KR101993987B1 - 트랜스-2-노네날에 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 - Google Patents

트랜스-2-노네날에 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 파지 디스플레이를 이용하여 선별하였고, 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 및 이를 이용한 악취 제거 방법에 관한 것이다.

Description

트랜스-2-노네날에 결합하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 {Trans-2-nonenal binding peptide and An composition for removing aldehyde-based odor containing the peptide}
본 발명은 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 파지 디스플레이를 이용하여 선별하였고, 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 및 이를 이용한 악취 제거 방법에 관한 것이다.
트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)은 9개의 탄소와 1개의 이중결합을 가지는 지방성의 불포화알데히드이다. 알데히드 계열의 악취는 ppm, ppb 단위의 극미량에서도 지독하게 느껴질 만큼 불쾌한 냄새를 가지는 것을 특징으로 한다. 다음의 트랜스-2-노네날은 노인성 악취의 주원인으로 알려져 있으며 최근에는 식품, 주정 등에서 산화취로 검출되고 있다.
우리나라는 2000년도에 고령화비 7.2%로 UN기준에서 고령화사회에 진입했고, 2020년경에는 14%가 넘는 고령화비로 고령사회에 들어설 것으로 예상되고 있다. 40세 이상부터 신체의 노화에 따라 신진대사 능력이 감소하여 지방산 등의 산화로 생성되어 축적되는 트랜스-2-노네날은 요즘과 같이 활동적인 삶을 누리는 중장년층에게는 말 못할 고민이라 할 수 있다. 외적으로 중시되는 제품, 즉 여성의 전유물로 여겨졌던 많은 제품들이 현 고령화 사회에 있어서 남성들 그리고 연령별 층으로 나뉘어 출시될만큼 급속도로 성장추세에 있다.
식품, 주정에서 발생하는 산화취는 젖은 종이, 기저귀, 가죽, 소독약 등의 냄새로 느껴지며 사람에 따라서는 ‘썩은 내’로 인지될 수 있다. 최근에는 맥주에서의 산화취가 논란이 되기도 했으며 이는 맥주의 원료인 맥아의 지방성분과 맥주 속 용존 산소가 산화 반응을 일으켜 산화취의 원인 물질인 트랜스-2-노네날이 생성되는 것으로 알려져 있다.
상기와 같이 트랜스-2-노네날는 노인성 악취 및 식품의 이취의 원인 되므로, 상기 트랜스-2-노네날을 제거하기 위해 많은 연구가 되고 있다. 가장 일반적인 방법으로 트랜스-2-노네날을 제거하기 위해 화학물질을 처리해 왔다. 그러나 트랜스-2-노네날을 처리하기 위한 화학물질의 남용은 안정성 문제가 제기될 수 있으며, 처리에 있어서 환경적으로도 안전하지 못하는 단점이 있다. 또한 화학물질의 경우 일시적인 방편일 뿐 당일에도 시간에 따라 감소되어 연속적으로 사용해야 하는 번거로움이 있다. 또한, 기존의 트랜스-2-노네날과 관련한 화장품, 의약품 등은 고가로 판매되고 있기 때문에 보다 값싼 원료 및 높은 효율을 가지는 처리제의 개발이 요구 되어 왔다. 국내에서는 ‘노인성 체취의 원인물질인 노네날 제거용 식물추출 조성물’(출원번호:1020120003624)와 ‘2-노네날 제거용 탈취제 및 이를 포함하는 탈취 필터’(출원번호:1020100095210)와 같은 특허들이 출원되어 있지만, 효율이 낮은 단점이 있었다. 따라서, 본 발명자들은 트랜스-2-노네날을 경제적으로, 환경적으로, 효율성 높게 제거하기 위해 연구를 한 결과, 파지 디스플레이를 이용하여 트랜스-2-노네날에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별함으로써, 본 발명을 완성 시켰다.
