ES2318576T3 - Polipeptidos insecticidas y procedimientos para su uso. - Google Patents

Polipeptidos insecticidas y procedimientos para su uso. Download PDF

Info

Publication number
ES2318576T3
ES2318576T3 ES05818323T ES05818323T ES2318576T3 ES 2318576 T3 ES2318576 T3 ES 2318576T3 ES 05818323 T ES05818323 T ES 05818323T ES 05818323 T ES05818323 T ES 05818323T ES 2318576 T3 ES2318576 T3 ES 2318576T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
polypeptide
actx
insect
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES05818323T
Other languages
English (en)
Inventor
Glenn F. King
Biranna Sollod Mcfarland
Graham Michael Nicholson
Simon Joseph Gunning
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Technology Sydney
University of Connecticut
Original Assignee
University of Technology Sydney
University of Connecticut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Technology Sydney, University of Connecticut filed Critical University of Technology Sydney
Application granted granted Critical
Publication of ES2318576T3 publication Critical patent/ES2318576T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds
    • Y10S530/858—Proteins from animals other than mammals or birds insects; venom

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Un polipéptido insecticida que bloquea aproximadamente 50% o más de la corriente de calcio en un canal de calcio voltaje-dependiente de un insecto y aproximadamente 50% o más de la actividad en un canal de potasio activado por calcio, de alta conductancia, de un insecto, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº. 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.

Description

Polipéptidos insecticidas y procedimientos para su uso.
Antecedentes
Aunque sólo una pequeña minoría de insectos se clasifican como plagas, los insectos destruyen aproximadamente 20% del suministro anual de alimentos y transmiten una serie de diversos patógenos humanos y animales. Por tanto, el control de las plagas de insectos es una cuestión de importancia agronómica y médica mundial. Las plagas de artrópodos tales como insectos siempre se han combatido principalmente con insecticidas químicos desde la introducción del DDT en la década de los cuarenta. Sin embargo, el control de las plagas de insectos en los Estados Unidos y en otras partes del mundo se ha complicado por varias razones. Primeramente, el control químico somete a la población de insectos a la selección de Darwin y, por consiguiente, más de 500 especies de artrópodos han desarrollado resistencia a una o varias clases de insecticidas químicos. Segundo, la concienciación creciente de las indeseables consecuencias ambientales y ecológicas de los insecticidas químicos, tales como la toxicidad a organismos no diana, ha conducido a regulaciones gubernamentales revisadas más exigentes para la evaluación de los riesgos de los insecticidas. La pérdida de clases enteras de insecticidas o su desregistro debido al desarrollo de resistencia, combinada con mayores exigencias para el registro de nuevos insecticidas, probablemente hará que disminuya en el próximo futuro el acervo de insecticidas químicos eficaces.
A lo largo de la pasada década, para combatir plagas de insectos muy resistentes se han propuesto estrategias de insecticidas "tolerables ambientalmente". Un enfoque recientemente introducido y, por ello, muy exitoso, es la introducción de cultivos transgénicos que expresan toxinas insecticidas, tales como cultivos de patata, maíz y algodón procesados por ingeniería, que expresan delta-toxinas de la bacteria del suelo Bacillus thurigiensis. Se han hecho con éxito ensayos en campo de una estrategia bioinsecticida alternativa que obvia el problema de la introducción de una proteína foránea en el suministro de alimento, y se basa en la liberación de virus específicos para insectos que se han procesado por ingeniería genética para expresar neurotoxinas peptídicas insecticidas.
Varios investigadores han reconocido venenos de araña como posible fuente de toxinas específicas de insectos para aplicaciones agrícolas. Una clase de toxinas peptídicas conocidas como omega-atracotoxinas se describe en la patente U.S. nº. 5.763.568 como aislada a partir de arañas de telaraña en forma de embudo por exploración del veneno en cuanto a la actividad de "larva de mariposa heterócera antialgodón". Uno de estos compuestos, designado "omega-ACTX-Hvla", ha revelado que inhibe selectivamente insectos, en oposición a las corrientes de canal de calcio voltaje dependiente de mamíferos. En la patente U.S. nº. 6.583.264, se describe una segunda familia, no afín, de bloqueantes peptídicos del canal de calcio específicos para insectos que se dice que se han aislado de la misma familia de
arañas.
Si bien parece que varias toxinas de péptidos insecticidas aisladas de escorpiones y arañas son vías prometedoras para el desarrollo de insecticidas, queda todavía una necesidad significativa de compuestos que actúen rápidamente y con potencia frente a insectos, pero que tengan una toxicidad diferencial para insectos y vertebrados.
\vskip1.000000\baselineskip
Sumario
En una realización, un polipéptido purificado comprende una cualquiera de las SEC. ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18 y 27. En otra realización, un polipéptido purificado comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº. 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
En otra realización, una composición insecticida comprende una cantidad eficaz como insecticida de los anteriores polipéptidos purificados con un vehículo agrícolamente aceptable.
En otra realización, un polinucleótido aislado codifica un polipéptido que comprende una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27. En otra realización, un polipéptido aislado codifica una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC.ID. nº. 2, teniendo el polipéptido actividad insecti-
cida.
En otra realización, un vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que codifica una cualquiera de las SEC. ID. n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
En otra realización más, una célula hospedadora comprende un factor de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
En una realización, un virus de insecto comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aproximadamente 70% o más con la SEC ID nº. 2, en el que el polipéptido tiene actividad insecticida.
En una realización, un insecto transgénico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia que tiene una secuencia con una identidad de aproximadamente 70% o más con la SEC ID nº. 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
En otra realización más, un procedimiento para tratar un insecto o una larva de insecto comprende poner en contacto el insecto o la larva de insecto con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido U-ACTX, comprendiendo el polipéptido U-ACTX una secuencia de aminoácidos cuya identidad es aproximadamente igual en 70% o más a la SEC ID nº. 2 y teniendo el polipéptido U-ACTX actividad insecticida. En un aspecto, un procedimiento para tratar una planta comprende poner en contacto la planta con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido U-ACTX, comprendiendo el polipéptido U-ACTX una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aproximadamente 70% o más con la SEC ID nº. 2, y teniendo el polipéptido U-ACTX actividad insecticida.
En otro aspecto más se incluye una planta transgénica en la que la planta transgénica expresa un polipéptido U-ACTX, polipéptido U-ACTX que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de aproximadamente 70% o más con la SEC ID nº. 2, teniendo el polipéptido U-ACTX tiene actividad insecticida.
\vskip1.000000\baselineskip
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias completas de polipéptidos de nueve homólogos de U-ACTX.
La Figura 2 muestra un procedimiento de construcción de un gen sintético para la producción de U-ACTX recombinante.
La Figura 3 es una curva de dosis-respuesta resultante de la inyección de U-ACTX en moscas domésticas.
La Figura 4 es una curva de dosis-respuesta que muestra los efectos de rU-ACTX-Hv-1a sobre corrientes de calcio en neuronas de DUM medidos como I_{Ca}.
La Figura 5 es una curva de dosis-respuesta que muestra los efectos de U-ACTX-Hv-1a sobre canales pSlo expresados en células de HEK293 y medidos como I_{K(Ca)}.
A partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones anexas, los expertos en la técnica apreciarán y entenderán los rasgos antes descritos y otros.
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción detallada
La presente invención incluye los polipéptidos U-ACTX y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. En una realización, el polipéptido es un componente del veneno de una araña del género Atrax o Hadronyche. Los polipéptidos U-ACTX y los polinucleótidos que los codifican se pueden emplear como insecticidas, bien solos o en combinación con otros polipéptidos insecticidas o sus genes. Un insecticida o una composición insecticida es el (la) que es tóxico(a) para una o varias especies de insectos. La actividad insecticida se refiere a la capacidad de los polipéptidos para matar o paralizar insectos, o para inhibir el desarrollo o crecimiento de insectos, de manera que, por ejemplo, en el caso de aplicaciones de agrícolas, los insectos ocasionen un daño menor a una planta y no sea afectado significativamente de forma perjudicial el rendimiento de la planta. Los polipéptidos que tienen actividad insecticida se califican también de tóxicos para los insectos. La especifidad insecticida es la especifidad de un polipéptido U-ACTX para una o varias especies de insectos. La DL_{50} es la dosis de un polipéptido U-ACTX que da por resultado la muerte del 50% de los insectos ensayados.
Tal como se usa en esta memoria, U-ACTX o polipéptido U-ACTX incluye U-ACTX-Hv1a o un homólogo suyo. En una realización, se proporciona un polipéptido insecticida que es tóxico para insectos adultos o larvas, teniendo el polipéptido una masa molecular de aproximadamente 4.300 daltons y una longitud de 38 a 39 restos de aminoácidos. En una realización, el polipéptido es capaz de formar tres enlaces disulfuro entre cadenas. La actividad insecticida se puede demostrar por el desarrollo de una hiperexcitabilidad descontrolada en insectos inyectados con polipéptido U-ACTX, tales como la mosca doméstica Musca domestica, el grillo doméstico Acheta domestica y otras especies de insectos.
Las secuencias de U-ACTX maduro presentan una identidad de secuencia menor que 50% con toxinas insecticidas de péptidos previamente aisladas tales como, por ejemplo, la familia de omega-ACRX-1 de toxinas insecticidas aisladas previamente del veneno de arañas de telaraña de embudo. Mientras que los insectos inyectados con omega-ACTX-Hv1a presentan una parálisis espástica a la que sigue la muerte, rU-ACTX-Hv1a induce una hiperexcitabilidad descontrolada en insectos inyectados que precede a la parálisis y la muerte. Así, U-ACTX-Hv1a tiene un modo de acción diferente al de omega-ACTX-Hv1a previamente caracterizado.
El polipéptido U-ACTX puede estar en forma de un polipéptido maduro o un prepropolipéptido. Sin que se quiera basarse en la teoría, se cree que la forma biológicamente activa del polipéptido U-ACTX se produce por un proceso proteolítico translacional (por ejemplo, excisión) del precursor prepropolipéptido por una proteasa que reconoce una secuencia de aminoácidos particular motivo en el prepropolipéptido. La porción "pre" del prepropolipéptido se refiere a la porción peptídica de señal del prepropolipéptido. Sin que se quiera basarse en la teoría, se cree que la secuencia señal es responsable de apuntar el prepolipéptido, así como en su translación hacia la membrana reticular endoplasmática en células que producen U-ACTX. En una realización, la secuencia peptídica señal incluye la SEC ID nº.: 38 MNTX_{1}TGFIVX_{2}LVLATX_{3}LGGX_{4}EA, en la que X_{1} es A o T, X_{2} es L o F, X_{3} es I o V y X_{4} es I o V. También se pueden emplear otras secuencias que actúan de manera similar. La parte "pro" del prepropolipéptido se refiere a la secuencia SEC ID nº. 39 X_{5}ESHMRKDAMGRVRR, en la que X_{5} es G o R; u otras secuencias unidas por covalencia corriente arriba de un polipéptido U-ACTX maduro. Sin que se quiera basarse en la teoría, entre los posibles papeles de la prosecuencia están incluidos facilitar la exportación de toxina facilitadora desde el retículo endoplasmático, asistir al plegado oxidante catalizado por enzima de la secuencia de toxina madura y señalar enzimas implicadas en el procesamiento proteolítico y la modificación postranslacional. El motivo de RR en la prosecuencia se cree que es el sitio de escisión de la endoproteasa. Así, un polipéptido purificado que comprende un polipéptido U-ACTX puede comprender además una secuencia de péptido señal, una prosecuencia o una combinación que comprende una o varias secuencias anteriores. La arquitectura prepropolipeptídica de las toxinas de U-ACTX parece similar a la determinada por los inventores para otras toxinas expresadas en la glándula de veneno de arañas australianas de telaraña de
embudo.
En una realización, el polipéptido U-ACTX es un prepropéptido de Hadranyche versula que tiene la secuencia
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro formado por escisión del prepropoliéptido de SEC ID nº. 1 es U-ACTX-Hv1a
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el polipéptido U-ACTX es rU-ACTX-Hc1a (SEC ID nº. 3) definida:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
rU-ACTX-Hv1a (SEC ID nº. 3) es una versión recombinante de la forma madura de U-ACTX-Hv1a en la que los dos primeros restos (Gln-Tyr) de la secuencia presumida de toxina madura (SEC ID nº. 2) han sido reemplazados por la secuencia dipeptídica Gly-Ser.
Una secuencia que codifica la SEC ID nº. 2 es
4 
\vskip1.000000\baselineskip
También están incluidos en la invención ocho homólogos de U-ACTX que también se aislaron por análisis de bibliotecas de ADNc de glándula de veneno. Están incluidas las secuencias de prepropolipéptidos (SC ID n^{os}. 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 y 26) secuencias de polipéptidos maduros (SEC ID n^{os}. 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27) así como los ADN que las codifican (SEC ID n^{os}. 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 y 28).
