CN104160033B - 将靶向肽偶联于重组溶酶体酶上的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了制备与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的方法，其通过使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)‑末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，使用第二交联剂修饰变体IGF‑2肽的氨基(N)‑末端的短延长接头的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽，然后将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述含有短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF‑2肽偶联。本申请还描述了使用本申请所公开的方法合成的偶联物，所述偶联物的特征为与IGF2/CI‑MPR受体具有更高的亲和性和能够被细胞摄取。本申请还描述了使用所公开的偶联物的治疗方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月27日提交的美国临时专利申请号61/490,957的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
技术领域
本申请的技术领域涉及肽化学。本申请的技术领域还涉及在溶酶体贮积症的治疗中将重组溶酶体酶靶向至溶酶体。
背景技术
溶酶体是一种专门的细胞内细胞器，蛋白质、多种脂质(包括糖脂和胆固醇)和碳水化合物在其中降解并重循环成最基本组分，这些最基本的组分能够合成新的蛋白、膜组分和其他分子。通过被称为自噬的适应性细胞过程，细胞还利用溶酶体帮助维持内环境稳态和细胞的健康，该过程增加溶酶体的活性以便为增加的多种蛋白质(例如，抗体和干扰素)的生物合成提供额外的氨基酸，并且为能量产生过程提供营养物以应对营养剥夺或病毒感染的应激期。各个代谢过程由特定的固有溶酶体酶催化。基因突变能够引起溶酶体生物活性的缺乏，其使得代谢过程改变并导致临床疾病。溶酶体贮积症(LSD)是由约50种不同的人类代谢疾病组成的一类疾病，其由缺乏特定的溶酶体蛋白引起，结果使得多种物质在内涵体/溶酶体区域蓄积。已对多种这些疾病进行了很好的鉴定以了解缺乏的溶酶体蛋白和其所导致的代谢缺陷。例如，存在糖脂分解代谢改变的若干LSD如戈谢氏症、法布瑞氏症和台萨氏/桑德霍夫病。鉴定Neimann-Pick C为脂质和胆固醇代谢受损，还鉴定了碳水化合物代谢改变的疾病如II型(庞贝氏症)和III型(科里-法布瑞氏症)糖原贮存疾病。其他LSD改变骨或细胞外基质[例如，粘多糖贮积症(MPS I-VII)，戈谢氏症]的代谢和蛋白的更新(神经 元蜡样脂褐质沉积症；Batten等)。尽管LSD相对罕见，但是如果未进行有效治疗，则其能够导致严重的慢性疾病并且往往会导致死亡。
尚无能够治愈溶酶体贮积症的方法，但是已经研究了用于治疗多种LSD的多种不同的治疗方法，包括骨髓和脐带血移植、酶替代疗法(ERT)、底物减少疗法(SRT)和药物伴侣疗法。还开发了基因疗法但是尚未经临床检验。在这些治疗方法中，ERT是最成熟的，已有多种ERT被批准用于治疗多种LSD，包括戈谢氏症、法布瑞氏症、庞贝氏症、MPS I、MPS II和MPSVI，而仅有一种SRT药物被批准用于治疗戈谢氏症。
ERT用于治疗溶酶体贮积症的原理相当明确，即将重组人溶酶体酶给予患者以补充其缺乏的生物活性并改善临床症状。然而，与主要在细胞表面或细胞外发挥功能的其他蛋白治疗疗法(例如，抗-VEGF和其他抗体、促红细胞生成素、凝血因子等)不同，溶酶体酶必须在细胞内的溶酶体内发挥功能，因而需要一种由细胞外进入细胞随后递送至这些内部区室的机制。在哺乳动物中，对大多数可溶性溶酶体酶而言，蛋白骨架上的分支碳水化合物结构在某些天冬酰胺残基(N-连接的寡糖；N-聚糖)上被翻译后修饰以形成称为甘露糖6-磷酸(M6P)的特殊碳水化合物结构。M6P是天然生物信号，其由膜结合M6P受体识别并将新合成的溶酶体蛋白从高尔基体向溶酶体转运。一类M6P受体(不依赖于阳离子的M6P受体；CI-MPR)还能够循环至质膜，并被功能性活化以结合和内化外源性的溶酶体蛋白。据信CI-MPR已发展成能够重新捕获从细胞中逃逸(分泌出细胞)的溶酶体蛋白，因此其提供了一种内化外源性溶酶体蛋白的靶机制，并且是治疗多种LSD的酶替代疗法的基础。
重组溶酶体酶替代疗法已显示出广泛的安全性，但是其减轻临床症状的效果存在较大差异。例如：剂量为1mg/kg体重隔周给药一次的FabrazymeTM(重组酸性α-半乳糖苷酶A；Genzyme Corp.)足以从法布瑞氏症的内皮细胞中清除蓄积的底物，而剂量为40mg/kg隔周给药一次的MyozymeTM(重组人酸性α-葡糖苷酶，rhGAA；Genzyme Corp.)对庞贝氏症仅具有有限的疗效。疗效不同主要由M6P含量的不同所致，因而M6P水平较低与药物的靶向性不佳和较低的疗效相关。重组溶酶体酶的生产非常有挑战性，因为在哺乳动物表达系统内控制碳水化合物的加工特别是控制M6P的水平非常困难。两种特定的高尔基酶催化M6P的修饰；N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶将连接了磷酸的N-乙酰葡糖胺添加在特定末端甘露糖残基上，而N-乙酰葡糖胺-1-磷 酸二酯α-N-乙酰葡糖苷酶(也称为去覆盖酶)除去覆盖的N-乙酰葡糖胺以暴露出M6P信号。然而，N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶仅限于在细胞内，并且该生化反应对多种溶酶体蛋白天生效率不高。在生产过程中过表达溶酶体蛋白大大加剧了这一问题，并且导致M6P的量存在较大差异。因而，碳水化合物的加工一般是不完全的，并且导致产生了具有N-聚糖混合物的重组溶酶体酶，N-聚糖混合物具有M6P、非M6P结构的高甘露糖型N-聚糖和复合型N-聚糖(一般为分泌性蛋白)。死亡或受损细胞释放除去M6P的酶(如磷酸酶)进入细胞培养基，这使问题更为复杂。因此，M6P的含量减少降低重组溶酶体酶与M6P受体的结合亲和性，并且减少了细胞摄取，进而降低了药物的疗效。死亡或受损细胞释放的其他糖苷酶，这些糖苷酶除去其他碳水化合物(例如，唾液酸、半乳糖等)从而暴露出通常不会暴露的内部的碳水化合物，而这些N-聚糖会被识别为异物。这些不完全的N-聚糖结构加快了重组溶酶体蛋白在循环中的清除率，这也会降低药物的疗效。因此，需要使用更高的药物剂量以抵偿降低的疗效。然而，更高药物剂量的需求具有多重负面影响：(1)更高的药物剂量可能会因增加本已昂贵的治疗成本而使人望而却步；(2)较高的药物剂量需要较长的输注时间；(3)较大量的循环药物会导致显著的抗体应答(见于大多数的庞贝氏症患者)，且在输注期间无数患者也经历了过敏反应。FDA已经对Myozyme下发了“黑色标签警告”，通常在开始时应非常缓慢的给予该药物而在输注过程中逐渐增加。这种策略有助于缓解过敏应答，但是显著延长输注时间，其中12小时输注的情况也并不少见。
用于改善药物对多种溶酶体ERT靶向性的一种潜在策略为引入靶向肽以有效地将ERT靶向至溶酶体而不需要传统M6P碳水化合物结构。这在概念上是可行的，因为不依赖于阳离子的M6P受体含有针对称为胰岛素样生长因子2(IGF-2)的小肽的独特的结合结构域，因此将该受体称为IGF-2/(IGF-2/CI-MPR)。因为IGF-2/CI-MPR存在于细胞表面并在细胞表面发挥生物活性，所以该受体实际上仅负责内化外源性的负载M6P的溶酶体蛋白。因为在细胞表面不具有生物活性并且缺乏IGF-2肽结合结构域，所以其他类型的M6P受体，即阳离子依赖性M6P受体(CD-MPR)，仅与细胞内的溶酶体蛋白转运有关。IGF-2/CI-MPR具有两个独立的针对M6P的结合位点(分别为结构域1-3和7-9)，以使其以中度亲和性与单-M6P N-聚糖(在N-聚糖上有1个M6P残基)结合或者以约高3000倍的亲和性与双-M6P N-聚糖(在同一N-聚糖上有两个M6P残基)结合。由于溶酶体蛋白含有复杂(无M6P)、单-和双-M6P N-聚 糖的混合物，因而其对IGF-2/CI-MPR的亲和性随着负载M6P的N-聚糖的类型和量的变化而大幅改变。IGF-2肽对IGF-2/CI-MPR具有最高的亲和性，其比单-M6P N-聚糖高约230,000倍。多种配体对IGF-2/CI-MPR的结合亲和性总结汇总于下表1。
表1：对IGF-2/CI-MPR的配体亲和性
在哺乳动物中，IGF-2是胚胎发育过程中主要的生长激素。出生后，尽管其不再调节生长(在整个生命过程中由IGF-1通过人生长激素刺激来调节生长)，IGF-2的水平仍维持相对恒定。IGF-2在出生后的作用尚不清楚，但是据信这种肽有助于伤口愈合和组织修复。在循环中IGF-2主要与血清IGF结合蛋白(IGFBP1-6)结合，其调节游离IGF-2肽的水平。这些IGFBP还与胰岛素和IGF-1结合并调节他们的循环水平。IGF-2/CI-MPR是游离IGF-2肽的天然清除途径。因为IGF-2在结构上与胰岛素和IGF-1接近，所以与IGF-2/CI-MPR相比，其与胰岛素受体(低～100-倍)和IGF-1受体(低～230-倍)的亲和性较低。通过除去不同的氨基酸或取代特定氨基酸残基(例如，[Leu27]IGF-2&[Leu43]IGF-2)能够极大地改善这种特异性，以维持其与IGF-2/CI-MPR较高的亲和性结合(表1)，但显著减少或消除其与胰岛素和IGF-1受体的结合。类似地，缺乏起始六个氨基酸残基或6位用精氨酸取代谷氨酸的IGF-2变体显示出IGF2肽与IGFBP的亲和性显著降低。重要的是，已在临床试验中证明IGF-2肽是安全的，并且在临床上用于辅助治疗某些生长缺乏。这些汇总数据提示：IGF-2 肽可能能够被用作替代传统M6P碳水化合物结构的靶向基序以促进重组溶酶体酶的细胞摄取和向溶酶体的转运。
仍需要制定策略以构建IGF-2-连接蛋白，以改善蛋白靶向性并且克服碳水化合物加工过程中存在的问题。
发明概述
本申请提供了一种与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)-末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，使用第二交联剂修饰在变体IGF-2肽的氨基(N)-末端的短延长接头的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF-2肽，和将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
本申请还提供了一种与重组溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：将第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联，其中所述第一交联剂修饰的重组溶酶体酶包括重组溶酶体酶，其特征为具有化学修饰的N-末端和一个或多个经修饰的赖氨酸残基，和所述一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽包括一个或多个变体IGF-2肽，所述变体IGF-2肽在氨基(N)-末端的短延长接头内包括经修饰的氨基酸。
本申请提供了一种用于酶替代疗法的分子的制备方法，包括：将异双功能交联剂与变体IGF-2肽偶联和然后将所述异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽与重组人溶酶体酶偶联。
本申请还提供了一种用于酶替代疗法的分子的制备方法，包括：将异双功能交联剂与重组人溶酶体酶偶联和然后将所述异双功能交联剂修饰的重组人溶酶体酶与变体IGF-2肽偶联。
本申请还提供了一种偶联物，包括：与重组人溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽。
本申请还提供了一种偶联物，包括：与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽。
本申请提供了一种治疗罹患溶酶体贮积症的个体的方法，所述方法包括给予所述个体偶联物的步骤，所述偶联物包括与经修饰的重组人溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽。
