KR101257222B1 - 미생물에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다.
나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.

Description

미생물에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물{Antibiotic peptides having an antibiotics and comprising antibiotic composition thereof}
본 발명은 미생물에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생능을 갖는 LPcinⅠ 펩타이드 중 일부 아미노산을 결실 및/또는 치환하여 항생능을 현저하게 증대시킨 LPcinⅠ 펩타이드 유래의 미생물에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물에 관한 것이다.
미생물의 침입에 대한 곤충의 방어기작에 관한 연구결과로부터 누에 애벌레에서 새로운 펩타이드 항생제인 세크로핀이 발견된 이래, 생리활성 물질로서 펩타이드의 중요성이 크게 인식되었다. 최근 수 년 간의 연구결과 거의 모든 고등생물이 병원성 미생물에 대한 방어수단으로서 면역체계와 별도의 항생 펩타이드를 체내에 축적하거나 분비하는 것으로 알려졌다. 현재까지 약 2,000 종 이상의 펩타이드 항생제가 발견되고 있으며, 이들 펩타이드들 은 발견된 종마다 그 아미노산 조성이 상이하지만 항생 작용기작은 유사한 것으로 알려지고 있다. 대표적인 항생 펩타이드로 세크로핀(cecropin), 머게이닌(magainin), 봄비닌(bombinin), 디펜신(defensin), 타키플레신(tachyplesin) 및 부포린(buforin) 등이 알려졌는데, 이들 항생 펩타이드들은 공통적으로 17-24개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 그람 음성균 및 그람 양성균뿐만 아니라 원핵생물 또는 곰팡이 등에 대해서도 항생력을 가지며, 일부는 암세포와 바이러스에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 상기 펩타이드 항생제 중 머게이닌은 양서류 표피에서 분리된 23개의 아미노산 조성을 갖는 펩타이드(Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp5449-5453, 1987)로서, 병원균뿐 아니라 인체 폐암세포에도 작용하는 것으로 보고되었다. 또한, 항생 펩타이드의 대부분은 특이적으로 세포에 작용하여 목적세포를 신속하게 죽이고, 대부분 넓은 범위에서 활성 스펙트럼을 나타낸다(Park, C.B. et al., Biochem. Biophys. Res.Comm., 218,pp408-413, 1996).
상기 항생 펩타이드들은, 첫째, 광범위한 미생물에 대하여 강력한 항생력을 가지며, 둘째, 숙주세포는 파괴하지 않으면서 외부에서 침입한 병원균에만 작용하여 인체에 무해한 항생물질로서 작용하며, 셋째, 미생물의 내성유발이 문제시되고 있는 종래의 항생제와는 전혀 다른 활성기작으로 항생활성을 나타내므로 내성유발 가능성이 적고, 넷째, 글리코실레이션(glycosylation)과 같은 2차 변형(secondary modification)이 없기 때문에 유전자 조작을 통하여 대량 생산할 수 있으며, 다섯째, 열, 산 또는 알칼리 등에 강한 이화학적 안정성을 가지고 있기 때문에 제약 및 식품분야에서의 산업적 이용성이 매우 크다는 장점을 갖는다.
현재까지 보고된 항생 펩타이드의 작용기작은 크게 두 가지로 분류된다. 첫째, 대부분의 항생 펩타이드들은 균의 세포막의 투과성을 증가시켜 막전위를 파괴하고 세포대사를 멈추게 하는 작용기작을 갖는다. 둘째, 이 외의 소수의 항생 펩타이드들은 균 세포 내로 침투하여 DNA 또는 RNA와 결합하여 전사(transcription) 또는 번역(translation)을 억제하는 강력한 작용기작을 나타낸다.
이들 항생 펩타이드들의 활성에 중요하다고 알려진 구조적인 요소로서는 다음과 같은 것들이 있다: 첫째, 양친매성 나선구조(amphipathic helix), 둘째, 상기 나선구조를 안정화시키는 잔기들의 분포, 셋째, 염기성 잔기들의 분포, 넷째, 소수성 잔기들의 분포, 다섯째, 전하를 띠는 잔기들과 나선구조의 쌍극자 간의 상호작용, 및 여섯째, 반대 전하를 띠는 잔기들 간의 염다리를 들 수 있다.