El prepropolipéptido del primer homólogo de Hadronyche versuta es:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del primer homólogo de Hadronyche versuta e
6 
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del primer homólogo de Hadronyche versuta es:
7
El prepropolipéptido del segundo homólogo de Hadronyche versuta es:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del segundo homólogo de Hadronyche versuta es:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del segundo homólogo de Hadronyche versuta es:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
El prepropolipéptido del tercer homólogo de Hadronyche versuta es:
11
El polipéptido maduro del tercer homólogo de Hadronyche versuta es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del tercer homólogo de Hadronyche versuta es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El prepropolipéptido del cuarto homólogo de Hadronyche versuta es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del cuarto homólogo de Hadronyche versuta es:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\newpage
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del cuarto homólogo de Hadronyche versuta es:
16 
\vskip1.000000\baselineskip
El prepropolipéptido del quinto homólogo de Hadronyche versuta es
17 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del quinto homólogo de Hadronyche versuta es:
18 
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del quinto homólogo de Hadronyche versuta es:
19
El prepropolipéptido del sexto homólogo de Hadronyche versuta es
20 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del sexto homólogo de Hadronyche versuta es:
21 
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del sexto homólogo de Hadronyche versuta es:
22
El prepropolipéptido del séptimo homólogo de Hadronyche versuta es
23
El polipéptido maduro del séptimo homólogo de Hadronyche versuta es:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro del séptimo homólogo de Hadronyche versuta es:
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
El prepropolipéptido del octavo homólogo de Atrax robustus es:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido maduro del octavo homólogo de Atrax robustus es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\newpage
Un polinucleótido que codifica el octavo homólogo de Atrax robustus es:
28
La invención incluye polipéptidos U-ACTX aislados o purificados. Un polipéptido, o un fragmento de él, "aislado" o "purificado" está sustancialmente exento de material celular u otros polipéptidos contaminantes de la célula, la fuente del tejido o el veneno del que deriva la proteína, o sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de polipéptido en las que el polipéptido se separa de componentes celulares de los que se aísla o se produce recombinantemente. Así, un polipéptido que está sustancialmente exento de material celular incluye preparaciones de polipéptido que tienen menos de aproximadamente 30%, de aproximadamente 20%, de aproximadamente 10% o de aproximadamente 5% (peso en seco) de polipéptido heterólogo (denominado también "polipéptido contaminante" en este contexto). En una realización, la preparación tiene como mínimo una pureza de 75% en peso puro, más específicamente, como mínimo de 90% en peso puro y, muy específicamente, de como mínimo 95% en peso puro. Un polipéptido U-ACTX sustancialmente puro se puede obtener, por ejemplo, por extracción de una fuente natural (por ejemplo, una célula de insecto); por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido U-ACTX, o por síntesis química del polipéptido. La pureza se puede medir por un procedimiento apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de acrilamida, espectrometría de masas o mediante análisis por cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC).
La invención incluye también homólogos de U-ACTX. "Homólogo" es un término genérico usado en la técnica para indicar una secuencia de polinucleótido o polipéptido que tiene un alto grado de relación de secuencia con una secuencia considerada. Este grado de relación se puede cuantificar determinando el grado de identidad y/o similitud entre las secuencias que se están comparando. Este término genérico abarca los términos "ortólogo", que significa un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional de un polinucleótido o polipéptido de otra especie, y el término "parálogo", que significa una secuencia funcionalmente similar cuando se considera dentro de la misma especie. Los parálogos presentes en la misma especie o los ortólogos de genes de U-ACTX de otra especie pueden identificarse fácilmente sin una experimentación 
\hbox{innecesaria por técnicas de biología  molecular bien
conocidas en la técnica.}
Tal como se usa en este contexto, el "porcentaje de homología" de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proced. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 87, 2264-2268. Este algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol.. 215, 403-410. Las búsquedas de los nucleótidos de BLAST se realizan con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud verbal 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud verbal = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas de un polipéptido de referencia (por ejemplo, SEC ID nº. 2). Para obtener alineamientos distanciados a fines comparativos se utiliza Gapped BLAST como describen Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3942. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST se usan típicamente los parámetros por defecto. (Véase http:/www.ncbi.nlm.nih.gov).
Se alinean polipéptidos afines con U-ACTX asignando grados de homología a diversas supresiones, sustituciones y otras modificaciones. La homología se puede determinar a lo largo del polipéptido o polinucleótido entero o subconjuntos de restos contiguos. La identidad porcentual es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos cuando se comparan las dos secuencias. La similitud porcentual es el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son químicamente similares cuando se comparan las dos secuencias. Los polipéptidos U-ACTX y homólogos preferiblemente son idénticos en aproximadamente 70% o más, específicamente en aproximadamente 80% o más, muy específicamente en aproximadamente 95% o más. Como polipéptido de referencia se puede emplear la SEC ID nº. 2.
Cuando se dice que un polipéptido particular tiene una identidad porcentual determinada respecto a un polipéptido de referencia de una longitud definida, la identidad porcentual es respecto al péptido de referencia. Así, un polipéptido que es idéntico en un 50% a un polipéptido de referencia que tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción con una longitud de 50 aminoácidos del polipéptido de referencia. También puede ser un polipéptido de una longitud de 100 aminoácidos que es idéntico en un 50% al polipéptido de referencia en toda su longitud. Obviamente, muchos otros polipéptidos satisfarán los mismos criterios.
Por "modificación" de la secuencia principal de aminoácidos se entiende que están incluidas "supresiones" (esto es, polipéptidos en los que no están presentes uno o varios aminoácidos), "adiciones" (esto es, un polipéptido que tiene una o varias adiciones de restos de aminoácidos en comparación con el polipéptido especificado), "sustituciones" (esto es, un polipéptido que es resultado del reemplazo de uno o varios restos de aminoácidos) y "fragmentos" (esto es, un polipéptido constituido por una secuencia principal de aminoácidos que es idéntica a una porción de la secuencia principal del polipéptido especificado). Por "modificación" se entiende que también se encuentran incluidos polipéptidos que están alterados como resultado de acontecimientos translacionales que cambian, por ejemplo, el esquema de glicosilación, amidación (por ejemplo, amidación C-terminal), lipidación, o la estructura primaria, secundaria o terciaria del polipéptido. Son posibles modificaciones N-terminales y/o C-terminales.
La referencia en este contexto a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de U-ACTX incluye también la referencia a variantes naturales de estas secuencias. También están incluidas variaciones no naturales que difieren de las SEC ID n^{os}. 1, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 y 26 del prepropolipéptido y las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 del polipéptido maduro, y que retienen la función biológica. Las variantes comprenden los polipéptidos que tienen cambios conservadores de aminoácidos, esto es, cambios de aminoácidos cargados similarmente o no cargados. Generalmente, los aminoácidos codificados se dividen en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato); categorías: (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina). A veces se clasifican conjuntamente como aminoacidos aromáticos la fenilalanina, el triptófano y la tirosina. Dado que cada miembro de una familia tiene propiedades físicas y químicas similares a las de los otros miembros de la misma familia, es razonable esperar que el reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, el de un aspartato con un glutamato, de una treonina con una serina o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente afín no tenga un efecto importante sobre las propiedades de unión de la molécula resultante. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da por resultado un polipéptido funcional ensayando la actividad insecticida de los derivados de polipéptido U-ACTX.
La referencia a U-ACTX también se refiere a derivados polipeptídicos de U-ACTX. En este contexto, los "derivados polipeptícos" incluyen los polipéptidos que difieren en la longitud de un U-ACTX natural y que comprenden aproximadamente 15 o más aminoácidos en el mismo orden principal que en el encontrado en U-ACTX. Los derivados de polipéptidos pueden ser más largos que U-ACTX, más cortos que U-ACTX (por ejemplo, fragmentos activos), siempre que los derivados polipeptídicos tengan actividad insecticida. Dentro de la definición de derivados polipeptídicos de U-ACTX están los polipéptidos que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que U-ACTX pero que tienen sustituciones menores de aminoácidos que no afectan sustancialmente a la actividad insecticida del polipéptido U-ACTX.
Los homólogos de U-ACTX se pueden identificar de varias maneras. En un procedimiento, se pueden identificar secuencias de ARNm nativo que codifican los precursores de ortólogos de U-ACTX usando técnica estándar de biología molecular para explorar bibliotecas de ADNc de glándula de veneno de araña para tales ortólogos. La secuencia de aminoácidos del ortólogo de U-ATCX maduro se puede obtener por translación de las secuencias de ADNc identificadas teniendo en cuenta que la escisión endoproteolítica del polipéptido a la toxina madura muy probablemente se produce en el lado C-terminal del sitio de procesamiento Arg-Arg que precede inmediatamente a la toxina madura (véase la segunda flecha en la Fig.1). El ortólogo de U-ACTX nativo maduro se puede aislar luego por fraccionamiento cromatográfico del veneno, seguido de identificación y purificación de una toxina peptídica con una masa que casa con la predicha de la secuencia de ADNc del ortólogo de U-ACTX. En otro procedimiento, la toxina sintética madura se puede producir por síntesis de péptidos en fase sólida de la secuencia de U-ACTX seguida de oxidación de la cisteína para formar el isómero de disulfuro nativo como se ha descrito previamente para la producción de J-atracotoxina-Hv1c (Wang y otros (2000) Nature Structural Biology 7, 505-513). Se puede oxidar un polipéptido U-ACTX y plegarlo a su estructura tridimensional nativa por incubación del péptido liofilizado reducido en un tampón redox de glutatión. Un tampón redox de glutatión adecuado incluye ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico (MOPS) 200 mM, pH 7,3, KCl 400 mM, EDTA 2 mM, glutatión reducido 4 mM (GSH) y glutatión oxidado 2 mM (GSSG), aunque los expertos en la técnica conocen numerosas de sus variantes. Esta mezcla de reacción se incuba durante la noche a 4ºC, a temperatura ambiente o a 37ºC, por ejemplo, y luego se fracciona usando HPLC de fase inversa para separar los isómeros disulfuro individuales. Las fracciones se pueden recoger y ensayar en cuanto a su actividad insecticida. En otro procedimiento más, se puede sintetizar el ortólogo de U-ACTX químicamente o por técnicas recombinantes de ADN construyendo un gen sintético que codifica la secuencia de U-ACTX por procedimiento conocidos en la técnica.
La invención incluye polinucleótidos U-ACTX aislados tales como, por ejemplo, las SEC. ID n^{os}. 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 y 28. El término "polinucleótido aislado" incluye polinucleótidos que están separados de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye polinucleótidos que están separados del cromosoma con el que el ADN genómico está asociado naturalmente. Un polinucleótido "aislado" está exento de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 kb, aproximadamente 4 kb, aproximadamente 3 kb, aproximadamente 2 kb, aproximadamente 1 kb, aproximadamente 0,5 kb o aproximadamente 0,1 kb de las secuencias de nucleótido de 5' y/o 3' que flanquean naturalmente la molécula de ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Además, un polinucleótido aislado, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente exento de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Por exento de otro material celular se entiende que la pureza del polinucleótido aislado es mayor que o igual a aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 99%.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico" se refiere a una forma polímera de nucleótidos con una longitud de como mínimo 5 bases. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier nucleótido. Las modificaciones incluyen, aunque no limitativamente, sustituciones conocidas de una unión de una base, un azúcar o internucleósido (esqueleto) natural con una base modificada tal como 5-metilcitosina, un azúcar modificado tal como azúcares 2'-metoxi y 2'-fluoro, y esqueletos modificados tales como fosforotioato y metilfosfonato. Tal como se usa en este contexto, el término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptido; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificadora (guía y remolque) así como secuencias interventoras (intrones) entre segmentos individuales de codificación (exones).
El polinucleótido puede ser una molécula de ADN, una molécula de ADNc, una molécula de ADN genómico o una molécula de ARN. El polinucleótido tal como ADN o ARN comprende una secuencia en la que T puede ser también U. El polinucleótido puede ser complementario de un polinucleótido que codifica un polipéptido U-ACTX (por ejemplo, las SEC ID n^{os}: 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 y 28), refiriéndose complementario a la capacidad para un emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un polinucleótido es capaz de unión por hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, el polinucleótido y la molécula de ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. El polinucleótido y la molécula de ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de las correspondientes posiciones de cada molécula está ocupado por nucleótidos que se hibridizan mutuamente con el fin de efectuar el proceso deseado. Tal como se usa en esta memoria, hibridación significa unión por hidrógeno, que puede ser una unión por hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa, entre bases complementarias de nucleósido o nucleótido.
Además, están incluidos los polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a un polinucleótido que codifica un polipéptido U-ACTX (por ejemplo, SEC ID n^{os}: 7, 10, 13, 16, 19, 21, 25 y 28) o que codifican proteínas sustancialmente idénticas a la SEC ID nº 2. Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido o polinucleótido que tiene una secuencia que es idéntica en como mínimo aproximadamente 85%, específicamente aproximadamente 90% y, más específicamente, aproximadamente 95%, o más, a la secuencia del aminoácido de referencia o la secuencia de ácido nucleico. Para polipéptidos, la longitud de la secuencia de polipéptido de referencia generalmente será de como mínimo aproximadamente 16 aminoácidos o, específicamente, de como mínimo aproximadamente 20 aminoácidos, más específicamente de como mínimo aproximadamente 25 aminoácidos y, muy específicamente, de como mínimo aproximadamente 35 aminoácidos. Para ácidos nucleicos, la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia generalmente será de como mínimo aproximadamente 50 nucleótidos, específicamente de como mínimo 60 nucleótidos, más específicamente de como mínimo aproximadamente 75 nucleótidos y, muy específicamente, de aproximadamente 110 nucleótidos.
Típicamente, las secuencias homólogas se pueden confirmar por hibridación, prefiriéndose efectuar la hibridación en condiciones rigurosas como se describe, por ejemplo, por Sambrook y otros en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Usando la hibridación rigurosa descrita por Sambrook y otros (esto es, lavando dos veces los fragmentos de ácido nucleico, cada vez a temperatura ambiente durante 30 min con cloruro sódico y citrato sódico (SCC) 2X y dodecilsulfato sódico SDS al 0,1%, lavando seguidamente una vez a 50ºC durante 30 min con SCC 2X y SDS al 0,1%, y luego dos veces cada vez a temperatura ambiente durante 10 min con SCC 2X, se pueden identificar las secuencias homólogas que comprenden como máximo de aproximadamente 25 a aproximadamente 30% de desemparejamientos de base, o aproximadamente de 15 a aproximadamente 25 de desemparejamientos de pares de base, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 desemparejamientos de pares de base.
Se puede producir un polipéptido homólogo, por ejemplo, por mutagénesis convencional dirigida al sitio de polinucleótidos (que es una vía para identificar rutinariamente si restos de la molécula son funcionalmente importantes o no) por mutación al azar, por síntesis química o por escisión química o enzimática de los polpéptidos.