本申请还提供了一种治疗罹患溶酶体贮积症的个体的方法，所述方法包括给予所述个体偶联物的步骤，所述偶联物包括与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽。
本申请还提供了一种治疗罹患庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPSII、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症和沃尔曼病的患者的方法，包括：给予所需患者足以治疗所述疾病的量的组合物，所述组合物包括与重组溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种治疗罹患庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPSII、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症和沃尔曼病的患者的适宜方法，包括：给予所需患者足以治疗所述疾病的量的组合物，所述组合物包括与重组人溶酶体酶偶联的经异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽和药学上可接受的载体。
本申请提供了一种编码变体IGF-2肽的DNA序列，所述序列被优化在大肠杆菌中表达，所述序列包括SEQ IDNO：1。
本申请还提供了一种变体IGF-2肽的氨基酸序列，所述序列包括SEQ ID NO：2。
本申请还提供了一种延长接头的氨基酸序列，所述序列包括SEQ ID NO：3。
附图简述
当结合附图考虑时，通过对本发明的下述详细描述，本发明的前述和其他方面是清晰易懂的。出于解释本发明的目的，在附图中所示的均为优选的实施方式，但是将理解本发明不仅限于所公开的特定方式。附图并不一定是按照比例绘制的。在附图中：
图1(A)显示了酰肼修饰的溶酶体酶与苯甲醛基修饰的变体IGF2肽偶联的示意图。在该偶联反应之前，使用第一交联剂如N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酰胺丙酮(S-Hynic)对溶酶体酶进行化学修饰，其修饰溶酶体酶的氨基末端和一个或多个赖氨酸残基以引入化学活化的酰肼官能团。在单独的反应中，使用第二交联剂如PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)对变体IGF2肽的短延长接头区域中的N-末端氨基酸残基进行化学修饰以引入如本专利申请中所述的苯甲醛官能团。在对酰肼修饰的溶酶体酶和苯甲 醛基修饰的变体IGF2肽纯化后，将这些蛋白在含有苯胺的酸性缓冲液中共同孵育以形成IGF2肽偶联的溶酶体酶。在这个偶联反应中，化学活化的酰肼化学基团与醛基反应以形成稳定的共价(腙)键。图1(B)显示了可以使用的其他适宜的第一交联剂(琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、琥珀酰亚胺4-盐酸肼基烟酸酯(SHNH)和N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-酰肼；其中n=3-24个PEG单元)和第二交联剂(PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)和C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB))。
图2(A)显示了通过施陶丁格(Staudinger)连接反应将膦修饰的溶酶体酶与叠氮化物修饰的变体IGF2肽偶联的示意图。在该偶联反应之前，使用第一交联剂如硫代-NHS膦对溶酶体酶进行化学修饰，其修饰溶酶体酶的氨基末端和一个或多个赖氨酸残基以引入化学活化的膦官能团。在单独的反应中，使用第二交联剂如NHS-(PEG)n-叠氮化物对变体IGF2肽的短延长接头区域中的N-末端氨基酸残基进行化学修饰以引入叠氮化物官能团。在对膦修饰的溶酶体酶和叠氮化物修饰的变体IGF2肽纯化后，将这些蛋白在略偏酸性的缓冲液中共同孵育以形成IGF2肽-偶联的溶酶体酶。在这个偶联反应中，化学活化的叠氮化物化学基团与膦基反应以形成稳定的共价(酰胺)键。图2(B)显示了可以使用的其他适宜的第一交联剂(N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)和硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦))和第二交联剂(N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物；其中n=3-24个PEG单元，以及NHS-PEG3-S-S-叠氮化物)。
图3(A)显示了通过点击化学将乙炔修饰的溶酶体酶与叠氮化物修饰的IGF2肽偶联的示意图。在该偶联反应之前，使用第一交联剂如NHS-(PEG)n-乙炔对溶酶体酶进行化学修饰，其修饰溶酶体酶的氨基末端和一个或多个赖氨酸残基以引入化学活化的乙炔官能团。在单独的反应中，使用第二交联剂如NHS-(PEG)n-叠氮化物对变体IGF2肽的短延长接头区域中的N-末端氨基酸残基进行化学修饰以引入叠氮化物官能团。在将乙炔修饰的溶酶体酶和叠氮化物修饰的IGF2肽纯化后，将这些蛋白在含铜(I)离子且略偏酸性的缓冲液中共同孵育以形成IGF2肽偶联的溶酶体酶。在这个偶联反应中，化学活化的叠氮化物化学基团与炔基反应以形成稳定的共价(三唑)键。图3(B)显示了可以使用的其他适宜的第一交联剂(N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十 五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-乙炔；其中n=3-24个单元，以及NHS-PEG3-S-S-乙炔)和第二交联剂(N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物；其中n=3-24个PEG单元，以及NHS-PEG3-S-S-叠氮化物)。
图4(A)显示了使用单一交联剂如m-马来酰亚胺基苯甲基N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)将溶酶体酶与IGF2肽偶联的示意图。在第一个反应中，将化学活化的马来酰亚胺基团与IGF2肽变体C-末端半胱氨酸残基上的游离巯基反应。然后将MBS修饰的IGF2肽纯化，再通过化学活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯基与溶酶体酶上的氨基末端和一个或多个赖氨酸残基交联，将其与溶酶体酶偶联以形成稳定的共价(酰胺)键。图4(B)显示了可以使用的其他适宜的交联剂(m-马来酰亚胺基苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、硫代-m-马来酰亚胺基苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(硫代-MBS)和硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC))。
图5显示了使用C4反相色谱对IGF2肽的鉴定。使用4.6x150mm C4反相分析柱来评估野生型和变体IGF2肽的纯度和蛋白构象。将肽样品上样于经过0.1％三氟乙酸(TFA)和25％乙腈平衡的C4柱。2分钟后，使用25-35％的乙腈线性梯度洗脱色谱柱10分钟。图5(A)显示了对应于30％的乙腈时在约7.5min时洗脱出重组野生型人IGF2肽。图5(B)显示了对应于30％的乙腈时在约7.5min时同样洗脱出重组变体人IGF2肽。图5(C)显示了对应于31％的乙腈时在约8min时洗脱出PEG4-PFB修饰的变体人IGF2肽。这些数据表明野生型和变体IGF2肽具有非常接近的蛋白构象，因为其在C4反相色谱中的表现基本相同。PEG4-PFB修饰的变体人IGF2肽的保留时间的迁移表明了变体IGF2肽已被化学交联剂完全修饰，这改变了其与C4色谱柱之间的相互作用。
图6显示了对变体IGF2肽偶联的rhGAA的受体结合和细胞摄取的评估。使用交联剂PEG4-PFB对变体IGF2肽进行修饰，随后将其与S-Hynic-修饰的rhGAA偶联。然后使用体积排阻色谱对所得到的变体IGF2肽偶联的rhGAA(称为vIGF2-rhGAA)进行纯化。为确定变体IGF2肽的化学偶联是否改善了rhGAA对IGF2/CI-MPR受体的亲和性，在图6(A)所示的受体板结合检测中在不同蛋白浓度下(0.003-10μg/ml，对应于0.012-42nM rhGAA)直接对未偶联的rhGAA和vIGF2-rhGAA的结合情况进行了比较。在这些IGF2/CI-MPR受体板结合检测的所有已检测的蛋白浓度下，与未 偶联的rhGAA相比，在vIGF2-rhGAA中观察到显著更高的捕获的酶活性量。这些结果确证了与IGF2肽的偶联增加了rhGAA与IGF2/CI-MPR受体的亲和性。而且，在这些板检测中引入野生型IGF2肽极大地降低vIGF2-rhGAA的捕获，这表明结合依赖于IGF2肽。在这些受体板检测中，完全消除vIGF2-rhGAA的结合可能需要更大量的游离野生型IGF2肽。为确定增加的受体亲和性是否会改善vIGF2-rhGAA的细胞摄取，在图6(B)所示的L6大鼠骨骼肌成肌细胞中评估了细胞外未偶联的rhGAA和vIGF2-rhGAA内化作用。在所有已检测的蛋白浓度下在L6成肌细胞中，vIGF2-rhGAA显示出与未偶联的rhGAA相比显著更好的内化。这些结果证明了受体结合亲和性的改善对于在靶细胞内增强外源性溶酶体酶内化和递送的功能性益处。
图7显示了对变体IGF2肽偶联I2S的鉴定。使用交联剂NHS-PEG4-叠氮化物对变体IGF2肽进行修饰，随后与膦修饰的I2S偶联。使用体积排阻色谱对所得到的变体IGF2肽偶联I2S(称为vIGF2-I2S)进行纯化。为确定化学偶联变体IGF2肽是否改善了I2S对IGF2/CI-MPR受体的亲和性，在图7(A)所示的受体板结合检测中在不同蛋白浓度下(0.03-10μg/m1)直接对未偶联的I2S和vIGF2-I2S的结合情况进行了比较。在这些IGF2/CI-MPR受体板结合检测所有已检测的蛋白浓度下，与未偶联的I2S相比，vIGF2-I2S的捕获量显著更高。这些受体结合结果与vIGF2-rhGAA的结果一致，这表明相同的变体IGF2肽能够与不同的溶酶体酶化学偶联以增加其对IGF2/CI-MPR受体的结合亲和性。为确定多个变体IGF2肽是否能与溶酶体酶化学偶联，如图7(B)所示利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对未偶联I2S和vIGF2-I2S的分子量进行了比较。SDS-PAGE的结果显示，未偶联I2S的表观分子量为约80kDa(第1道)，而vIGF2-I2S具有明显更高的约120kDa的表观分子量(第2道)。这些数据表明肯定有多个变体IGF2肽与I2S化学偶联，因为其增加了约40kDa而变体IGF2肽的分子量仅为～8kDa(第3道)。这些结果还表明SDS-PAGE上的宽蛋白条带证实了I2S完全转化为具有不同量变体IGF2肽的vIGF2-I2S。
发明详述
通过参考下述的详细描述结合作为本公开一部分的附图和实施例可能更容易理解本主题。应理解的是本发明不仅限于本文所描述和/或所示的特定设备、方法、应 用、条件或参数，并且本文所使用的术语仅用于通过示例性的方式描述特定实施方式的目的，而非旨在限制所要求保护的发明。
此外，除非上下文中另有明示，否则在说明书包括所附权利要求书中使用的单数形式的“一”和“一”以及“所述”包括复数，提及一个特定数值至少包括该特定值。如本文所使用的，术语“多数”指一个以上。当表示值的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或至其他特定值。类似地，当通过在其前面使用“约”表示近似值时，应理解为该特定值形成另一个实施方式。所有范围均是开放式和可组合的。
提供实施例以帮助进一步理解本发明。所使用的特定材料、方案和条件均旨在进一步解释本发明，不应将其解释为限制其合理的范围。
将靶向肽与重组溶酶体酶偶联的适宜方法包括使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)-末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，使用第二交联剂修饰变体IGF-2肽前端的短延长接头区域的氨基(N)-末端以产生第二交联剂修饰的变体IGF-2肽，然后将第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与含有短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