한편, 소의 우유에 존재하는 락토포리신 (LPcin-I)은 23 개의 아미노산 잔기를 가진 양이온, 양친매성 펩타이드로 PP3의 카르복시 말단 113 ~ 135 영역이다. LPcin-I은 그람-양성균과 그람-음성균 둘 다의 성장을 억제하지만 200 μM이하의 농도에서 용혈작용이 나타나지 않는다. LPcin-I과 반대로, PP3의 아미노산 119 ~ 135 영역에 해당하는 LPcin-II는 항생기능이 없다고 알려져 있다.
그런데 항생능이 있는 것으로 알려진 LPcin-I은 이를 상업화하기 위하여 야생형 LPcin-I보다 높은 항생능 및 제조원가를 낮추기 위하여 보다 짧은 아미노산 서열로 이루어진 항생 펩타이드를 제조하는 기술개발이 절실하게 요청되었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 23개의 아미노산으로 이루어진 야생형 락토포리신 (LPcin-I) 항생 펩타이드에 비하여, 아미노산 서열의 개수는 적으면서도 항생력이 현저하게 향상된 미생물에 대한 항생활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 것이다.
발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 미생물에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표현되는 펩타이드를 제공한다.
[일반식 Ⅰ]
[(N-말단)-N X1 V K E X2 I K Y L K S L F S H A F E V V K T-(C-말단)]
여기에서, X1 은 T 또는 염기성 아미노산이고;
X2 는 T 또는 무극성 아미노산이며,
상기 X1 및 X2 가 모두 T이면 C-말단으로부터 8개 아미노산(H A F E V V K T)가 결실된 펩타이드임.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 염기성 아미노산은 리신(K)이며, 상기 무극성 아미노산은 트립토판(W)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 C-말단으로부터 8개 이하의 아미노산이 결실된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 11 및 서열번호 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생 펩타이드 조성물을 제공한다.
본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다.
또한 항생펩타이드는 drug delivery과정에서 아미노산 길이가 짧을 수록 생체 내에서 소화 되지 않고 필요한 곳까지 운반되기 용이하다.
나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.
도 1a는 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)으로 구성되는 5종의 미생물에 대하여 항생활성시험을 수행하여 9시간이 경과한 사진이며, 도 1b는 12시간 경과후 사진이고, 도 1c는 12시간 경과 후 항생활성결과를 나타내는 사진이다. 도 1d는 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)으로 구성되는 5종의 미생물에 대하여 LP1-T2KT6W-C8)의 항균실험결과사진이다.
도 2는 LPcin-I 항균펩타이드 및 실시예 5, 11, 12의 항균펩타이드의 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 소의 우유에 존재하는 락토포리신 (LPcin-I)은 23 개의 아미노산 잔기를 가진 양이온, 양친매성 펩타이드로 PP3의 카르복시 말단 113 ~ 135 영역이다. LPcin-I은 그람-양성균과 그람-음성균 둘 다의 성장을 억제하지만 200 μM이하의 농도에서 용혈작용이 나타나지 않는다.그런데 항생능이 있는 것으로 알려진 LPcin-I은 이를 상업화하기 위하여 야생형 LPcin-I보다 높은 항생능 및 제조원가를 낮추기 위하여 보다 짧은 아미노산 서열로 이루어진 항생 펩타이드를 제조하는 기술개발이 절실하게 요청되었다.
이에, 본 발명의 일실시예에 따른본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 미생물에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표현되는 펩타이드를 제공하여 상술한 문제의 해결을 도모하였다. 이를 통해 본 발명의 항생 펩타이드 및 이를 포함하는 항생 펩타이드 조성물은 23개의 아미노산 서열로 이루어진 항생능을 가지는 야생형 LPcin-I에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다. 나아가, 야생형 LPcin-I에 비하여 아미노산의 개수가 적으므로 합성이 용이할 뿐 아니라 생산비용을 절감하는데 매우 유리하다.