Los polinucleótidos que codifican secuencias de U-ACTX permiten la preparación de secuencias relativamente cortas de ADN (o ARN) que tienen la capacidad de hibridarse específicamente a tales secuencias de genes. Las secuencias cortas de ácido nucleico se pueden usar como sondas para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada, o se pueden usar como cebadores para detectar, amplificar o mutar un segmento definido de las secuencias de ADN que codifican un polipéptido U-ACTX. Una secuencia de ácido nucleico empleada para estudios de hibridación puede ser de una longitud igual a o mayor que aproximadamente 14 nucleótidos para asegurar que el fragmento tiene una longitud suficiente para formar una molécula dúplex estable y electiva. Tales fragmentos se pueden preparar, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por procedimientos químicos, aplicando tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como tecnología de PCR, o escindiendo fragmentos seleccionados de ácido nucleico de plásmidos recombinantes que contienen insertos apropiados y sitios de restricción adecuados.
Los polinucleótidos U-ACTX y homólogos se pueden insertar en un vector o en vectores de expresión recombinantes. El término "vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus u otro medio conocido en la técnica que ha sido manipulado por inserción o incorporación de las secuencias genéticas de U-ACTX. El término "plásmido" generalmente se designa en esta memoria con una minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números, de acuerdo con cualesquiera convenciones estándar de denominación que son familiares a los expertos en la técnica. Los plásmidos descritos en esta memoria están disponibles comercialmente, disponibles públicamente sobre una base no restringida o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles por aplicación de muchos procedimientos publicados, bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión son bien conocidos y se puede disponer de ellos con facilidad, o los expertos normales en la técnica pueden construir fácilmente cualesquier plásmidos adecuados para uso. Estos vectores se pueden transformar en una célula hospedadora adecuada para formar un sistema de vectores de células hospedadoras para la producción de un polipéptido.
Los polinucleótidos U-ACTX se pueden insertar en un vector adaptado para expresión en una célula bacteriana, de planta, de levadura, de insecto, anfibia o mamífera que además comprende los elementos reguladores necesarios para expresión de la molécula de ácido nucleico en la célula bacteriana, de levadura, de insecto, anfibia, de planta o mamífera operativamente unida a la molécula de ácido nucleico que codifica U-ACTX. "Operativamente unida" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que permite que actúen de la forma pretendida. Una secuencia de control de expresión operativamente unida a una secuencia de codificación está ligada de manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control de la expresión. Tal como se usa en este contexto, el término "secuencias de control de expresión" se refiere a secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico a la que están operativamente unidas. Las secuencias de control de la expresión están operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, según sea apropiado, la translación de la secuencia de ácido nucleico. Así, las secuencias de control de la expresión pueden incluir apropiados promotores, intensificadores, acabadores de transcripción, un codón de inicio (esto es, ATG) delante de un gen que codifica proteínas, señales de reparación de intrones (si están presentes intrones), mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la apropiada translación del ARNm, y codones de parada. El término "controles de expresión" está designado para que incluya, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir sobre la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de partícipes de la fusión. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un promotor. Por "promotor" se entiende una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También están incluidos elementos de promotor que son suficientes para hacer controlable la expresión de genes dependiente del promotor para la inducción específica del tipo de célula, la inducción específica del tipo de tejido, o promotores que se pueden inducir por señales o agentes externos; tales elementos pueden estar situados en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen promotores constitutivos y promotores que se pueden inducir.
Si para transformar una planta se usa un vector de expresión, se puede seleccionar un promotor que tenga la capacidad de guiar la expresión en la planta. En la técnica son bien conocidos promotores que actúan en plantas. Son ejemplos de promotores de plantas específicos para tejido, el promotor sintasa-1 de sacarosa de maíz, el promotor de virus mosaico de coliflor (CaMV 35S), el promotor de RuBP carboxilasa de subunidad pequeña S-E9 y el promotor de proteína de choque de calor de maíz.
La elección de a qué vector de expresión y finalmente a qué promotor se une una región de codificación de polipéptido depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la localización y el momento de expresión de la proteína y la célula hospedadora a transformar. En una realización, el vector usado para expresar el polipéptido incluye un marcador de selección que es eficaz en una célula de planta. Se describen vectores de transformación usados para transformar plantas y procedimientos para preparar esos vectores en, por ejemplo, las patentes U.S. nº. 4.971.908, nº. 4.940.835, nº. 4.769.061 y nº. 4.757.011.
Los sistemas de expresión pueden contener también secuencias de péptido señal y polipéptido que facilitan la expresión del gen de toxina y/o el pliegue de la toxina. Estas podrían ser secuencias señal de U-ACTX nativo y propéptido descritas en esta memoria y otras secuencias señal y/o de propéptido que sirven para el mismo fin.
Los virus de insecto son patógenos de insecto naturales. Los insectos que son susceptibles de infección viral pueden ser una diana para virus de insectos. Pueden ser virus de ADN o virus de ARN. En la técnica son conocidos muchos virus de insectos y la gama de sus huéspedes, incluidos virus que son específicos para el huésped y ambientalmente seguros. La eficacia insecticida de un virus de insecto se puede intensificar por incorporación de un gen que codifica una toxina de insecto en su genoma, usando un procedimiento similar a los descritos en la patente U.S. nº. 6.096.304. Un virus de insecto adecuado es un virus de ADN que se ha usado tradicionalmente como agente de control biológico en plagas de insectos, tal como baculovirus (nucleopolihedrovirus y granulovirus) y entomopoxivirus. Otro ejemplo de virus de ADN es el baculovirus específico para mosquito descrito en la patente U.S. nº. 6.521.454. Entre los virus de ARN adecuados está incluido, no exclusivamente, el cypovirus.
Los vectores útiles para expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica y entre ellos están incluidos vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaccions y el vector de control de transferencia pCaMVCN (asequible de Pharmacia, Piscataway, N.J.).
La transformación de una célula hospedadora con un vector de expresión u otro ADN se puede realizar por técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por "transformación" se entiende un cambio genético permanente o transitorio inducido en una célula después de la incorporación de nuevo ADN (esto es, ADN exógeno a la célula). Cuando la célula es una célula mamífera, generalmente se hace un cambio genético permanente por introducción del ADN en el genoma de la célula. Por "célula transformante" o "célula hospedadora" se entiende una célula (por ejemplo, procariótica o eucariótica) en la que (o en un antecesor de ella) se ha introducido, por técnicas de ADN recombinante, una molécula de ADN que codifica un polipéptido de la invención (esto es, un polipéptido U-ACTX), o un fragmento de él.
Cuando la célula hospedadora es un eucariote, se pueden usar procedimientos de transfección con ADN tales como coprecipitados de fosfato cálcico, procedimientos mecánicos tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido revestido en liposomas, o vectores virales, así como otros. conocidos en la técnica. Cuando la célula hospedadora es una célula de planta, también se pueden emplear otros procedimientos de introducción de genes en la célula tales como, por ejemplo, transformación de protoplastos mediada por polietilenglicol, incorporación de ADN mediada por desecación/inhibición, agitación con fibras de carburo de silicio, aceleración de partículas revestidas con ADN, inyección en órganos de reproducción e inyección en embriones inmaduros.
Las células eucarióticas también se pueden cotransfectar con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de esta descripción, y una segunda molécula de ADN foránea que codifica un fenotipo seleccionable, tal como gen timidina quinasa de herpes simple. Entre los marcadores adecuados están incluidos, por ejemplo, neomicina e higromicina y similares, que pueden ser asimiladas por células mamíferas. La resistencia al marcador la puede conferir el gen de neomicina o el gen de higromicina, por ejemplo, cuando el gen tiene un promotor eucariótico adecuado. Otro procedimiento es usar un vector viral eucariótico, tal como virus 40 de simio (SV40), adenovirus o virus de papiloma bovino, para infectar transitoriamente o transformar células eucarióticas y expresar la proteína (Eukayiotic Viral Vectores, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). En una realización, como célula hospedadora se utiliza un hospedador eucariótico como se describe en este contexto. La célula eucariótica puede ser una célula de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevesiae) o puede ser una célula mamífera, incluida una célula humana.
Los sistemas de células mamíferas que utilizan virus recombinantes o elementos virales para dirigir la expresión pueden procesarse por ingeniería. Por ejemplo, cuando se usan vectores de expresión de adenovirus, las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína foránea se pueden ligar a un complejo de control de transcripción/translación de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. El gen quimérico se puede insertar luego en el genoma de adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción de una región no esencial del genoma viral dará por resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el polipéptido U-ACTX en hospedadores infectados (por ejemplo, Logan y Shenk (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3655-3659).
A largo plazo se prefiere una expresión estable con una producción de alto rendimiento de polipéptidos recombinantes. Con preferencia sobre el uso de vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospedadoras se pueden transformar con ADNc que codifica un polipéptido de fusión U-ACTX controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias de promotor, secuencias de intensificador, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y que crezcan para formar focos que, a su vez, se pueden clonar y expandir en líneas de células. Por ejemplo, después de la introducción de ADN foráneo, se pueden dejar crecer células procesadas ingenierilmente durante 1-2 días en medio enriquecido y luego pasarlas a un medio selectivo. Se pueden usar diversos sistemas de selección, incluidas, no exclusivamente, timidinaquinasa de virus de herpes simple (Wigler y otros (1977) Cell 11, 223-32), fosforibosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska y Szybalski (1962) Proced. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 2026-2034) y fosforibosiltransferasa de adenina (Lowy y otros (1980) Cell 22, 817-823).
Se pueden diseñar también los polipéptidos U-ACTX para proporcionar secuencias adicionales tales como, por ejemplo, la adición de secuencias de codificación para aminoácidos C-terminales y N-terminales añadidos que facilitarían la purificación por atrapamiento en columna o uso de anticuerpos. Entre tales etiquetas están incluidas, por ejemplo, etiquetas ricas en histidina que permiten la purificación de polipéptidos en columnas de níquel. Tales técnicas de modificación de genes y secuencias adicionales adecuadas son bien conocidas en las técnicas de biología molecular.
Las proteínas de U-ACTX, los polipéptidos y derivados polipeptídicos se pueden purificar por procedimientos conocidos en la técnica. Entre estos procedimientos están incluidos, no exclusivamente, cromatografía de exclusión por tamaños, fraccionamiento con sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cristalización, electrofocalización, electroforesis preparativa en gel y combinaciones que comprenden uno o más de los procedimientos anteriores. La purificación se puede realizar de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica que darán por resultado un preparado de U-ACTX sustancialmente exento de otros polipéptidos y de carbohidratos, lípidos u orgánulos subcelulares. La pureza se puede estimar por métodos conocidos en la técnica tales como electroforesis en gel de SDS-policrilamida.
También se proporciona un polipéptido de fusión de U-ACTX que comprende un polipéptido U-ACTX unido covalentemente a un polipéptido al que no se uniría naturalmente. Los polipéptidos de fusión son útiles en diversos sistemas de ensayo. Los polipéptidos de fusión se pueden usar, por ejemplo, para detectar la expresión de U-ACTX. Por ejemplo, se pueden usar polipéptidos de fusión U-ACTX para identificar proteínas que interaccionan con la proteína de U-ACTX e influyen sobre su función. La interacción puede referirse específicamente a la capacidad de U-ACTX para regular otras proteínas, o puede aumentar o disminuir el efecto de la función de U-ACTX. A este fin, se pueden usar procedimientos físicos tales como cromatografía de afinidad de proteínas, o ensayos basados en biblioteca para interacciones de proteína-proteína, tales como híbrido de levadura, híbrido bacteriano y sistemas de pantalla de fago. Tales procedimientos son bien conocidos en la técnica.
Un polipéptido de fusión comprende como mínimo dos segmentos polipeptídicos heterólogos fusionados mediante un enlace peptídico. El primer segmento de polipéptido puede comprender en todo o en parte los aminoácidos contiguos de un polipéptido U-ACTX. Cuando es en parte, como mínimo se usan aproximadamente 8 aminoácidos contiguos de U-ACTX, específicamente como mínimo aproximadamente 10, más específicamente como mínimo aproximadamente 15 y, muy específicamente, como mínimo aproximadamente 20. El primer segmento de polipéptido puede ser también una proteína de U-ACTX de longitud entera. El segundo segmento de polipéptido puede comprender una enzima que generará un producto detectable tal como beta-galactosidasa u otras enzimas que son conocidas en la técnica. Alternativamente, el segundo segmento de polipéptido puede incluir una proteína fluorescente tal como proteína fluorescente verde, HcRed (Clontech) u otras proteínas fluorescentes conocidas en la técnica. Además, la proteína de fusión puede estar marcada con un marcador detectable tal como un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador biotinilado y similares
Las técnicas para hacer polipéptidos de fusión, recombinantemente o por unión covalente de dos segmentos de polipéptido, son bien conocidas. Para construir polipéptidos de fusión de U-ACTX se pueden usar procedimientos de ADN recombinantes, por ejemplo, haciendo una construcción de ADN que comprende una secuencia de codificación de U-ACTX en un marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifican el segundo segmento de polipéptido y expresando la construcción de ADN en una célula hospedadora. La construcción de ADN se puede unir operativamente a secuencias que facilitan la producción de proteínas (esto es, promotores, etc.).
Además de los polipéptidos de fusión, se puede marcar U-ACTX in vitro por procedimientos conocidos en la técnica. Se puede conjugar U-ACTX a colorantes tales como Texas Red, colorantes de rodamina, fluoresceína y otros colorantes conocidos en la técnica. Las químicas de conjugación incluyen éster de succinimidilo, isocianatos y maleimidas. Se puede encontrar información detallada sobre colorantes que se pueden conjugar en Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Researh Products (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tales polipéptidos de fusión se pueden usar para la producción de anticuerpos que pueden tener una especifidad y una sensibilidad mayores que las generadas frente a secuencias cortas de aminoácidos. Además, los polipéptidos de fusión se pueden usar para examinar su capacidad de influir sobre la supervivencia, proliferación y diferenciación de células en ensayos de cultivo de tejidos.