将靶向肽与重组溶酶体酶偶联的其他适宜方法包括将第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联，其中所述第一交联剂修饰的重组溶酶体酶包括重组溶酶体酶，其特征为具有化学修饰的N-末端和一个或多个经修饰的赖氨酸残基，以及所述一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽包括一个或多个变体IGF肽，所述变体IGF肽包括在IGF2肽前端的短延长接头的经修饰的N-末端氨基酸。
适宜的短延长接头的长度可以是5至20个氨基酸残基。短延长接头的长度还可以是约10个氨基酸。适宜的短延长接头可以用SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列表示。其他适宜的短延长接头可以是5个氨基酸的柔性GS延长接头(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)、包括2个柔性GS接头的10个氨基酸的延长接头、包括3个柔性GS接头的15个氨基酸的延长接头、包括4个柔性GS接头的20个氨基酸的延长接头、或其任意组合。
将靶向肽与重组溶酶体酶偶联的适宜制备方法，其中所述第一交联剂修饰的重组溶酶体酶包括重组人溶酶体酶，其特征为具有化学修饰的N-末端，和使用第一交联剂修饰的一个或多个赖氨酸残基。适宜的重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶 (rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、及其任意组合。还可以对重组人溶酶体酶上的一个或多个赖氨酸残基进行修饰。可以使用适宜的第一交联剂，包括琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、硫代-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(硫代-S-HyNic)、或C6-琥珀酰亚胺6-肼基-烟酰胺(C6-S-Hynic)、或琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、或琥珀酰亚胺4-盐酸肼基烟酸酯(SHNH)或其任意组合，以便在溶酶体酶上引入用于与含有反应性醛基的靶向肽化学偶联的酰肼基团。或者，可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-NHS-膦、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、其他NHS-(PEG)n-乙炔异双功能交联剂，其中“n”的范围可以是3-24个不连续的PEG单元、或可裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-乙炔、或含有环辛炔如二氟环辛炔(DIFO)和二苯基环辛炔(DIBO)的异双功能交联剂、或其任意组合对溶酶体酶进行修饰，以便将化学修饰的溶酶体酶与含有反应性叠氮化物基团的靶向肽偶联。用于修饰靶向肽的适宜的第二交联剂包括PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、或琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、或C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)以便在靶向肽上引入用于与含有反应性酰肼基团的溶酶体酶偶联的反应性醛基。还可以使用异双功能交联剂如N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、或N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)或其他NHS-(PEG)n-叠氮化物交联剂其中n的范围可以是3-24个不连续的PEG单元、或可裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-叠氮化物、或其任意组合对靶向肽进行修饰以便在靶向肽上引入用于与含有反应性膦或者炔或环辛炔基团的溶酶体酶偶联的反应性叠氮化物基团。在一个优选实施方式中，所述第一交联剂可以是N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)和第二交联剂可以是PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)。
可以将所述重组人溶酶体酶上的N-末端和一个或多个赖氨酸残基在室温下在约pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中修饰约30分钟。在所述重组人溶酶体酶上的所述N-末端和赖氨酸残基被修饰后，所述重组人溶酶体酶能够迅速交换进入酸性缓冲液中。例如，所述酸性缓冲液可以是约pH5.0的50mM的乙酸钠。所述酸性缓冲液可以是约 pH5.0的0.1M的乙酸钠、乙酸钾、柠檬酸钠、MES、磷酸钠或磷酸钾。可以使用体积排阻色谱实现交换进入酸性缓冲液，和可以使用透析实现交换进入酸性缓冲液。
在与第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶偶联之前，可以将含有短接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽纯化。可以使用凝胶过滤、透析或反相色谱实现纯化。
在存在苯胺的约pH5.0的酸性缓冲液中实现将酰肼修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的醛修饰的变体IGF-2肽的偶联。可以在pH范围为5.0-7.0的缓冲液中实现将膦-或乙炔-或环辛炔-修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的叠氮化物-修饰的变体IGF-2肽的偶联。可以使用体积排阻色谱或透析对含有短接头的重组人溶酶体酶修饰的IGF-2肽进行纯化。
使用适宜的第一交联剂在溶酶体酶上引入用于与含有反应性醛基的靶向肽化学偶联的酰肼部分，所述适宜的第一交联剂包括琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、硫代-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(硫代-S-HyNic)、或C6-琥珀酰亚胺6-肼基-烟酰胺(C6-S-Hynic)、或琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、或琥珀酰亚胺4-盐酸肼基烟酸酯(SHNH)或其任意组合。或者，可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-NHS-膦、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、其他NHS-(PEG)n-乙炔异双功能交联剂其中n的范围可以是3-24个不连续的PEG单元、或可裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-乙炔、或含有环辛炔如二氟环辛炔(DIFO)和二苯基环辛炔(DIBO)的异双功能交联剂、或其任意组合对溶酶体酶进行修饰，以便将这些化学修饰的溶酶体酶与含有反应性叠氮化物基团的靶向肽偶联。用于修饰靶向肽的适宜的第二交联剂包括PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、或琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、或C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)、或N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)、或其他NHS-(PEG)n-叠氮化物异双功能交联剂其中“n”的范围可以是3-24个不连续的PEG单元、或可裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-叠氮化物。在另一个适宜的实施方式中，第一交联剂可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)或硫代-NHS-膦和第二交联剂可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)。在另一个适宜的实施方式中，第一交联剂可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-忆乙炔)或其他NHS-(PEG)n-乙炔异双功能交联剂其中“n”的范围可以是3-24个PEG单元、或可 裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-乙炔和第二交联剂可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)。在另一个适宜的实施方式中，第一交联剂可以是环辛炔如二氟环辛炔(DIFO)和二苯基环辛炔(DIBO)和第二交联剂可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)。
可以将所述重组人溶酶体酶上的N-末端和一个或多个赖氨酸残基在室温下在约pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中修饰约30分钟。在重组人溶酶体酶上的N-末端和赖氨酸残基被修饰后，所述重组人溶酶体酶能够迅速被交换进入酸性缓冲液中。例如，所述酸性缓冲液约pH5.0，包含50mM乙酸钠。所述酸性缓冲液可以是约pH5.0的0.1M的乙酸钠、乙酸钾、柠檬酸钠、MES、磷酸钠或磷酸钾。可以使用体积排阻色谱或透析适宜地实现交换进入酸性缓冲液。
在与第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶偶联之前，可以使用凝胶过滤、透析或反相色谱对包含短接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽进行纯化。可以在存在苯胺的约pH5.0的酸性缓冲液中实现酰肼修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的醛修饰的变体IGF-2肽的偶联。可以在pH范围为5.0-7.0的缓冲液中实现膦-或乙炔-或环辛炔-修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的叠氮化物-修饰的变体IGF-2肽的偶联。可以使用体积排阻色谱或透析对含有短接头的重组人溶酶体酶修饰的IGF-2肽进行纯化。
在偶联后，可以使用体积排阻色谱或透析对含有短接头的重组人溶酶体酶-变体IGF2肽进行纯化。
可以在存在铜(Cu+1)的约pH5.0的酸性缓冲液中实现第一交联剂(NHS-PEG4-乙炔)修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的第二交联剂(NHS-PEG4-叠氮化物)修饰的变体IGF-2肽的偶联。在该偶联步骤后，可以使用体积排阻色谱或透析实现对含有短接头的重组人溶酶体酶修饰的IGF-2肽偶联物的纯化步骤。
在约pH6.0的酸性缓冲液中将第一交联剂(环辛炔如二氟环辛炔；DIFO)修饰的重组人溶酶体酶与含有短接头的第二交联剂(NHS-PEG4-叠氮化物)修饰的变体IGF-2肽偶联。在该偶联步骤后，可以使用体积排阻色谱或透析实现对含有短接头的重组人溶酶体酶修饰的IGF-2肽偶联物的纯化步骤。
