施例中所用原料均为市售产品。
本发明以包封率、粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位对包覆效果进行评价。包封率直接反映生物活性物质在脂质体中的封装效果，包封率越大则封装量越高，脂质体制备越成功；粒径反映脂质体大小，纳米级别的粒径通常具有更好的稳定性；PDI反映微粒在体系中的分散情况，PDI值越低(＜0.3)，说明体系分散程度越好，分散均匀；电位反映微粒带电情况，电位绝对值越高，体系所带同种电荷量越多，体系越稳定。本发明中包封率、粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位的评价方法如下：
(1)ε-聚赖氨酸的定量
通过甲基橙比色确定ε-聚赖氨酸的定量方法。具体的，配制不同浓度梯度的ε-聚赖氨酸标准溶液，与甲基橙溶液等量混合，震荡，离心取上清，稀释后于465nm处测定其吸光值，作标准曲线y＝-3.3357x+0.5113(R2＝0.9992,0～0.1mg/mL)。
(2)包封率的测定方法
通过超滤离心法测定包覆方法的包封率。具体的，将ε-聚赖氨酸含量为C1的脂质体加入超滤离心管中，于离心力4000g下离心30min，取外管溶液测定ε-聚赖氨酸含量，即为未包封的游离ε-聚赖氨酸含量C2。
包封率＝[(C1-C2)/C1]×100％
(3)粒径、PDI和Zeta电位的测定方法
包覆物的粒径、PDI和zeta电位通过动态光散射(DLS)测定。
实施例1：
在本实施例中，ε-聚赖氨酸脂质体中大豆卵磷脂含量为1.8％，胆固醇含量为0.2％，ε-聚赖氨酸含量为0.02％、0.04％、0.06％、0.08％和0.1％，其余为水。
具体方法是：
将0.09g大豆卵磷脂和0.01g胆固醇溶于10mL无水乙醇中，减压蒸发去除乙醇形成磷脂薄膜，于干燥器内静置一夜；
在60℃下，分别用5mL的不同浓度ε-聚赖氨酸水溶液(pH 6.5，浓度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL)冲洗磷脂薄膜，搅拌30min得到多个ε-聚赖氨酸粗包覆物；
所得粗包覆物在400W下超声处理5min(1s开1s关)以降低尺寸，超声处理后得到ε-聚赖氨酸中间包覆物。
对该实施例所制备的中间包覆物的包封率、粒径、PDI和Zeta电位进行检测，结果如表1所示。
表1
实施例2：
在本实施例中，ε-聚赖氨酸脂质体中大豆卵磷脂含量为2％、1.9％、1.8％、1.7％和1.6％，对应胆固醇含量为0％、0.1％、0.2％、0.3％和0.4％，ε-聚赖氨酸含量为0.04％，其余为水。
具体操作方法是：
将多组大豆卵磷脂和胆固醇(大豆卵磷脂和胆固醇共0.1g，其中各组胆固醇占比量分别是0％，5％，10％，15％，20％)分别溶于10mL无水乙醇中，减压蒸发去除乙醇形成磷脂薄膜，于干燥器内静置一夜；
在60℃下，采用5mL 0.4mg/mL的ε-聚赖氨酸水溶液(pH 6.5)冲洗磷脂薄膜，搅拌30min得到ε-聚赖氨酸粗包覆物。
分别对所得粗包覆物在400W下超声处理5min(1s开1s关)以降低尺寸，超声处理后得到多组ε-聚赖氨酸中间包覆物。
对该实施例所制备的中间包覆物的包封率、粒径、PDI和Zeta电位进行检测，结果如表2所示。
表2
实施例3：
在本实施例中，ε-聚赖氨酸脂质体中大豆卵磷脂含量为1.9％，胆固醇含量为0.1％，ε-聚赖氨酸含量为0.04％，其余为水。
具体操作方法为：
将0.095g大豆卵磷脂和0.005g胆固醇溶于10mL无水乙醇中，减压蒸发去除乙醇形成磷脂薄膜，于干燥器内静置一夜；
在60℃下，采用5mL 0.4mg/mLε-聚赖氨酸水溶液(pH 6.5)冲洗磷脂薄膜，搅拌30min得到ε-聚赖氨酸粗包覆物。
对所得中间包覆物在340W下超声处理分别处理不同时长(5，10，15，20，25min(1s开1s关))以降低尺寸，超声处理后得到多组ε-聚赖氨酸中间包覆物。
对该实施例所制备的中间包覆物的包封率、粒径、PDI和Zeta电位进行检测，结果如表3所示。
表3
实施例4：
在本实施例中，ε-聚赖氨酸脂质体中大豆卵磷脂含量为1.9％，胆固醇含量为0.1％，ε-聚赖氨酸含量为0.04％，其余为水。
具体操作方法如下：
将0.095g大豆卵磷脂和0.005g胆固醇溶于10mL无水乙醇中，减压蒸发去除乙醇形成磷脂薄膜，于干燥器内静置一夜；
在60℃下，分别用不同pH值、5mL 0.4mg/mLε-聚赖氨酸水溶液(pH 6.5，5.5，4.5，3.5)冲洗磷脂薄膜，搅拌30min得到不同ε-聚赖氨酸粗包覆物。
分别对所得粗包覆物在340W下超声处理5min(1s开1s关)以降低尺寸，超声处理后得到ε-聚赖氨酸中间包覆物。
对该实施例所制备的中间包覆物的包封率、粒径、PDI和Zeta电位进行检测，结果如表4所示。
表4