본 발명은 9개의 탄소와 1개의 이중결합을 가지는 지방성의 불포화알데히드로서, 극미량에서도 불쾌한 냄새를 가지는 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 트랜스-2-노네날 (Trans-2-nonenal)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 파지 디스플레이를 이용하여 선별하였고, 상기 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물 및 이를 이용한 악취 제거 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 조성물이 고정된 비드를 포함하는 알데히드계 악췌 제거 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 조성물을 포함하는 노인성 체취 제거용 소취제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 조성물을 포함하는 식품 이취 제거용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 알데하이드계 악취를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 키트를 시료에 접촉시켜 반응 시키는 단계; 및
상기 반응한 시료로부터 상기 키트를 분리하는 단계.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 알데하이드계 악취 제거 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 알데하이드계 악취의 원인 물질은 노네날, 옥타날, 노나날 및 데카날으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 조성물이 고정된 비드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 비드는 자성 비드일 수 있다.
본 발명은 또 다른 목적을 달성하기 위해, 전술한 조성물을 포함하는 노인성 체취 제거용 소취제 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 전술한 조성물을 포함하는 식품 이취 제거용 조성물을 제공 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 식품은 맥주일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해 하기의 단계를 포함하는 알데하이드계 악취를 제거하는 방법을 제공할 수 있다:
상기 키트를 시료에 접촉시켜 반응 시키는 단계; 및
상기 반응한 시료로부터 상기 키트를 분리하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 알데하이드계 악취의 원인 물질은 노네날, 옥타날, 노나날 및 데카날으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
파지 디스플레이에 의해 선별된 펩타이드는 적은 양으로 트랜스-2-노네날을 높은 효율로 제거할 수 있으며, 생물학적 소재를 이용하기 때문에 친환경 적이고, 경제제거인 악취 처리효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 파지디스플레이(Phage display) 전체에 대한 설명을 보여주는 모식도이다.
도 2는 trans-2-nonenal 코팅을 확인하기 위해 Vibrio fischeri 발광을 측정한 결과이다.
도 3은 패닝 횟수에 따라 선별되고 증폭되는 파지의 수를 나타내는 결과이다.
도 4는 선별된 펩타이드의 서열을 정리한 결과이다.
도 5는 ELISA 분석에 의해 선별된 파지와 trans-2-nonenal의 친화력을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 펩타이드를 비드에 고정화한 후 trans-2-nonenal에 처리한 뒤, HPLC로 정량을 실시한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 트랜스-2-노네날은 높은 효율로 제거하며, 경제적이고, 안저성이 높은 새로운 물질을 확보하기 위해, 트랜스-2-노네날을 고정화하여 파지디스플레이 스크리닝을 실시하였다. 파지디스플레이는 ‘New England Biolabs Inc.’의 Ph.D.-12 라이브러리를 이용하였다. 5회의 파지디스플레이 패닝과정을 통해 trans-2-nonenal에 특이적인 파지를 선별하였고 그 친화력을 확인하였다. 이후 선별된 파지의 DNA 분석을 통해서 특이적인 서열을 확인한 후 펩타이드를 제작하였으며 이렇게 제작된 펩타이드를 자성이 있는 비드에 고정화하여 trans-2-nonenal의 처리를 확인하였다.
상기 파지디스플레이(Phage display)는 단백질 및 기타 분자에 대한 리간드를 확인하는 시험관 내 스크리닝 기술이다. 파지디스플레이의 핵심은 박테리오파지의 외피 단백질에 융합체로서 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 서열을 찾는 것이다. ‘파지’에 의해 ‘디스플레이’된 펩타이드 또는 단백질의 라이브러리는 코딩된 핵산에 물리적으로 연결되어 ‘패닝(panning)’ 및 ‘증폭(amplification)’의 반복적 라운드에 의해 무수한 표적 유형에 대한 결합 파트너의 선택을 허용하고 DNA 시퀀싱이 이어진다. DNA 시퀀싱을 통해서 파지의 pIII 외막 단백질에 있는 서열을 알아내고 이를 활용한다.