可以通过将异双功能交联剂与变体IGF-2肽偶联，然后将所述异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽与重组人溶酶体酶偶联生产用于酶替代疗法的分子。还可以通过将异双功能交联剂与重组人溶酶体酶偶联，然后将所述异双功能交联剂修饰的重组人溶 酶体酶与变体IGF-2肽偶联制备用于酶替代疗法的分子。适宜的重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、或其任意组合。适宜的异双功能交联剂包括m-马来酰亚胺苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、硫代-m-马来酰亚胺苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(硫代-MBS)或其任意组合。可以任选地使用凝胶过滤或透析对变体IGF-2肽重组人溶酶体酶偶联物进行纯化。
可以使用酵母制备适宜的重组人溶酶体酶。可以使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)对由酵母制备的重组人溶酶体酶进行处理以除去N-聚糖。在另一个适宜的实施方式中，可以在酸性pH缓冲液中使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)进行处理。适宜的酸性pH缓冲液包括0.1M的乙酸钠，pH5.0。可以在室温下进行该反应。在使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)处理后，可以任选地使用体积排阻色谱或透析对重组人溶酶体酶进行纯化。
本申请还提供了与重组人溶酶体酶化学连接的一个或多个变体IGF-2肽的偶联物。在这些实施方式中，第一交联剂修饰的重组溶酶体酶可以是重组人溶酶体酶，所述重组人溶酶体酶可以具有一个或多个经修饰的赖氨酸残基，例如其N-末端可以被化学修饰。适宜的变体IGF-2肽可以是IGF-2肽类似物且在N-末端具有短接头。至少一个变体IGF-2肽适宜地是在短接头内具有经修饰的N-末端的IGF-2肽。适宜的经修饰的IGF-2肽的特征在于具有在约pH7.5的缓冲液中能够被修饰的N-末端。适宜的变体IGF-2肽包括合成的IGF-2肽类似物，其含有在N-或C-末端的具有适宜的反应性化学基团的短接头。适宜变体IGF-2肽包括IGF-2肽类似物，在N-末端存在短接头，所述短接头作为重组蛋白产生并且随后可以使用异双功能交联剂对N-末端氨基酸进行化学修饰。
适宜的重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)。可以用于这些方法的其他适宜的重组人溶酶体酶包括人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶β(HexB)、人酸性α-甘露糖苷 酶A、人β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、或其任意组合。适宜的重组人溶酶体酶的特征为具有修饰的N-末端和至少一个经修饰的赖氨酸残基。
适宜的第一交联剂修饰的重组溶酶体酶能够具有的特征为具有衍生自氨基反应性双功能交联剂的交联剂。适宜的第一交联剂修饰的重组溶酶体酶能够具有的特征为包括衍生自琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、硫代-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(硫代-S-HyNic)、或C6-琥珀酰亚胺6-肼基-烟酰胺(C6-S-Hynic)、或琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、或琥珀酰亚胺4-盐酸肼基烟酸酯(SHNH)或其任意组合的交联剂以引入酰肼基团。或者，可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-NHS-膦、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、其他NHS-(PEG)n-乙炔异双功能交联剂其中n的范围可以是3-24个不连续的PEG单元、或可裂解的异双功能交联剂如NHS-PEG3-S-S-乙炔、或含有环辛炔如二氟环辛炔(DIFO)和二苯基环辛炔(DIBO)的异双功能交联剂、或其任意组合对溶酶体酶进行修饰，以便将这些化学修饰的溶酶体酶与含有反应性叠氮化物基团的靶向肽偶联。重组人溶酶体酶上经修饰的N-末端和赖氨酸残基可以被表征为衍生自第一个(N-末端)氨基酸的伯胺和在室温下在约pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中修饰约30分钟的赖氨酸残基。变体IGF-2肽还可以包括IGF-2肽和与第二交联剂偶联的短延长接头。适宜的第二交联剂可以是用于与琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)-修饰的溶酶体酶偶联的PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)。在不同实施方式中，所述第二交联剂可以包括用于与膦-修饰的溶酶体酶偶联的NHS-PEG4-叠氮化物。在另一个实施方式中，所述第二交联剂可以包括用于与乙炔修饰的溶酶体酶偶联的N-羟基琥珀酰亚胺酯-PEG4-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)。在另一个实施方式中，所述第二交联剂可以包括用于与环辛炔修饰的溶酶体酶偶联的N-羟基琥珀酰亚胺酯-PEG4-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)。
本申请还提供了与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽。适宜的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽的特征为衍生自与变体IGF-2肽偶联的异双功能交联剂。适宜的重组人溶酶体酶可以是人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷脂酶(GlcCerase)、人酸性 脂肪酶(LPA)。适宜的异双功能交联剂包括m-马来酰亚胺基苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和硫代-m-马来酰亚胺基苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(硫代-MBS)、硫代琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)。所述偶联物可以基本上是纯的，具有小于10％的游离的、未结合的IGF2肽。可以通过下述方法检测偶联物的纯度：测定来自体积排阻色谱的组分中的溶酶体蛋白在280nm处和游离IGF2肽在214nm处的吸光度，或者通过使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白凝胶染色，或在SDS-PAGE后进行Western印迹分析和用检测溶酶体酶或IGF2的特异性抗体。所述偶联物还可以是基本上纯的，具有小于0.1％的游离的、未偶联的IGF2肽或其他污染物。所述重组人溶酶体酶可以适宜地衍生自具有高甘露糖或复合型N-聚糖的酵母。衍生自具有复合型N-聚糖的酵母的适宜的重组人溶酶体酶可以直接用于与IGF2肽偶联。还可以在化学偶联之前或之后使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)处理具有高甘露糖型N-聚糖的适宜的重组人溶酶体酶，以除去这些外源的N-聚糖。所述重组人溶酶体酶还可以适宜地衍生自其他蛋白表达系统包括昆虫细胞、植物细胞、真菌、转基因动物和体外翻译系统。
通过给予个体一个或多个变体IGF-2肽与化学修饰的重组人溶酶体酶化学偶联的偶联物来实施治疗罹患溶酶体贮积症的个体的方法。可以采用该方法治疗多种溶酶体贮积症中的任意一种，包括下述疾病中的至少一种：庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPS II、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症和沃尔曼病。
通过给予个体异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽与重组人溶酶体酶偶联的偶联物来实施治疗罹患溶酶体贮积症的个体的方法。可以采用该方法治疗多种溶酶体贮积症中的任意一种，包括下述疾病中的至少一种：庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPSII、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症和沃尔曼病。
本申请还提供了一种治疗罹患庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPSII、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症或沃尔曼病的患者的方法，所述方法通过给予所需患者足以治疗所述疾病的量的组合物，所述组合物为与重组溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽和药学上可接受的载体。适宜的经修饰的重组人溶酶体酶包括用于治疗庞贝氏症的酸性α-葡糖苷酶。所述经修饰的重组人溶酶体酶还可以是用于治疗法布瑞氏症的酸性α-半乳糖苷酶。所述经修饰的重组人溶酶体 酶可以是用于治疗戈谢氏症的酸性β-葡糖脑苷脂酶。经修饰的重组人溶酶体酶可以是用于治疗粘多糖贮积症I(MPS I)的酸性α-艾杜糖醛酸酶。所述经修饰的重组人溶酶体酶可以是用于治疗粘多糖贮积症II(MPS II)的酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶。所述经修饰的重组人溶酶体酶还可以是用于治疗粘多糖贮积症VII(MPS VII)的酸性β-葡糖苷酸酶。或者，所述经修饰的重组人溶酶体酶可以是用于治疗GM2神经节苷脂贮积症(台萨氏症)的β-氨基己糖苷酶A。在另一个适宜的实施方式中，所述经修饰的重组人溶酶体酶可以是用于治疗GM2神经节苷脂贮积症(桑德霍夫病)的β-氨基己糖苷酶B。在另一个实施方式中，所述经修饰的重组人溶酶体酶是用于治疗沃尔曼病的酸性脂肪酶。所述经修饰的重组人溶酶体酶还可以是用于治疗α-甘露糖苷贮积症的酸性α-甘露糖苷酶。可以以每月每名患者每公斤体重给予约0.1至约1000毫克的与重组溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽的量给予本申请提供的所述组合物。在另一个适宜的实施方式中，可以以每月每名患者每公斤体重给予约1至约500毫克与重组溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽的量给予所述组合物。
本申请还提供了一种治疗罹患庞贝氏症、法布瑞氏症、和戈谢氏症、MPS I、MPSII、MPS VII、台萨氏症、桑德霍夫病、α-甘露糖苷贮积症或沃尔曼病的患者的方法，所述方法通过给予所需患者足以治疗所述疾病的量的组合物，所述组合物为与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽和药学上可接受的载体。可以以每月每名患者每50公斤体重给予约0.1至约1000毫克与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽的量给予所述组合物。在另一个适宜的实施方式中，可以以每月每名患者每50公斤体重给予约1至约500毫克与重组人溶酶体酶偶联的异双功能交联剂修饰的变体IGF-2肽的量给予所述组合物。
本申请提供了一种编码变体IGF-2肽的适宜DNA序列，所述序列被优化在大肠杆菌中表达，所述序列为SEQ ID NO：1。本申请提供了一种变体IGF-2肽的适宜氨基酸序列，所述序列为SEQ ID NO：2。本申请提供了一种延长接头的适宜氨基酸序列，所述序列为SEQ IDNO：3。在本方法中使用的变体IGF2肽可以具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，在偶联物中的变体IGF2肽可以具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
实施例和其他说明性实施方式