Se pueden construir plantas transgénicas que expresan polipéptido U-ACTX o el prepolipéptido o la forma de prepolipéptidos de la toxina. Por "planta transgénica" se entiende una planta o progenie de ella, derivada de una célula o protoplasto de "planta transformada", en la que el ADN de la planta (nuclear o cloroplasto) contiene una molécula de ADN exógena no presente originalmente en una planta nativa no transgénica de la misma cepa.
El desarrollo o regeneración de plantas a partir de protoplastos de una planta individual o varios explantes es bien conocido en la técnica. Típicamente, este proceso de regeneración y crecimiento incluye la selección de células transformadas y el cultivo de esas células individualizadas mediante las etapas usuales de desarrollo embriónico a través de la etapa de plantones enraizados. Los embriones transgénicos y simientes se pueden regenerar de forma similar. Los retoños transgénicos enraizados resultantes se pueden plantar luego en un medio de crecimiento de plantas adecuado, tal como suelo.
Las plantas regeneradas se pueden autopolinizar para que resulten plantas transgénicas homozigóticas. De otra manera, se puede cruzar polen obtenido de plantas regeneradas a plantas crecidas de semilla de líneas endogámicas agronómicamente importantes. Recíprocamente, para polinizar plantas regeneradas se pueden usar los retoños transgénicos enraizados resultantes. Se puede cultivar por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica una planta transgénica que contiene un polipéptido deseado.
Una planta transgénica adecuada incluye un agente de segregación independiente que puede transmitir los genes de U-ACTX y su actividad a su progenie. En una realización, una planta transgénica es homozigótica para el gen de U-ACTX y transmite ese gen a la totalidad de su prole en el ligue sexual. La semilla de una planta transgénica se puede hacer que crezca en el campo o en un invernadero y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes se autopolinizan para generar verdaderas plantas de transmisión sexual. La progenie de estas plantas se convierte en líneas de transmisión sexual que se evalúan, por ejemplo, en cuanto a una capacidad insecticida aumentada frente a uno o varios insectos, preferiblemente en el campo, en una gama de condiciones ambientales. La planta transgénica puede ser maíz, soja, algodón, trigo, avena, cebada, otros cereales, vegetales, frutas, árboles frutales, frambuesas, hierba de césped, plantas ornamentales, arbustos, árboles y similares.
Los polinucleótidos que codifican polipéptidos U-ACTX se pueden emplear para producir insectos transgénicos que tienen rasgos genéticos particulares. Los expertos en la técnica conocen la tecnología para la producción de animales e insectos transgénicos. Se puede insertar un polinucleótido que codifica un polipéptido U-ACTX en el genoma del insecto usando elementos que se pueden transponer. La integración (transposición) se puede facilitar con la enzima transpostasa y el elemento que se puede transponer puede comprender repeticiones inversas que actúan para dirigir la transpostasa a la posición correcta con el fin de iniciar la escisión. Se pueden preparar, usando tecnología convencional, construcciones genéticas, que comprenden un elemento que se puede transponer combinado (en una fusión genética) con un gen heterólogo, e insertarlas en el huevo del insecto para producir un insecto transgénico. Además del gen de U-ACTX, el elemento que se puede transponer puede comprender los factores reguladores que aseguran que se pueda producir una expresión exitosa.
Entre los elementos adecuados que se pueden transponer están incluidos, por ejemplo, Hermes de Musca domestica, Mariner de D. mauritania, piggyBac y Minos, encontrado en Drosophila hydei. Es factible emplear un elemento Minis que se puede transponer para integrar un polinucleótido U-ACTX en el genoma de un embrión de insecto, opcionalmente en presencia de una Minostransposasa. El elemento que se puede transponer puede estar en forma de un vector de plásmido junto con un gen foráneo, comprendiendo además secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor. En una realización, el promotor es el promotor actin5c de D. melanogaster. En una realización, el gen de Minos transposasa está localizado en un plásmido cooperador separado para introducción separada en el embrión.
El elemento que se puede transponer se puede usar para integrar en el embrión de insecto un gen heterólogo que se puede expresar in vivo. Alternativamente, la integración del elemento susceptible de transposición se puede emplear para integrar un polinucleótido que se puede expresar para interrumpir la expresión de un gen particular. Por ejemplo, se puede usar una molécula de ARN para silenciar genes.
El gen de U-ACTX se puede emplear para producir machos estériles que se pueden liberar como medio de control genético. En la técnica de insectos estériles se obtienen y esterilizan numerosos insectos antes de ser liberados. Si se libera un número suficiente de insectos, las hembras en condiciones naturales se emparejarán con los machos esterilizados liberados y no producirán cría viable alguna. Cuando mejor funciona esta técnica es cuando sólo se liberan machos estériles. Un medio para liberar sólo machos estériles es emplear un gen que es letal para las hembras en ciertas condiciones (esto es, un gen tóxico), pero no para los machos. La expresión del gen letal se puede controlar por el intensificador específico para hembras del gen de Drosophila yp1 (proteína 1 de yema de huevo) o el intensificador de cuerpo graso Yp3, por ejemplo. El uso de un promotor específico para el sexo ha sido propuesto en Drosophila (Heinrich y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000) 97, 8229-8232; Thomas y otros, Science, (2000) 287, 2474-2476). También se pueden introducir genes suicidas que se pueden activar por exposición a ciertas sustancias
químicas.
También están incluidos aquí polipéptidos insecticidas que tienen la actividad de un poliéptido U-ACTX. La actividad de neuronas de insecto está generada por una regulación precisa de la apertura y cierre de canales iónicos, incluidos canales de sodio, canales de calcio y canales de potasio activados con calcio. La actividad del polipéptido U-ACTX se demuestra por la rápida parálisis de insectos, la inhibición de canales de calcio voltaje-dependientes de insectos, o la inhibición de canales de potasio activados por calcio de alta conductancia. La inhibición de canales de calcio y canales de potasio activados por calcio se puede estudiar en neuronas de insecto aisladas, en células recombinantes que expresan un canal o una combinación que comprende uno o más de los medios anteriores. En una realización, los canales de calcio y/o los canales de potasio activados por calcio de alta conductancia son los naturales encontrados en un sistema neuronal de insecto. En una realización, el polipéptido U-ACTX inhibe un canal de calcio voltaje-dependiente de alta conductancia y un canal de potasio activado por calcio.
En una realización, el polipéptido U-ACTX bloquea aproximadamente 50% o más, 60% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más o 95% o más de la corriente de calcio en un canal de calcio voltaje-dependiente de un insecto. En una realización, el canal de calcio voltaje-dependiente de un insecto es uno expresado en neuronas dorsales medias no emparejadas (DUM) de la cucaracha americana Periplaneta amrericana.
En otra realización, el polipéptido U-ACTX bloquea aproximadamente 50% o más, 60% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más o 95% o más del canal de potasio activado por calcio de alta conductancia de un insecto. En una realización, el canal de potasio activado por calcio de un insecto comprende un canal de potasio activado por calcio, de alta conductancia, de P. americana. En otra realización, el canal de calcio es la subunidad \alpha del canal pSlo de P. americana como se ha descrito previamente (Derst y otros (2003) Eur. J. Neurosci. 17, 1197-1212).
En otra realización más, el polipéptido U-ACTX bloquea aproximadamente 50% o más, 60% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más o 95% o más de la corriente de calcio en un canal de calcio voltaje-dependiente de un insecto y 50% o más, 60% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más o 95% o más de la actividad de un canal de potasio activado por calcio, de alta conductania de un insecto.
Los polipéptidos insecticidas se pueden emplear en una amplia gama de procedimientos según se describe detalladamente más adelante.
A fines de exploración se pueden obtener bibliotecas de polipéptidos insecticidas mutados por evolución in vitro de un gen de U-ACTX-Hv 1 o una variante, como se ha descrito anteriormente para proteínas no afines. Las bibliotecas se pueden producir usando PCR propensa a errores del gen de U-ACTX-HV1a entero o un gen variante, o digestión del gen de U-ACTX-Hv1a o un gen variante con una enzima apropiada, a lo que sigue la reconstrucción por PCR propensa a error de la secuencia entera del gen. Estos procedimientos de PCR propensa o errores se podrían aplicar también a la secuencia completa del gen prepropolipeptídico de U-ACTX-Hv1a o una variante. La biblioteca de U-ACTX-Hv1a mutante o secuencias de gen variante se podrían usar luego para generar una serie de antagonistas de variantes de U-ACTX-Hc 1a. Estas variantes se podrían explorar luego en cuanto a su capacidad de inhibir la unión de U-ACTX-Hc1a, o una variante seleccionada suya, a su diana molecular. La exploración se puede realizar, por ejemplo, por presentación de genes de una biblioteca de genes mutantes seguida de selección de partículas de fagos que se unen estrechamente a la diana molecular de U-ACTX, o partículas de fagos que inhiben la unión de U-ACTX-Hv 1a, o su variante seleccionada, a la diana molecular de U-ACTX. Como lo entenderá un experto normal en la técnica, una biblioteca de genes mutantes se podría construir también por otros procedimientos biológicos moleculares estándar tales como mutagénesis de casetes de oligonucleótidos o la construcción de genes sintéticos con ciertas posiciones de nucleótidos al azar.
Se pueden usar U-ACTX o sus homólogos para explorar bibliotecas de compuestos en cuanto a moléculas insecticidas que se unen al mismo sitio que U-ACTX en canales de insectos. En una realización, la exploración se realiza por selección de compuestos que compiten con la unión de U-ACTX a canales de calcio voltaje-dependientes de insecto o que causan la liberación de U-ACTX que está preunido a canales de calcio voltaje-dependientes. En otra realización, la exploración se realiza por selección de compuestos que compiten con la unión de U-ACTX a canales de potasio activados por calcio de insecto o que causan la liberación de U-ACTX que está preunido a canales de potasio activados por calcio de insectos. En otra realización más, la exploración se puede realizar, por ejemplo, por selección de compuestos que impiden la unión de U-ACTX a canales de potasio activados por calcio de insectos y que también impiden la unión de U-ACTX a canales de calcio de insectos voltaje-dependientes, o por selección de compuestos que causan la liberación de U-ACTX que está preunido a canales de potasio activados por calcio y que también causan la liberación de U-ACTX que está preunido a canales de calcio voltaje-dependientes de
insectos.
Un procedimiento para seleccionar un compuesto de ensayo que se une a un canal de insecto comprende proporcionar el canal de insecto, en el que el canal de insecto es un canal de calcio voltaje-dependiente de insecto, un canal de potasio activado por calcio de insecto, o una combinación que comprende uno o más de los anteriores canales de insecto, y determinar si el compuesto de ensayo compite con la unión de un péptido de U-ACTX al canal de insecto, en el que el péptido de U-ACTX tiene una identidad mayor que o igual a aproximadamente 70% con la secuencia a la SEC ID nº. 2 y si tiene actividad insecticida. El procedimiento puede comprender además ensayar la capacidad del compuesto de ensayo para actuar como bloqueante de canales de calcio de insecto, o bloqueante de canales de potasio activados por calcio de insecto, o un bloqueante de ambos tipos de canales.
Un procedimiento para seleccionar un compuesto de ensayo que se une a un canal de insecto comprende proporcionar el canal de insecto, siendo el canal de insecto un canal de calcio voltaje-dependiente de insecto, un canal de potasio activado por calcio de insecto, o una combinación que comprende uno o más de los anteriores canales de insecto, y determinar si el compuesto de ensayo libera al menos una porción de un péptido de U-ACTX preunido al canal de insecto, teniendo el péptido de U-ACTX una identidad mayor que o igual a aproximadamente 70% con la secuencia a la SEC ID nº. 2 y teniendo actividad insecticida. El procedimiento puede comprender además ensayar la capacidad del compuesto de ensayo para actuar como bloqueante de canales de calcio de insecto, o bloqueante de canales de potasio activados por calcio de insecto, o un bloqueante de ambos tipos de canales.
La competición con un péptido de U-ACTX o la liberación de un péptido de U-ACTX preunido se puede determinar usando un péptido de U-ACTX marcado. Por ejemplo, la señal fluorescente obtenida de U-ACTX marcado fluorescentemente cambiará dependiendo del estado unido frente a estado no unido del péptido marcado. Alternativamente, la liberación de un U-ACTX marcado a un canal de calcio después de unir un compuesto de ensayo se puede medir como la liberación de U-ACTX radiomarcado desde el canal de calcio a, por ejemplo, la solución tampón circundante.
Un procedimiento para combatir un insecto comprende poner en contacto el insecto o una larva de insecto con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido U-ACTX. El polipéptido U-ACTX puede estar en forma de un polipéptido purificado, un polinucleótido que codifica el polipéptido U-ACTX opcionalmente en un vector de expresión, un virus de insecto que expresa al polipéptido U-ACTX, una célula tal como una célula de planta o una célula bacteriana que expresa el polipéptido U-ACTX, o una planta transgénica que expresa el polipéptido U-ACTX. El polipéptido U-ACTX también puede fusionarse con, o ser suministrado junto con, un agente que intensifica la actividad del polipéptido U-ACTX cuando es ingerido por insectos, tal como lectina de campanilla de invierno. El poner en contacto incluye, por ejemplo, la inyección del polipéptido U-ACTX, el contacto externo o la ingestión de polipéptido U-ACTX o el polinucleótido o el virus que expresa el polipéptido U-ACTX.
Un procedimiento para tratar una planta comprende poner en contacto la planta con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido U-ACTX. El polipéptido U-ACTX puede estar en forma de un polipéptido purificado, un polinucleótido que codifica el polipéptido U-ACTX opcionalmente en un vector de expresión, un virus de insecto que expresa al polipéptido U-ACTX, una célula tal como una célula de planta o una célula bacteriana que expresa el polipéptido U-ACTX.