특정한 세포의 유형 또는 생물학적 구조를 인지하는 표적 리간드는 치료제 및 조영제의 세포 특이적 전달을 위해 중요한 하나의 툴로서 부상하고 있다. 일반적으로 항체가 그러한 도구로서 많이 사용되었지만 펩타이드 또한 하나의 대안으로서 가능하다. 항체와는 다르게 펩타이드는 대량으로 합성하기 쉽고, 작은 크기는 조직 침투를 향상시킨다. 또한 펩타이드는 화학적으로 그 특성을 변화시키기 용이하기 때문에 친화력, 소수성, 안정성, 용해성 등의 화학적 특성을 조절할 수 있다. 이러한 방식을 통해 펩타이드는 생체 내 사용을 위해서도 최적화될 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 펩타이드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 알데히드계 악취의 원인 물질은 노네날, 옥타날, 노나날 및 데카날으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 노네날은 9개의 탄소와 1개의 이중결합을 가지는 지방성의 불포화 알데히드의 일종이다. 알데히드 계열의 악취는 ppm, ppb 단위의 극미량에서도 지독하게 느껴질 만큼 불쾌한 매새를 가지는 것을 특징으로 한다. 인체 내에서 노네날은 40세 이상부터 신체의 노화에 따라 신진대사 능력이 감소하여 지방산 등의 산화로 생성되어 축적되는 것으로, 인체가 노화하면서 발생하는 몸 냄새와 밀접한 관련이 있다. 또한 노네날은 식품에서 식품 내의 지방이 산화하여 나는 이취이다. 노네날은 식품 중에서 맥주에서 문제가 되는데, 맥아의 지방 성분과 맥주에 녹아 있는 산소가 산화 반응을 일으키면서 노네날을 생성하게 된다. 특히 더운 여름철 고온의 날씨에 맥주의 산화반응이 촉진되어 많이 생성된다. 상기의 이취는 식품에 대한 기호도를 저하 시키는 원인이 된다.
본 발명은 전술한 조성물이 고정된 비드를 포함하는 알데히드계 악취 제거 키트를 제공할 수 있다 .
상기 비드는 자성 비드일 수 있다.
본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 노인성 체취 제거용 소취제 조성물을 제공할 수 있다. 노인성 체취는 40세 이상부터 신체의 노화에 따라 신진대사 능력이 감소하여 지방산 등의 산화로 생성되어 축적되는 트랜스-2-노네날에 의해 발생된다. 본 발명의 펩타이드는 상기 트랜스-2-노네날에 특이적으로 결합하여 제거할 수 있다. 상기 노인성 체쥐 제거용 소취제 조성물은 화장료 조성물 있고, 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바는 없으며, 예를 들어 계면활성제-함유 클린징, 각질제거제, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저 또는 유액의 화장료 제형을 가질 수 있다.
본 발명은 전술한 조성물을 포함하는 식품 이취 제거용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 식품의 이취는 식품에서 식품 내의 지방이 산화하여 발생되는 노네날에 의한 이취이다. 노네날은 식품 중에서 맥주에서 문제가 되는데, 맥아의 지방 성분과 맥주에 녹아 있는 산소가 산화 반응을 일으키면서 노네날을 생성하게 된다. 특히 더운 여름철 고온의 날씨에 맥주의 산화반응이 촉진되어 많이 생성된다. 상기의 이취는 식품에 대한 기호도를 저하 시키는 원인이 된다.
본 발명의 상기 식품은 맥주일 수 있다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 알데히드계 악취 제거하는 방법을 제공 할 수 있다.
전술한 키트를 시료에 접촉시켜 반응 시키는 단계; 및
상기 반응한 시료로부터 상기 키트를 분리하는 단계.
본 발명은 상기 알데히드계 악취의 원인 물질은 노네날, 옥타날, 노나날 및 데카날으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
[실시예 1] 메탄올을 이용한 trans-2-nonenal 코팅
본 실시예에서는 파지디스플레이를 진행하기에 앞서 표적물질인 trans-2-nonenal을 dish에 코팅하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 500 μl의 메탄올에 trans-2-nonenal을 0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM이 되도록 녹인 후 60π petri dish에 넣어 상온에서 1시간 동안 뚜껑을 열어 건조시켰다. 파지디스플레이의 매뉴얼 상에서는 표적 물질의 적정 농도는 10 nM로 표기하고 있으나 trans-2-nonenal의 물성은 물에 녹지 않는 소수성이기 때문에 기존의 파지디스플레이에서 표적 물질을 0.1 M NaHCO3로 코팅하는 방법을 사용하지 않았다. 코팅이 끝난 다음에는 0.1%[v/v]의 Tween-20이 포함된 TBST 버퍼로 dish의 표면을 씻어주었다. 이렇게 코팅된 trans-2-nonenal는 Vibrio fischeri의 독성테스트에 의해 확인되었다 (도 2).