采用化学交联法将变体人IGF-2肽与溶酶体酶偶联以开发用于治疗多种溶酶体贮积症(LSD)的新型和优异的ERT。预计这种策略会增加IGF2肽偶联的ERT与IGF-2/CI-MPR的结合亲和性，并且改善这些溶酶体酶的细胞摄取和递送至溶酶体。通过这种做法，预计这些IGF2肽偶联的ERT会更加有效地清除受累细胞中蓄积的底物。
若干不同的人IGF-2肽变体可以被合成或表达(在哺乳动物细胞或在其他生物体中)、纯化并在随后使用异双功能交联剂化学修饰以便与溶酶体酶偶联。变体IGF-2肽可以含有下述修饰中的一个或组合：6位由精氨酸取代谷氨酸；1-4和6位氨基酸缺失；1-4和6、7位氨基酸缺失；1-4和6位氨基酸缺失和7位由赖氨酸取代苏氨酸；1-4位氨基酸缺失和6位由甘氨酸取代谷氨酸和7位由赖氨酸取代苏氨酸；27位由亮氨酸取代酪氨酸；43位由亮氨酸取代缬氨酸；65位由精氨酸取代赖氨酸。这些修饰中的大部分均是设计用于降低IGF-2肽与胰岛素和IGF-1受体以及血清IGF结合蛋白(IGFBP)的结合亲和性，同时维持其与IGF-2/CI-MPR的较高的亲和性。所述经修饰的IGF-2肽还可以含有用于快速纯化经修饰的IGF-2肽的亲和性标签(例如，聚组氨酸；His标签)，可以表达成具有可溶性蛋白伴侣的融合蛋白、具有用于除去亲和性标签的蛋白酶位点(例如，增强的烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶位点)的融合蛋白或具有融合蛋白伴侣的融合蛋白，具有在IGF-2前端的至少为5个氨基酸的接头延长区的融合蛋白。
可以通过两种主要策略将变体IGF-2肽和重组溶酶体酶化学偶联。(A)使用异双功能交联剂和与之不同的异双功能交联剂分别独立地修饰IGF-2肽和重组溶酶体酶(如实施例1-3所述)。纯化除去过量的未偶联交联剂和化学副产物后，随后在最后的化学反应中将化学修饰的IGF2肽与化学修饰的溶酶体酶偶联以形成IGF2肽-溶酶体酶偶联物，并在酸性pH缓冲液中对其进行纯化和贮存以维持酶活性。(B)使用单一的异双功能交联剂将IGF2肽和溶酶体酶化学偶联(如实施例4所述)。在一个pH反应条件下将IGF-2肽与异双功能交联剂化学偶联。然后，加入化学修饰的溶酶体酶，并将pH调节至另一个pH反应条件以便将IGF2肽与溶酶体酶偶联。然后将偶联物纯化以除去过量的未偶联异双功能交联剂和化学副产物并将其贮存在酸性pH缓冲液中以维持酶活性。
上述化学偶联方法在改善溶酶体酶替代疗法中蛋白靶向性的方面具有明显的优势。第一，偶联经修饰的IGF-2肽增强了溶酶体酶与IGF-2/CI-MPR的结合亲和性，而不需要特定的M6P碳水化合物结构。第二，不同于在每个溶酶体酶中含有单个IGF-2肽的IGF-2融合蛋白，为了使其对IGF-2/CI-MPR具有更高的亲和性，这种策略可以附加多个经修饰的IGF-2肽到溶酶体酶上。第三，这种方法可以用于偶联混合肽(IGF2肽和其他肽)以改善药物对其他组织(例如，脑)的靶向性。第四，这种方法可以利用由大多数真核表达系统生产的重组溶酶体酶，包括但不限于哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞、植物细胞、转基因动物(例如，存在于鸡卵、奶中等)。可以将含有复合型N-聚糖(即，衍生自哺乳动物表达系统、具有改进的N-聚糖加工过程并产生复合N-聚糖的酵母、转基因动物等)的重组溶酶体酶直接用于偶联。在与经修饰的IGF-2肽化学偶联之前或之后，可以对带有高甘露糖型N-聚糖(即，衍生自酵母、Lec1哺乳动物细胞系等)的酶进行脱糖基化反应(通过糖苷内切酶如EndoF或EndoH)(如实施例5所述)。第五，能够在大部分的表达系统中生产经修饰的IGF-2肽，包括细菌、酵母或其他真菌细胞，这使得能够低成本高效益地进行工艺放大步骤。第六，可以将相同的经修饰的IGF-2肽偶联至任何溶酶体酶以改善蛋白的靶向性，而不需要单独制备各IGF-2溶酶体酶的融合蛋白。第七，这种策略能够制备出新型、优异的ERT组合物，其具有能够减少药物需求、缩短输注时间和降低免疫源性的潜在可能。
实施例1
衍生自大多数哺乳动物细胞生产系统的重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)含有极低量的M6P，并且大部分为复合型N-聚糖，这些M6P不足以使rhGAA与IGF-2/CI-MPR高亲和性结合。这种N-聚糖的性质类似于血清蛋白，因而其能够使rhGAA在循环中具有良好的药代动力学性质(即，清除较慢)。因而，可以利用rhGAA与经修饰的IGF-2肽偶联以增加其对IGF-2/CI-MPR的亲和性，从而获得改善的蛋白靶向性和细胞摄取以开发优异的rhGAAERT。特别地，可以将rhGAA浓缩至蛋白浓度8-10mg/ml，并交换进入约pH7.3且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM的磷酸钠，pH7.3/100mM NaCl)中，随后使用12-至20倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)在室温下修饰约30min。在这个反应中，源自S-Hynic的化学活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团与rhGAA氨基(N)-末端的第一个氨基酸残基的α-氨基和赖氨酸上的ε-氨基反应，以便在这些经修饰的氨基酸残基上引 入新的、化学活化的酰肼基。然后，通过体积排阻色谱或透析将S-Hynic-修饰的rhGAA迅速交换至酸性缓冲液(例如，50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中，以除去过量的交联剂和化学副产物并保持酶活性。可以使用不同量的S-Hynic(例如，5-40X摩尔过量)滴定该化学反应以了解在rhGAA上可重现地产生1-4化学-活化的酰肼基所需的S-Hynic与rhGAA比例。然后使用最佳条件放大rhGAA的S-Hynic修饰反应。
在一个单独的反应中，在pH～7.5并且室温条件下使用异双功能交联剂PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)对变体IGF2肽例如含有短延长接头区(在N-末端)的[del(1-4)，Arg6，Leu27，Arg65]IGF2化学修饰2-3小时。在这个反应中，PEG4-PFB修饰短延长接头区的第一个氨基酸甘氨酸的α-氨基，以便在氨基末端引入新的反应性醛基化学基团。如图5所示，可以利用C4反相色谱监测变体IGF2肽的化学修饰以评估化学修饰的进程和完全性。然后利用凝胶过滤色谱或透析纯化PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽以便在用于偶联的缓冲液(例如，50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中除去过量的交联剂和化学副产物。然后，在室温下于50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80缓冲液中进行最终反应24小时，以将S-Hynic-修饰的rhGAA与PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽偶联。该化学反应将S-Hynic-修饰的rhGAA上的酰肼基与PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽上的化学活化的醛基偶联以形成稳定的共价(腙)键。可以在存在苯胺(例如，10mM)和不同量的PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽(例如，1-10X摩尔过量)的条件下进行该反应以优化偶联。然后利用凝胶排阻色谱或透析在50mM磷酸钠，pH6.2/100mMNaCl/0.05％聚山梨醇酯-80中对IGF-2肽偶联的rhGAA进行纯化，以除去过量的PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽，并将所述变体IGF2肽偶联的rhGAA(vIGF2-rhGAA)在4℃下在相同的缓冲液中贮存或在-20℃或-70℃下冻存。
实施例2
利用衍生自哺乳动物生产系统的重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)与变体IGF-2肽偶联以增加其对IGF-2/CI-MPR的亲和性，从而获得改善的蛋白靶向性和细胞摄取以开发优异的rhGAA ERT。特别地，采用施陶丁格(Staudinger)(叠氮化物-膦)反应化学将IGF2肽与rhGAA偶联以产生用于改善药物靶向性的IGF2肽-rhGAA偶联物。在这个实施例中，将rhGAA(5-10mg/m1)交换进入约pH7.3且缺乏伯胺的缓冲 液(例如，50mM磷酸钠(pH7.3)/100mMNaCl)中，随后在室温下使用10-至20-倍摩尔过量的异双功能交联剂硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)修饰约30min。在这个化学反应中，源自硫代-NHS-膦的化学活化的NHS基团与rhGAA上氨基N-末端的第一个氨基酸残基的α-氨基和赖氨酸上的ε-氨基反应，以便在这些经修饰的氨基酸残基上引入新的、化学活化的膦基。然后，通过体积排阻色谱或透析将含膦的rhGAA迅速交换至略呈酸性的缓冲液(例如，50mM磷酸钠，pH6.5/100mMNaCl)中，以除去过量的交联剂和化学副产物并保持酶活性。可以使用不同量的硫代-NHS-膦(例如，5-40X摩尔过量)滴定该化学反应以了解在rhGAA上可重现地产生1-4化学-活化的膦基所需的硫代-NHS-膦与rhGAA比例。然后可以使用最佳条件放大rhGAA的硫代-NHS-膦修饰反应。
在一个单独的反应中，在pH～7.5且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM磷酸钠/50mMNaCl，pH7.5)中在室温条件下使用30-倍摩尔过量的异双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺酯-PEG4-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)对变体IGF2肽如含有短延长接头区(在N-末端)的[del(1-4)，Arg6，Leu27，Arg65]IGF2化学修饰1-3小时。在这个反应中，NHS-PEG4-叠氮化物的反应性NHS基团与短延长接头区的甘氨酸的α-氨基反应，以便在N-末端引入新的叠氮化物化学基团。可以利用C4反相色谱监测变体IGF2肽的化学修饰以评估化学修饰的进程和完全性。然后利用C4反相色谱对PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽进行纯化，并将所述经修饰的肽冻干以除去溶剂并以干粉形式保存。
然后进行最终的反应将所述膦修饰的rhGAA与所述PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽偶联，以1份rhGAA对5份IGF2肽的摩尔比直接将膦-修饰的rhGAA(在50mM磷酸钠，pH6.5/100mM NaCl缓冲液中)加入到冻干的PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽中，在室温下孵育24小时。该化学反应将叠氮化物-修饰的IGF-2肽上的叠氮化物化学基团与膦修饰的rhGAA偶联以形成稳定的共价(酰胺)键。然后利用体积排阻色谱或透析将变体IGF-2肽偶联的rhGAA(vIGF2-rhGAA)纯化，以除去过量的PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽，并贮存在4℃下略呈酸性pH的缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.5/100mM NaCl缓冲液)中。
实施例3