对实施例4中pH为6.5组制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物进行微观结构观察，观察其表观与微观形貌，具体是取10μL稀释后的ε-聚赖氨酸中间包覆物滴加于云母片上，静置过夜待其完全干燥，于原子力显微镜下观察其微观形貌，结果如图1所示，如图1可以看出，所制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物均匀、透光、稳定，微观结果显示其形成了球形囊泡结构。
实施例5：
在本实施例中，ε-聚赖氨酸脂质体中大豆卵磷脂含量为0.95％，胆固醇含量为0.05％，ε-聚赖氨酸含量为0.02％，壳聚糖含量为0.025％、0.05％和0.1％，其余为水。
具体操作如下：
壳聚糖溶液的制备：将一定量壳聚糖粉末添加于1％(v/v)的乙酸溶液中，搅拌至完全溶解，分别配制浓度为0.5、1.0、2.0mg/mL的壳聚糖溶液；
ε-聚赖氨酸包覆物的制备：将等体积实施例4中pH 6.5组制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物分别逐滴加至上述不同浓度的壳聚糖溶液中；同时将等体积实施例4中pH 6.5组制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物逐滴加至1％乙酸溶液中制备未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物；
上述滴加过程在搅拌下进行，添加完成后继续搅拌至30min，得到该实施例的多组ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物；同时制备不含ε-聚赖氨酸与壳聚糖的空白脂质体作为对照组。
对该实施例所制备的ε-聚赖氨酸包覆物、未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物和对照组的包封率、粒径、PDI和Zeta电位进行检测，结果如表5所示，经过壳聚糖修饰后，ε-聚赖氨酸包覆物的包封率显著提高，粒径增加13～18％，整体小于100nm，PDI均在0.31以下，显示出较好的稳定性。经过壳聚糖修饰后，Zeta电位由负值转变为正值，说明带正电的壳聚糖通过静电作用附着在负电磷酸基团上，成功修饰在ε-聚赖氨酸脂质体表面。
表5
结构表征
采用傅里叶变换红外光谱仪研究实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物(壳聚糖/ε-聚赖氨酸脂质体)、未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物(未修饰的ε-聚赖氨酸脂质体)、对照组(空白脂质体)、壳聚糖粉末、ε-聚赖氨酸粉末的结构性质：
具体是分别各将样品经冷冻干燥后，采用溴化钾压片法，扫描范围为400～4000cm-1,分辨率为4cm-1；
结果如图2所示，在ε-聚赖氨酸粉末光谱中，位于3000cm-1至3600cm-1处的宽峰对应胺(-NH2，-NH-)的重叠峰，位于1663cm-1、1560cm-1和1248cm-1的宽峰依次代表C＝O拉伸、-CO-NH-弯曲和C-N拉伸，分别对应于ε-聚赖氨酸的酰胺I、II和III吸收带；
在对照组(空白脂质体)光谱中，位于3453cm-1、1733cm-1、1465cm-1处的特征峰对应为O-H、C＝O的拉伸和CH2基团的剪切振动，位于1236cm-1和1089cm-1处的特征峰对应磷脂中-PO2的不对称和对称拉伸；
ε-聚赖氨酸经过包封后，未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物的红外光谱与空白脂质体相似，ε-聚赖氨酸的特征峰(1663cm-1和1560cm-1处)消失，这表明ε-聚赖氨酸被包覆。
在壳聚糖粉末光谱中，位于800cm-1至1200cm-1处的一系列峰为碳水化合物特征峰，位于1660cm-1和1592cm-1的特征峰分别对应于壳聚糖中C＝O拉伸和N-H弯曲，位于890cm-1处的弱峰是β-(1,4)糖苷键的特殊吸收峰，位于1080cm-1和1157cm-1处的特征峰对应壳聚糖中C-O拉伸振动，位于3300cm-1附近的峰对应壳聚糖中的氢键O-H或N-H的拉伸振动；
通过对比ε-聚赖氨酸包覆物与壳聚糖粉末光谱，发现3300cm-1附近的特征峰向更高的波数移动(从3303cm-1到3405cm-1)。这一结果证实了-OH基团和-NH基团之间的相互作用，说明壳聚糖成功地修饰在脂质体表面。
进一步对实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物进行微观形貌观察、稳定效果评价、缓释效果评价、抑菌效果评价。
微观形貌观察：