En una realización, se proporciona una composición insecticida que comprende un polipéptido U-ACTX purificado y un vehículo, diluyente y/o excipiente agrícolamente aceptable. En otra realización una composición insecticida comprende un virus que expresa un polipéptido U-ACTX. Los virus de insecto se pueden replicar y expresar dentro de un insecto hospedador una vez que el virus infecta el insecto hospedador. Se puede conseguir infectar un insecto con un virus de insecto por procedimientos convencionales, incluidos la ingestión, la inhalación, el contacto directo del insecto o las larvas de insecto con el virus de insecto, y similares.
La composición insecticida puede estar en forma de solución o suspensión deslizable, tal como una solución o suspensión acuosa. Tales soluciones o suspensiones acuosas se pueden proporcionar como solución concentrada madre que se diluye para aplicación o, alternativamente, como solución diluida lista para aplicación. En otra realización, una composición insecticida comprende un gránulo dispersable en agua. En otra realización más, la composición insecticida comprende un polvo que se puede mojar, un polvo atomizado, un pélet o un concentrado coloidal. Las formas secas de las composiciones insecticidas se pueden formular para disolverlas inmediatamente después de mojarlas o, alternativamente, para disolverlas de manera que la liberación sea controlada, sostenida o que depende de otra manera del tiempo.
Cuando los polipéptidos U-ACTX pueden ser expresados por un virus de insecto, el virus que expresa el polipéptido U-ACTX se puede aplicar a la cosecha a proteger. El virus puede procesarse ingenierilmente para que exprese un polipéptido U-ACTX, solo o en combinación con otro u otros varios polipéptidos U-ACTX, o en combinación con otros insecticidas tales como otras toxinas polipeptídicas insecticidas que pueden dar por resultado una actividad insecticida intensificada o sinérgica. Entre los virus adecuados están incluidos, no limitativamente, los baculovirus.
Cuando las composiciones insecticidas comprenden células intactas (por ejemplo, células bacterianas) que expresan un polipéptido U-ACTX, tales células se pueden formular de diversas maneras. Se pueden emplear como polvos, gránulos o polvos atomizados que se pueden mojar, mezclados con diversos materiales inertes tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares), o materiales botánicos (mazorca de maíz pulverizada, cáscara de arroz, cáscara de nuez y similares) y combinaciones que comprenden uno o varios de los anteriores materiales. Las formulaciones pueden incluir coadyuvantes para dispersar-pegar, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas, tensioactivos y combinaciones que comprenden uno o varios de los anteriores aditivos. Las formulaciones líquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y se emplean como espumas, suspensiones, concentrados emulsionables y similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsivos, dispersivos, polímeros, liposomas y combinaciones que comprenden uno o varios de los ingredientes anteriores.
Alternativamente, los polipéptidos U-ACTX se pueden expresar in vitro y aislar para posterior aplicación en campo. Tales polipéptidos pueden estar en forma de lisados de células en bruto, suspensiones, coloides, etc., o se pueden purificar, refinar, tamponar y/o procesar más antes de formularlos en una formulación insecticida activa.
Independientemente del procedimiento de aplicación, la cantidad del (los) componente(s) activo(s) se aplica en una cantidad insecticidamente eficaz, que variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, los insectos específicos a controlar, la planta o cultivo específico a tratar, las condiciones ambientales y el procedimiento, la velocidad y la cantidad de aplicación de la composición insecticidamente activa.
Las composiciones insecticidas que comprenden polipéptidos U-ACTX, polinucleótidos, células, vectores, etc. se pueden formular con un vehículo agrícolamente aceptable. Las composiciones se pueden formular antes de su administración en un medio apropiado tal como un medio liofilizado, secado por congelación, desecado o en un vehículo acuoso, medio o diluyente adecuado tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un material granular o en polvo, o una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o una emulsión en agua o aceite/agua, o como polvo que se puede mojar, o en combinación con otro material vehículo apropiado adecuado para aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término "vehículo agrícolamente aceptable" cubre todos los coadyuvantes, por ejemplo, componentes inertes, dispersivos, tensioactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc. que se usan normalmente en la tecnología de formulación de insecticidas, y que son bien conocidos por los expertos en la formulación de insecticidas. Las formulaciones se pueden mezclar con uno o varios coadyuvantes sólidos o líquidos y preparar por varios procedimientos, por ejemplo, por mezcla homogénea, combinación y/o trituración de la composición insecticida con coadyuvantes adecuados usando técnicas convencionales de formulación.
Las composiciones insecticidas se pueden aplicar en el medio del insecto diana, por ejemplo, sobre el follaje de la planta o cultivo a proteger, por procedimientos convencionales, preferiblemente por pulverización. La potencia y duración de la aplicación insecticida puede fijarse atendiendo a las condiciones específicas para la(s) plaga(s), cultivo(s)
a tratar y las condiciones ambientales particulares. La relación proporcional de ingrediente activo a vehículo dependerá naturalmente de la naturaleza química, la solubilidad y la estabilidad de la composición insecticida, así como de la formulación particular contemplada.
También son factibles otras técnicas, por ejemplo, atomización de polvo, dispersión por proyección, remojo, inyección en el suelo, revestimiento de semillas, revestimiento de retoños, pulverización, aireación, creación de niebla de insecticida, proyección de polvo y similares, que se pueden requerir en ciertas circunstancias tales como, por ejemplo, insectos que causan infección de la raíz o el tallo, o para aplicación a vegetación delicada o plantas ornamentales. Estos procedimientos de aplicación son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las composiciones insecticidas se pueden aplicar individualmente o en combinación con otros compuestos, incluidos, no exclusivamente, otros plaguicidas. Se pueden usar junto con otros tratamientos tales como con tensioactivos, detergentes, polímeros o formulaciones de liberación con el tiempo. Las composiciones insecticidas pueden comprender un atractivo para el insecto. Las composiciones insecticidas se pueden formular para uso tópico o sistémico. Tales agentes también se pueden aplicar directamente a los insectos.
La concentración de la composición insecticida que se usa para aplicación ambiental, sistémica o foliar puede variar dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, el medio de aplicación, las condiciones ambientales y el grado de actividad biocida.
Alternativamente, se puede procesar por ingeniería un cultivo para expresar U-ACTX solo o en combinación con otras toxinas de polipéptidos insecticidas, lo que puede dar por resultado una actividad insecticida intensificada o sinérgica. Los cultivos para los que este enfoque sería útil incluyen, no limitativamente, algodón, tomate, elote, alfalfa, soja, sorgo, guisante, semilla de lino, alazor, colza, girasol y altramuz.
Entre los artrópodos de importancia agrícola, doméstica y/o médica/veterinaria adecuados para tratamiento con los polipéptidos de la invención están incluidos, por ejemplo, miembros de las clases y órdenes: Coleópteros tales como el gorgojo americano de alubia Acanthoscelides obtectus, el escarabajo de hojas Agelastica alni, los escarabajos elatéridos (Agriotes lineatus, Agriotes obscurus, Agriotes bicolor), el escarabajo de cereales Ahasverus advena, el abejorro de verano Amphimallon solstitialis, el escarabajo de mobiliario Anobium punctatum; esp Anthonomus (gorgojos), el escarabajo criptofágido pigmeo Atomaria linearis, los escarabajos de alfombras (esp Anthrenus, esp Attagenus), el gorgojo de guisante de vaca Callosobruchus maculatus, el escarabajo de frutas de sartén Carpophilus hemipterus, el gorgojo de vainas vegetales, Ceutorhynchus assimilis, el gorgojo de tallos de invierno de colza Ceutorhynchus picitarsis, los gusanos filamentosos Conodeus vespertinus y Conoderus fali, el gorgojo de plátano Cosmopolites sordidus, la larva de hierba de Nueva Zelanda Costelytra zealandica, el escarabajo de junio Cotinis nítida, el gorgojo de tallos de girasol Cylindrocopturus adspersus, el escarabajo de alacena Dermestes lardarius, los gusanos de la raíz de maíz Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera y Diabrotica barberi, el escarabajo de guisante mejicano Epilachna varivestis, el insecto perforador Hylotropes bajulus, el gorgojo de alfalfa Hypera postica, el escarabajo de araña brillante Gibbium psylloides, el escarabajo de cigarrilos Lasioderma serricorne, el escarabajo de patata de Colorado Leptinotarsa decemlineata, los escarabajos saprofitos xilófagos Lyctus (esp Lyctus), el escarabajo de polen Meligethes aeneus, el abejorro martillo común Melolontha melolontha, el escarabajo de araña americana Mezium americanum, el escarabajo de araña dorada Niptus hololeucus, los escarabajos de cereales Oryzaephilus surinamensis y Oryzaephilus mercator, el escarabajo de vid negra Otiorhynchus sulcatus, el escarabajo de mostaza Phaedon cochleariae, el escarabajo saltarín Phyllotreta cruciferae, el escarabajo a rayas Phyllotreta strioalata, el escarabajo de repollo Psylliodes chrysocephala, esp Ptinus. (escarabajos araña), el perforador menor de cereales Rhizopertha dominica, el escarabajo de guisante y alubias Sitona lineatus, los escarabajos de arroz y cereales Sitophilus oryzae y Sitophilus granarius, el gorgojo rojo de semilla de girasol Smicronyx fulvus, el escarabajo de droguería Stegobium paniceum, el escarabajo amarillo de alimentos Tenebrio molitor, los escarabajos de harinas Tribolium castaneum y Tribolium confusum, los escarabajos de almacenes y retretes (esp Tragoderma) y el escarabajo de girasol Zyogramma exclamationis;
Dermópteros (tijeretas) tales como la tijereta europea Forficula auricularis y la tijereta a rayas Labidura rioparia; Dictiópteros tales como la cucaracha oriental Blatta orientalis, la cucaracha alemana Blatella germanica, la cucaracha de Madeira Leucophaea maderae, la cucaracha americana Periplaneta americana y la cucaracha pardoahumada Periplaneta fuliginosa; Diplópodos tales como el ciempiés de caracol con manchas Blaniulus guttulatus, el ciempiés de espalda plana Brachydesmus superus y el ciempiés de invernadero Oxidus gracilis; Dípteros tales como la mosca califórida africana (Cordylobia anthropophaga), mosquitos de arena (esp Culicoides), piojo de abeja (esp Braula), la mosca de remolacha Pegomya betae, moscas negras (esp Cnephia, esp Eusimulium., esp Simulium), moscas cuterébridas (esp Cuterebra., esp Gastrophiluss., esp Oestrus), típulas (esp Tipula), mosca ciclorrafa del ojo (esp Hippelatres), moscas que se crían en las carroñas (esp Callíphora., esp Fannia, esp Hermetia., esp Lucilia, esp Musca, esp Muscina, esp Phaenicia, esp Phormia), moscarda de la carne (esp Sarcophaga, esp Wohlfarthia), el mosquito de los ojos Oscinella frit, moscas de frutas (esp Dacus, esp Drosophila), moscas de cabezas y carne putrefacta (esp Hydrotea), la mosca de arpillera Mayetiola destructor, la mosca de cuernos y de búfalo (esp Haematofobia), moscas de caballo y ciervo (esp Chrysops, esp Haematopota, esp Tabanus), moscas de piojo (esp Lipoptena, esp Lynchia y esp Psorophora), mosca de fruta mediterránea (esp Ceratitus), mosquitos (esp Aedes, esp Anopheles, esp Culex, esp Psotophora), moscas de arena (esp Phlebotomus, esp Lutzomya), moscas de gusano tornillo (Chrysomya bezziana y Cochliomyia hominovorax), garrapata de la oveja (esp Melophagus); moscas de los establos (esp Stomoxys), moscas tsé tsé (esp Glossina) y tábanos (esp Hypoderma); Isópteros (termitas), incluidas especies de las familias Hodotermitidae, Kalotertermitidae, Mastotermidae, Rhinotermitidae, Serritertermidae, Termitidae, Termopsidae; Heterópteros tales como el chinche de camas Cimex lecturalius, el chinche del algodón Dysdercus intermedius, la plaga solar Eurigaster integripces, el chinche manchado de plantas Lygus lineolaris, el chinche verde hediondo Nezara antennata, el chinche verde hediondo sureño Nezara viridula, y los chinches triatómidos Panstrogylus megistus, Rhodnius ecuadorinensis, Rhodnius pallescans, Rohdnius prolixus, Rohdnius robustus, Triatoma dimiata, Triatoma infectans y Triatoma sordida; Homópteros tales como la roña roja de California Aonidiella auranti, el áfido negro de alubia Aphis fabae, el áfido de algodón o melón Aphis gossypii, el áfido verde de manzana Aphis pomi, la mosca blanca de cítricos Aleurocantus spiniferus, la roña de la adelfa Aspidiotus hederae, la mosca blanca de patata dulce Bemesia tabaci, la polilla del repollo Brevicoryne brassicae, la sila de la pera Cacopsylla pyricola, el áfido corriente Cryptomyzus ribis, la filoxera de la uva Daktulosphaira vitifoliae, la sila de cítricos Diaphorina citri, la cigarra de las hojas de la patata Empoasca fabae, la cigarra de hojas de alubias Empoasca solana, la cigarra de las hojas de la vid Emposca vitis, el pulgón lanoso Eriosoma lanigerum, la roña europea de frutas Eulecanium comi, el áfido de la ciruela Hyalopterus arundinis, la pequeña cigarra marrón de plantas Laodelphax striatellus, el áfido de la patata Macrosiphum