利用衍生自哺乳动物生产系统的重组人艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)与变体IGF-2肽偶联以增加其对IGF-2/CI-MPR的酶亲和性，从而获得改善的蛋白靶向性和细胞摄取以开发优异的I2S ERT。特别地，采用施陶丁格(Staudinger)(叠氮化物-膦)反应化学将变体IGF2肽与I2S偶联以产生用于改善药物靶向性的IGF2肽-I2S偶联物。在这个实施例中，在pH～7.3且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mMM磷酸钠/100mMNaCl，pH7.3)中在室温下使用20-倍摩尔过量的异双功能交联剂硫代-N-羟基琥珀酸亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)修饰I2S(约3mg/m1)约30min。在这个化学反应中，源自硫代-NHS-膦的化学活化的NHS基团与I2S上氨基N-末端的第一个氨基酸残基的α-氨基和赖氨酸上的ε-氨基反应，以便在这些经修饰的氨基酸残基上引入新的、化学活化的膦基。然后，通过体积排阻色谱或透析将含膦的I2S迅速交换至略呈酸性的缓冲液(例如，50mM磷酸钠，pH6.5/100mM NaCl)中，以除去过量的交联剂和化学副产物并保持酶活性。可以使用不同量的硫代-NHS-膦(例如，5-40X摩尔过量)滴定该化学反应以了解在I2S上可重现地产生1-4化学-活化的膦基所需的硫代-NHS-膦与I2S比例。然后可以使用最佳条件放大I2S的硫代-NHS-膦修饰反应。
在一个单独的反应中，在室温条件下在pH～7.5且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM磷酸钠/50mMNaCl，pH7.5)中，使用30-倍摩尔过量的异双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺酯-PEG4-叠氮化物(NHS-PEG4-叠氮化物)对变体IGF-2肽如含有短延长接头区(在N-末端)的[del(1-4)，Arg6，Leu27，Arg65]IGF-2化学修饰1-3小时。在这个反应中，NHS-PEG4-叠氮化物的反应性NHS基团与短延长接头区中甘氨酸的α-氨基反应以便在N-末端引入新的叠氮化物化学基团。可以利用C4反相色谱监测变体IGF2肽的化学修饰以评估化学修饰的进程和完全性。然后利用C4反相色谱对PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽进行纯化，将所述的肽冻干并以干粉形式保存。
然后进行最终的反应将所述膦修饰的I2S与所述PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽偶联，以1份I2S对5份IGF2肽的摩尔比直接将膦-修饰的I2S(在50mM磷酸钠，pH6.5/100mMNaCl缓冲液中)加入到冻干的PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽中，在室温下孵育24小时。该化学反应将叠氮化物-修饰的IGF-2肽上的叠氮化物化学基团与膦修饰的I2S偶联以形成稳定的共价(酰胺)键。然后利用体积排阻色谱或透析将变体IGF-2肽偶联的I2S(vIGF2-I2S)纯化以除去过量的PEG4-叠氮化物修饰的IGF-2肽，并贮存在4℃下略呈酸性pH的缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.5/100mM NaCl缓 冲液)中。
实施例4
利用衍生自哺乳动物生产系统的重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)与经修饰的IGF-2肽偶联以增加其对IGF-2/CI-MPR的亲和性，从而获得改善的蛋白靶向性和细胞摄取以开发优异的rhGAAERT。在这个实施例中，在约pH6和室温下使用异双功能交联剂m-马来酰亚胺苯甲基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)修饰变体IGF-2肽例如在N-末端的短延长接头区具有半胱氨酸残基的[del(1-4)，Arg6，Leu27，Arg65]IGF-230-60min。在这个反应中，源自MBS的化学反应性马来酰亚胺基团将与N-末端半胱氨酸上的游离巯基反应，同时保留了用于与rhGAA偶联的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应性基团。利用凝胶过滤色谱或透析迅速对MBS修饰的IGF-2肽进行纯化以除去过量的MBS。然后加入rhGAA使其在室温下在不含胺的pH7.3的缓冲液中与MBS修饰的IGF-2肽偶联30min。在这个化学反应中，化学反应性的N-羟基琥珀酰亚胺酯基(来自MBS修饰的IGF-2肽)与rhGAA上氨基N-末端的第一个氨基酸残基的α-氨基和赖氨酸上的ε-氨基反应以形成稳定的共价键。使用不同量的MBS修饰的IGF-2肽(例如，1-20X摩尔过量)对该反应进行滴定，以确定在rhGAA上偶联1-4个IGF-2肽时，MBS修饰的IGF-2肽的摩尔过量情况。然后使用最佳偶联条件放大该工艺。利用凝胶过滤色谱或透析纯化IGF-2偶联的rhGAA以除去过量的IGF-2肽，并贮存在酸性pH缓冲液(0.1M柠檬酸钠，pH5.5缓冲液)中。
实施例5
可以利用重组人溶酶体酶如具有高甘露糖型N-聚糖结构的rhGAA(衍生自酵母，GNT-1缺陷Lec1哺乳动物细胞等)与变体IGF-2肽偶联以增加其对IGF-2/CI-MPR的亲和性，从而获得改善的蛋白靶向性和细胞摄取以开发优异的rhGAA ERT。在这个实施例中，将rhGAA(8-10mg/m1)交换进入约pH7.3且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM磷酸钠(pH7.3)/100mM NaCl)中，随后在室温下在pH～7.3且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM磷酸钠/0.1MNaCl，pH7.3)中，使用异双功能交联剂如N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)修饰30min。然后利用体积排阻色谱或透析将酰肼修饰的rhGAA迅速交换至酸性缓冲液(例如，50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中，以除去过量的交联剂和化学副产物并保持酶活性。
在一个单独的反应中，在pH～7.5且缺乏伯胺的缓冲液(例如，50mM磷酸钠/50mMNaCl，pH7.5)中在室温条件下，使用30-倍摩尔过量的异双功能交联剂PEG4-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)对变体IGF-2肽例如含有短延长接头区(在N-末端)的[del(1-4)，Arg6，Leu27，Arg65]IGF-2化学修饰1-3小时。在这个反应中，PEG4-PFB修饰短延长接头区的甘氨酸的α氨基以便在N-末端引入新的醛基化学基团。可以利用C4反相色谱监测变体IGF2肽的化学修饰以评估化学修饰的进程和完全性。然后在适于偶联的缓冲液(例如，50mMNaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中，利用凝胶过滤色谱或透析对PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽进行纯化以便除去过量的交联剂和化学副产物。
然后进行最终的反应，在室温下在50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80中将S-Hynic-修饰的rhGAA与PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽偶联24小时。这个化学反应将S-Hynic-修饰的rhGAA上的酰肼基与PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽上的化学活化的醛基偶联以形成稳定的共价(腙)键。可以在存在苯胺(例如，10mM)和不同量的PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽(例如，1-10X摩尔过量)的条件下进行该反应以优化偶联。然后，在酸性pH缓冲液(50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中，利用体积排阻色谱或透析纯化变体IGF-2肽偶联的rhGAA(vIGF2-rhGAA)，以便除去过量的PEG4-叠氮化物-修饰的IGF-2肽。
rhGAA上的高甘露糖型N-聚糖是存在问题的，因为据信这些碳水化合物会导致所述蛋白被巨噬细胞和脾甘露糖受体从循环中迅速清除。但是，在室温下在酸性pH缓冲液(例如，50mM NaOAc，pH4.8/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)能够在自然条件下(即，非变性条件，保留了催化活性)，从rhGAA中除去高甘露糖型N-聚糖。已通过实验表明，在除去N-聚糖后rhGAA仍是可溶的并具有完全的活性(数据未列出)。在使用S-Hynic对酶修饰和纯化(利用体积排阻色谱或透析除去过量的交联剂)后可以对rhGAA进行脱糖基化。这种策略使用EndoF或EndoH，使得rhGAA在1-5天内能够完全脱糖基化并且不会影响酶活性。然后将脱糖基化的酰肼修饰的rhGAA与PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽偶联。或者，可以使用高浓度的EndoF或EndoH在PEG4-苯甲醛基修饰的IGF-2肽与酰肼修饰的rhGAA进行偶联的同时，进行rhGAA的脱糖基化。利用凝胶过滤色谱或透析对脱糖基化的、IGF2肽偶联的rhGAA进行纯化以除去过量的膦修饰的IGF-2肽，并贮存在酸性pH缓冲液(50mM磷酸钠，pH6.2/100mM NaCl/0.05％聚山梨醇酯-80)中。从酵母来源的rhGAA中除去高甘露糖N-聚糖的理想方法是将EndoH与溶酶体酶共表达，以便在对rhGAA进行蛋白纯化前在体内脱糖基化。这将产生脱糖基化的rhGAA，能够对其直接进行修饰并将其与不同的靶向肽偶联，而不需要进行其他处理。
上述策略能够从rhGAA上除去不需要的N-聚糖以避免免疫源性反应并防止蛋白的迅速清除，同时显著改善了其与IGF-2/CI-MPR的结合亲和性，从而获得具有改善蛋白靶向性和细胞摄取的IGF2肽偶联的溶酶体酶。重要的是，这种策略能够利用由非哺乳动物系统产生的溶酶体酶，并且这表示这是一种用于开发优异ERT的成本更低有效性更高的方法。
设计上述实施例以通过化学偶联经修饰的IGF-2肽增加不同溶酶体酶对IGF-2/CI-MPR的亲和性。这一策略为目前和将来的ERT提供了改善的蛋白靶向性以开发出更优异的治疗LSD的方法。
实施例6
利用IGF2/CI-MPR受体结合检测评估IGF2肽的化学偶联对溶酶体酶rhGAA和I2S受体亲和性的影响。设计这项检测以便将对IGF2/CI-MPR具有高结合亲和性的溶酶体酶与具有较低至中度结合的那些相区分，因为未结合的溶酶体酶在处理过程中被洗去。而且，由于使用不同蛋白浓度的溶酶体酶评估结合情况，因而这些检测能够确定结合受体所需的蛋白浓度，可以用于估计各溶酶体酶制剂的结合亲和性。特别地，使用40mM HEPES(pH6.7)/150mM NaCl/10mM EDTA对未经修饰的溶酶体酶和IGF2肽偶联的溶酶体酶进行系列稀释，然后在已包被了IGF2/CI-MPR受体(在磷酸盐缓冲液中的6μg/ml的受体每孔50μl；然后使用在磷酸盐缓冲液中的2％的BSA封闭)的96-孔ELISA板中30℃孵育1小时。随后使用相同的含0.1％吐温-20的缓冲液洗板三次以除去未结合的蛋白。然后对结合的溶酶体酶进行检测，使用在检测缓冲液(50mMNaOAc，pH4.8/2％BSA/0.02％TritonX-100)中的适宜荧光底物(例如，针对rhGAA的4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡糖苷(4-MU-α-Glc))在37℃下孵育1小时来检测酶活性。然后将样品转移至新的96孔板中，加入0.1M的NaOH使溶液的pH升高至约10.5，在适宜的激发和发射波长下(即，针对4-MU的370nm的激发波长，460nm的发射波长为)在荧光酶标仪上读板。如图6A所示，我们的结果显示在所有已检测的蛋白浓度下，vIGF2-rhGAA结合酶活性的量比未偶联的rhGAA高得多。通 过引入游离的WT人IGF2肽使vIGF2-rhGAA与IGF2/CI-MPR板的结合显著降低，表明该结合依赖于IGF2肽。完全阻断vIGF2-rhGAA与IGF2/CI-MPR的结合可能需要更高量的游离WT人IGF2肽。将IGF2肽化学偶联于I2S上也显示出极大增加了该酶对IGF2/CI-MPR的结合亲和性(图7A)。而且，在IGF2肽偶联的I2S(vIGF2-I2S)为1和3μg/ml时，观察到了相似量的结合I2S活性，这表明受体的结合已经饱和。