[실시예 2] 파지디스플레이 패닝과정
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 코팅된 trans-2-nonenal dish 위에서 파지디스플레이 패닝과정을 진행하였으며, 그 과정은 다음과 같다. Trans-2-nonenal의 표적 농도를 메탄올에 녹인 후, 이를 60×15 mm petri dish에 넣어 상온에서 1시간 건조시킨다. Trans-2-nonenal의 코팅이 끝난 후 각각의 플레이트에 blocking 버퍼를 코팅이 완전히 잠길 때까지 채워주고 4℃에서 1시간동안 반응시킨다. 반응이 끝나면 blocking 버퍼를 완전히 제거하고 TBS와 0.1%[v/v] Tween-20으로 구성된 TBST 버퍼로 6회 세척한다. 이 때 표적 물질이 완전히 건조되는 것은 피해준다. 세척이 끝나면 2×1011 라이브러리 파지를 2×109가 되도록 TBST 버퍼에 희석시켜 1 ml을 플레이트에 넣고 상온에서 10-60분간 흔들어 반응시킨다. 반응이 끝나면 파지가 포함되어있는 TBST 버퍼를 제거하고 TBST 버퍼로 10회 세척한다. 이후 표적 물질에 붙어있는 파지를 수득하기 위해서 1 mg/ml의 BSA가 포함된 0.2 M Glycine-HCl(pH2.2)를 각 플레이트에 넣고 10-20분간 흔들어 반응시킨다. 반응이 끝나면 이를 중화시키기 위해 1 M Tris-HCl(pH 9.1)를 150 μl 넣어준다. 이렇게 수득된 파지의 일부를 titering하고 일부는 20 ml의 ER2738의 희석된 배양액에 넣어 37℃, 180 rpm에서 4.5시간동안 증폭시킨다. 증폭이 끝난 배양액은 12000 g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 모은 뒤, 같은 조건에서 다시 원심분리한다. 원심분리가 끝나면 상층액의 윗부분 80%를 모아준 뒤 이것의 1/6 부피로 20% PEG/2.5 M NaCl를 넣고 4℃에서 하루를 반응시킨다. PEG와 침전된 파지를 12000 g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한다. 간단하게 다시 원심분리해서 남은 상층액을 완벽하게 제거해준 뒤 살펴보면 튜브 가장자리에 아주 작은 하얀 침전물을 확인할 수 있다. 침전물 확인 후 1 ml의 TBS 버퍼를 넣어 이를 풀어준 뒤 14000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리한다. 이 상층액을 다시 1/6 부피로 20% PEG/2.5 M NaCl과 섞고 4℃에서 15-60분간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 상층액을 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 다시 간단하게 원심분리하여 남은 상층액을 완전히 제거한다. 남은 침전물을 200 μl의 TBS 버퍼를 넣어 풀어준 뒤 1분간 원심분리해서 상층액을 새로운 튜브로 옮긴다. 이렇게 증폭된 파지의 일부는 titering을 진행하고 나머지를 보관할 때는 4℃에서 3주, 1:1의 glycerol을 넣어준 경우에는 20℃에서 길게 보관할 수 있다. 증폭된 파지를 titering한 뒤 생성되는 파지의 개수로 pfu를 계산한다. 이것이 1013-14 pfu/ml이 되면 이어서 실험을 진행할 수 있다. 만약 pfu가 너무 적게 나온다면(109 이하) 앞 과정의 패닝을 다시 진행하게 된다. 두 번째 패닝에서부터는 앞의 과정을 그대로 반복하되 blocking 버퍼와 파지를 세척할 때에 사용되는 버퍼를 TBS와 0.5%[v/v] Tween-20으로 구성된 버퍼로 바꿔준다.