euphorbiae, el áfido verde del melocotón Myzus persicae, la cigarra verde de hojas del arroz Nephotettix cinticeps, la cigarra marrón de plantas Nilaparvata lugens, los áfidos que forman hiel (esp Pemphigus), el pulgón del lúpulo Phorodon humuli, el pulgón negro de los cereales Rhopalosiphum padi, la cochinilla de tizne Saissetia oleae, chinche verde Schiaapus graminum, el áfido de cereales Sitobion avenae, y la mosca blanca de invernadero Trialeurodes vaporariorum; Isópodos tales como el bicho bolita común Armadillidium vulgare y el piojo de la madera común Oniscus asellus; Lepidópteros tales como Adoxophyes orana (mariposa tortrícida de frutales), Agrotis ipsolon (gusano cuchillo negro), Archips podana (mosca tortrícida de frutales), Bucculatrix pyrivorella (desfoliador de las hojas del peral), Bucculatrix thurberiella (perforador de las hojas del algodón), Bupalux piniarius (oruga del pino), Carcopapsa pomonella (mariposa tortrícida), Chilo suppressalis (perforador del arroz a rayas), Choristoneura fumiferana (mariposa tortrícida del éste), Cochylis hospes (mariposa del girasol con bandas), Diatraea grandiosella (perforador del maíz), Earis insulana (larva de mariposa egipcia), Euphestia kuehniella (mariposa mediterránea de la harina), Eupoecilla ambiguella (mariposa de la uva europea), Euproctis chrysorrhea (oruga de zurrón), Euproctis subflava (mariposa de color apagado), Gallearía mellonella (mosca mayor de la cera de abejas), Helicoverpa armigera (larva de mariposa del algodón), Helicoverga zea (larva de mariposa del algodón), Heliothis virescens (larva de mariposa del tabaco), Hofmannophila pseudopretella (mariposa doméstica marrón), Homeosoma electellum (mariposa del girasol), Homona magnánima (mariposa tortrícida oriental del árbol de té), Lithocolletis blancardella (desfoliador con forma de tienda de campaña moteado), Lymantria dispar (mariposa gitana), Melacosoma neustria (oruga de tienda de campaña), Mamestra brassicae (gusano de polilla del repollo), Mamestra configurata (gusano de polilla Berta), los gusanos trompeteros Manduca sexta y Manduca quinquemaculata, Operaphtera brumata (mariposa de invierno), Ostrinia nubilalis (perforador de maíz europeo), Panolies flamea (mariposa noctuída del pino), Pectinophora gossypiella (larva de mariposa rosa), Phyllocnitis citrella (desfoliador de cítricos), Pieris brassicae (mariposa blanca del repollo), Plutella xylostella (palomilla dorso de diamante), Rachiplusia ni (oruga del haba de soja), Spilosoma virginica (gata peluda norteamericana), Spodoptera exigua (gusano de polilla de la remolacha), Spodoptera frugiperda (gusano de polilla de otoño, Spodoptera littoralis (gusano de polilla del algodón), (oruga de polilla común), Spodoptera praelica (oruga de polilla con rayas amarillas), Sylepta derogata (insecto que enrolla las hojas del algodón), Tineola bisselliella (mariposa tejedora), Tineola pellionella (mariposa de telas que hace caja), Tortrix viridiana (desfoliador de roble europeo), Trichoplusia ni (oruga del repollo), Yponeumeta padella (mariposa pequeña del armiño); Ortópteros tales como el grillo común Acheta domesticus, langostas de árboles (esp Anacridium), la langosta migratoria Locusta migratoria, la cigarra de la hierba de rayas dobles Melanus bivittatus, la cigarra de la hierba diferencial Melanopus differencialis, la cigarra de la hierba de patas rojas Melanoptus femurrubrum, la cigarra migratoria Melanoplus sanguinipes, el grillo topo Neocurtilla hexadectyla, la langosta roja Nomadacris septemfasciata, el grillo topo de alas cortas Scapteriscus abbreviatus, el grillo topo del sur Scapteriscus borelli, el grillo topo pardo rojizo Scapteriscus vicinus y la langosta del desierto Schistocerca gregaria; Ftirápteros tales como el piojo que pica el ganado Bovicola bovis, el piojo que pica (esp Damalinia), el piojo del gato Felicola subrostrata, el piojo de nariz corta del ganado Haematopinus eurystemus, el piojo con mechón en la cola Haematopinus quadripertussus, el piojo del cerdo Haematopinus suis, el piojo de la cara Lignonatus ovillus, el piojo de los pies Linognatus pedalis, el piojo que chupa el perro Linognatus setosus, el piojo de nariz larga del ganado Linognatus vituli, el piojo del cuerpo de los pollos Menacanthus stramineus, el piojo de las plumas de aves Menopon gallinae, el piojo del cuerpo humano Pediculus humanus, el piojo púbico Phthirus pubis, el piojo pequeño azul del ganado Solenopotes capillatus y el piojo que pica los perros Trichodectes canis; Psocópteros tales como los piojos de libros Liposcelis bostrychphilia, Liposcelis decolor, Liposcelis entomophila y Trogium pulsatorium; Sifonápteros tales como la pulga de pájaros Ceratophylus gallinae, la pulga del perro Ctenocephalides canis, la pulga del gato Ctenocephalides felis, la pulga humana Pulex irritans y la pulga de rata oriental Xenopsylla cheopis; Sínfilos tales como el sínfilo de jardín Scutigerella immaculata; Tisanuros tales como el pececillo de plata gris Ctenolepisma longicaudata, el pececillo de plata de cuatro rayas Ctenolepisma quadriseriata, el pececillo de plata común Lepisma saccharina y el pececillo del fuego Thermobia domestica; Tisanópteros tales como el trip del tabaco Frankliniella fusca, el trip de flores Frankliniella intensa, el trip de flores del occidente Frankliniella occidentalis, el trip de capullos del algodón Frankliniella schultzei, el trip bandeado de invernadero Hercinothrips femoralis, el trip de habas de soja Neohydatothrips variabilis, el trip de cítricos de Kelly Pezothrips kellyanus, el trip de aguacate Scirtothrips perseae, el trip de melón Thrips palmi y el trip de cebolla Thrips tabaci; y similares, y combinaciones que comprenden uno o más de los insectos anteriores.
En una realización, las composiciones insecticidas que comprenden los polipéptidos U-ACTX, polinucleótidos, células, vectores, etc. se pueden emplear para tratar ectoparásitos. Entre los ectoparásitos están incluidos, por ejemplo, pulgas, garrapatas, sarna, ácaros, mosquitos, moscas molestas y que pican, piojos, y combinaciones que comprenden uno o varios de los anteriores ectoparásitos. El término pulga incluye las especies usuales o accidentales de la mosca del orden Siphonaptera y, en particular, la especie Ctenocephalides, en particular, C. felis y C. canis, pulgas de rata (Xenopsylla cheopis) y pulgas humanas (Pulex irritans). Se pueden tratar ectoparásitos de animales de granja (por ejemplo, ganado), animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros) y del hombre. En el caso de animales de granja y domésticos, el tratamiento puede incluir la impregnación de un collar o la aplicación tópica en una región localizada seguida de la difusión a través de la dermis del animal. Tal composición puede ser adecuada para aplicación al cuero cabelludo de una persona, como puede ser en forma de champú o acondicionador.
La invención se ilustra adicionalmente con los siguientes ejemplos no limitativos
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
Ejemplo 1
Identificación de U-ACTX-Hv1a y homólogos
Se obtuvo una araña hembra Hadronyche versuta de la región de las Montañas Azules de Nueva Gales del Sur, Australia. Se recogieron arañas Atrax robustus macho y hembra en el área metropolitana de Nueva Gales del Sur, Australia. Las muestras se alojaron en recipientes de recogida impermeables al aire hasta la extracción de las glándulas de veneno. Las arañas de telaraña de embudo se enfriaron a -60ºC durante 40-60 min. Se diseccionaron independientemente las glándulas de veneno de cada muestra. Cada pareja de glándulas de veneno se puso independientemente en tampón de extracción (Amersham Pharmacia Biotech).
Inmediatamente después de aislar la glándula del veneno, se preparó poli A + ARNm usando un kit QuickPrep Micro mRNA Purification (Amersham Pharmacia Biotech). Las muestras de ARNm purificadas se lavaron con etanol al 80% y se secaron con un Speedvac. Para rehidratar las muestras de ARNm se usaron 10 \mul (microlitros) de agua destilada exenta de ARNasa. Las muestras de ARNm purificado se almacenaron a -20ºC.
Después se construyeron bibliotecas de ADNc usando un kit de amplificación de ADNc Marathon (CLONTECH). En resumen, se aisló poli A + ARN del que se obtuvo ADNc ds. El ADNc se ligó a ADN adaptador para formar una biblioteca de moléculas de ADNc adaptador. A partir del molde de ARNm adaptado se construyeron los ADNc de cadena simple usando transcriptasa inversa Superscript III (Life Technologies, Inc.) y cebador Echoclonanch-2, un cebador de anclaje poli(dT) (GGGCAGGT_{17}). La síntesis de la segunda cadena se realizó de acuerdo con las especificaciones del kit. Los productos de ADNc es purificaron usando el lit Concert Rapid PCR Puriifcation, un cartucho de purificación de alto rendimiento (GIBCO). El ADNc de doble cadena se eluyó con 50 \mul de tampón Tris-EDTA (10 mM) Tris-Cl, EDTA 1 mM, pH 8,0).
El adaptador de amplificación de ADNc Marathon (CLONTECH) se ligó luego a ADNc de doble cadena. Se dejó que la reacción de ligación transcurriera a 16ºC durante la noche. Después de la ligación durante la noche, se precipitó la muestra usando 10 \mul de una dilución 1 a 20 de glicógeno, 10 \mul de acetato sódico 3M pH 5,2 y 100 \mul de etanol al 100% frío. Seguidamente se lavó la muestra con etanol al 80% y se secó durante 10 min antes de volver a ponerla en suspensión en 200 \mul de tampón Tris-EDTA.
Se obtuvo información de la secuencia líder usando 5' RACE (Amplification Rápida de los extremos de ADNc; véase Forman y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 8993-9002). Para esta técnica se diseñaron cebadores redundantes de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los cebadores redundantes se usaron junto con un cebador adaptador universal (EchoAP1) con el fin de obtener información desconocida de la secuencia líder. Los cebadores para 3' RACE se diseñaron a partir de la secuencia líder de ADNc obtenida de 5' RACE. Los cebadores 3' RACE se usaron en combinación con cebador oligo d(T) adaptador universal (CLONTECH) para generar productos génicos que tienen una secuencia de señal homóloga a la de U-ACTX-Hv 1a. Todos los cebadores no incluidos en los kits los construyó PROLIGO Ltd. Los cebadores 5' RACE fueron:
SEC ID nº: 29:
CACCCCTAATACGACTCACTATAGG
SEC ID nº: 30:
(A/G)TTNCC(A/G)TT(T/C)(A/G)TT(T/C)TC(T/C)TC(A/G)AA
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores 3' RACE fueron:
SEC ID nº: 31:
TGCTGCAATATGAATACCGC
SEC ID nº: 32:
GGGCAGGTTTTTTTTTTTTTTTTT
Las reacciones PCR se realizaron usando 5 \mul de ADNc de doble cadena, 27 \mul de agua Milli Q, MgCl_{2} 25 mM, tampón 10x de PCR, dNTPs 50x y 5 \mul de enzima AMPLI_{GOLD}TAQ (Perkin Elmer, AmploTaqGold con kit GeneAmp). Las reacciones PCR se realizaron en un ciclador térmico usando el protociolo siguiente (Tabla 1)
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Protocolo de ciclación térmica para reacciones PCR
29
Los productos de ADNc amplificados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se tiñeron con bromuro de etidio para verificación del tamaño.
Los productos de PCR verificados se extrajeron del gel de agarosa usando un kit de purificación de gel GIBCO y se precipitaron usando el kit coprecipitante Pellet Paint (Novagen). Una vez precipitados, los extremos de ADNc se fosforilaron con quinasa para prepararlos para la clonación. Las muestras se ligaron en el vector pSMART y se transformaron en células E. cloni (Lucigen) usando el kit Lucigen CloneSmart Blunt Cloning. Los clones transformados con éxito se cultivaron durante 1 hora en caldo Terrific con 50 \mug de ampicilina y luego se cultivaron para que crecieran durante la noche.
Las muestras se ensayaron por PCR y electroforesis en gel en cuanto al tamaño correcto del inserto. Se obtuvieron por secuenciación de numerosos clones secuencias completas de ADNc que codifican la forma de prepropolipéptido de U-ACTX-Hv1a (SEC ID nº. 1) y ocho homólogos de él (SEC ID n^{os}. 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23 y 26).
En la Figura 1 se resumen las secuencias de prepropolipéptidos. El sitio de escisión del polipéptido señal de estos prepropolipéptidos se predijo usando la versión 3.0 del programa SignalP (Dryløv y otros, Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0, Journal of Molecular Biology (2004) 340, 783-795, programa disponible en la red en http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Se predice que el polipéptido maduro resulta de la escisión del propolipéptido siguiendo la secuencia dibásica Arg-Arg en las posiciones 36-37, como para el sitio de escisión conocido en los polipéptidos \omega-ACTX-1 producidos por las mismas arañas. Estos dos sitios de escisión endoproteolítica se señalan con flechas en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Preparación de una forma recombinante de U-ACTX-Hv1a
Por hibridación, extensión y amplificación de oligonucleótidos que se solapan se diseñó un gen sintético que codifica los restos 3 a 39 de la región polipeptídica madura predicha de U-ACTX-Hv1a (véase la Figura 2). En la primera etapa se anillaron 4 oligopéptidos que codifican las regiones 3 a 39 de U-ACTX-Hv1a y se extendieron con Pfu polimerasa. Se optimizó el uso de codón en los 4 oligonucleótidos para expresión óptima de Escherichia coli. Los 4 oligonucleótidos se designan
30
31
32
Los 4 oligonucleótidos se añadieron a una concentración final de 2 \muM en 50 \mul de tampón de reacción. La mezcla de reacción contenía también mezcla de dNTP 400 \muM (Invitrogen). La reacción de hibridación tuvo lugar a 60ºC durante 15 minutos. La temperatura se elevó luego a 72ºC y la mezcla se incubó más durante 30 minutos después de añadir 2,5 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene).