这些汇总数据揭示了变体IGF2肽偶联方法的若干重要特征。(1)变体IGF2肽的蛋白结构适于与IGF2/CI-MPR受体高亲和性结合。这些功能评估结果与如图5所示的C4反相色谱数据一致，其表明野生型和变体IGF2肽在几乎相同的条件下结合和洗脱。由于通过C4反相色谱几乎无法区分这两个IGF2肽的“指纹”，因而其蛋白构象一定是非常相似的。(2)与变体IGF2肽的化学偶联不会影响rhGAA或I2S的酶活性(数据未列出)。延长接头区的使用可能为肽与溶酶体酶的化学偶联提供了纽带，其足以使IGF2肽结合并保持酶活性。(3)偶联的变体IGF2肽是稳定的，并在维持溶酶体酶活性所需的酸性缓冲液中保持适宜的蛋白结构。
因此，汇总数据表明将IGF2肽与溶酶体酶(例如，rhGAA和I2S)化学偶联的确能够显著增加其与IGF2/CI-MPR受体的结合亲和性。这种方法在理论上应当可以广泛地应用于将变体IGF2肽与任意溶酶体蛋白和其他非溶酶体蛋白化学偶联，以改善其与IGF2/CI-MPR的结合亲和性。
实施例7
为评估IGF2肽对外源性溶酶体酶的细胞摄取的功能性作用，在L6大鼠骨骼肌成肌细胞中对IGF2偶联的rhGAA(vIGF2-rhGAA)的内化作用进行了评估。简言之，将L6成肌细胞在T-75培养瓶中在37C和5％CO2环境下于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中扩增至汇合。利用胰酶/EDTA收集细胞，以3x105个细胞每孔的细胞密度将细胞接种于6孔组织培养板中，并在DMEM/10％FBS的培养基中培养。在加入溶酶体酶前2小时，使用2.5ml摄取培养基(Ham’s F-12/10％FBS/2mM PIPES，pH6.7)替换已经消耗的DMEM/10％FBS培养基。使用50mM磷酸钠pH6.5/100mMNaCl/0.05％聚山梨醇酯-80将未偶联的rhGAA和vIGF2-rhGAA稀释至0.5mg/ml，并通过0.2μm过滤旋转设备(Costar)除菌。在各孔中加入未偶联的rhGAA使其蛋白终浓度为10-200nM，而加入vIGF2-rhGAA的浓度为2-25nM。为确保各孔均具有相同的体积和正确的蛋白浓度，加入50mM磷酸钠pH6.5/100mM NaCl/0.05％聚山梨 醇酯-80缓冲液，以使得各样品的酶和缓冲液的总体积均为0.2ml。如图6B所示，在所有检测的蛋白浓度下，vIGF2-rhGAA的内化作用均显著优于未偶联的rhGAA。这些结果揭示了关于vIGF2-rhGAA的几个重要的方面：(1)变体IGF2肽的蛋白结构足以使其高亲和性地与细胞表面的IGF2/CI-MPR受体结合；(2)vIGF2-rhGAA在L6成肌细胞中有效地内化并输送至溶酶体，因为在该方案中细胞内的细胞器被分离；(3)与预期结果一致：变体IGF2肽与血清IGF结合蛋白(IGFBP)具有较低的结合亲和性，因为vIGF2-rhGAA在L6成肌细胞中被内化而不是与培养基中的IGBP结合；(4)与变体IGF2肽的化学偶联不会改变rhGAA的酶活性。
这些结果清楚地表明在rhGAA上化学偶联变体IGF2肽能够显著改善与IGF2/CI-MPR的结合亲和性，其直接转化为在靶细胞中显著改善的溶酶体酶的细胞摄取。这些结果表明vIGF2-rhGAA将是用于治疗庞贝氏症的优异的ERT。
实施例8
为评估多个IGF2肽是否能够与溶酶体酶化学偶联，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)基于其尺寸分离蛋白，随后使用改良的考马斯亮蓝染色以对蛋白条带进行目测检查。如图7B所示，在与变体IGF2肽化学偶联后，重组野生型人艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)的分子量由～80kDa显著增至约120kDa。这些数据清楚地表明肯定是多个变体IGF2肽与I2S偶联，因为变体IGF2肽的分子量仅为约8kDa。染色的SDS-PAGE凝胶显示vIGF2-I2S片段带有不同量的连接的变体IGF2肽，其分布范围为每个I2S分子平均连接5个肽(对应于增加～40kDa，使得凝胶上的分子量达到约120kDa)。重要的是，这些数据还强调了这种方法有潜力用于将多个不同的肽偶联至同一溶酶体酶上。例如，能够将变体IGF2肽和其他靶向肽(例如，已知的跨血脑屏障(BBB)转运肽)化学偶联至同一溶酶体酶，以便将溶酶体酶靶向至内脏组织(通过IGF2肽)以及至脑和中枢神经系统(通过BBB-穿透肽)。因此，这种方法具有克服目前ERT存在的主要缺陷的潜力。
实施例9
SEQ ID NO：1表示具有N-末端延长接头区和TEV蛋白酶识别位点的8XHis标记的[(del1-4)-Arg6-Leu27-Arg65]IGF-2肽的cDNA序列(被优化以在大肠柑杆菌中表达)。
SEQ ID NO：1：
atgggcagccaccaccaccatcatcaccaccacactagtgccggcgagaatctgtactttCagggcggtggtggtagcggcggtggtggtagCCgtaCCCtgtgtggtggcgaattggttgataCgctgcaattcgtctgtggtgaccgcggtttCCtgttctctcgtCCggcgtCCCgcgtgagCCgtcgCagCCgtggtatcgttgaagagtgctgttttcgtagctgcgacctggctctgctggaaacctattgcgcgaccccggCaCgtagcgagtga
SEQ ID NO：2表示具有延长序列的变体IGF2肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2：
NH2-
GGGGSGGGGSRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE-COOH
SEQ ID NO：2对应于利用TEV蛋白酶除去N-末端8X His标签后的变体IGF2肽。这个变体IGF2肽缺乏残基1-4，这样N-末端丝氨酸残基对应于WT IGF2的残基5。已知用精氨酸取代6位的谷氨酸会极大地降低IGF2肽与血清IGF结合蛋白(IGFBP)的结合亲和性。已知亮氨酸取代27位的酪氨酸会极大地降低IGF2肽与胰岛素和IGF1受体的结合亲和性。使用精氨酸保守取代65位的赖氨酸，使得仅能够在N-末端的延长接头区进行用于与溶酶体酶偶联的化学修饰。SEQ ID NO：3表示N-末端延长区。SEQ ID NO：3：
GGGGSGGG
SEQ ID NO：3中的N-末端甘氨酸残基用于化学修饰以便于溶酶体酶偶联。
Claims (46)
1.一种与重组人溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：
使用第一交联剂修饰重组人溶酶体酶的氨基(N)-末端和一个或多个赖氨酸残基以产生第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶，其中：
所述重组人溶酶体酶选自由以下组成的组：人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、及其任意组合；和
所述第一交联剂选自琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼烟酸(SHNH)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-乙炔、或者NHS-PEG3-S-S-乙炔，其中n＝3-24；
使用第二交联剂修饰在变体IGF-2肽的短延长接头的氨基(N)-末端的第一个氨基酸以产生第二交联剂修饰的变体IGF-2肽，其中：
所述变体IGF-2肽由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列表示；
所述短延长接头由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列表示；和
所述第二交联剂选自PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物、或者NHS-PEG3-S-S-叠氮化物，其中n＝3-24；和
将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
2.一种与重组人溶酶体酶偶联的靶向肽的制备方法，所述方法包括：
将第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与一个或多个第二交联剂修饰的变 体IGF-2肽偶联，其中：
所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶包括重组人溶酶体酶，其特征为具有第一交联剂修饰的N-末端和一个或多个经第一交联剂修饰的赖氨酸残基，其中所述第一交联剂选自琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼基对苯二酸(SHTH)、琥珀酰亚胺4-盐酸酰肼烟酸(SHNH)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-酰肼、N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(NHS-膦)、硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-乙炔、或者NHS-PEG3-S-S-乙炔，其中n＝3-24；
所述重组人溶酶体酶选自由以下组成的组：人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)、人酸性α-半乳糖苷酶A(GLA)、人酸性β-葡糖醛酸酶(GUS)、人酸性α-透明质酸酶A(IduA)、人酸性艾杜糖酸2-硫酸酯酶(I2S)、人β-氨基己糖苷酶A(HexA)、人β-氨基己糖苷酶B(HexB)、人酸性α-甘露糖苷酶A、人β-葡糖脑苷酶(GlcCerase)、人酸性脂肪酶(LPA)、及其任意组合；
所述一个或多个第二交联剂修饰的变体IGF-2肽包括在变体IGF-2肽的短延长接头的氨基(N)-末端的经修饰的第一个氨基酸，其中所述变体IGF-2肽由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列表示；所述短延长接头由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列表示；和
所述第二交联剂选自PEG4-戊氟苯基苯甲酸酯(PEG4-PFB)、琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(SFB)、C6-琥珀酰亚胺4-甲酰基苯甲酸酯(C6-SFB)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-叠氮化物(NHS-叠氮化物)、N-羟基琥珀酰亚胺酯-(PEG)n-叠氮化物、或者NHS-PEG3-S-S-叠氮化物，其中n＝3-24。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在重组人溶酶体酶上的两个赖氨酸残基被修饰。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一交联剂为N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二交联剂为PEG4-戊氟 苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述重组人溶酶体酶上的N-末端和一个或多个赖氨酸残基在室温下在pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中修饰30分钟。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在所述重组人溶酶体酶上的N-末端和赖氨酸残基被修饰后，所述重组人溶酶体酶迅速交换进入酸性缓冲液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酸性缓冲液pH5.0，包含50mM乙酸钠。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述酸性缓冲液pH5.0，包含0.1M乙酸钠、乙酸钾、柠檬酸钠、MES、磷酸钠或磷酸钾。