对实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物进行微观形貌观察：
取一滴稀释后的ε-聚赖氨酸包覆物加至铜网上，采用2％的磷钨酸负染90s，干燥后于透射电子显微镜下观察其微观形貌。同时观察未修饰的未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物作为对照。
结果如图2所示，所得脂质体均呈球形囊泡状结构，对照组脂质体囊泡边界平滑，经过壳聚糖修饰后边界粗糙，表面有附着物形成。
稳定效果评价
对实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物进行稳定效果评价：
各待测样品于4℃下贮藏30天，每五天取样测定其粒径和PDI，同时测定未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物作为对照。
结果如表6所示，在任一时间ε-聚赖氨酸包覆物的粒径均大于对照组，且随时间逐渐增加。贮藏30d后，ε-聚赖氨酸包覆物粒径增加了8.87％，对照组粒径增加了11.11％。在贮藏前期(前15d)，ε-聚赖氨酸包覆物和对照组粒径变化无显著性差异。此外，所有样品PDI均小于0.3，显示较好的分散结果。
表6
缓释效果评价
对实施例5 0.5 mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物进行缓释效果评价：
分别取一定量包覆物(ε-聚赖氨酸含量为M)加入透析袋，并浸入10倍体积的磷酸盐缓冲液(50 mM，pH 6.5)中；于100 rpm、37℃下搅拌24 h，并在0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12和24 h时取一定量透析袋外液测定其ε-聚赖氨酸含量Mn，计算其累计释放率；每次取样后补充等量磷酸盐缓冲液； 同时测定相同浓度的游离 ε-聚赖氨酸释放情况作为对照组。
累计释放率＝(Mn/M)×10×100％
如图4所示，游离ε-聚赖氨酸释放速度较快，且在第12 h释放率高达98％；经过壳聚糖修饰后， ε-聚赖氨酸的释放率显著变缓；在第1 h时， ε-聚赖氨酸包覆物中的ε-聚赖氨酸释放率低于20％，显著小于未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物以及游离ε-聚赖氨酸。这表明壳聚糖涂层可以有效控制释放进程。
最小抑菌浓度研究
采用二倍稀释法分别测定壳聚糖、 ε-聚赖氨酸、实施例5 0.5 mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3923的最小抑菌浓度(MIC)。
具体将以上四种待测样品加入到脂环酸芽孢杆菌的AAM悬浮液中(菌种初始浓度为105～106CFU/mL)，调整抗菌剂最终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10mg/L(两种包覆物的浓度以其ε-聚赖氨酸含量计算)；于45℃、120rpm下培养24h，无微生物生长的浓度为其MIC。
结果如表7所示，ε-聚赖氨酸包覆物对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3923的MIC为0.625mg/L，低于壳聚糖、ε-聚赖氨酸和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物，这表明壳聚糖包覆后具有更高的抗菌性能，同时也体现了壳聚糖和ε-聚赖氨酸具有良好的抗菌协同作用。
表7
对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3923的生长抑制情况研究
通过平板计数法分别判断ε-聚赖氨酸、实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物对酸土脂环酸芽孢杆菌DSM3923的生长抑制情况。
具体的，将上述三种待测样品分别加入到酸土脂环酸芽孢杆菌DSM3923的AAM悬浮液中(菌种初始浓度为105～106CFU/mL)，调整各样品最终浓度为0.5MIC、MIC、2MIC和4MIC；于45℃、120rpm下培养5天，每天同一时间取样涂布，在45℃下培养24～48小时后计数；测定不含样品的菌液生长情况作为对照组。
如图5所示，酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3923的初始菌种量为5.26Log CFU/mL。对照组培养24小时后达到7Log CFU/mL以上，并在随后5天内逐渐减少；当添加量为4MIC时，ε-聚赖氨酸处理组中DSM 3923的数量在第3天下降到3.64Log CFU/mL，然后增加到4.07LogCFU/mL，说明ε-聚赖氨酸不能发挥持续抑菌作用；与ε-聚赖氨酸处理组相比，ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物组中DSM 3923菌种量在培养期间显著减少，添加量为4MIC时，菌落数分别达到1.92Log CFU/mL和2.99Log CFU/mL。结果显示菌种量在培养期间没有回升趋势，说明脂质体具有缓释和长期抗菌作用。