En la segunda etapa se usaron como molde 20 \mul de la mezcla de reacción para una amplificación estándar por PCR de la secuencia codificadora entera con los cebadores FW178-F (SEC ID nº 37: cgggatccTGCGTTCCGGTTGACCAG CCG) y FW178-R (SEC ID nº. 34) (véase la Fig. 2). Estos cebadores contienen un sitio 5' BamHI y 3' EcoRI, respectivamente, a fines de clonación. El producto amplificado por PCR se digirió con BamHI y EcoRI y se subclonó el vector PGEX-2T digerido con BamHI/EcoRI usando procedimientos estándar. El plásmido resultante (pBLS1) codifica los restos 3 a 39 de la secuencia de polipéptido maduro como una fusión en marco al término C glutationa S-transferasa (GST) de de Schistosoma japonicum. Un sitio de escisión de trombina situado entre las regiones de codificación de GST y U-ACTX-Hv1a permite la liberación del polipéptido de la proteína de fusión por escisión de la trombina. El polipéptido liberado contiene la secuencia de dipéptido Gly-Ser (un vestigio del sitio de escisión de la trombina) anexa al término N de los restos 3 as 39 de U-ACTX-Hv1a; en este documento se designa este resto 39 de polipéptido rU-ACTX-Hv1a.
Células BL21 de Escherichia coli se transformaron con pBLS1 para hiperproducción de la proteína de fusión GST:rU-ACTX-Hv1a. Las células se hicieron crecer en medio LB a 37ºC a una DO_{600} de 0,6 a 0,8 antes de inducir la proteína de fusión con isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 300 \muM. Las células se cosecharon por centrifugación a una DO_{600} de 1,9-2,2 y luego se lisaron por sonicación. El polipéptido de fusión recombinante se purificó de la fracción soluble de células usando cromatografía de afinidad en GSH-Sepharose (Amersham Biosciences) y luego se escindió en la columna añadiendo trombina bovina (Sigma) durante aproximadamente 24 horas. El polipéptido U-ACTX no unido se eluyó de la columna con solución salina tamponada con Tris (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 8,0) y se purificó inmediatamente usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (rpHPLC). El polipéptido U-ACTX recombínante y los contaminantes se eluyeron de una columna analítica Vydac C18 rpHPLC (4,6 x 250 mm, tamaño del poro 5 \mum) a un caudal de 1 ml/min usando un gradiente lineal de 10-32% de acetonitrilo a lo largo de 20 minutos. Eluyó un pico mayor individual que corresponde al polipéptido U-ACTX purificado por rpHPLC para un tiempo de retención de aproximadamente 9 minutos. El análisis espectral de masas por electropulverización del polipéptido U-ACTX purificado por rpHPLC dio una masa molecular de 4273 Da, que es idéntica a la masa molecular predicha del rU-ACTX-Hv1a totalmente oxidado, en el que las seis cisteínas forman tres enlace disulfuro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
U-ACTX-Hv1a recombinante es letal para los insectos
La actividad insecticida de rU-ACTX-Hv1a se determinó cuantitativamente por inyección directa en Musca domestica (moscas domésticas) de polipéptidos disueltos en solución salina de insecto. A las moscas de sexo indeterminado (peso corporal de 10 a 25 mg) se inyectaron 1-2 \mul de polipéptido a concentraciones de 10 a 10^{5} pmol/g. Se inyectaron a moscas de control 2 \mul de solución salina de insecto. Se inyectó a 10 moscas polipéptido a cada concentración. Para administrar inyecciones torácicas dorsales se usó un microaplicador Arnold (Burkard Scientific Supply, Rickmansworth, Inglaterra) equipado con una aguja de galga 29. Las moscas se inmovilizaron temporalmente a 4ºC para las inyecciones e inmediatamente después se pasaron a una habitación a temperatura ambiente (24ºC).
La Figura 3 muestra la curva de dosis-respuesta para rU-ACTX-Hv1a obtenida usando este procedimiento. Cada punto representa la media de tres mediciones independientes realizadas en días diferentes. El valor de DL_{50} (esto es, la dosis de rU-ACTX-Hv1a que mata el 50% de las moscas al cabo de 24 horas después de la inyección) se calculó ajustando la ecuación siguiente a la curva log dosis-respuesta.
y = (a-b)/[1\ +\ (x/DL_{50})^{n}]
en la que y es el porcentaje de muertes en la población de muestra 24 horas después de la invención, x es la dosis de toxina en pmol/g, n es un factor de pendiente variable, a es la respuesta máxima y b es la respuesta mínima. El valor de DL_{50} calculado de 1200 \pm 4 pmol/g hace a rU-ACTX una de las toxinas peptídicas insecticidas más potentes descubiertas hasta ahora.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Determinación de las dianas moleculares de experimentos de ru-ACTX-Hv1a con neuronas DUM de la cucaracha americana Periplaneta americana Protocolos
Las neuronas DUM de P. americana contienen canales de calcio de los que se pueden registrar corrientes de canal Ca_{v} (I_{Ca}) usando técnicas de registro con pinza de micropipeta ("Patch-Clamp") de célula entera. Se aislaron cuerpos de células de neuronas DUM de la linea central del ganglio abdominal terminal (TAG) del cordón nervioso de P. americana. Se anestesiaron las cucarachas enfriándolas a -20ºC durante aproximadamente 5 minutos. Se pusieron luego con el lado dorsal hacia arriba en un plato desecador y se extrajeron la cutícula dorsal, el contenido del intestino y los músculos longitudinales. Se identificó el cordón nervioso gangliónico y se quitó cuidadosamente el TAG, que se puso en solución salina normal de insectos (NIS) que contenía NaCl 200 mM, KCl 3,1 mM, CaCl_{2} 5 mM, MgCl_{2} 4 mM, N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-2-ácido etanosulfónico] 10 mM (EDTA), sacarosa 50 mM con 5% vol/vol de suero de ternero bovino y se añadieron 50 IU/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina (Trace Biosciences, Noble Park, Australia) y el pH se ajustó a 7,4 usando NaOH.
Se diseccionó cuidadosamente el TAG y se puso en solución salina de insectos exenta de Ca^{+2}/Mg^{2+} que contenía NaCl 200 mM, KCl 3,1 mM, HEPES 10 mM, sacarosa 60 mM, 50 IU/ml de penicilina y 50 IU/ml de estreptomicina, con el pH ajustado a 7,4 usando NaOH. Los ganglios es enfriaron y se incubaron durante 20 minutos en solución salina de insectos exenta de Ca^{2+}/Mg^{2+} que contenía 1,5 mg/ml de colagenasa. Los ganglios se enjuagaron tres veces en solución salina normal de insectos. La suspensión resultante se distribuyó en 8 pocillos de una placa múltiple de 24 pocillos. Cada pocillo contenía un cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro que previamente se había revestido con concavalina A (2 mg/ml). Se dejó que las células aisladas se adhirieran a los cubreobjetos durante la noche en una incubadora (100% de humedad relativa, 37ºC).
En los experimentos electrofisiológicos se empleó la técnica registro con micropipeta en la configuración de célula entera para medir las corrientes de sodio, potasio y calcio voltaje-dependientes de las neuronas DUM de cucaracha. Los cubreobjetos con las células aisladas se pasaron a una cámara de perfusión de 1 ml con fondo de vidrio montada sobre la platina de un microscopio de contraste de fase. Los registros para célula entera de las corrientes de sodio, potasio y calcio se hicieron usando un amplificador integrador Axopatch 200A (Axon Instruments, Foster City, CA). Se usaron tubos capilares de vidrio de borosilicato (Harvard Apparatus Ltd., Kent, RU) para tirar de las micropitetas de registro para un solo uso.
Se varió el contenido de las soluciones externas e internas de acuerdo con el tipo de procedimiento de registro empleado y también con la corriente iónica particular que se estaba estudiando. El contenido de todas las soluciones internas y externas usadas en los estudios electrofisiológicos con micropipetas se detallan en las Tablas 2 a 4. En todos los experimentos el potencial de mantenimiento era de -80 mV. La resistencia de la punta del electrodo estaba siempre en el intervalo de 0,8-4,0 M\Omega. La osmolaridad de las soluciones externas e internas se ajustó a 310 mosmol/litro con sacarosa para disminuir la tensión osmótica. El potencial de la unión líquida entre las soluciones internas y externas se determinó usando el programa JPCalc (Barry (1994) J. Neurosci. Method. 51, 107-116) y todos los datos se compensaron para este valor.
TABLA 2 Composición de soluciones externas e internas usadas para registros electrofisiológicos de corriente de potasio para neuronas DUM de cucaracha
33
TABLA 3 Composición de soluciones externas e internas usadas para registros electrofisiológicos de corriente de sodio para neuronas DUM de cucaracha 
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Composición de soluciones externas e internas usadas para registros electrofisiológicos de corriente de calcio para neuronas DUM de cucaracha 
\vskip1.000000\baselineskip
35 
\vskip1.000000\baselineskip
Para los experimentos se seleccionaron neuronas DUM grandes con forma de lágrima con diámetros mayores que 45 \mum. Se aplicaron al baño impulsos de mando invertidos de pinza de voltaje mediante un puente de pélet Ag/AgCl/KCl 3M-agar. Después de formar un sello de gigaohm, se aplicó succión para romper a través de la membrana. Los experimentos no comenzaron durante un período de 5 a 10 minutos para el bloqueo completo de corrientes superfluas. Se rechazaron experimentos individuales si había corrientes de fugas o si las corrientes presentaban signos de mal pinzamiento en el espacio tales como una activación abrupta de corrientes después de pulsos de despolarización relativamente pequeños. Todos los productos químicos eran de calidad analítica y fueron suministrados por Sigma Chemicals con la excepción de la tetrodoxina, de Alomone Labs. (Jerusalén, Israel). Los datos, cuando se cuantifican, se expresan como medias \pm error estándar.
La estimulación y el registro se controlaron por un sistema de adquisición de datos AxoData (Axon Instruments) aplicado en un ordenador Apple Macintosh. Los datos se filtraron a 5 kHz (filtro Bessel de bajo paso) y las velocidades de muestreo digital eran de entre 15 y 25 kHz dependiendo de la longitud del protocolo de voltaje. Las corrientes de fugas y de capacitancia se restaron digitalmente con procedimientos P-P4. El análisis de datos se realizó fuera de línea después de finalizar el experimento. Los datos de I/V se ajustaron por regresión no lineal de la ecuación siguiente sobre los datos
I = g_{max} \{1 -(1/(1 + exp[V - V_{1/2})/s]))\}(V - V_{rev})
en la que I es la amplitud de la corriente pico a un potencial dado, V; g_{max} es la conductancia máxima; V_{1/2} es el voltaje a la activación semimáxima; s es el factor de pendiente y V_{rev} es el potencial inverso.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Las corrientes de canal Ca_{v} (I_{Ca}) se registraron de neuronas DUM de P. americana usando técnicas de registro de pinza de micropipeta de célula entera. Las neuronas DUM producen corriente de canal de sodio (I_{Na}) sensible a tetrodoxina (TTT) y numerosas corrientes de canal de potasio (I_{K}) voltaje-dependientes después de pulsos de ensayo de despolarización. Estas corrientes se bloquearon usando una combinación de TTX, tetraetilamonio (TEA) y Cs, dejando así intactas las corrientes que pasaban a través de los canales de Ca_{v}.
Una vez que se aislaron las corrientes de canal de calcio Ca_{v}, a las neuronas DUM se aplicaron varias concentraciones de rU-ACTX-Hv1a. A una concentración de 1 \muM, rU-ACTX-Hv1a bloqueaba la mayoría de las corrientes de Ca_{v} en las neuronas DUM. La curva de dosis-respuesta (Figura 4) indica que rU-ACTX-Hv1a bloquea las corrientes de Ca_{v} en neuronas DUM con una IC_{50} de 409 nM. No había desplazamientos significativos de la voltaje-dependencia de la activación de canal, como lo evidencian los gráficos de corriente.voltaje (I_{Ca}/V), lo que indica que el rU-ACTX-Hv1a es un bloqueante de poro en oposición a un modificador de la dependencia.
A diferencia con los efectos sobre las corrientes de calcio, se encontró que rU-ACTX-Hv1a no tiene efecto sobre las corrientes de sodio en neuronas DUM a concentraciones de hasta 1 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Determinación de las dianas moleculares de rU-ACTX-Hv1a. Experimentos con canales pSlo de cucaracha expresados heterólogamente Protocolos
Células embrionarias de riñón humano (HEK293) (American Type Culture Collection, Bethesda, MD, USA) se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbesco (DMEM/High Modified, JRH Biosciences, Lenexa KS, USA) suplemantado con suero de ternero bovino al 10%. La expresión de los canales pSlo (canales de canal de potasio activados con calcio, de alta conductancia, de P. americana) se realizó por transfección de las células HEK293 con una construcción que contenía la región codificadora de pSlo clonada en el vector de expresión ADNpc3.1, que también presenta el gen de resistencia G418 (Invitrogen BV, San Diego, CA, USA). Se transfectaron monocapas de HEK293 en discos de 35 mm^{2} usando 9 \mul de Lipofectamine Reagent (Gibco, BRL) y 5 \mug de ADN. Luego se seleccionaron células transfectadas establemente con 1000 \mug/ml de G418 (Gibco, Grand Island, NY, USA). Estas células se mantuvieron en el medio de crecimiento normal descrito antes y se cultivaron en cubreobjetos estériles de vidrio a usar para los experimentos de pinza de micropipeta que se describen seguidamente.