[실시예 3] 파지의 수를 파악하기 위한 titering 과정
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 선별되고 증폭된 파지의 수를 파악하기 위한 titering을 진행하였으며, 그 과정은 다음과 같다. ER2738을 5-10 ml의 LB배지에서 4-8시간 배양해서 OD600 값이 ~0.5가 되도록 한다. ER2738이 자라는 동안 전자레인지에 미리 만들어 놨던 탑 아가를 녹인 후 튜브가 각각 7.5 ml씩 나눠 놓는다. 이렇게 나눠 담은 탑 아가는 굳지 않도록 60℃에 보관. 탑 아가를 첨가했을 때 바로 굳지 않도록 적어도 1시간 이상 LB/IPTG/Xgal 플레이트를 37℃에서 보관한다. LB에 파지를 적절한 농도에 따라 희석을 해 놓는데, 이때 추천되는 희석양은 증폭 후의 파지는 108-1011이고 패닝 후의 파지는 101-104이다. 배양된 ER2738을 각각의 튜브에 200 μl 담고 10 μl의 희석된 파지를 첨가한 후 빠르게 vortexing 해줌. 상온에서 1-5분간 반응시키고 이 반응물을 위에서 녹여놨던 탑 아가에 넣어준 뒤 간략히 섞어 즉시 LB/IPTG/Xgal 플레이트에 부어 골고루 펴준다. 탑 아가가 완전히 굳으면 뒤집어서 37℃ 배양기에 넣고 하룻밤동안 배양한다. 대략적으로 100개 정도의 플라크를 가지는 플레이트의 파지 수를 세어주고 희석배수와 10 μl당의 파지를 고려해서 pfu를 계산한다.도 3은 상기와 같은 방법으로 패닝 횟수에 따라 선별되고 증폭되는 파지의 수를 나타낸 결과이다.
[실시예 4] 패닝을 통해 선별된 파지의 DNA 서열 분석
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 선별되고 증폭된 파지의 DNA 서열 분석을 진행하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 하룻밤동안 배양된 ER2738을 LB배지에 1:100로 희석함. 이것을 각각의 튜브에 1 ml씩 담고 3 패닝 이상의 파지 클론을 넣어준다. 이때 3패닝 이상에서 10-20개의 클론은 분석하기에는 적절한 양이다. 파지 클론을 넣어줄 때는 피펫 팁이나 나무 스틱으로 titering 이후의 플레이트에서 각각의 플라크를 따서 배지에 넣어준다. Titering 후의 플레이트는 1-3일 이전의 파지를 사용하며(4℃ 보관) 100개미만의 플라크를 가지는 것을 기준으로 둔다. 이렇게 클론 각각의 플라크가 들어간 ER2738이 담긴 배지는 37℃, 180 rpm으로 4.5-5시간동안 배양한다. 배양이 끝나면 이를 14000 rpm에서 30초간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 다시 한 번 원심분리하여 상층액의 80%를 깨끗한 튜브로 옮겨준다. 이것은 증폭된 파지의 수득물로 짧은 몇 주간은 4℃에서 보관이 가능하나 장기보관의 경우 1:1로 glycerol을 섞어 -20℃에서 보관한다. 상기에서 얻어진 파지 수득물의 500 μl를 깨끗한 튜브로 옮겨준다. 여기에 200 μl의 20% PEG/2.5 M NaCl을 첨가하고 여러 회 섞어준 뒤 상온에서 10-20분간 반응한다. 반응이 끝난 후 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 간략히 다시 원심분리 후 상층액을 모두 제거한다. 여기에 100 μl의 Iodide 버퍼를 넣고 튜브를 손가락으로 여러 번 살짝 튕겨준다. 추가로 250 μl의 100% 에탄올을 넣어준 뒤 상온에서 10-20분 동안 반응. 반응이 끝나면 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 0.5 ml의 70% 에탄올을 첨가한다. 다시 14000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물은 상온에서 잠시동안 건조시켜 준다. 건조를 시켜서 에탄올이 모두 날아가면 30 μl의 TE 버퍼를 넣고 풀어준 뒤 -20℃에서 보관한다. 파지의 DNA를 추출한 뒤 이를 증폭시켜 DNA 염기서열을 분석한다. 파지의 DNA는 PCR을 통해 증폭되었으며 올리고뉴클레오티드 프라이머는 삽입 라이브러리 전후에 있는 서열을 이용해서 제작하였다. 앞의 프라이머는 Phage_F로 5‘-CCG ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT-3’의 서열을 가지며 뒤의 프라이머는 96 sequencing primer로 5‘-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’의 서열을 가진다. 이러한 두 가지 프라이머를 사용해서 PCR을 진행하였다.