果汁透光率与离心稳定性研究
对ε-聚赖氨酸、实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物对果汁品质影响进行研究：添加不同剂量待测样品于市售苹果汁中，各待测样品设置多个不同浓度：果汁中ε-聚赖氨酸浓度分别为5、10、15、20mg/L；所有样品在4℃下静置24h。
结果显示：添加有ε-聚赖氨酸的苹果汁均发生沉淀；
未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物无沉淀产生；ε-聚赖氨酸包覆物在高剂量(＞10mg/L)下产生少量丝状聚合物。
进一步对实施例5 0.5mg/mL组制备的ε-聚赖氨酸包覆物和未修饰的ε-聚赖氨酸包覆物对果汁品质影响进行研究：
添加不同剂量待测样品于市售苹果汁中，各待测样品设置多个不同浓度：果汁中ε-聚赖氨酸浓度分别为5、10、15、20mg/L；所有样品在4℃下静置24h；
之后于5000rpm下离心15min，取其上清测定透光率(λ＝625nm)，取其沉淀质量为M1，原果汁质量为M2，计算离心沉淀率。
离心沉淀率＝(M1/M2)×100％
如图6所示，随着脂质体添加量增加，果汁透光率有下降趋势，但均保持在92％以上，具有较好的透光效果；当添加量为10mg/L时，透光率大于95％，符合国家标准规定。如图7所示，脂质体添加量对果汁离心沉淀率无显著差异。
对比例：
该对比例与实施例5 0.5mg/mL组不同的是，分别采用四种溶液替换实施例50.5mg/mL组中的壳聚糖乙酸溶液制备修饰制备四种不同材料修饰ε-聚赖氨酸包覆物：四种溶液分别为：
羧甲基壳聚糖溶液的制备：将一定量羧甲基壳聚糖粉末溶于蒸馏水中，搅拌至完全溶解，配制浓度为0.5mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液；
羧甲基纤维素钠溶液的制备：将一定量羧甲基纤维素钠粉末溶于蒸馏水中，搅拌至完全溶解，配制浓度为0.5mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液；
果胶溶液的制备：将一定量果胶粉末溶于蒸馏水中，搅拌至完全溶解，配制浓度为0.5mg/mL的果胶溶液；
海藻酸钠溶液制备：将一定量海藻酸钠粉末溶于蒸馏水中，搅拌至完全溶解，配制浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液。
所得包覆物结果如表8所示，均无法得到稳定且均匀的体系。
表8
| 不同溶液 | 脂质体外观 |
| 羧甲基壳聚糖溶液 | 产生白色颗粒状沉淀 |
| 羧甲基纤维素钠溶液 | 产生白色絮状沉淀 |
| 果胶溶液 | 产生黄色胶状沉淀 |
| 海藻酸钠溶液 | 产生白色颗粒状沉淀 |
Claims (7)
1.一种ε-聚赖氨酸包覆方法，其特征在于，方法包括：
步骤一，将大豆卵磷脂和胆固醇溶于乙醇中混匀后去除乙醇形成磷脂薄膜材；
步骤二，将ε-聚赖氨酸和步骤一所制得的磷脂薄膜材溶于水中超声处理后得到ε-聚赖氨酸中间包覆物；
步骤三，将步骤二所制备的ε-聚赖氨酸中间包覆物中加入壳聚糖乙酸水溶液并混匀。
2.根据权利要求1所述的ε-聚赖氨酸包覆方法，其特征在于，所述ε-聚赖氨酸中间包覆物以滴加的方式加入壳聚糖乙酸水溶液中。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以质量百分比100％计，所制备的ε-聚赖氨酸包覆物中各物质的含量为，ε-聚赖氨酸：0.02％～0.1％，大豆卵磷脂：1.6％～2％，胆固醇：0％～0.4％，壳聚糖：0.025％～0.1％，其余为水。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大豆卵磷脂和胆固醇在乙醇中两者的质量和浓度为10mg/mL，步骤二中ε-聚赖氨酸在水中的质量浓度为0.2～1.0mg/mL，所述的壳聚糖乙酸水溶液中壳聚糖的质量浓度为0.5～2mg/mL，乙酸水溶液质量百分比浓度1％。
5.权利要求1-4任一权利要求所述制备方法制备的ε-聚赖氨酸包覆物。
6.权利要求5所述ε-聚赖氨酸包覆物作为食品抗菌剂的应用。
7.一种果汁，其特征在于，所述果汁中添加有权利要求5所述的ε-聚赖氨酸包覆物。
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