[일반식 Ⅰ]
[(N-말단)-N X1 V K E X2 I K Y L K S L F S H A F E V V K T-(C-말단)]
여기에서, X1 은 T 또는 염기성 아미노산이고;
X2 는 T 또는 무극성 아미노산이며,
상기 X1 및 X2 가 모두 T이면 C-말단으로부터 8개 아미노산(H A F E V V K T)가 결실된 펩타이드임.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글라이신 G
히스티딘 H 이소루신 I
루신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
한편, 본 발명에서 무극성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 페닐알라닌, 트립토판(W), 메티오닌, 시스테인, 프롤린으로 구성된다. 극성 아미노산은 세린, 트레오닌(T), 티로신, 아스파라긴, 글루타민으로 구성된다. 산성 아미노산은 아스파라트산, 글루탐산으로 구성되며, 염기성 아미노산은 리신(K), 아르기닌, 히스티딘으로 구성되며, 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 염기성 아미노산은 리신(K)이며, 상기 무극성 아미노산은 트립토판(W)일 수 있다.
한편, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 C-말단으로부터 8개 이하의 아미노산이 결실된 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 서열번호 5, 12로 표시되는 항균 펩타이드들은 서열번호 1로 표시되는 23개의 아미노산으로 이루어진 LPcin-I에 비하여 C-말단으로부터 8개 아미노산 잔기(H A F E V V K T)가 결실된 항균 펩타이드들이며, 이들 서열번호 5, 12로 이루어진 항균펩타이드는 야생형 LPcin-I(서열번호 1)에 비하여 현저하게 우수한 항균활성을 나타낸다(실험예 1 참조).
발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 5, 서열번호 11 및 서열번호 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것이 제작비용을 절감하고 우수한 항균활성을 나타내는데 매우 유리하다(실험예 1 참조).
한편 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 서열번호 1로 표시되는 23개의 아미노산으로 이루어진 LPcin-I 펩타이드는 통상의 펩타이드 합성방법을 통해 제작될 수 있으며, 구체적으로 자동 펩타이드 합성기를 통해 제작되거나, 재조합 발현벡터를 제작하고 이를 정제하여 제작될 수 있으며, 재조합 발현벡터를 통해 LPcin-I 항생 펩타이드를 합성하는 방법에 관한 한국특허출원 제2008-130593호는 본 발명에 참조로서 삽입된다. 또한, Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하는 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성할 수 있다(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963).
또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 서열번호 2 ~ 12로 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 서열번호 1의 항생 펩타이드의 제작과 마찬가지로 통상의 방법에 의해 제작할 수 있다. 이를 통해 제작된 본 발명의 항생 펩타이드들은 그람(+)균주, 그람(-)균주 등에 대하여 높은 항생 활성을 가지며 이들의 대표적인 균주인 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)에 대하여 높은 항생활성을 가지나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 항생제, 항진균제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 외상치료제, 안약 및 의약품
보존제의 첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 본발명의 항생 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는
충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용할 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들을 약제로 사용할 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드의 유효용량은 0.1∼3 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투
여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항생 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 조성물을 제공한다. 이 경우 유효용량은 사료 1㎏에 대하여 0.01∼100㎎이 함유될 수 있으며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 한정되지 않는다.
<실시예 1> 신규한 항균 펩타이드의 제조
자동 펩타이드 합성기(Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 하기 표 1에 기재된 서열의 펩타이드들을 합성하고, 이들 합성된 펩타이드들을 preparative 역상 고분해능 액체 크로마토그래피(Shiseido capcell pak C18 column을 사용한 Shimadzu Prominence HPLC)를 이용하여 순수분리하였다.