11.根据权利要求8所述的方法，其中使用体积排阻色谱实现交换进入酸性缓冲液。
12.根据权利要求8所述的方法，其中使用透析实现交换进入酸性缓冲液。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联前，将所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽纯化。
14.根据权利要求6所述的方法，其中在pH7.5的缓冲液中将经修饰的变体IGF-2肽上的短延长接头的N-末端的第一个氨基酸修饰。
15.根据权利要求13所述的方法，其中使用凝胶过滤纯化所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的IGF-2肽。
16.根据权利要求13所述的方法，其中使用透析纯化所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的IGF-2肽。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在存在苯胺的pH5.0的酸性缓冲液中将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
18.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化所述重组人溶酶体酶与经修饰的含有短延长接头的IGF-2肽的偶联物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中使用体积排阻色谱纯化。
20.根据权利要求18所述的方法，其中使用透析纯化。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一交联剂为硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)。
22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一交联剂为N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)。
23.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在pH5.0的酸性缓冲液中将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
24.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在存在Cu+1的pH5.0的酸性缓冲液中将所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶与所述包含短延长接头的第二交联剂修饰的变体IGF-2肽偶联。
25.根据权利要求1所述的方法，其中使用昆虫细胞、植物细胞、真菌、转基因动物和体外翻译系统制备所述重组人溶酶体酶。
26.根据权利要求1所述的方法，其中使用酵母制备所述重组人溶酶体酶。
27.根据权利要求26所述的方法，其中使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)对由酵母制备的含有高甘露糖型N-聚糖的所述重组人溶酶体酶进行处理。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述处理在酸性pH缓冲液中进行。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述酸性pH缓冲液是pH5.0的0.1M柠檬酸钠。
30.根据权利要求28所述的方法，其中在室温下实施所述反应。
31.根据权利要求27所述的方法，其中在使用糖苷内切酶F(EndoF)或糖苷内切酶H(EndoH)处理后，进一步包括纯化所述重组人溶酶体酶。
32.根据权利要求31所述的方法，其中使用体积排阻色谱纯化。
33.根据权利要求31所述的方法，其中使用离子交换色谱纯化。
34.根据权利要求31所述的方法，其中使用疏水性相互作用色谱纯化。
35.一种由权利要求2的方法制备的偶联物，包括：与重组人溶酶体酶化学偶联的一个或多个变体IGF-2肽。
36.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶包括重组人溶酶体酶，所述重组人溶酶体酶包括一个或多个经修饰的赖氨酸残基。
37.根据权利要求36所述的偶联物，其进一步包括化学修饰的N-末端。
38.根据权利要求37所述的偶联物，其中在变体IGF-2肽上短延长接头的经修饰的N-末端的第一个氨基酸的特征为具有在pH7.5的缓冲液中被修饰的能力。
39.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述重组人溶酶体酶包括人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)。
40.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述重组人溶酶体酶的特征为包括经修饰的N-末端和至少一个经修饰的赖氨酸残基。
41.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶的特征为包括衍生自氨基反应性双功能交联剂的交联剂。
42.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶的特征为包括衍生自N-琥珀酰亚胺6-肼基烟酸酯丙酮(S-Hynic)的交联剂。
43.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶的特征为包括衍生自硫代-N-羟基琥珀酰亚胺酯-膦(硫代-NHS-膦)的交联剂。
44.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述第一交联剂修饰的重组人溶酶体酶的特征为包括衍生自N-羟基琥珀酰亚胺酯-四氧杂十五烷乙炔(NHS-PEG4-乙炔)的交联剂。
45.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述重组人溶酶体酶上经修饰的N-末端和赖氨酸残基的特征为衍生自在第一个(N-末端)氨基酸的伯胺和在室温下在pH7.3的缺乏伯胺的缓冲液中被修饰30分钟的赖氨酸残基。
46.根据权利要求35所述的偶联物，其中所述交联剂包括用于与酰肼修饰的溶酶体酶偶联的-戊氟苯基-4-甲酰基苯甲酸酯(PEG4-PFB)。
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| US20220023434A1 (en) | 2018-12-19 | 2022-01-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Bifunctional Molecules for Lysosomal Targeting and Related Compositions and Methods |
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| US20220193261A1 (en) * | 2019-04-30 | 2022-06-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions useful for treatment of pompe disease |
| CN110373405B (zh) * | 2019-07-24 | 2023-12-15 | 杭州恩和生物科技有限公司 | 一种接枝聚合物的生物酶及其制备方法和固定方法 |
| CN115087458A (zh) * | 2019-10-10 | 2022-09-20 | 阿米库斯治疗学公司 | 变体igf2构建体 |
| WO2022063990A1 (en) | 2020-09-28 | 2022-03-31 | Dbv Technologies | Particle comprising an rsv-f protein for use in rsv vaccination |
| US20240024507A1 (en) | 2020-12-01 | 2024-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Novel compositions with tissue-specific targeting motifs and compositions containing same |
| BR112023021971A2 (pt) | 2021-04-23 | 2024-02-20 | Univ Pennsylvania | Composições com motivos de direcionamento específicos do cérebro e composições contendo os mesmos |
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| WO2024130067A2 (en) | 2022-12-17 | 2024-06-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant aav mutant vectors with cardiac and skeletal muscle-specific targeting motifs and compositions containing same |
| WO2024130070A2 (en) | 2022-12-17 | 2024-06-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Recombinant aav capsids with cardiac- and skeletal muscle- specific targeting motifs and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102066422A (zh) * | 2008-05-07 | 2011-05-18 | 齐斯特治疗公司 | 溶酶体靶向肽及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1118334A1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-25 | Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Method for the production of conjugates and uses thereof for the prevention and treatment of allergic reactions and autoimmune diseases |
| US7560424B2 (en) * | 2001-04-30 | 2009-07-14 | Zystor Therapeutics, Inc. | Targeted therapeutic proteins |
| US20030072761A1 (en) * | 2001-10-16 | 2003-04-17 | Lebowitz Jonathan | Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier |
| WO2005033134A2 (en) | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Secreted protein therapeutics and uses thereof |
| PL3903829T3 (pl) * | 2009-02-13 | 2023-08-14 | Immunomedics, Inc. | Immunokoniugaty z połączeniem rozszczepialnym wewnątrzkomórkowo |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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