Se midieron corrientes de canal de pSlo de célula entera a temperatura ambiente usando pipetas de borosilicato (Harvard Apparatus Ltd., Kent, RU) con resistencias de 2-4-M\Omega. Las mediciones de corriente se hicieron usando un amplificador integrador Axopatch 200 A (Axon Instruments, Foster City, CA, USA). En todos los experimentos, el potencial de mantenimiento era de -90 mV. Para registrar las corrientes de pS10 de célula entera, se llenaron pipetas con una solución que contenía NaCl 4 mM, KCl 140 mM, ATP-Mg_{2} 2 mM, CaCl_{2} 0,6 mM y N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES), con el pH ajustado a 7,25 con KOH 2 M. La solución externa contenía NaCl 135 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 1mM, CaCl_{2} 1 mM, NaH_{2}PO_{4} 0,33 mM, glucosa 10 mM y HEPES 10 mM, con el pH ajustado a 7,4 con NaOH 2 M. Las osmolaridad era de aproximadamente 290 mosmol/l. Después de romper a través la membrana, los experimentos no comenzaron durante un período de 10-15 minutos para que se formaran selladuras > 2 M\Omega.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados
Se ensayó el efecto de rU-ACTX-Hv1a sobre I_{K(Ca)} en células HEK293 que expresan la subunidad \alpha del canal de potasio activado con calcio, de alta conductancia, (pS1o) de P. americana. La adición de 1 \muM de rU-ACTX-Hv1a al canal pS10o que expresan células HEK293 causó aproximadamente 77% de bloqueo de I_{K(Ca)}. Esto es similar a aproximadamente el 80% dado a conocer antes para la adición de 1 \muM de caribdocina a células HEK293 que expresan canales pS1o. (Derst y otros (2003) European Journal of Neuroscience 17, 1197-1212). La curva de dosis-respuesta (Figura 5) indica que rU-ACTX-Hv1a bloquea corrientes de pS1o con una CI_{50} de 579 nM. Así, parece que rU-ACTX-Hv1a apunta tanto a canales Ca_{v} como K_{Ca} de insectos. Parece que rU-ACTX-Hv1a actúa como bloqueante de poros más bien que como modificador de dependencia, puesto que no había desplazamientos despolarizantes significativos en la voltaje-dependencia de la activación de canales.
Sin que se quiera estar condicionados por la teoría, se cree que la marcada potencia de rU-ACTX-Hv1a es resultado de un efecto sinérgico sobre los canales de Ca_{v} y K_{Ca} de insecto. Desde hace mucho tiempo es conocido que estos canales están fisiológicamente acoplados y una evidencia reciente sugiere que, de hecho, están fisiológicamente asociados en la membrana. Además de bloquear directamente el poro de los canales K_{Ca} de insecto, rU-ACTX-Hv1a puede disminuir indirectamente corrientes a través de estos canales por bloqueo del flujo hacia el interior de calcio a través de los canales Ca_{v}, disminuyendo así la masa global de calcio intracelular disponible para activar el canal de K_{Ca}. Así, la acción de rU-ACTX-Hv1a sobre los canales de Ca_{v} potencia su bloqueo de canales de K_{Ca} de insecto.
Se han descrito nuevos polipéptidos que tiene actividad insecticida. Los polipéptidos pueden estar en forma de prepropolipéptido, propilpéptido o polipéptido maduro. Se pueden usar como insecticidas los polipéptidos, los polinucleótidos que codifican opcionalmente los polipéptidos en un vector de expresión, un virus de insecto, vectores virales que codifican los polipéptidos y células que expresan los polipéptidos. Entre las ventajas de los polipéptidos descritos sobre los insecticidas convencionales está incluida la potencia de los insecticidas combinada con una toxicidad diferencial entre insectos y vertebrados.
Los términos "primero", "segundo" y similares empleados en esta memoria no denotan orden, cantidad o importancia alguna, sino que se usan para distinguir un elemento de otro, y los términos "un" y "una" no denotan una limitación de cantidad, sino que denotan la presencia de al menos una de las cuestiones referenciadas. Todos los intervalos descritos en la memoria son inclusive y combinables.
<110> Centro de Salud de la Universidad de Connecticut
\hskip1cm
King, Glenn F 
\hskip1cm
Sollod, Brianna L 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Polipéptidos Insecticidas y Procedimientos para su Uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> UCT-0070
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/625.297
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2004-11-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0,8cm
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
43 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
49 
\hskip0,8cm
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Atrax robustus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Atrax robustus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Atrax robustus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,9cm
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> X
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> A o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> X
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L o F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> X
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I o V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> X
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> I o V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
73 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hadronyche versuta 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> X
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G o R u otras secuencias unidas covalentemente corriente arriba de un polipéptido U-ACTX maduro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
74

Claims (13)

1. Un polipéptido insecticida que bloquea aproximadamente 50% o más de la corriente de calcio en un canal de calcio voltaje-dependiente de un insecto y aproximadamente 50% o más de la actividad en un canal de potasio activado por calcio, de alta conductancia, de un insecto, que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº. 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
2. El polipéptido purificado de la reivindicación 1, que comprende una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27.
3. El polipéptido purificado de la reivindicación 2, que además comprende una secuencia de propéptido, una secuencia de péptido señal, o una combinación de ellas.
4. Una composición insecticida que comprende una cantidad insectidamente eficaz del polipéptido purificado de la reivindicación 1 y un vehículo agrícolamente aceptable.
5. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
6. El polinucleótido de la reivindicación 5, que codifica un polipéptido que comprende una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27.
7. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 operativamente unido a una secuencia de control de expresión.
8. Una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27 operativamente unido a una secuencia de control de expresión.
9. Un virus de insecto que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
10. Un procedimiento para tratar un insecto, una larva de insecto o una planta, que comprende poner en contacto el insecto, la larva de insecto o la planta con una cantidad insecticidamente eficaz de un polipéptido U-ACTX, comprendiendo el polipéptido U-ACTX una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº 2, y teniendo el polipéptido U-ACTX actividad insecticida.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el polipéptido U-ACTX comprende una cualquiera de las SEC ID n^{os}. 2, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 y 27.
12. Una planta transgénica que expresa un polipéptido U-ACTX, comprendiendo el polipéptido U-ACTX comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº 2, y teniendo el polipéptido U-ACTX actividad insecticida.
13. Un insecto transgénico que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en aproximadamente 70% o más a la SEC ID nº 2, teniendo el polipéptido actividad insecticida.
ES05818323T 2004-11-04 2005-11-04 Polipeptidos insecticidas y procedimientos para su uso. Active ES2318576T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62529704P 2004-11-04 2004-11-04
US625297P 2004-11-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2318576T3 true ES2318576T3 (es) 2009-05-01

Family

ID=36337057

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05818323T Active ES2318576T3 (es) 2004-11-04 2005-11-04 Polipeptidos insecticidas y procedimientos para su uso.

Country Status (9)

Country Link
US (4) US7354993B2 (es)
EP (2) EP2030983A1 (es)
JP (1) JP5107717B2 (es)
AT (1) ATE410445T1 (es)
AU (1) AU2005304859B2 (es)
CA (1) CA2595757C (es)
DE (1) DE602005010295D1 (es)
ES (1) ES2318576T3 (es)
WO (1) WO2006052806A2 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE410445T1 (de) * 2004-11-04 2008-10-15 Univ Connecticut Insektizide polypeptide und deren verwendung
JP2009540295A (ja) * 2006-06-06 2009-11-19 ユニバーシティ オブ コネチカット 昆虫特異的クモ毒素模倣物を同定する方法
US20070281864A1 (en) * 2006-06-06 2007-12-06 King Glenn F Methods of identifying insect-specific spider toxin mimics
US20090047235A1 (en) * 2007-05-17 2009-02-19 Husseneder Claudia R Paratransgenesis to Control Termites or Other Social Insects
CA2738320C (en) * 2008-10-01 2020-04-21 Vestaron Corporation Peptide toxin formulation
WO2010081078A2 (en) * 2009-01-09 2010-07-15 The University Of Vermont And State Agriculture College Device and non-toxic compositions and methods for permeabilization of drosophila embryos
GB201105418D0 (en) 2011-03-31 2011-05-18 Univ Durham Pesticide
KR20220047395A (ko) * 2012-03-09 2022-04-15 베스타론 코포레이션 독성 펩타이드 제조, 식물에서의 펩타이드 발현 및 시스테인 농후 펩타이드의 조합
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
GB201321938D0 (en) 2013-12-11 2014-01-22 Univ Durham Pesticidal fusion protein improvements
BR112016023040A2 (pt) * 2014-04-04 2018-01-16 Vestaron Corporation processo para aumentar a atividade ou toxicidade de um peptídeo
MX2019004648A (es) 2016-10-21 2019-05-23 Vestaron Corp Peptidos escindibles y proteinas insecticidas y nematicidas que los comprenden.
JP7112757B2 (ja) 2017-04-04 2022-08-04 ベイラー ユニバーシティ 標的化された殺蚊毒素
CN108822196B (zh) * 2018-06-06 2023-04-21 湖南生达生物科技有限公司 一种促凝血多肽lgtx-f2及其应用
CA3181913A1 (en) * 2020-05-01 2021-11-04 Vestaron Corporation Insecticidal combinations
CN111821055A (zh) * 2020-08-11 2020-10-27 兰州大学 一种快速准确解剖蜘蛛毒腺的方法
CN114957426B (zh) * 2022-06-02 2023-05-16 华南师范大学 Sp6rars及其在防治蜚蠊目昆虫中的应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4757011A (en) 1983-09-30 1988-07-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
JPH06794B2 (ja) 1984-03-02 1994-01-05 武田薬品工業株式会社 グルタミン酸レセプタ−阻害物質
US4879236A (en) 1984-05-16 1989-11-07 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
DK354487A (da) * 1986-07-11 1988-01-12 Noboru Yanaihara Oncogen-relaterede peptider
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
JPH082856B2 (ja) 1987-06-10 1996-01-17 暉躬 中嶋 グルタミン酸レセプター阻害物質，その製造法ならびに殺虫剤組成物
US5763568A (en) 1992-01-31 1998-06-09 Zeneca Limited Insecticidal toxins derived from funnel web (atrax or hadronyche) spiders
US7084119B2 (en) * 1993-06-29 2006-08-01 Chiron Corporation Truncated keratinocyte growth factor (KGF) having increased biological activity
US5457178A (en) * 1993-07-07 1995-10-10 Fmc Corporation Insecticidally effective spider toxin
NZ308772A (en) 1995-05-17 1999-04-29 Du Pont Recombinant baculovirus insecticides
US5756459A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Fmc Corporation Insecticidally effective peptides isolatable from phidippus spider venom
AUPO733397A0 (en) * 1997-06-13 1997-07-10 University Of Sydney, The Pesticidal compounds
US6521454B1 (en) 1999-06-30 2003-02-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Baculoviruses, insecticidal compositions, and methods for control of invertebrates
US7279547B2 (en) 2000-02-10 2007-10-09 University Of Connecticut Insecticidal compounds and methods for selection thereof
US6583264B2 (en) 2000-02-10 2003-06-24 University Of Connecticut Insecticidal compounds and methods for selection thereof
ATE410445T1 (de) 2004-11-04 2008-10-15 Univ Connecticut Insektizide polypeptide und deren verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
US20130276155A1 (en) 2013-10-17
WO2006052806A2 (en) 2006-05-18
US8293868B2 (en) 2012-10-23
EP1812464B1 (en) 2008-10-08
CA2595757A1 (en) 2006-05-18
AU2005304859A1 (en) 2006-05-18
CA2595757C (en) 2015-02-03
AU2005304859B2 (en) 2011-06-30
US20110237502A1 (en) 2011-09-29
US7354993B2 (en) 2008-04-08
DE602005010295D1 (de) 2008-11-20
JP2008518624A (ja) 2008-06-05
US20080260789A1 (en) 2008-10-23
WO2006052806A3 (en) 2006-08-17
US7880060B2 (en) 2011-02-01
JP5107717B2 (ja) 2012-12-26
EP1812464A2 (en) 2007-08-01
ATE410445T1 (de) 2008-10-15
EP2030983A1 (en) 2009-03-04
US20060242734A1 (en) 2006-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2318576T3 (es) Polipeptidos insecticidas y procedimientos para su uso.
ES2674324T3 (es) Plaguicidas
JPH02231094A (ja) 昆虫選択的毒素、その毒素をコードする遺伝子、その毒素に結合する抗体およびその毒素を発現するトランスジェニック植物細胞および植物
KR20190085514A (ko) 절단성 펩타이드 및 이를 포함하는 살충 및 살선충 단백질
CN108064298A (zh) 铁杉下色杆菌(chromobacterium subtsugae)基因组
US8362201B2 (en) Insecticidal compounds and methods for selection thereof
US7575758B2 (en) Acaricidal compositions and methods of use thereof
JPH06503229A (ja) 殺虫に有効なペプチド
AU2012300197B2 (en) Pest-controlling agents isolated from spider venom and uses thereof
DE69631978T2 (de) Insektizide enzyme
JP2015531775A (ja) 種子粉衣法およびリアノジン受容体拮抗物質を含む組成物
Caldwell California plants as resources for Lepidoptera: a guide for gardeners, restorationists, and naturalists
Pruett Constructing a Nectar Delivery System for Mosquito Control Using Impatiens walleriana
Chong Characterisation of novel insecticidal ion channel toxins from araneomorph and mygalomorph spider venoms
CN107304226A (zh) 蝎α‑型神经毒素的突变体及其用途
Prasad et al. Effect of crude sugar ester fractions from wild Nicotiana sp. on tobacco aphid, Myzus nicotianae and bud worm, Helicoverpa armigera
Łazuka et al. A comprehensive inventory of entomo-and arachnofauna of Limestone Quarry „Górażdże” with particular emphasis on xerothermic species of auchenorrynchans, heteropterans, orthopterans, coleopterans, lepidopterans and arachnids.
MX2008003704A (es) Composiciones acaricidas y metodos de uso de las mismas