No Peptide Size Sequence
1 LP1-C0(서열번호 1) 23mer NTVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKT
2 LP1-C2(서열번호 2) 21mer NTVKE TIKYL KSLFS HAFEV V
3 LP1-C4(서열번호 3) 19mer NTVKE TIKYL KSLFS HAFE
4 LP1-C6(서열번호 4) 17mer NTVKE TIKYL KSLFS HA
5 LP1-C8(서열번호 5) 15mer NTVKE TIKYL KSLFS
6 LP1-C10(서열번호 6) 13mer NTVKE TIKYL KSL
7 LP1-T6W(서열번호 7) 23mer NTVKE WIKYL KSLFS HAFEV VKT
8 LP1-T2W(서열번호 8) 23mer NWVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKT
9 LP1-T2,6W(서열번호 9) 23mer NWVKE WIKYL KSLFS HAFEV VKT
10 LP1-T2K(서열번호 10) 23mer NKVKE TIKYL KSLFS HAFEV VKT
11 LP1-T2K,T6W(서열번호 11) 23mer NKVKE WIKYL KSLFS HAFEV VKT
12 LP1-T2K,T6W-C8(서열번호 12) 15mer NKVKE WIKYL KSLFS
상기 표 1에서 1번은 23개 아미노산 서열을 가지는 야생형 LPcin-I 항생 펩타이드이고, 2번 내지 6번은 상기 1번의 C-말단에서 아미노산을 2개씩 제거한 펩타이드 서열이다.
7번 내지 11번은 1번 아미노산 서열에서 2번 또는 6번째 아미노산을 K 또는 W로 치환한 펩타이드 서열이며, 서열번호 12는 11번의 아미노산 서열에서 C-말단에서 8개의 아미노산을 결실시킨 펩타이드 서열이다.
<시험예 1> 항균활성측정
상기 실시예 1에서 합성한 1 ~ 12번의 12개의 펩타이드에 대하여 항생활성을 측정하였다. 구체적으로 미생물에 대한 항생 활성은 Mueller-Hinton agar (Difco)를 사용하여 수행했다. 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)의 다섯 가지의 미생물에 대해 agar hole diffusion 테스트에 기초했다. 접종원은 37℃ , tryptic soy broth 5 ml에서 박테리아를 하룻밤 동안 배양하는 것으로 준비했다. 현탁액의 혼탁 정도는 600 nm에서 분광 광도계로 0.5 표준탁도액과 같게 최종농도를 조절했다. 20 ml의 Mueller-Hinton agar를 φ90 mm의 세포 배양 플레이트에 도포했다. Agar 플레이트에 멸균된 spreader를 사용하여 30 ul의 박테리아 현탁액을 접종시켰다. 접종된 agar 플레이트는 30분 동안 상온에서 말렸다. 항생펩타이드들은 10 ug/ul의 농도로 멸균물에 녹이고, agar 플레이트 표면에 20 ul의 용액을 떨궜다. 상온에서 1 시간 동안 pre-diffusion을 시킨 뒤, 플레이트들을 37 ℃에서 15 시간 동안 배양했다. 시간에 따른 항생 정도를 비교하기 위해 9 시간, 12 시간 15 시간의 agar hole을 기록했다. 박테리아 군에 대한 항생 펩타이드들의 민감도는 박테리아 생장을 억제하는 영역의 크기와 없앤 정도에 의해서 결정했다. 측정은 2 번 반복하여 얻었다.
도 1a 내지 도 1c는 각각 9시간, 12시간 및 15시간이 경과한 후 관찰한 agar hole diffusion 테스트 결과를 나타내는 사진이다. 이 중 LP1-tag는 한국특허출원 제2008-130593호에 기재된 방법에 따라 발현 및 정제한 LPcinⅠ 펩타이드(23 mer)이다.
변형시킨 시퀀스 중에서는 LP1-T2W, LP1-T6W, LP1-T2K, LP1-T2K,T6W가 항생 활성을 나타내는 것을 보인다. 길이가 짧은 시퀀스의 펩타이드는 5 가지 박테리아 군 중에 Listeria , P. aeruginosa, Salmonella, E. coli에 대해 강한 항생활성을 나타내는 구멍을 보이고 하나의 종(S. aureus)에 대해서 약한 항생 활성을 보인다. 변형된 시퀀스의 펩타이드들은 Salmonella와 E. coli에 강한 활성을 보이고 Listeria와 S. aureus에는 약한 항생 활성을 보이며 펩타이드 자체가 물에 잘 녹지 않아 불투명한 hole을 만든다.