[실시예 5] ELISA 분석
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 선별되고 증폭된 파지와 trans-2-nonenal과의 친화력을 확인하기 위해서 anti-m13 antibody를 사용해서 ELISA 분석을 진행하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 상기 실시예 4의 파지 플라크 증폭 과정과 동일하게 각각의 파지의 수를 늘린다. 96-well 플레이트에서 상기 실시예 1과 같은 방법으로 trans-2-nonenal을 코팅하고 blocking 과정을 진행한다. Trans-2-nonenal이 코팅된 96-well 플레이트에 2×105 파지를 각각 200 μl 넣어주고 상온에서 1-2시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 TBST 버퍼로 남은 파지를 모두 씻어주고 anti-M13 antibody를 200 μl를 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 TBST 버퍼로 남은 항체를 모두 씻어주고 H2O2가 포함된 azino-bis diammonium salt(ABTS) 기질을 200 μl 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨다. 반응이 끝나면 405-415 nm에서 흡광도를 측정한다. 그 결과 서열번호 1의 아미노산 (AHKSKLHQHVMFGGG)으로 구성된 P4가 trans-2-nonenal과 가장 높은 친화력을 나타내었다. (도 5).
[실시예 6] 자성이 있는 비드에 고정화된 펩타이드
본 실시예에서는 상기 실시예 4, 5에서 선별된 서열을 가지는 펩타이드를 제작하였고 이러한 펩타이드를 자성이 있는 비드에 고정화하여 trans-2-nonenal 에 처리하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 세 가지 펩타이드의 농도별(0 μl, 12 μl, 36 μl, 48 μl, 96 μl)로 아민기가 포함된 bead에 상온에서 12시간동안 고정화한 뒤 HPLC(High-performance liqiud chromatography)로 정량 분석을 진행하였다. Trans-2-nonenal은 휘발성이 있고 빛에 분해될 수 있기 때문에 빛을 차단하고 스크류 캡이 있는 바이알 조건에서 모든 과정은 진행되었다. 그 결과 도 6과 같이 서열번호 1의 아미노산으로 구성된 P4가 trans-2-nonenal이 가장 효율이 좋은 것으로 나타났다.
< 표 1. HPLC 분석 조건 >
Column C18, 5 μm, 12.5 cm × 4.6 mm
Absorbance 226 nm
Buffer Ammonium formate 25 mM
Retension time 3.96 min
Solvent Methanol 75%, H2O 25%
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Trans-2-nonenal binding peptide and An composition for removing aldehyde-based odor containing the peptide <130> 1062932 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide specifically binding to trans-2-nonenal <400> 1 Ala His Lys Ser Lys Leu His Gln His Val Met Phe Gly Gly Gly 1 5 10 15

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 포함하는 트랜스-2-노네날로 인한 악취 제거 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 조성물이 고정된 비드를 포함하는 트랜스-2-노네날로 인한 악취 제거 키트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 비드는 자성 비드인, 트랜스-2-노네날로 인한 악취 제거 키트.
  5. 제 1항의 조성물을 포함하는 트랜스-2-노네날로 인한 노인성 체취 제거용 소취제 조성물.
  6. 제 1항의 조성물을 포함하는 트랜스-2-노네날로 인한 식품 이취 제거용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 식품은 맥주인, 식품 이취 제거용 조성물.
  8. 제 3항의 키트를 시료에 접촉시켜 반응 시키는 단계; 및
    상기 반응한 시료로부터 상기 키트를 분리하는 단계;
    를 포함하는 트랜스-2-노네날로 인한 악취를 제거하는 방법.
  9. 삭제
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