이를 종합적으로 관찰하면, 서열번호 5로 표시되는 15개의 아미노산으로 구성된 항균펩타이드(LP1-C8(NTVKE TIKYL KSLFS), 야생형 LPcin-I 펩타이드 서열에서 2번째 T가 K로 치환되고 6번째 T가 W로 치환된 서열번호 11로 표시되는 항균 펩타이드(LP1-T2K,T6W(NKVKE WIKYL KSLFS HAFEV VKT) 및 상기 서열번호 11로 이루어진 항균펩타이드의 C-말단에서 8개의 아미노산이 결실된 항균 펩타이드(LP1-T2KT6W-C8(NKVKE WIKYL KSLFS)의 항균능이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
도 1d는 두 개의 그람-양성균(Listeria innocua MC2 KCTC 3658 and Staphylococcus aureus ATCC 6538)과 세 개의 그람-음성균(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella ATCC 19430, Escherichia coli KCTC 1682)으로 구성되는 5종의 미생물에 대하여 LP1-T2KT6W-C8)의 15시간 경과 후 항균실험결과 사진이다. 이를 통해 LP1-T2KT6W-C8 항균 펩타이드(서열번호 12)가 야생형 LPcin-I과 서열번호 5인 항균펩타이드(LP1-C8(NTVKE TIKYL KSLFS), 서열번호 11로 표시되는 항균 펩타이드(LP1-T2K,T6W(NKVKE WIKYL KSLFS HAFEV VKT)에 비하여 그람(+) 및 그람(-) 균주에 대하여 현저하게 높은 항균활성을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
도 2에서 알 수 있듯이, 상기 선택된 세 개의 펩타이드에 대한 helical wheel 패턴은 기존의 LPcin 시퀀스보다 친수성과 소수성 부분의 구분이 뚜렷하게 구분되는 것을 알 수 있다.
<시험예 2> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 실시예 1에서 제조한 12개의 항생 펩타이드를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 실험군당 2 마리씩의 동물에 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 본 발명의 항생 펩타이드를 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 항생 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내며 인체에 안전하므로 사료첨가제. 식품방부제, 화장품 및 의약품 보존제, 상처치료 촉진제, 외상치료제, 구강청정제 및 안약 등의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Hankuk University Of Foreign Studies Research and Industry-University Cooperation Foundation <120> Antibiotic peptides having an antibiotics and comprising antibiotic composition thereof <130> HPC2434 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Bos indicus <400> 1 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-C2 <400> 2 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val 20 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-C4 <400> 3 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-C6 <400> 4 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-C8 <400> 5 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-C10 <400> 6 Asn Thr Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T6W <400> 7 Asn Thr Val Lys Glu Trp Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T2W <400> 8 Asn Trp Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T2,6W <400> 9 Asn Trp Val Lys Glu Trp Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T2K <400> 10 Asn Lys Val Lys Glu Thr Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T2K,T6W <400> 11 Asn Lys Val Lys Glu Trp Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser His 1 5 10 15 Ala Phe Glu Val Val Lys Thr 20 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LP1-T2K,T6W-C8 <400> 12 Asn Lys Val Lys Glu Trp Ile Lys Tyr Leu Lys Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15

Claims (6)

  1. 미생물에 대한 항생활성을 갖는 하기 서열 일반식 Ⅰ로 표현되는 펩타이드.
    [일반식 Ⅰ]
    [(N-말단)-N X1 V K E X2 I K Y L K S L F S H A F E V V K T-(C-말단)]
    여기에서, X1 은 T 또는 리신(K)이고;
    X2 는 T 또는 트립토판(W)이며,
    상기 X1 및 X2 가 모두 T이면 C-말단으로부터 10개 이하의 아미노산(F S H A F E V V K T)가 결실된 펩타이드임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 5 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제1항 또는 제4항의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생 펩타이드 조성물.
  6. 미생물에 대한 항생활성을 갖는 서열번호 12로 표현되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
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